KR101263398B1 - 다중 분석을 위한 원심력 기반 미세 유동장치 및 이를 이용한 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
다중 분석을 위한 원심력 기반 미세 유동장치 및 이를 이용한 분석 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 미세 유동장치는 플랫폼과, 플랫폼의 내부에 형성되며 복수의 챔버 및 챔버들 사이에 위치하는 밸브를 구비하는 미세 유동 구조물을 포함한다. 미세 유동 구조물은 시료 주입구와 연결된 시료 분리 챔버와, 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 수용하는 복수의 반응 챔버를 포함한다.
Description
본 발명은 면역학적 검사, 유전자 검사, 생화학적 검사, 또는 환경 오염물질 분석 등을 수행할 수 있는 원심력 기반 미세 유동장치 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것이다.
미세 유동장치는 소량의 유체를 저장하는 복수의 챔버와, 챔버들 사이의 유체 흐름을 제어하는 밸브와, 유체를 제공받아 지정된 기능을 수행하는 여러 가지 기능성 유닛을 포함한다.
랩 온어 칩(lab on a chip)은 소형 칩에 미세 유동장치가 설치된 것으로서, 여러 단계의 반응과 조작을 하나의 칩 상에서 수행할 수 있다. 특히 시료 분리와 유체 이송을 위한 구동 압력으로서 원심력을 이용하는 랩 온어 칩을 랩 온어 디스크(lab on a disc)라고 한다. 종래 랩 온어 디스크 형태의 미세 유동장치는 일반적으로 시료에서 하나의 표적 물질을 검출하는 구성으로 이루어진다.
시료에서 여러 개의 표적 물질을 검출하기 위해서는 표면의 지정된 위치에 서로 다른 종류의 표지 인자들을 코팅하고, 반응 이후에 반응 위치를 스캔하여 표적 물질을 분석하거나, 하나의 반응 챔버 내에 바코드, 형광 입자, 다양한 모양의 비드와 같은 향후 식별이 가능한 반응 매개체를 활용한 예(한국 공개특허 10-2010-0038007호 등)가 알려져 있다. 그러나 이러한 종류의 미세 유동장치들은 검출용 하드웨어나 소프트웨어가 복잡하고, 분석 비용이 높아지는 불편함이 있다.
본 발명은 하나의 시료에서 복수의 표적 물질을 동시에 검출할 수 있는 다중 분석을 위한 미세 유동장치 및 이를 이용한 분석 방법을 제공하고자 한다. 또한, 전체 크기와 분석에 필요한 유체들의 체적을 줄이고, 분석 시간을 단축할 수 있는 미세 유동장치 및 이를 이용한 분석 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동장치는 플랫폼과, 플랫폼의 내부에 형성된 복수의 챔버 및 챔버들 사이에 위치하는 밸브를 구비하는 미세 유동 구조물을 포함한다. 미세 유동 구조물은 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 수용하는 복수의 반응 챔버를 포함한다.
복수의 반응 챔버 각각은 표지 인자들이 코팅된 반응 매개체를 수용할 수 있다. 복수의 반응 챔버는 반응 중의 일부 단계에서 상호 연결되거나 상호 격리될 수 있다. 플랫폼은 복수의 영역으로 구분되고, 미세 유동 구조물은 복수의 영역 각각에 구비되어 독립적으로 작동할 수 있다.미세 유동 구조물은 시료 분리 챔버를 포함할 수 있다. 시료 분리 챔버는 플랫폼의 원주 방향과 나란하게 형성된 시료 수집부와, 시료 수집부와 연결되며 플랫폼의 반경 방향과 나란하게 형성된 침강물 수집부를 포함할 수 있다. 복수의 반응 챔버는 시료를 가장 먼저 제공받는 제1 반응 챔버와, 시료를 가장 나중에 제공받는 최종 반응 챔버를 포함할 수 있다.
미세 유동 구조물은, 제1 반응 챔버의 앞쪽에 위치하며 2종 이상 검출 항체의 혼합물을 수용하는 제1 저장 챔버를 포함할 수 있다.
제1 저장 챔버는 닫힌 밸브를 통해 제1 반응 챔버와 연결되고, 복수의 반응 챔버는 제1 저장 챔버보다 플랫폼의 회전 중심으로부터 더 멀리 위치할 수 있다. 복수의 반응 챔버는 열린 밸브를 통해 상호 연결되어 제1 저장 챔버로부터 검출 항체의 혼합물을 차례로 제공받을 수 있다.
미세 유동 구조물은, 닫힌 밸브를 통해 복수의 반응 챔버 각각에 연결되며 기질 용액을 수용하는 복수의 제2 저장 챔버를 포함할 수 있다. 복수의 반응 챔버는 표적 물질과 표지 인자의 결합 반응이 일어난 후 열린 밸브의 닫힘에 의해 상호 격리되고, 복수의 제2 저장 챔버로부터 기질 용액을 제공을 수 있다.
다른 한편으로, 미세 유동 구조물은, 복수의 반응 챔버 각각에 연결되며 2종 이상 검출 항체들을 종류별로 나누어 수용하는 복수의 제1 저장 챔버를 포함할 수 있다. 복수의 제1 저장 챔버는 형광 물질과 발광 물질 중 적어도 하나가 접합된 검출 항체들을 수용할 수 있다.
미세 유동 구조물은, 복수의 제1 저장 챔버 각각에 연결되며 기질 용액을 수용하는 복수의 제2 저장 챔버를 포함할 수 있다.
미세 유동 구조물은, 닫힌 밸브를 통해 제1 반응 챔버와 연결되며 세척액을 수용하는 제3 저장 챔버를 포함할 수 있다. 미세 유동 구조물은, 닫힌 밸브를 통해 제3 저장 챔버와 연결되고 세척액을 수용하는 제4 저장 챔버를 포함할 수 있다.
미세 유동 구조물은, 최종 반응 챔버와 연결되며 잔류 용액을 수용하기 위한 제5 저장 챔버를 포함할 수 있다. 최종 반응 챔버와 제5 저장 챔버 사이에 하나의 닫힌 밸브와 두 개의 가역 열린 밸브 및 하나의 열린 밸브가 설치될 수 있다.
미세 유동 구조물은, 닫힌 밸브를 통해 복수의 반응 챔버 각각에 연결되며 정지 용액을 수용하는 복수의 검출 챔버를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 미세 유동장치는 플랫폼과, 플랫폼의 내부에 형성된 복수의 챔버들 및 챔버들 사이에 위치하는 밸브를 구비하는 미세 유동 구조물을 포함한다. 미세 유동 구조물은 서로 다른 종류의 표적 단백질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 포집 항체들을 종류별로 나누어 수용하는 복수의 반응 챔버를 포함한다. 복수의 반응 챔버 각각은 포집 항체들이 코팅된 비드(bead)를 수용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동장치를 이용한 다중 분석 방법은, 시료를 2종 이상 검출 항체의 혼합물을 수용하는 제1 저장 챔버로 이송하는 제1 단계와, 제1 저장 챔버 내부의 혼합물을 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 수용한 복수의 반응 챔버들로 차례로 이송하고 인큐베이션 반응을 진행하는 제2 단계와, 반응 챔버들 내부의 혼합물 중 표지 인자와 결합된 표적 물질 및 검출 항체를 제외한 불순물을 배출하는 제3 단계와, 반응 챔버들 사이를 격리시키고, 반응 챔버들로 기질 용액을 공급하는 제4 단계와, 반응 챔버들 내부의 혼합물을 검출 챔버들로 이송하고, 검출 챔버들의 흡광도를 측정하는 제5 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 미세 유동장치를 이용한 다중 분석 방법은, 시료를 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 수용한 복수의 반응 챔버들로 차례로 이송하는 제1 단계와, 복수의 반응 챔버들로 해당 표적 물질에 대응하는 검출 항체들을 이송하고 인큐베이션 반응을 진행하는 제2 단계와, 반응 챔버들 내부의 혼합물 중 표지 인자와 결합된 표적 물질 및 검출 항체를 제외한 불순물을 배출하는 제3 단계와, 반응 챔버들 사이를 격리시키고, 반응 챔버들로 기질 용액을 공급하는 제4 단계와, 반응 챔버들 내부의 혼합물을 검출 챔버들로 이송하고, 검출 챔버들의 흡광도를 측정하는 제5 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미세 유동장치를 이용한 다중 분석 방법은, 시료를 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 수용한 복수의 반응 챔버들로 차례로 이송하는 제1 단계와, 복수의 반응 챔버들로 해당 표적 물질에 대응하는 형광 또는 발광 접합 검출 항체들을 이송하고 인큐베이션 반응을 진행하는 제2 단계와, 반응 챔버들 내부의 혼합물 중 표지 인자와 결합된 표적 물질 및 검출 항체를 제외한 불순물을 배출하는 제3 단계와, 반응 챔버들의 형광 또는 발광 검출 신호를 측정하는 제4 단계를 포함한다.
