CN109718880A - 基于双抗法分选胎儿有核红细胞额定微流控芯片及其分选方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种基于双抗法分选胎儿有核红细胞的微流控芯片，由基片和盖片夹持构成独立的腔体分别为样本池、缓冲液池、第一废液池、第二废液池、第一捕获区和第二捕获区，由基片和盖片夹持构成独立的通道，其中三个通道一端分别连通样本池、缓冲液池和第一捕获区的一端，所述三个通道的另一端在近端交叉点连通，另外三个通道一端分别连通第一废液池、第二捕获区一端和第一捕获区的另一端，所述另外三个通道的另一端在远端交叉点连通，所述第二捕获区另一端通过通道连通第二废液池。通过第一捕获区的免疫磁珠分选待测物质，再通过第二捕获区包埋的抗体结合并识别待测物质，提高了灵敏度，能够高效的捕获胎儿有核红细胞。

Description

基于双抗法分选胎儿有核红细胞额定微流控芯片及其分选 方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术，尤其是对胎儿有核红细胞进行分选的微流控芯片及其使用方法。

背景技术

唐氏综合症，又称21三体综合征，是最早被发现的染色体疾病之一，多数患儿在胎内早期即夭折流产，存活者有明显的先天性智力障碍、特殊面容，多器官发育不全等主要特点，给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担，影响我国的人口出生素质，是孕期进行检查的常规项目之一，并且在妊娠早中期对唐氏胎儿进行诊断并及时终止妊娠是防止患儿出生的主要措施。

目前唐氏产前诊断仍然是侵入性取材结合染色体制备核型分析，产前诊断取材方式为羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐带血取样、胎儿镜和胚胎活检等，有一定的流产、感染等相关并发症发生风险，有创性使很多孕妇及其家属难以接受，从而可能造成漏诊，并且检验周期长，技术要求高。

胎儿有核红细胞(FNRBCs)，具有胎儿完整的遗传物质，被学者们认为是进行非创伤性产前诊断的最佳细胞来源。胎儿有核红细胞于1979首先用流式细胞术从母血中富集得到FNRBCs，之后利用巢式PCR从有核细胞层中分离出了胎儿细胞，母胎间存在细胞转运的理论和现象逐渐得到国际学术界的共识。但母血中的FNRBC数目较少，如何有效富集成为利用FNRBCs进行产前诊断的关键。目前FNRBCs常用的富集方法有密度梯度离心法、磁激活细胞分选法(MACS)、荧光激活细胞分选法(FACS)等。密度梯度离心分离显微操作需要对目的细胞进行有效标记和识别，常用的有瑞氏染色、Kl ei hauer抗酸染色或者免疫组化等，而FACS和MACS需借用荧光素或者磁珠标记细胞特异性抗体来达到分离目的，但是设备昂贵，细胞用量大，操作繁琐，难以在实验室和医院得到大面积推广。

微流控芯片以微加工技术为基础，在芯片上制作多种功能单元，使得多种实验技术可以在方寸大小的芯片上实现，可称之为芯片上的实验室，其具有分析速度快，分离效率高，减少试剂盒样本的消耗量等优点。随着微流控芯片技术的进一步发展，特别是检测灵敏度的提高，微流控对单个细胞的应用日益得到重视，微流控芯片适合于细胞分析主要是由于微流控的通道尺寸与典型哺乳动物细胞尺寸相适应，封闭的多维网状结构行成相对密闭的环境，与生理状态下细胞的生存空间类似，可满足高通量细胞分析的要求。

