CN117463421B - 一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片,所述微通道左端与盖片上开设的缓冲液加样孔连通,右端与第二废液区连通,所述第二废液区控制微通道内液体向第二废液区的流动,所述微通道从左到右依次设置有标记区、检测区、样本加样区,所述标记区与检测区之间设置有第一废液区,所述检测区上设置有第一检测位点、第二检测位点、共用参考点,所述标记区包被有标记抗原和标记抗体,所述第一检测位点设置有第一捕获抗体,所述第二检测位点设置有第二捕获抗体,所述标记抗原与靶分析物竞争结合第一捕获抗体,所述标记抗体、第二捕获抗体与靶分析物结合形成双抗体夹心复合物。可以提升竞争法的分析敏感度,有效克服双抗体夹心法中存在的HOOK效应。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断及免疫检测技术领域,特别涉及一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片及其应用。
背景技术
标记免疫分析是用示踪物质标记抗原或抗体,结合抗原-抗体特异性结合的特性,所建立的一种定性或定量的检测方法。按照分析原理不同,标记免疫分析分为竞争性免疫分析和非竞争性免疫分析两类,前者一般用于检测小分子抗原或半抗原,后者常用于检测大分子抗原。
侧向流免疫微流控芯片是将抗原-抗体特异性结合与微流控芯片技术相融合的一种新兴POCT检测平台,而荧光免疫微流控融合免疫微流控技术和荧光免疫分析的原理,是传统微流控技术基础上的拓展,此项技术特点是以荧光微球标记抗体作为检测探针,整个检测过程被整合至如“信用卡”大小的检测卡中,检测卡中含干燥标记抗体、微米级反应通道、捕获抗体或抗原等,并通过内置的微通道产生毛细作用作为驱动力,完成抗原抗体结合、游离标记物分离,最后通过小型仪器读取信号。
竞争性免疫分析包括两种抗原:一个是待检抗原,一个是标记抗原,同时保持抗体限量,待检抗原和标记抗原竞争结合特异性抗体并分别形成免疫复合物。随后分离去除游离标记物,检测结合标记物信号强度,其强度和待检抗原含量呈反比例函数关系。在常规侧向流分析中,一般采用顺序竞争模式,采用标记抗体和固相抗原模式,在滴加样本之后,待检抗原优先遇到标记抗体,并优先结合限量抗体,而剩余抗体在继续前行,遇到检测区的包被抗原,与之结合形成复合物。在此种模式下,标记抗体与待检抗原于液相中碰撞并结合达到平衡,分析敏感度不能满足临床需求。
非竞争性免疫分析包含多种类型,其中双抗体夹心法是检测大分子抗原的重要方法。大分子抗原存在多种抗原表位,选择一对相匹配的抗体,一个作包被抗体(捕获抗体),另一个作标记抗体,待检抗原可同时结合标记抗体和捕获抗体,形成双抗体夹心复合物。在常规侧向流双抗体夹心免疫分析中,在检测区包被抗体,在标记区放置标记抗体。在滴加样本后,待检抗原依次和标记抗体(液相)和捕获抗体(固相)结合形成双抗体夹心复合物。然而,待检抗原和标记抗体优先在液相中结合,随后待检抗原-标记抗体复合物再被捕获抗体所捕获形成双抗体夹心复合物。在此种情况下,两步结合反应的速率存在显著差异,尤其是当样本中待检抗原含量过高时,待检抗原和标记抗体过度结合,且移动至检测区时不能被捕获抗体捕获,从而发生假阴性结果(HOOK效应)。
发明内容
本发明针对现有竞争和夹心法在常规侧向流检测的不足,提供一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片及其应用,利用该芯片可以提升竞争法的分析敏感度,有效克服双抗体夹心法中存在的HOOK效应。
为实现上述目的,本发明的技术方案是这样实现的,一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片,包括基片及压合于基片上的盖片,基片和盖片围合形成微通道,所述微通道左端与盖片上开设的缓冲液加样孔连通,右端与第二废液区连通,所述第二废液区控制微通道内液体向第二废液区的流动,所述微通道从左到右依次设置有标记区、检测区、样本加样区,所述标记区与检测区之间设置有第一废液区,所述第一废液区设置在所述微通道宽度方向的两端,并通过控制阀与所述微通道相连通,所述检测区设置有第一检测位点、第二检测位点、共用参考点,所述标记区设置有标记抗原和标记抗体,所述第一检测位点设置有第一捕获抗体,所述第二检测位点设置有第二捕获抗体,所述标记抗原与靶分析物竞争结合第一捕获抗体,所述标记抗体、第二捕获抗体与靶分析物结合形成双抗体夹心复合物。