본 실시예의 미세 유동장치는 하나의 시료에서 복수의 표적 물질을 동시에 검출하는 다중 분석이 가능하다. 또한, 미세 유동장치는 시료로서 혈액, 타액, 소변 등의 생체 시료 또는 수질 오염, 토양 오염 등을 분석하기 위한 물이나 토양 시료 등 다양한 시료를 사용할 수 있다. 또한, 시료를 포함한 분석에 필요한 유체들의 체적과 전체 크기를 줄이면서도 전체 분석 시간을 단축시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 미세 유동장치의 개략도이다.
도 2는 도 1에 도시한 미세 유동장치의 부분 확대도이다.
도 3은 도 2에 도시한 미세 유동장치 중 닫힌 밸브의 한가지 예를 나타낸 개략도이다.
도 4는 도 2에 도시한 미세 유동장치 중 열린 밸브의 한가지 예를 나타낸 개략도이다.
도 5는 도 2에 도시한 미세 유동장치 중 가역 열린 밸브의 한가지 예를 나타낸 개략도이다.
도 6a 내지 도 6i는 검체 분석 방법을 설명하기 위해 도시한 제1 실시예에 따른 미세 유동장치의 부분 확대도이다.
도 7은 본 발명의 제2 실시예에 따른 미세 유동장치의 개략도이다.
도 8은 본 발명의 제3 실시예에 따른 미세 유동장치의 개략도이다.
도 9a 내지 도 9c는 세가지 표적 단백질에 대해 농도별로 측정하여 얻은 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 10a 내지 도 10c는 단일 표적 단백질을 사용한 경우 측정된 흡광도와 세가지 표적 단백질을 사용한 경우 측정된 흡광도를 비교하여 얻은 농도별 상관 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 11a 내지 도 11c는 세가지 표적 단백질에 대해 농도별로 측정하여 얻은 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 12a 내지 도 12c는 세럼을 사용한 경우 측정된 흡광도와 인산염 버퍼를 사용한 경우 측정된 흡광도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 13a 내지 도 13c는 세가지 표적 단백질에 대해 농도별로 측정하여 얻은 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 2는 도 1에 도시한 미세 유동장치의 부분 확대도이다.
도 3은 도 2에 도시한 미세 유동장치 중 닫힌 밸브의 한가지 예를 나타낸 개략도이다.
도 4는 도 2에 도시한 미세 유동장치 중 열린 밸브의 한가지 예를 나타낸 개략도이다.
도 5는 도 2에 도시한 미세 유동장치 중 가역 열린 밸브의 한가지 예를 나타낸 개략도이다.
도 6a 내지 도 6i는 검체 분석 방법을 설명하기 위해 도시한 제1 실시예에 따른 미세 유동장치의 부분 확대도이다.
도 7은 본 발명의 제2 실시예에 따른 미세 유동장치의 개략도이다.
도 8은 본 발명의 제3 실시예에 따른 미세 유동장치의 개략도이다.
도 9a 내지 도 9c는 세가지 표적 단백질에 대해 농도별로 측정하여 얻은 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 10a 내지 도 10c는 단일 표적 단백질을 사용한 경우 측정된 흡광도와 세가지 표적 단백질을 사용한 경우 측정된 흡광도를 비교하여 얻은 농도별 상관 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 11a 내지 도 11c는 세가지 표적 단백질에 대해 농도별로 측정하여 얻은 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 12a 내지 도 12c는 세럼을 사용한 경우 측정된 흡광도와 인산염 버퍼를 사용한 경우 측정된 흡광도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 13a 내지 도 13c는 세가지 표적 단백질에 대해 농도별로 측정하여 얻은 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 미세 유동장치의 개략도이다.
도 1을 참고하면, 제1 실시예의 미세 유동장치(100)는 회전 가능한 디스크 형상의 플랫폼(10)과, 플랫폼(10)의 내부에 형성된 미세 유동 구조물(20)을 포함한다. 미세 유동 구조물(20)은 유체를 수용하기 위한 챔버들과, 챔버들 사이에 설치되어 유체의 흐름을 제어하는 밸브를 포함한다. 챔버들은 채널에 의해 연결되거나, 채널 없이 밸브에 의해 직접 연결될 수 있다.
플랫폼(10)은 회전 중심을 가지며, 예를 들어 디스크 모양으로 형성될 수 있다. 플랫폼(10)은 성형이 용이하고, 표면이 생물학적으로 비활성인 플라스틱 소재, 예를 들어 폴리스타이렌(polystyrene, PS), 폴리디메틸실록산(poly(demethylsiloxane), PMDS), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리실릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 및 폴리우레탄(polyurethanes) 등으로 제조될 수 있다. 또한, 플랫폼(10)은 화학적 및 생물학적 안정성과 광학적 투명성을 가지는 소재로 제조된다.
플랫폼(10)은 복수의 판, 예를 들어 상판과 하판으로 구성된다. 상판 또는 하판의 내면에는 음각 형상의 미세 유동 구조물(20)이 형성되어 유체를 수용하는 챔버와, 유체의 흐름을 제어하는 밸브를 제공한다. 상판과 하판은 접착제를 이용한 접착, 초음파 융착, 레이저 융착 등 다양한 방법으로 접합되어 미세 유동장치(100)를 구성한다.
플랫폼(10)은 복수의 영역으로 구분되며, 각 영역마다 독립적으로 작동하는 미세 유동 구조물(20)이 마련된다. 예를 들어, 플랫폼(10)은 제1 영역(A10)과 제2 영역(A20)으로 구분되고, 제1 영역(A10)과 제2 영역(A20) 각각에 시료로부터 복수의 표적 물질을 동시에 검출하기 위한 미세 유동 구조물(20)이 마련된다.
본 실시예에서 제1 영역(A10)과 제2 영역(A20)에 배치된 미세 유동 구조물은 동일한 구조를 가지므로, 아래에서는 제1 영역(A10)에 배치된 미세 유동 구조물에 대해 설명한다.
도 2는 도 1에 도시한 미세 유동장치의 부분 확대도이다.
도 2를 참고하면, 미세 유동 구조물(20)은 시료 주입구(211)와 연결된 시료 분리 챔버(210)를 포함할 수 있다. 시료 분리 챔버(210)는 액체를 포함하는 시료, 예를 들어 혈액, 타액, 소변, 강물, 및 토양 시료 등을 수용하는 공간을 제공한다.