微流控芯片结合免疫磁珠分选细胞也受到了广泛的关注，其原理是包被抗体的磁珠与细胞表面抗原的特异性识别，在外加磁场的作用下含有特异性抗原的细胞因磁场力的作用被滞留在磁场中而无该抗原的细胞无法再磁场中滞留，从而使特定的细胞得以分离。目前用于胎儿有核红细胞分离的抗原主要为CD71与GPA，CD71即转铁蛋白石受体，是一种胎儿红细胞表面抗原，在胎儿有核红细胞上高度表达，且随着孕周的增加而增高，并随着胎儿红细胞的成熟而消失。抗CD71的鼠源单克隆抗体，分选胎儿有核红细胞效果较好，且受到母亲细胞污染的较少，GPA即血型糖蛋白A，是在幼稚红细胞和成熟红细胞表明均表达的红细胞特异性血型抗原，在白细胞表面不表达。且有研究表明将CD71+/GPA+作为靶细胞进行分离，其准确性较单一CD71+抗体更高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是实现一种基于免疫分离法，使用双抗体对胎儿有核红细胞进行高效分选的微流控芯片及其使用方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：基于双抗法分选胎儿有核红细胞的微流控芯片，由基片和盖片夹持构成独立的腔体分别为样本池、缓冲液池、第一废液池、第二废液池、第一捕获区和第二捕获区，由基片和盖片夹持构成独立的通道，其中三个通道一端分别连通样本池、缓冲液池和第一捕获区的一端，所述三个通道的另一端在近端交叉点连通，另外三个通道一端分别连通第一废液池、第二捕获区一端和第一捕获区的另一端，所述另外三个通道的另一端在远端交叉点连通，所述第二捕获区另一端通过通道连通第二废液池，所述远端交叉点连通与第一废液池之间的通道上设有第一微阀，所述远端交叉点连通与第二捕获区之间的通道上设有第二微阀，所述基片和盖片外固定有磁块，所述磁块的磁场贯穿第一捕获区，所述盖片位于样本池、缓冲液池和第二捕获区处设有加样口，缓冲液加样口和观测口。

所述第一捕获区位于样本池、缓冲液池、第一废液池、第二废液池的中间位置，所有通道构成X型结构。

所述通道以及样本池、缓冲液池、第一废液池、第二废液池、第一捕获区和第二捕获区均由基板上的凹陷结构构成，所述盖片为封盖在基板上的平板。

所述第二捕获区的底部密布有用于放置包埋抗体的圆形凹槽。

所述通道以及样本池、缓冲液池、第一废液池、第二废液池、第一捕获区和第二捕获区的凹陷结构构成深度相同，所述第一捕获区的长度为2.5-3.5mm，宽度为1.5-2.5mm，所述第一捕获区的长度为4.5-5.5mm，宽度为2.5-3.5mm，所述通道的宽度小于第一捕获区的宽度，所述圆形凹槽的深度为25-35μm。

所述第一捕获区和第二捕获区两端均为喇叭口结构，且均朝向捕获区开口逐渐变大，朝向通道开口逐渐变小。

基于所述微流控芯片的分选方法，包括以下步骤：

步骤1、在第一捕获区外置磁场；

步骤2、免疫磁珠捕获抗体；

步骤3、包埋的抗体与待测物质结合，分离细胞。

所述步骤1，在第一捕获区的上下两侧放置永久性磁铁，磁场强度为350-500mT。

所述步骤2，保持第一微阀打开，第二微阀关闭，将表面结合有CD71或GAP抗体的免疫磁珠以7-9μl/min的速度从样本池进样，然后将缓冲液以7-9μl/min的速度从缓冲液池加入缓冲液，将磁珠冲入第一捕获区，免疫磁珠因磁场作用滞留在第一捕获区中，再以0.3-0.6μl/min的速度将血液单细胞层样本从样本池通入微通道中，特异性的细胞在第一捕获区完成捕获。

所述步骤3，在第一捕获区完成细胞捕获后，从缓冲液池以2-4μl/min的流速加入缓冲液除去残留细胞，之后闭合第一微阀，打开第二微阀，除去第一捕获区两侧的磁体，从缓冲液池以7-9μl/min的速度加入缓冲液，将第一捕获区捕获的细胞冲入第二捕获区，CD71或GAP抗体与磁珠捕获的细胞在第二捕获区内结合实现特异性细胞的捕获分离。