在本发明的一个实施方案中,所述第一废液区、第二废液区均设置在所述基片上表面,所述第一废液区、第二废液区均设置有吸水材料,所述第一废液区为矮圆柱形,所述第二废液区的吸水材料为可移动的滤纸片,所述滤纸片移动时接触或远离所述微通道。
在本发明的一个实施方案中,所述控制阀设置在所述基片上表面,所述控制阀为设置在所述微通道内的两个弧形挡板,且弧形挡板的外弧面朝向标记区,所述弧形挡板一端伸入所述微通道并向所述检测区延伸,另一端与所述第一废液区相连。
在本发明的一个实施方案中,所述标记区、检测区均设置在所述盖片下表面,所述第一检测位点、第二检测位点、共用参考点在检测区从左到右依次分布。
在本发明的一个实施方案中,所述样本加样区包括所述盖片上设置的样本加样孔,所述样本加样孔与所述微通道相连通。
在本发明的一个实施方案中,所述标记抗体为荧光微球标记的抗体。
另一方面,本发明还提供了一种利用上述任一一个技术方案中的微流控芯片对大分子抗原及小分子半抗原进行联合检测的应用,包括至少以下步骤:
1)在样本加样区滴加样本,液体流动方向是由右向左移动,样本中的靶分析物优先以侧向流方式与检测区的捕获抗体结合,剩余样本或样本中其它物质被收集在第一废液区;
2)在缓冲液加样孔注入蒸馏水,同时将位于第二废液区的滤纸片左移,与微通道内液体接触,液体由左向右移动,依次溶解标记区的标记抗原和标记抗体,标记抗原和标记抗体继续移动至检测区,标记抗体流经第一检测区结合剩余的抗原位点,标记抗原流经第二检测区结合被捕获的待检抗原并形成双抗体夹心复合物,而过剩的标记抗原和标记抗体随液体流动被收集在第二废液区;
3)按常规微流控读取检测区和共用参考区的信号值,计算抑制率,经校准函数获得未知样本的结果。
通过上述技术方案得到的一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片的应用,其有益效果是:
采用双向侧向流方式,并分别设计两个废液区,来分别驱动两个方向的液体流动,对于双抗原竞争法而言,让待检抗原以侧向流方式优先快速结合捕获抗体,之后再让标记抗原以同样方式(侧向流)结合剩余的抗体位点,利于显著提升竞争法的分析敏感度;对于双抗体夹心法而言,是一种两步法的双抗体夹心分析模式,能够有效克服HOOK效应。
附图说明
图1是本发明所述两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片的结构示意图;
图2是本发明所述基片上表面的结构示意图;
图3是本发明所述盖片下表面的结构示意图;
图4是本发明在进行hCG和PROG联合检测时微流控芯片的结构示意图;
图5是本发明在进行hCG和PROG联合检测时使用双抗原竞争法检测PROG的原理图;
图6是本发明在进行hCG和PROG联合检测时使用双抗体夹心法检测hCG的原理图。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
本发明总体来说涉及免疫检测技术领域,涉及两种抗原联合检测,特别是两种性质不同的抗原,一种是采用双抗体夹心法检测的大分子抗原,另一种是采用竞争法检测的小分子半抗原,可有效规避双抗体夹心法的HOOK效应,并显著提升竞争法的分析敏感度,具体的,采用“双向”侧向流方法,并通过设置两个驱动装置作为驱动力,让待检抗原或半抗原优先结合检测区的捕获抗体,待分离过剩物质之后,再启动反向流动,让标记抗原和标记抗体结合检测区内剩余的捕获抗体(竞争法)或已被捕获的待检抗原(夹心法)。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的解释说明,可以理解的是,本发明并不限于描述的具体实施方式。