시료 분리 챔버(210)는 플랫폼(10)의 원주 방향과 나란하게 형성된 시료 수집부(212)와, 시료 수집부(212)와 연결되며 플랫폼(10)의 반경 방향과 나란하게 형성된 침강물 수집부(213)로 구성된다. 시료 주입구(211)는 침강물 수집부(213)의 단부에 형성될 수 있으며, 시료 수집부(212)는 침강물 수집부(213)보다 플랫폼(10)의 회전 중심(C)에 더 가깝게 위치한다.
미세 유동 구조물(20)은 시료의 종류에 따라 시료 분리 챔버(210)를 생략하거나, 침강물 수집부(213)에 모인 침강액을 시료로 사용할 수도 있다.미세 유동 구조물(20)은 2종 이상 검출 항체의 혼합물을 수용하는 제1 저장 챔버(220)를 포함한다. 제1 저장 챔버(220)는 시료 수집부(212)보다 플랫폼(10)의 회전 중심(C)으로부터 더 멀리 위치한다. 검출 항체의 혼합물은 다음에 설명하는 반응 챔버(310, 320, 330)의 개수에 대응하는 종류의 검출 항체들을 포함한다. 즉, 반응 챔버(310, 320, 330)가 3개로 구비되는 경우, 제1 저장 챔버(220)는 3종의 검출 항체 혼합물을 수용한다.
검출 항체의 혼합물은 면역학적 검사를 위한 컨주게이트(conjugate) 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 미세 유동장치(100)는 심혈관 질환을 진단하기 위한 C-반응 단백질(CRP), cTnⅠ(cardiac troponin Ⅰ), NT-proBNP(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide)의 세가지 표적 단백질을 검출하기 위한 용도일 수 있다. 이 경우 제1 저장 챔버(220)는 HRP(horseradish peroxidase)가 접합된 3종의 검출 항체(anit-CRP, anti-cTnⅠ, anti-NT-proBNP) 혼합물을 수용할 수 있다.
시료 수집부(212)와 제1 저장 챔버(220) 사이에 닫힌 밸브(v1)(normally closed valve)가 위치한다. 닫힌 밸브(v1) 개방시 제1 저장 챔버(220)는 시료 수집부(212)와 연결된다. 시료 수집부(212)와 제1 저장 챔버(220) 사이에 채널이 형성될 수도 있다. 닫힌 밸브(v1)는 외부로부터 에너지를 제공받아 개방되기 전에는 유체 흐름을 차단하는 밸브이다.
도 3은 닫힌 밸브의 한가지 예를 나타낸 개략도이다.
도 3을 참고하면, 닫힌 밸브(v1)는 상온에서 고체 상태로 존재하여 유체 흐름을 차단하는 밸브 물질을 포함한다. 밸브 물질은 전자기파 흡수에 의해 온도가 올라가는 히터 물질과, 파라핀 왁스와 같이 온도에 따라 용융과 응고가 가능한 물질을 포함할 수 있다. 닫힌 밸브(v1)에 전자기파 에너지(레이저, 가시광선, 적외선 등)를 가하면 히터 물질이 파라핀 왁스를 순간적으로 녹여 닫힌 밸브(v1)는 열린 상태로 전환되고, 밸브 물질은 열린 상태로 재응고된다.
도 3에서 부호 11은 플랫폼의 상판을 나타내고, 부호 12는 플랫폼의 하판을 나타낸다.
다시 도 2를 참고하면, 미세 유동 구조물(20)은 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 내장하는 복수의 반응 챔버(310, 320, 330)를 포함한다. 복수의 반응 챔버(310, 320, 330)는 그 표면에 해당 표지 인자들이 직접 코팅된 구성으로 이루어지거나, 표지 인자들이 코팅된 비드(bead)와 같은 반응 매개체들을 수용할 수 있다.
여기서, "표적 물질"이란 시료로부터 분석하고자 하는 대상 물질로서, 예를 들면 생체를 이루는 분자 레벨의 물질 수 있다. 표적 물질은 예를 들어 단백질, 항원, 항체, 효소, 디엔에이(DNA), 알엔에이(RNA), 호르몬, 및 화학물질 등을 포함한다.
그리고 "표지 인자"는 표적 물질을 포획하기 위하여 표적 물질에 특이적으로 반응하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 표지 인자는 표적 물질과 단백질 상호작용, 항원-항체 반응, 효소-기질 반응, 또는 서열 특이적 반응 등을 일으킬 수 있다. 서로 다른 반응 챔버에 내장된 2종 이상의 표지 인자들은 서로 교차 반응성이 없는 것을 사용한다.
"교차 반응성"이란 표지 인자가 2종 이상의 표적 물질에 결합하는 반응을 할 때 그 물질에 특이적인 표적 물질과 반응하는 동시에 유사한 구조 또는 일부 동일한 구조를 가지는 물질과 반응하는 것을 의미한다. 복수의 반응 챔버(310, 320, 330)에 내장된 2종 이상의 표지 인자들은 해당 표적 물질과 특이적으로 반응하면서 상호 간에 교차 반응성이 없어야 한다.
미세 유동장치(100)가 면역혈청 검사용인 경우 포집 항체가 코팅된 비드가 사용될 수 있고, 유전자 분석용인 경우에는 해당 유전자 물질이 코팅된 비드가 사용될 수 있다. 또한, 면역혈청 검사용인 경우에도 표지 인자로서 앱타머 등 다양한 물질이 사용될 수 있다.
비드로 구성된 반응 매개체는 사용이 편리하고, 혼합 반응이 효율적이며, 다양한 종류의 표적 반응이 용이하게 일어나는 장점이 있으나, 반응 매개체는 전술한 비드로 한정되지 않으며, 반응 챔버(310, 320, 330)의 표면에 직접 표적 물질에 특이적으로 반응하는 포집 물질을 고정화하는 경우도 포함한다.
반응 챔버(310, 320, 330)의 개수는 검출하고자 하는 표적 물질의 개수와 동일하다. 반응 챔버(310, 320, 330)는 제1 반응 챔버(310)와 제2 반응 챔버(320) 및 제3 반응 챔버(330)를 포함할 수 있다. 도 2에서는 반응 챔버(310, 320, 330)가 3개로 구비된 경우를 예로 들어 도시하였으나, 반응 챔버(310, 320, 330)의 개수는 도시한 예로 한정되지 않는다.
제1 반응 챔버(310)와 제2 반응 챔버(320) 및 제3 반응 챔버(330)에는 각각 제1 표지 인자로 코팅된 제1 비드, 제2 표지 인자로 코팅된 제2 비드, 및 제3 표지 인자로 코팅된 제3 비드가 위치할 수 있다. 제1 내지 제3 비드는 플라스틱 비드, 예를 들어 폴리스타이렌(PS) 비드일 수 있으며, 마이크로미터의 크기로 형성될 수 있다.
미세 유동장치(100)가 전술한 심혈관 질환 진단을 위한 세가지 표적 단백질을 검출하기 위한 용도인 경우, 제1 표지 인자는 CRP 포집 항체일 있고, 제2 표지 인자는 cTnⅠ 포집 항체일 수 있다. 그리고 제3 표지 인자는 NT-proBNP 포집 항체일 수 있다. 표지 인자들의 종류는 전술한 예들로 한정되지 않으며, 분석하고자 하는 표적 단백질의 종류에 따라 달라진다.
복수의 반응 챔버(310, 320, 330)는 제1 저장 챔버(220)보다 플랫폼(10)의 회전 중심(C)으로부터 더 멀리 위치한다. 제1 반응 챔버(310)와 제2 반응 챔버(320) 및 제3 반응 챔버(330)의 순서대로 제1 저장 챔버(220)에 가깝게 위치할 수 있다. 제1 저장 챔버(220)와 제1 반응 챔버(310) 사이에는 닫힌 밸브(v2)가 위치한다.