本发明包括以下优先：

1、通过第一捕获区的免疫磁珠分选待测物质，再通过第二捕获区包埋的抗体结合并识别待测物质，提高了灵敏度，能够高效的捕获胎儿有核红细胞；

2、对细胞的损伤较小，方便后续的检测分析；本发明通过微流控技术控制待测样品的流速和流量，从而减少误差，提高准确度；

3、操作简单，易推广使用，节约了成本。

附图说明

下面对本发明说明书中每幅附图表达的内容及图中的标记作简要说明：

图1为微流控芯片结构示意图；

图2为图1中微阀结构示意图；

上述图中的标记均为：1、样本池；2、缓冲液池；3、近端交叉点；4、第一捕获区；5、远端交叉点；6、第一微阀；7、第一废液池；8、第二微阀；9、上倒三角区；10、第二捕获区；11、下倒三角区；12、第二废液池。

具体实施方式

如图1所示，基于双抗法分选胎儿有核红细胞微流控芯片，包括基片和盖片；基片为芯片载体，盖片为板状结构，基片上具有凹陷结构，构成样本池1、缓冲液池2、第一捕获区4、第一废液池7、下倒三角区11、第二捕获区10、上倒三角区9、第二废液池12，以及连通这些凹陷结构的通道，通道及其凹陷结构构成了X型结构。

样本池1和缓冲液池2位于X型微通道的一端，第一废液池7和第二废液池12位于X型微通道的另一端，通过微通道连接；捕获区两侧为倒三角结构，分别为上倒三角区9和下倒三角区11，并通过上倒三角区9和下倒三角区11连通通道，捕获区包括第一捕获区4和第二捕获区10，其中第一捕获区4位于X型微通道的中间位置，并且在第一捕获区4外固定有磁块(永磁铁)，构成贯穿第一捕获区4的磁场。第二捕获区10包括包埋抗体的圆形凹槽，第二捕获区10且位于第二微阀8与第二废液池12之间，第二微阀8位于远端交叉点5后支路起始处，用于控制相应微通道的开与关。

所述盖片包括加样口、缓冲液加样口、观测口；加样口、缓冲液加样口、观测口的位置在样本池1、缓冲液池2、第二捕获区10的正上方；X型微通道用于各个功能区之间的相互连接。

第一捕获区4为圆角矩形结构，长度为3mm，宽度为2mm，槽的深度与微流控通道深度相同；所述第二捕获区10为矩形结构，长度为5mm，宽度为3mm，槽的深度与微流控通道深度相同，圆形槽孔深度为30μm。

第一微阀6和第二微阀8可以为气动微阀，压电微阀，电磁微阀等；优选地为电磁微阀，如图2所示，微阀上部半圆尺寸与微流控通道相同，可实现紧密闭合。

芯片采用的抗体为鼠源CD71单克隆抗体以及GPA抗体，抗体与磁珠结合，上述抗体与第二捕获区10内包埋的抗体无顺序影响；第二捕获区10前后两端分别连接上倒三角区9域和下倒三角区11域，下倒三角区11域连接有废液池；第二捕获区10密布的圆形槽孔为截面尺寸为圆形，直径为15μm。

上述的微流控芯片的分选方法，包括如下步骤：

(1)在第一捕获区4外置磁场：在第一捕获区4的上下两侧放置永久性磁铁，磁场强度为350-500mT；

(2)免疫磁珠捕获抗体：将表面结合有CD71或GAP抗体的免疫磁珠以8μl/min的速度从样本池1进样，然后将缓冲液以8μl/mi n的速度从缓冲液池2加入缓冲液，将磁珠冲入第一捕获区4，免疫磁珠因磁场作用滞留在第一捕获区4中，再以0.5μl/min的速度将血液单细胞层样本从样本池1通入微通道中，特异性的细胞在第一捕获区4完成捕获，此时第二微阀8处于闭合状态；