如图1所示,本发明提出一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片,包括基片及压合于基片上的盖片,基片和盖片围合形成微通道,所述微通道左端与盖片上开设的缓冲液加样孔B连通,右端与第二废液区W2连通,所述第二废液区W2控制微通道内液体向第二废液区W2的流动,所述微通道从左到右依次设置有标记区L、检测区、样本加样区,所述标记区L与检测区之间设置有第一废液区W1,所述第一废液区W1设置在所述微通道宽度方向的两端,并通过控制阀与所述微通道相连通,控制阀控制微通道内的液体在从右往左流动时,液体从检测区向第一废液区W1流动,所述检测区设置有第一检测位点T1、第二检测位点T2、共用参考点R,所述标记区L设置有标记抗原和标记抗体,所述第一检测位点T1设置有第一捕获抗体,所述第二检测位点T2设置有第二捕获抗体,所述标记抗原与靶分析物竞争结合第一捕获抗体,所述标记抗体、第二捕获抗体与靶分析物结合形成双抗体夹心复合物。
如图2所示,所述第一废液区W1、第二废液区W2均设置在所述基片上表面,所述第一废液区W1、第二废液区W2均设置有吸水材料,所述第一废液区W1为矮圆柱形,所述第二废液区W2的吸水材料为可移动的滤纸片,所述滤纸片移动时接触或远离所述微通道。
所述控制阀设置在所述基片上表面,所述控制阀为设置在所述微通道内的两个弧形挡板,且弧形挡板的外弧面朝向标记区,所述弧形挡板一端伸入所述微通道并向所述检测区延伸,另一端与所述第一废液区W1相连,使微通道内的液体通过检测区向标记区L流动时通过弧形挡板的圆弧内侧流入第一废液区W1,而微通道内的液体通过标记区L向检测区流动时通过弧形挡板的圆弧外侧继续向检测区流动,不流入第一废液区W1。
与常规侧向流微流控相比,本技术发明设置两个废液区,均设置有吸水材料,并作为微流控液体流动的主要驱动力。其中,第一废液区位于标记区的右侧,分布于微流控通道的两侧,面积大小和需收集的液体(样本量)相关。第一废液区为固定区域且不能移动,主要作为第一次驱动力,加入样本后,让液体由右侧向左侧逆向流动,剩余液体被收集在第一个废液区内。
第二个废液区位于右侧终端,且根据需要移动滤纸片来控制液体流动的开启,作为第二次驱动力。加入样本时,位于第二废液区的滤纸片未接触到微通道,由于表面张力作用,液体不会流出。当完成样本与捕获抗体的特异性结合,未参加反应物质被收集于第一废液区。此时,于缓冲液孔注入一定量的蒸馏水,同时启动第二次驱动力,将第二废液区的滤纸片向左移动并接触到微通道,液体进入滤纸片并驱动液体流动。
所述共用参考点R按常规设置,例如设置与标记抗体相匹配的抗抗体,为消除芯片检测过程的误差,分别读取第一检测位点T1、第二检测位点T2和共用参考点R信号值,计算抑制率T1/R(或T2/R),以抑制率为纵坐标,校准品浓度值为横坐标建立函数关系,获得校准函数。
如图3所示,所述标记区L、检测区均设置在所述盖片下表面,所述第一检测位点T1、第二检测位点T2、共用参考点R在检测区从左到右依次分布。
所述样本加样区包括所述盖片上设置的样本加样孔S,所述样本加样孔S与所述微通道相连通。
所述标记抗体为荧光微球标记的抗体。
如图4所示,以人绒毛膜促性腺激素(hCG)和孕酮(PROG)的联合检测为例,分别说明双抗原竞争法和双抗体夹心法的作用原理:
标记区L:标记抗原:PROG-荧光微粒;标记抗体:抗hCG抗体-荧光微粒。
第一检测区T1:竞争法设计,包被抗PROG抗体。
第二检测区T2:夹心法设计,包被抗hCG抗体。
共用参考区R:包被与标记抗体相匹配的抗抗体。
双抗原竞争法的检测原理:
如图5所示,1.在S孔滴加样本,液体流动方向是由右向左移动,样本中的待检抗原优先以侧向流方式结合第一检测区的抗PROG抗体,剩余液体或样本中其它物质被收集在第一废液区。
2.然后在B孔注入蒸馏水,同时将位于第二废液区的滤纸片左移,与微通道内液体接触,使液体由左向右移动,溶解标记区的PROG-荧光微粒,PROG-荧光微粒继续移动至第一检测区,结合剩余的抗PROG抗体位点,而过剩的PROG-荧光微粒随液体流动被收集在第二废液区。
按常规微流控读取T1和R信号值,计算抑制率,经校准函数获得未知样本的结果。
双抗体夹心法的检测原理:
如图6所示,1.在S孔滴加样本,液体流动方向是由右向左移动,样本中的待检抗原优先以侧向流方式结合第二检测区的抗hCG抗体,剩余液体或样本中其它物质被收集在第一废液区。需特别说明,如样本中抗原过量,未被抗体捕获的抗原,同样会被收集在第一废液区,从而减少HOOK效应。