복수의 반응 챔버들(310, 320, 330)은 시료가 투입되기 이전의 초기 상태에서 열린 밸브(normally open valve)에 의해 상호 연결된 상태를 유지할 수 있다. 즉, 제1 반응 챔버(310)와 제2 반응 챔버(320) 사이에 열린 밸브(v10)가 위치하고, 제2 반응 챔버(320)와 제3 반응 챔버(330) 사이에 열린 밸브(v9)가 위치할 수 있다. 열린 밸브(v10, v9)는 외부로부터 에너지를 전달받아 폐쇄되기 전에는 유체가 흐를 수 있도록 챔버들 사이를 개방하고 있는 밸브이다.
한편, 복수의 반응 챔버들(310, 320, 330)은 시료가 투입되기 이전의 초기 상태에서 닫힌 밸브에 의해 상호 독립된 상태를 유지하다가 반응 중의 일부 단계에서 서로 연결되는 구성도 가능하다. 이 경우, 반응 챔버들(310, 320, 330) 사이에는 닫힌 밸브가 위치한다.
도 4는 열린 밸브의 한가지 예를 나타낸 개략도이다.
도 4를 참고하면, 열린 밸브(v4, v6)가 설치되는 플랫폼의 내부에는 오목부(13)와 볼록부(14)가 위치하며, 오목부(13)에 밸브 물질이 채워져 챔버들 사이를 개방시킨다. 도 4에서는 오목부(13)가 플랫폼의 상판(11)에 위치하고, 볼록부(14)가 플랫폼의 하판(12)에 위치하는 경우를 도시하였으나, 그 반대의 경우도 가능하다. 오목부(13)와 볼록부(14)의 중심 위치는 서로 일치하지 않고 어긋날 수 있다.
밸브 물질은 전술한 닫힌 밸브에서 설명한 밸브 물질과 같은 물질일 수 있다. 열린 밸브(v4, v6)의 오목부(13)로 전자기파 에너지를 가하면 밸브 물질이 녹아 내리면서 오목부(13)에서 볼록부(14) 위로 이동하여 챔버들 사이를 폐쇄시킨다. 밸브 물질은 닫힌 상태에서 재응고된다.
다시 도 2를 참고하면, 미세 유동 구조물(20)은 각각의 반응 챔버(310, 320, 330)와 연결되며 기질 용액(substrate solution)을 수용하는 복수의 제2 저장 챔버(231, 232, 233)를 포함한다. 제2 저장 챔버(231, 232, 233) 각각은 자신과 연결된 반응 챔버(310, 320, 330)보다 플랫폼(10)의 회전 중심(C)에 더 가깝게 위치한다.
기질 용액은 컨주게이트 반응의 결과물과 기질 반응을 하여 소정의 색상을 발현시키는 기능을 하며, 기질 반응에 의해 표적 물질의 양에 대응하는 색상으로 발색이 일어난다.
제1 반응 챔버(310)와 해당 제2 저장 챔버(231) 사이에 닫힌 밸브(v11)가 위치하고, 제2 반응 챔버(320)와 해당 제2 저장 챔버(232) 사이에 닫힌 밸브(v12)가 위치한다. 그리고 제3 반응 챔버(330)와 해당 제2 저장 챔버(233) 사이에 닫힌 밸브(v13)가 위치한다. 복수의 반응 챔버(310, 320, 330)와 해당 제2 저장 챔버(231, 232, 233) 사이에 채널이 형성될 수도 있다.
미세 유동 구조물(20)은 제1 반응 챔버(310)와 연결되며 세척액을 수용하는 제3 저장 챔버(240)와, 제3 저장 챔버(240)와 연결되며 세척액을 수용하는 제4 저장 챔버(250)를 포함한다. 세척액은 표적 물질과 표지 인자의 반응 후 잔류물을 세척하기 위한 용액이다. 2회 이상의 세척이 필요한 경우에는 본 실시예와 같이 세척액을 수용하는 챔버(240, 250)를 2개로 구비하여 반응 챔버들(310, 320, 330)의 세척 작업을 두 번 반복할 수 있다.
제3 저장 챔버(240)와 제1 반응 챔버(310) 사이에 닫힌 밸브(v5)가 위치하고, 제4 저장 챔버(250)와 제3 저장 챔버(240) 사이에 닫힌 밸브(v7)가 위치한다. 제3 저장 챔버(240)와 제4 저장 챔버(250)는 제1 반응 챔버(310)보다 플랫폼(10)의 회전 중심(C)에 더 가깝게 위치한다. 제1 저장 챔버(220)와 제3 저장 챔버(240) 및 제4 저장 챔버(250)는 플랫폼(10)의 원주 방향(회전 방향)을 따라 나란히 위치할 수 있다.
미세 유동 구조물(20)은 제3 반응 챔버(330)와 연결되며 반응 챔버들(310, 320, 330)로부터 폐기되는 잔류 용액을 수용하기 위한 제5 저장 챔버(260)를 포함한다. 제5 저장 챔버(260)는 최초 제조시 비어 있으며, 시료, 검출 항체의 혼합물, 기질 용액, 및 세척액의 전체 용량에 대응하는 내부 용적을 갖도록 형성된다. 제5 저장 챔버(260)는 제3 반응 챔버(330)보다 플랫폼(10)의 회전 중심(C)으로부터 더 멀리 위치하며, 플랫폼(10)의 가장 바깥에 위치할 수 있다.
제3 반응 챔버(330)와 제5 저장 챔버(260) 사이에는 하나의 닫힌 밸브(v3)와 두 개의 가역(reversible) 열린 밸브(v4, v6) 및 하나의 열린 밸브(v8)가 위치한다. 닫힌 밸브(v3)가 제5 저장 챔버(260)와 가깝게 위치하고, 열린 밸브(v8)가 제3 반응 챔버(330)와 가깝게 위치한다. 그리고 닫힌 밸브(v3)와 열린 밸브(v8) 사이에 두 개의 가역 열린 밸브(v4, v6)가 위치한다.
여기서, '가역 열린 밸브'는 열린 상태와 닫힌 상태가 여러번 반복되는 것이 아닌 열린 상태에서 닫힌 상태로 전환 후 다시 열린 상태로 전환되면 다시 닫힌 상태로 전환될 수 없는 밸브를 의미한다. 즉, 가열 열린 밸브는 한 번의 가역적인 열린 상태 변환이 가능한 밸브를 의미한다. 본 실시예에서는 한 번의 가역적인 상태 변환이 가능한 밸브를 사용하였으나, 수 회 가역적인 상태 변환이 가능한 밸브를 사용할 수도 있다.
도 5는 가역 열린 밸브의 한가지 예를 나타낸 개략도이다.
도 5를 참고하면, 가역 열린 밸브(v4, v6)가 설치되는 플랫폼의 내부에는 오목부(13)와 볼록부(14)가 위치하며, 오목부(13)에 밸브 물질이 채워져 챔버들 사이를 개방시킨다. 밸브 물질은 전술한 열린 밸브에서 설명한 밸브 물질과 같은 물질일 수 있다. 오목부(13)로 전자기파 에너지를 가하면 밸브 물질이 녹아 내리면서 오목부(13)에서 볼록부(14) 위로 이동 후 굳어 챔버들 사이를 폐쇄시키는 과정까지는 전술한 열린 밸브와 동일하다.
가역 열린 밸브에서는 볼록부(14) 위에서 응고된 밸브 물질에 다시 전자기파 에너지를 가한다. 그러면 밸브 물질이 다시 녹아 볼록부(14)의 측면을 타고 흘러 내리면서 챔버들 사이를 다시 개방시키고, 밸브 물질은 열린 상태로 재응고된다. 따라서 가역 열린 밸브(v4, v6)는 열린 상태와 닫힌 상태를 거친 후 다시 열린 상태로 복귀하는 특성을 나타낸다.