(3)包埋的抗体与待测物质结合，分离细胞：在第一捕获区4完成细胞捕获后，从缓冲液池2以2-4μl/min的流速加入缓冲液除去残留细胞，之后闭合第一微阀6，打开第二微阀8，除去第一捕获区4两侧的磁体，从缓冲液池2以8μl/min的速度加入缓冲液，将第一捕获区4捕获的细胞冲入第二捕获区10，上倒三角区9域使流体在进入第二捕获区10后流速减慢，CD71或GAP抗体与磁珠捕获的细胞可在第二捕获区10内充分与第二捕获区10槽孔内包埋的抗体结合，反应过后使用缓冲液再次冲洗微流通道，即得到胎儿有核红细胞。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于双抗法分选胎儿有核红细胞的微流控芯片，其特征在于：由基片和盖片夹持构成独立的腔体分别为样本池、缓冲液池、第一废液池、第二废液池、第一捕获区和第二捕获区，由基片和盖片夹持构成独立的通道，其中三个通道一端分别连通样本池、缓冲液池和第一捕获区的一端，所述三个通道的另一端在近端交叉点连通，另外三个通道一端分别连通第一废液池、第二捕获区一端和第一捕获区的另一端，所述另外三个通道的另一端在远端交叉点连通，所述第二捕获区另一端通过通道连通第二废液池，所述远端交叉点连通与第一废液池之间的通道上设有第一微阀，所述远端交叉点连通与第二捕获区之间的通道上设有第二微阀，所述基片和盖片外固定有磁块，所述磁块的磁场贯穿第一捕获区，所述盖片位于样本池、缓冲液池和第二捕获区处设有加样口，缓冲液加样口和观测口。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述第一捕获区位于样本池、缓冲液池、第一废液池、第二废液池的中间位置，所有通道构成X型结构。

3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于：所述通道以及样本池、缓冲液池、第一废液池、第二废液池、第一捕获区和第二捕获区均由基板上的凹陷结构构成，所述盖片为封盖在基板上的平板。

4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于：所述第二捕获区的底部密布有用于放置包埋抗体的圆形凹槽。

5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于：所述通道以及样本池、缓冲液池、第一废液池、第二废液池、第一捕获区和第二捕获区的凹陷结构构成深度相同，所述第一捕获区的长度为2.5-3.5mm，宽度为1.5-2.5mm，所述第一捕获区的长度为4.5-5.5mm，宽度为2.5-3.5mm，所述通道的宽度小于第一捕获区的宽度，所述圆形凹槽的深度为25-35μm。

6.根据权利要求1或5所述的微流控芯片，其特征在于：所述第一捕获区和第二捕获区两端均为喇叭口结构，且均朝向捕获区开口逐渐变大，朝向通道开口逐渐变小。

7.基于权利要求1-6中任一所述微流控芯片的分选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、在第一捕获区外置磁场；

步骤2、免疫磁珠捕获抗体；

步骤3、包埋的抗体与待测物质结合，分离细胞。

8.根据权利要求7所述的分选方法，其特征在于：所述步骤1，在第一捕获区的上下两侧放置永久性磁铁，磁场强度为350-500mT。

9.根据权利要求7所述的分选方法，其特征在于：所述步骤2，保持第一微阀打开，第二微阀关闭，将表面结合有CD71或GAP抗体的免疫磁珠以7-9μl/min的速度从样本池进样，然后将缓冲液以7-9μl/mi n的速度从缓冲液池加入缓冲液，将磁珠冲入第一捕获区，免疫磁珠因磁场作用滞留在第一捕获区中，再以0.3-0.6μl/min的速度将血液单细胞层样本从样本池通入微通道中，特异性的细胞在第一捕获区完成捕获。

10.根据权利要求7所述的分选方法，其特征在于：所述步骤3，在第一捕获区完成细胞捕获后，从缓冲液池以2-4μl/min的流速加入缓冲液除去残留细胞，之后闭合第一微阀，打开第二微阀，除去第一捕获区两侧的磁体，从缓冲液池以7-9μl/min的速度加入缓冲液，将第一捕获区捕获的细胞冲入第二捕获区，CD71或GAP抗体与磁珠捕获的细胞在第二捕获区内结合实现特异性细胞的捕获分离。