2.然后在B孔注入蒸馏水,溶解缓冲液干粉,同时将位于第二废液区的滤纸片左移,与微通道内液体接触,使液体由左向右移动,溶解标记区的抗hCG抗体-荧光微粒,抗hCG抗体-荧光微粒继续移动至第二检测区,结合被捕获的待检抗原并形成双抗体夹心复合物,而过剩的抗hCG抗体-荧光微粒随液体流动被收集在第二废液区。
按常规微流控读取T2和R信号值,经校准函数获得未知样本的结果。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案,本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理,属于本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片,包括基片及压合于基片上的盖片,基片和盖片围合形成微通道,其特征在于,所述微通道左端与盖片上开设的缓冲液加样孔连通,右端与第二废液区连通,所述第二废液区控制微通道内液体向第二废液区的流动,所述微通道从左到右依次设置有标记区、检测区、样本加样区,所述标记区与检测区之间设置有第一废液区,所述第一废液区设置在所述微通道宽度方向的两端,并通过控制阀与所述微通道相连通,所述检测区设置有第一检测位点、第二检测位点、共用参考点,所述标记区设置有标记抗原和标记抗体,所述第一检测位点设置有第一捕获抗体,所述第二检测位点设置有第二捕获抗体,所述标记抗原与靶分析物竞争结合第一捕获抗体,所述标记抗体、第二捕获抗体与靶分析物结合形成双抗体夹心复合物。
2.根据权利要求1所述的一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片,其特征在于,所述第一废液区、第二废液区均设置在所述基片上表面,所述第一废液区、第二废液区均设置有吸水材料,所述第一废液区为矮圆柱形,所述第二废液区的吸水材料为可移动的滤纸片,所述滤纸片移动时接触或远离所述微通道。
3.根据权利要求1或2所述的一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片,其特征在于,所述控制阀设置在所述基片上表面,所述控制阀为设置在所述微通道内的两个弧形挡板,且弧形挡板的外弧面朝向标记区,所述弧形挡板一端伸入所述微通道并向所述检测区延伸,另一端与所述第一废液区相连。
4.根据权利要求1所述的一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片,其特征在于,所述标记区、检测区均设置在所述盖片下表面,所述第一检测位点、第二检测位点、共用参考点在检测区从左到右依次分布。
5.根据权利要求1所述的一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片,其特征在于,所述样本加样区包括所述盖片上设置的样本加样孔,所述样本加样孔与所述微通道相连通。
6.根据权利要求1所述的一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯片,其特征在于,所述标记抗体为荧光微球标记的抗体。
7.一种两步法竞争和夹心的免疫微流控芯的应用,其特征在于,应用权利要求2-6中任一项的微流控芯片对大分子抗原及小分子半抗原进行联合检测,包括至少以下步骤:
1)在样本加样区滴加样本,液体流动方向是由右向左移动,样本中的靶分析物优先以侧向流方式与检测区的捕获抗体结合,剩余样本或样本中其它物质被收集在第一废液区;
2)在缓冲液加样孔注入蒸馏水,同时将位于第二废液区的滤纸片左移,与微通道内液体接触,液体由左向右移动,依次溶解标记区的标记抗原和标记抗体,标记抗原和标记抗体继续移动至检测区,标记抗体流经第一检测区结合剩余的抗原位点,标记抗原流经第二检测区结合被捕获的待检抗原并形成双抗体夹心复合物,而过剩的标记抗原和标记抗体随液体流动被收集在第二废液区;
3)按常规微流控读取检测区和共用参考区的信号值,计算抑制率,经校准函数获得未知样本的结果。
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