다시 도 2를 참고하면, 미세 유동 구조물(20)은 각각의 반응 챔버(310, 320, 330)와 연결되며 최종 반응물을 수용하는 복수의 검출 챔버(271, 272, 273)를 포함한다. 검출 챔버(271, 272, 273)는 흡광도 측정이 이루어지는 챔버로서, 흡광도 측정을 통해 검체인 표적 물질의 농도를 산출할 수 있다. 복수의 검출 챔버(271, 272, 273)에는 기질 반응을 정지시키는 정지 용액(stop solution)이 미리 수용되어 있다.
검출 챔버(271, 272, 273) 각각은 자신과 연결된 반응 챔버(310, 320, 330)보다 플랫폼(10)의 회전 중심(C)으로부터 더 멀리 위치한다. 검출 챔버들(271, 272, 273)은 제5 저장 챔버(260)와 플랫폼(10)의 원주 방향(회전 방향)을 따라 나란히 위치할 수 있다.
제1 반응 챔버(310)와 제1 검출 챔버(271) 사이에 닫힌 밸브(v14)가 위치하고, 제2 반응 챔버(320)와 제2 검출 챔버(272) 사이에 닫힌 밸브(v15)가 위치한다. 그리고 제3 반응 챔버(330)와 제3 검출 챔버(273) 사이에 닫힌 밸브(v16)가 위치한다.
도 2에서 검은색의 작은 원은 닫힌 밸브를 나타내고, 검은색의 큰 원은 열린 밸브를 나타내며, 고리 모양은 가역 열린 밸브를 나타낸다.
본 실시예의 미세 유동장치(100)는 제1 저장 챔버(220)에 2종 이상 검출 항체의 혼합물을 수용하고, 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 복수의 반응 챔버들(310, 320, 330)에 내장한다. 이때 반응 챔버들(310, 320, 330)은 열린 밸브(v10, v9)에 의해 상호 일렬로 연결된다.
이로써 한번의 원심력 작용에 의해 제1 저장 챔버(220)에 수용된 검출 항체의 혼합물을 반응 챔버들(310, 320, 330)로 빠른 시간에 이송할 수 있다. 본 실시예의 미세 유동장치(100)는 하나의 시료로부터 반응 챔버(310, 320, 330)의 개수에 대응하는 복수의 표적 물질을 동시에 검출하는 다중 분석이 가능하며, 전체 반응 시간을 단축시킬 수 있다.
특히 미세 유동장치(100)가 같은 구조로 이루어진 복수의 영역, 예를 들어 제1 영역(A10)과 제2 영역(A20)을 포함함에 따라, 서로 다른 두 개의 시료로부터 반응 챔버(310, 320, 330)의 개수에 대응하는 표적 물질, 예를 들어 6개의 표적 물질을 동시에 검출할 수 있다. 이러한 미세 유동장치(100)는 적은양의 시료와 세척액(예를 들어, 200μL의 시료와 700μL의 세척액)을 사용하며, 전체 반응 시간을 20분 이내로 단축할 수 있다.
다음으로, 도 6a 내지 도 6i를 참조하여 전술한 미세 유동장치를 이용한 표적 물질 분석 방법에 대해 자세하게 설명한다.
도 6a를 참고하면, 시료 주입구(211)를 통해 시료 분리 챔버(210)에 유체 상태의 시료를 주입하고, 플랫폼(10)을 고속으로 회전시켜 원심력을 발생시킨다. 원심력에 의해 시료 중 무거운 침강물은 침강물 수집부(213)로 이동하고, 나머지 성분이 시료 수집부(212)로 이동하여 상호 분리된다.
제1 저장 챔버(220)는 닫힌 밸브(v1)에 의해 시료 분리 챔버(210)와 격리되어 있으며, 제1 저장 챔버(220)에는 3종의 검출 항체 혼합물이 미리 수용되어 있다.
도 6b를 참고하면, 닫힌 밸브(v1)에 전자기파 에너지를 가하여 닫힌 밸브(v1)를 개방시키고, 플랫폼(10)을 회전시켜 원심력을 발생시킨다. 그러면 침강물이 제거된 시료가 제1 저장 챔버(220)로 이송되어 3종의 검출 항체 혼합물과 혼합된다.
도 6c를 참고하면, 닫힌 밸브(v2)에 전자기파 에너지를 가하여 닫힌 밸브(v2)를 개방시키고, 플랫폼(10)을 회전시켜 원심력을 발생시킨다. 제1 저장 챔버(220)의 혼합물은 원심력에 의해 제1 반응 챔버(310)와 제2 반응 챔버(320) 및 제3 반응(330) 챔버의 순서대로 이송되어 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330) 모두를 채운다.
이때 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330)는 열린 밸브(v10, v9)에 의해 상호 연결되어 있으므로, 한번의 원심력 작용에 의해 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330) 모두에 혼합물을 빠르게 이송할 수 있다. 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330)에서 대략 10분간 인큐베이션 반응이 진행된다. 인큐베이션 반응은 표지 인자, 표지 인자에 대응하는 검체, 및 검출 항체 사이의 결합 반응을 의미한다.
도 6d를 참고하면, 닫힌 밸브(v3)에 에너지를 가하여 닫힌 밸브(v3)를 개방시키고, 플랫폼(10)을 회전시켜 원심력을 발생시킨다. 그러면 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330)에서 표지 인자와 반응한 검체 및 검출 항체를 제외한 불순물은 제5 저장 챔버(260)(도 2 참조)로 이송되어 제5 저장 챔버(260)에 수용된다. 불순물 배출 후 가역 열린 밸브(v4)에 전자기파 에너지를 가하여 이를 닫힌 상태로 전환한다.
도 6e를 참고하면, 닫힌 밸브(v5)에 에너지를 가하여 닫힌 밸브(v5)를 개방시키고, 플랫폼(10)을 회전시켜 원심력을 발생시킨다. 원심력에 의해 제3 저장 챔버(240)에 수용된 세척액은 제1 반응 챔버(310)와 제2 반응 챔버(320) 및 제3 반응 챔버(330)의 순서대로 이송되어 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330) 모두를 채운다.
세척액을 이용하여 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330)의 반응 매개체를 세정한 다음 가역 열린 밸브(v4)를 다시 열린 상태로 전환시킨다. 이어서 플랫폼(10)을 회전시켜 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330) 내부의 세척액과 반응 불순물을 제5 저장 챔버(260)(도 2 참조)로 배출한다. 그리고 가역 열린 밸브(v6)에 전자기파 에너지를 가하여 이를 닫힌 상태로 전환한다.
도 6f를 참고하면, 닫힌 밸브(v7)에 에너지를 가하여 닫힌 밸브(v7)를 개방시키고, 플랫폼(10)을 회전시켜 원심력을 발생시킨다. 원심력에 의해 제4 저장 챔버(250)에 수용된 세척액은 제3 저장 챔버(240), 제1 반응 챔버(310), 제2 반응 챔버(320), 및 제3 반응 챔버(330)의 순서대로 이송되어 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330)를 모두 채운다.
도 6g를 참고하면, 세척액을 이용하여 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330)의 반응 매개체를 2차 세정한 다음 가역 열린 밸브(v6)를 다시 열린 상태로 전환시킨다. 그리고 플랫폼(10)을 회전시켜 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330) 내부의 세척액과 반응 불순물을 제5 저장 챔버(260)(도 2 참조)로 배출한 다음 열린 밸브(v8)에 에너지를 가하여 열린 밸브(v8)를 닫는다. 2차에 걸친 세정 과정에 의해 검출 정밀도를 높일 수 있다.
도 6h를 참고하면, 열린 밸브(v10)와 열린 밸브(v9)에 에너지를 가하여 이들 밸브(v10, v9)를 닫힌 상태로 전환함으로써 복수의 반응 챔버들(310, 320, 330)을 상호 격리시킨다.
이후 닫힌 밸브(v11)와 닫힌 밸브(v12) 및 닫힌 밸브(v13)에 에너지를 가하여 이들 밸브(v11, v12, v13)를 개방시킨다. 그리고 플랫폼(10)을 회전시켜 원심력을 가한다. 원심력에 의해 제2 저장 챔버들(231, 232, 233)에 미리 수용된 기질 용액이 제1 내지 제3 반응 챔버들(310, 320, 330)로 각각 이송된다.
제1 내지 제3 반응 챔버들(310, 320, 330)로 이송된 기질 용액은 각 반응 챔버(310, 320, 330) 내의 표지 인자와 표적 물질 반응의 결과물과 혼합되며, 기질 반응에 의해 각 반응 챔버(310, 320, 330) 내의 혼합물은 검체(표적 물질)의 양에 대응하는 색상으로 발색된다.
도 6i를 참고하면, 닫힌 밸브(v14)와 닫힌 밸브(v15) 및 닫힌 밸브(v16)에 에너지를 가하여 이들 밸브(v14, v15, v16)를 개방시키고, 플랫폼(10)을 회전시켜 원심력을 가한다. 원심력에 의해 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330) 내부의 혼합물은 정지 용액이 미리 수용된 복수의 검출 챔버(271, 272, 273)로 각각 이송된다. 정지 용액은 제1 내지 제3 반응 챔버(310, 320, 330)로부터 이송된 혼합물과 혼합되어 기질 반응을 종료시킨다.
이어서 발광 다이오드 및 포토 다이오드를 내장한 측정 장치(도시하지 않음)를 이용하여 검출 챔버들(271, 272, 273)의 흡광도를 측정한다. 측정 장치는 데이터 저장 및 연산 기능을 갖춘 제어부와, 표시부를 포함한다. 제어부는 기준 흡광도를 미리 저장하고 있으며, 측정된 흡광도와 기준 흡광도를 비교 연산하여 검출 챔버들(271, 272, 273) 각각에 대한 검체 농도를 산출하고, 검체 농도에 관련된 정보를 표시부로 출력한다.
도 7은 본 발명의 제2 실시예에 따른 미세 유동장치의 개략도이다.
도 7을 참고하면, 제2 실시예의 미세 유동장치(200)는 2종 이상 검출 항체들을 종류별로 나누어 수용하는 복수의 제1 저장 챔버(221, 222, 223)가 복수의 반응 챔버(310, 320, 330) 각각에 대해 설치되는 것을 제외하고 전술한 제1 실시예의 미세 유동장치와 동일한 구성으로 이루어진다.
제1 저장 챔버(221, 222, 223)는 기질 용액을 수용하는 제2 저장 챔버(231, 232, 233)와 각 반응 챔버(310, 320, 330) 사이에 설치된다. 제2 저장 챔버(231, 232, 233)와 제1 저장 챔버(221, 222, 223) 사이, 및 제1 저장 챔버(221, 222, 223)와 해당 반응 챔버(310, 320, 330) 사이에는 닫힌 밸브가 설치된다.
제2 실시예의 미세 유동장치(200)에서는 침강물이 분리된 시료를 복수의 반응 챔버들(310, 320, 330)로 차례로 이송하고, 복수의 반응 챔버들(310, 320, 330)로 복수의 제1 저장 챔버(221, 222, 223)에 미리 수용된 해당 표적 물질에 대응하는 검출 항체들을 이송하여 인큐베이션 반응을 진행한다.
그리고 반응 챔버들(310, 320, 330) 내부의 혼합물 중 표지 인자와 결합된 표적 물질 및 검출 항체를 제외한 불순물을 배출하고, 반응 챔버들(310, 320, 330) 사이를 격리시킨 후 반응 챔버들(310, 320, 330)로 복수의 제2 저장 챔버(231, 232, 233)에 미리 수용된 기질 용액을 공급한다. 이어서 반응 챔버들(310, 320, 330) 내부의 혼합물을 검출 챔버들(271, 272, 273)로 이송하고, 검출 챔버들(271, 272, 273)의 흡광도를 측정함으로써 다중 분석을 실시할 수 있다.
도 8은 본 발명의 제3 실시예에 따른 미세 유동장치의 개략도이다.
도 8을 참고하면, 제3 실시예의 미세 유동장치(300)는 제1 실시예의 제2 저장 챔버들과 검출 챔버들이 생략됨과 더불어 형광 또는 발광 접합 검출 항체를 수용한 복수의 제1 저장 챔버(221, 222, 223)가 복수의 반응 챔버(310, 320, 330) 각각에 대해 설치되는 것을 제외하고 전술한 제1 실시예의 미세 유동장치와 동일한 구성으로 이루어진다.
제3 실시예에서 제1 저장 챔버(221, 222, 223)에 수용된 검출 항체는 제1 실시예의 HRP(horseradish peroxidase) 대신 형광 물질 또는 발광 물질이 접합되어 있다. 이 경우 기질 용액을 저장한 제2 저장 챔버들 및 정지 용액을 저장한 검출 챔버들을 구비하지 않고도 반응 챔버(310, 320, 330)에서 직접 표적 물질을 검출할 수 있다.
제1 실시예에서는 하나의 제1 저장 챔버(220)에 2종 이상 검출 항체의 혼합물을 수용하였으나, 제3 실시예에서는 복수의 제1 저장 챔버(221, 222, 223)에 2종 이상 검출 항체들을 종류별로 나누어 따로 수용하며, 각각의 검출 항체들은 해당 반응 챔버(310, 320, 330)로 이송되어 반응에 사용된다. 제1 저장 챔버(221, 222, 223)와 해당 반응 챔버(310, 320, 330) 사이에는 닫힌 밸브가 설치된다.
제3 실시예의 미세 유동장치(300)에서는 침강물이 분리된 시료를 복수의 반응 챔버들(310, 320, 330)로 차례로 이송하고, 복수의 반응 챔버들(310, 320, 330)로 복수의 제1 저장 챔버(221, 222, 223)에 미리 저장된 해당 표적 물질에 대응하는 형광 또는 발광 접합 검출 항체들을 이송하여 인큐베이션 반응을 진행한다.
그리고 반응 챔버들(310, 320, 330) 내부의 혼합물 중 표지 인자와 결합된 표적 물질 및 검출 항체를 제외한 불순물을 배출한 다음 반응 챔버들(310, 320, 330)의 형광 또는 발광 검출 신호를 측정함으로써 다중 분석을 실시할 수 있다.
다음으로, 전술한 미세 유동장치를 이용한 다중 분석 방법 중 면역학적 검사 결과에 대해 설명한다.
< 표적 단백질의 농도별 표준 곡선 >
전술한 미세 유동장치를 이용하여 CRP, cTnⅠ, NT-proBNP 세가지 표적 단백질에 대한 농도별 면역학적 검사를 수행하였다. 각 표적 단백질의 농도는 0, 1, 5, 10, 25, 50, 100ng/mL이 사용되었고, 표적 단백질을 일체 포함하지 않은 타액 샘플에 정량의 표적 단백질을 전술한 농도별로 넣어 사용하였다.
도 9a 내지 도 9c는 세가지 표적 단백질에 대해 농도별로 측정하여 얻은 표준 곡선을 나타낸 그래프이다. 도 9a 내지 도 9c에서 그래프 내 작은 그래프는 동적 범위(dynamic range)를 나타낸다. 표준 곡선을 평가한 결과 동적 범위는 CRP, cTnⅠ, NT-proBNP 모두 0 내지 25ng/mL이고, 검출 한계(limit of detection, LOD)는 CRP 0.05ng/mL, cTnⅠ0.19ng/mL, NT-proBNP 0.26ng/mL로 측정되었다.
< 단일 표적 단백질 검사 >
미세 유동장치의 검사 성능을 평가하기 위하여 한 종류의 표적 단백질을 3개의 반응 챔버에서 분석이 이루어지도록 실험하였다. 즉, 한 종류의 표적 단백질에 대한 포집 항체가 고정된 비드를 3개의 반응 챔버에 동일하게 배치하고, 한 종류의 표적 단백질과 검출 항체만을 사용하여 검사를 수행하였다.
하기 표 1에 표적 단백질의 농도별 제1 반응 챔버와 제2 반응 챔버 및 제3 반응 챔버에서 측정된 흡광도와 정밀도(CV%)를 나타내었다.
표 1을 참고하면, 3개의 반응 챔버에서 측정된 흡광도는 서로 유사한 값을 나타내고, 정밀도는 모두 10% 미만의 값을 보이고 있다. 이러한 결과로부터 본 실시예의 미세 유동장치에서 유체가 3개의 반응 챔버를 순서대로 거쳐 흐르는 구조는 검사 성능에 거의 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있다.
< 다중 표적 단백질 검사 >
CRP, cTnⅠ, NT-proBNP 세 종류의 표적 단백질을 모두 포함하여 면역학적 검사를 수행하였다. 제1 반응 챔버와 제2 반응 챔버 및 제3 반응 챔버에는 각각 CRP 포집 항체로 코팅된 비드, cTnⅠ 포집 항체로 코팅된 비드, NT-proBNP 포집 항체로 코팅된 비드가 위치한다. 시료에는 각 농도별 CRP, cTnⅠ, NT-proBNP을 혼합하여 사용하였고, 검출 항체 또한 세 종류의 검출 항체를 혼합하여 사용하였다.
도 10a 내지 도 10c는 단일 표적 단백질을 사용한 경우 측정된 흡광도(제1 흡광도)와 세가지 표적 단백질을 사용한 경우 측정된 흡광도(제2 흡광도)를 비교하여 얻은 농도별 상관 곡선(correlation curve)을 나타낸 그래프이다.
도 10a 내지 도 10c에서 세 종류의 표적 단백질에 대한 상관 곡선을 살펴보면 결정계수(R-square) 값이 모두 0.95 이상을 나타내고 있다. 이를 통해 단일 표적 단백질을 사용한 경우와 세 종류의 단일 표적 단백질을 사용한 경우의 측정값이 매우 유사하다는 것을 확인할 수 있다. 그 결과, 세 종류의 표적 단백질에 대해 포집 항체와 표적 단백질 및 검출 항체간의 상호 간섭이 일어나지 않으며, 분석 결과에도 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있다.
< 형광 검출 방법을 이용한 면역학적 검사 수행 결과 >
타액에 존재하는 표적 단백질은 혈액에 존재하는 양보다 대략 1/100배 내지 1/1,000배 이하로 존재한다. 따라서 타액에 존재하는 매우 낮은 농도의 표적 단백질을 검출하기 위해서는 민감도가 매우 높은 검출 방법이 요구된다. 기질 용액으로 화학형광성(chemifluorescent) HRP 용액을 사용하여 실험하였다.
도 11a 내지 도 11c는 세가지 표적 단백질에 대해 농도별로 측정하여 얻은 표준 곡선을 나타낸 그래프이다. 도 11a 내지 도 11c에서 표준 곡선을 평가한 결과 동적 범위는 CRP 1 내지 10ng/mL, cTnⅠ 1 내지 50ng/mL, NT-proBNP 1 내지 50ng/mL이고, 검출 한계(LOD)는 CRP 7pg/mL, cTnⅠ 0.02ng/mL, NT-proBNP 0.02ng/mL이다. 전술한 흡광 검출 방법의 경우보다 형광 검출 방법을 이용한 경우 민감도가 10배 정도 우수한 것을 확인할 수 있다.
< 세럼-베이스 면역학적 검사 >
본 실시예의 미세 유동장치는 타액뿐만 아니라 혈액을 사용한 검사 방법에도 적용된다. 혈액이 면역학적 검사를 위한 항체의 활성에 영향을 주는지 여부를 확인하기 위해 타겟-프리 세럼(Fetal Bovine Serum-Charcoal Stripped, GeneTex, USA)을 이용하여 검사 성능을 평가하였다. 타겟-프리 세럼에 정량의 표적 단백질을 농도별로 다르게 넣어 사용하였다.
도 12a 내지 도 12c는 세럼을 사용한 경우 측정된 흡광도와 인산염 버퍼를 사용한 경우 측정된 흡광도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 12a 내지 도 12c를 참고하면, CRP의 경우 전체 농도 범위에서 세럼을 사용한 경우가 인산염 버퍼를 사용한 경우보다 높은 흡광도를 나타낸다. cTnⅠ의 경우 낮은 농도 범위에서 세럼을 사용한 경우가 인산염 버퍼를 사용한 경우보다 높은 흡광도를 나타낸다. NT-proBNP의 경우 낮은 농도 범위에서는 세럼을 사용한 경우가 인산염 버퍼를 사용한 경우와 거의 유사한 흡광도를 보이는 반면, 높은 농도 범위에서는 세럼을 사용한 경우가 더 높은 흡광도를 나타낸다.
이와 같이 표적 단백질에 따라 양상의 차이는 있지만 전체적으로 세럼을 사용한 경우가 인산염 버퍼를 사용한 경우보다 검출 신호가 더 높은 것을 확인할 수 있다.
< 미세 유동장치를 이용한 세럼-베이스 면역학적 검사 >
본 실시예의 미세 유동장치에서 세럼을 사용하여 면역학적 검사를 수행하였다. 세가지 표적 단백질의 농도는 0, 1, 5, 10, 25, 50, 100ng/mL로 설정하였다
도 13a 내지 도 13c는 세가지 표적 단백질에 대해 농도별로 측정하여 얻은 표준 곡선을 나타낸 그래프이다. 도 13a 내지 도 13c에서 세럼을 사용한 경우, 인산염 버퍼 또는 타액을 사용한 경우보다 같은 농도에서 검출 신호가 훨씬 높게 나타난 것을 확인할 수 있다. 표준 곡선을 평가한 결과 동적 범위는 CRP 0 내지 10ng/mL, cTnⅠ 0 내지 25ng/mL, NT-proBNP 0 내지 25ng/mL이고, 검출 한계는 CRP 0.02ng/mL, cTnⅠ 0.8ng/mL, NT-proBNP 0.8ng/mL로 측정되었다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 특허청구범위와 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.
100: 미세 유동장치 10: 플랫폼
11: 상판 12: 하판
13: 오목부 14: 볼록부
20: 미세 유동 구조물 210: 시료 분리 챔버
220: 제1 저장 챔버 231, 232, 233: 제2 저장 챔버
240: 제3 저장 챔버 250: 제4 저장 챔버
260: 제5 저장 챔버 271, 272, 273: 검출 챔버
310: 제1 반응 챔버 320: 제2 반응 챔버
330: 제3 반응 챔버 v1~v16: 밸브
11: 상판 12: 하판
13: 오목부 14: 볼록부
20: 미세 유동 구조물 210: 시료 분리 챔버
220: 제1 저장 챔버 231, 232, 233: 제2 저장 챔버
240: 제3 저장 챔버 250: 제4 저장 챔버
260: 제5 저장 챔버 271, 272, 273: 검출 챔버
310: 제1 반응 챔버 320: 제2 반응 챔버
330: 제3 반응 챔버 v1~v16: 밸브
Claims (24)
- 플랫폼과, 상기 플랫폼의 내부에 형성된 복수의 챔버들 및 상기 챔버들 사이에 위치하는 밸브를 구비하는 미세 유동 구조물을 포함하고,
상기 미세 유동 구조물은,
서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 수용하며, 시료를 순차적으로 제공받는 복수의 반응 챔버
를 포함하는 미세 유동장치. - 제1항에 있어서,
상기 복수의 반응 챔버 각각은 상기 표지 인자들이 코팅된 반응 매개체를 수용하는 미세 유동장치. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 복수의 반응 챔버는 반응 중의 일부 단계에서 상호 연결되거나 상호 격리되는 미세 유동장치. - 제1항에 있어서,
상기 플랫폼은 복수의 영역으로 구분되고,
상기 미세 유동 구조물은 상기 복수의 영역 각각에 구비되어 독립적으로 작동하는 미세 유동장치. - 제1항에 있어서,상기 미세 유동 구조물은 시료 분리 챔버를 포함하며,
상기 시료 분리 챔버는,
상기 플랫폼의 원주 방향과 나란하게 형성된 시료 수집부; 및
상기 시료 수집부와 연결되며, 상기 플랫폼의 반경 방향과 나란하게 형성된 침강물 수집부를 포함하는 미세 유동장치. - 제1항에 있어서,
상기 복수의 반응 챔버는 시료를 가장 먼저 제공받는 제1 반응 챔버와, 시료를 가장 나중에 제공받는 최종 반응 챔버를 포함하는 미세 유동장치. - 제6항에 있어서,
상기 미세 유동 구조물은,
상기 제1 반응 챔버의 앞쪽에 위치하며, 2종 이상 검출 항체의 혼합물을 수용하는 제1 저장 챔버를 포함하는 미세 유동장치. - 제7항에 있어서,
상기 제1 저장 챔버는 닫힌 밸브를 통해 상기 제1 반응 챔버와 연결되고,
상기 복수의 반응 챔버는 상기 제1 저장 챔버보다 상기 플랫폼의 회전 중심으로부터 더 멀리 위치하는 미세 유동장치. - 제8항에 있어서,
상기 복수의 반응 챔버는 열린 밸브를 통해 상호 연결되어 상기 제1 저장 챔버로부터 검출 항체의 혼합물을 차례로 제공받는 미세 유동장치. - 제9항에 있어서,
상기 미세 유동 구조물은,
닫힌 밸브를 통해 상기 복수의 반응 챔버 각각에 연결되며, 기질 용액을 수용하는 복수의 제2 저장 챔버를 포함하는 미세 유동장치. - 제10항에 있어서,
상기 복수의 반응 챔버는 표적 물질과 표지 인자의 결합 반응이 일어난 후 상기 열린 밸브의 닫힘에 의해 상호 격리되고, 상기 복수의 제2 저장 챔버로부터 기질 용액을 제공받는 미세 유동장치. - 제6항에 있어서,
상기 미세 유동 구조물은,
상기 복수의 반응 챔버 각각에 연결되며, 2종 이상 검출 항체들을 종류별로 나누어 수용하는 복수의 제1 저장 챔버를 포함하는 미세 유동장치. - 제12항에 있어서,
상기 복수의 제1 저장 챔버는 형광 물질과 발광 물질 중 적어도 하나가 접합된 검출 항체들을 수용하는 미세 유동장치. - 제12항에 있어서,
상기 미세 유동 구조물은,
상기 복수의 제1 저장 챔버 각각에 연결되며, 기질 용액을 수용하는 복수의 제2 저장 챔버를 포함하는 미세 유동장치. - 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미세 유동 구조물은,
닫힌 밸브를 통해 상기 제1 반응 챔버와 연결되며, 세척액을 수용하는 제3 저장 챔버를 포함하는 미세 유동장치. - 제15항에 있어서,
상기 미세 유동 구조물은,
닫힌 밸브를 통해 상기 제3 저장 챔버와 연결되고, 세척액을 수용하는 제4 저장 챔버를 포함하는 미세 유동장치. - 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미세 유동 구조물은,
상기 최종 반응 챔버와 연결되며, 잔류 용액을 수용하기 위한 제5 저장 챔버를 포함하는 미세 유동장치. - 제17항에 있어서,
상기 최종 반응 챔버와 상기 제5 저장 챔버 사이에 하나의 닫힌 밸브와 두 개의 가역 열린 밸브 및 하나의 열린 밸브가 설치되는 미세 유동장치. - 제6항 내지 제12항, 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미세 유동 구조물은,
닫힌 밸브를 통해 상기 복수의 반응 챔버 각각에 연결되며, 정지 용액을 수용하는 복수의 검출 챔버를 포함하는 미세 유동장치. - 플랫폼과, 상기 플랫폼의 내부에 형성된 복수의 챔버들 및 상기 챔버들 사이에 위치하는 밸브를 구비하는 미세 유동 구조물을 포함하고,
상기 미세 유동 구조물은,
서로 다른 종류의 표적 단백질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 포집 항체들을 종류별로 나누어 수용하며, 시료를 순차적으로 제공받는 복수의 반응 챔버
를 포함하는 미세 유동장치. - 제20항에 있어서,
상기 복수의 반응 챔버 각각은 상기 포집 항체들이 코팅된 비드(bead)를 수용하는 미세 유동장치. - 시료를 2종 이상 검출 항체의 혼합물을 수용하는 제1 저장 챔버로 이송하는 제1 단계;
상기 제1 저장 챔버 내부의 혼합물을 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 수용한 복수의 반응 챔버들로 차례로 이송하고 인큐베이션 반응을 진행하는 제2 단계;
상기 반응 챔버들 내부의 혼합물 중 표지 인자와 결합된 표적 물질 및 검출 항체를 제외한 불순물을 배출하는 제3 단계;
상기 반응 챔버들 사이를 격리시키고, 상기 반응 챔버들로 기질 용액을 공급하는 제4 단계; 및
상기 반응 챔버들 내부의 혼합물을 검출 챔버들로 이송하고, 상기 검출 챔버들의 흡광도를 측정하는 제5 단계
를 포함하는 미세 유동장치를 이용한 다중 분석 방법. - 시료를 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 수용한 복수의 반응 챔버들로 차례로 이송하는 제1 단계;
상기 복수의 반응 챔버들로 해당 표적 물질에 대응하는 검출 항체들을 이송하고 인큐베이션 반응을 진행하는 제2 단계;
상기 반응 챔버들 내부의 혼합물 중 표지 인자와 결합된 표적 물질 및 검출 항체를 제외한 불순물을 배출하는 제3 단계;
상기 반응 챔버들 사이를 격리시키고, 상기 반응 챔버들로 기질 용액을 공급하는 제4 단계; 및
상기 반응 챔버들 내부의 혼합물을 검출 챔버들로 이송하고, 상기 검출 챔버들의 흡광도를 측정하는 제5 단계
를 포함하는 미세 유동장치를 이용한 다중 분석 방법. - 시료를 서로 다른 종류의 표적 물질에 특이적으로 반응하는 2종 이상의 표지 인자들을 종류별로 나누어 수용한 복수의 반응 챔버들로 차례로 이송하는 제1 단계;
상기 복수의 반응 챔버들로 해당 표적 물질에 대응하는 형광 또는 발광 접합 검출 항체들을 이송하고 인큐베이션 반응을 진행하는 제2 단계;
상기 반응 챔버들 내부의 혼합물 중 표지 인자와 결합된 표적 물질 및 검출 항체를 제외한 불순물을 배출하는 제3 단계; 및
상기 반응 챔버들의 형광 또는 발광 검출 신호를 측정하는 제4 단계를 포함하는 미세 유동장치를 이용한 다중 분석 방법.
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