CN215415464U - 微流控荧光免疫分析试剂卡以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及免疫分析领域,特别涉及微流控荧光免疫分析试剂卡以及试剂盒。该微流控免疫分析试剂卡内含T和C两个独立的微流控区,其中T区包括T加样口3、T反应区4、T区单通流道5、T区出样口6,C区包括C加样口7、C反应区8、C区单通流道9、C区出样口10。该实用新型设计的试剂卡具有结构简单,生产制造难度小、成本低,检测特异性好、灵敏度高,用途广泛,可用于荧光免疫法、酶联免疫法等的有益效果。
Description
技术领域
本实用新型涉及免疫分析领域,特别涉及微流控荧光免疫分析试剂卡以及试剂盒。
背景技术
免疫荧光技术是指根据抗原抗体免疫结合的原理,先将已知的抗原或抗体包被荧光素或荧光微球等荧光标记物,再用这种包被了荧光标记物的抗体/抗原作为分子探针进入检测待检样本内与检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)进行结合形成结合物。该结合物上含有荧光标记物,对其采用激发光照射(如紫外光),荧光标记物受激发而发出明亮的荧光,使检测人员可以看见荧光,确定抗原或抗体的性质,并可以利用定量检测技术测定结合物的荧光强度等来判定待测物的浓度等参数。
现有技术中,应用于免疫荧光技术的微流控芯片是指在芯片上设置微流道结构及其他功能元件,且微流道中的反应位点固定有包被了荧光标记物的抗体/抗原、捕获位点固定有捕获抗体/抗原。将待检样本加入微流道中,待检样本流经反应位点时,待检样本中的待测物会通过反应位点与包被了荧光标记物的抗体/抗原结合,而后流经捕获位点,待测物会与捕获抗体/抗原发生免疫反应,被固定在捕获位点。然后向微流道中加入清洗液将结合物之外的检测待检样本冲洗掉、使微流道中只剩余结合物,即可对结合物进行检测得出检测待检样本的各个参数。此技术虽然使得检测待检样本与荧光标记物、捕获抗体/抗原的混合、反应、分离在一个设备内进行,但现有技术中,存在以下问题:
①将捕获抗体/抗原偶联和包被了荧光标记物的抗体/抗原固化在微流道内并进行一体封装保存,增加了生产技术难度和运输保存难度,增加生产成本;②由于免疫反应只能在待检样本流经反应位点和捕获位点时发生,同时,反应位点和捕获位点的横截面由于加工精度受使得截面半径不能足够小来增加抗原抗体接触概率,且反应位点和捕获位点流道长度有限,最终造成免疫反应很难充分进行,灵敏度不够高;③为使免疫结合反应进行得充分,现有的微流道内均设置了各种复杂结构以减缓待检样本的流动速度或增大待检样本流动量、或对反应后待检样本进行多重过滤来保证反应生成的结合物量满足检测要求,导致微流控芯片结构复杂、不易生产及生产成本高、产品合格率低、检测特异性和灵敏度有限等问题。
实用新型内容
有鉴于此,本实用新型提供了微流控荧光免疫分析试剂卡以及试剂盒。该试剂卡具有结构简单,生产制造难度小、成本低,检测特异性好、灵敏度高,用途广泛,可用于荧光免疫法、酶联免疫法等的有益效果。
为了实现上述实用新型目的,本实用新型提供以下技术方案:
本实用新型提供了微流控荧光免疫分析试剂卡,包括试剂卡本体(1)和核孔膜免疫固相载体(2);
所述试剂卡本体设置有:T反应部和C反应部;
所述T反应部包括:T区加样口(3)、T反应区(4)、T区单通流道(5)、T区出样口(6);
所述C反应部包括:C区加样口(7)、C反应区(8)、C区单通流道(9)、C区出样口(10);
所述核孔膜免疫固相载体(2)包括镀金核孔膜、接枝改性核孔膜、接枝改性镀金核孔膜中的任意一种或多种;
所述核孔膜免疫固相载体(2)设置于所述T反应区(4)和/或所述C反应区(8)。
在本实用新型的一些具体实施方案中,所述T区单通流道(5)为所述T反应区(4)的待检样本流道,连接所述T反应区(4)和所述T区出样口(6)。
在本实用新型的一些具体实施方案中,所述C区单通流道(9)为所述C反应区(8)的待检样本流道,连接所述C反应区(8)和所述C区出样口(10)。
在本实用新型的一些具体实施方案中,所述T区单通流道(5)与所述C区单通流道(9)为独立的两个流道,互不连通。
在本实用新型的一些具体实施方案中,设置于所述T反应区(4)的所述核孔膜免疫固相载体(2)为包被抗体/抗原的核孔膜(2A),包被有能够与待检样本特异性结合的抗体或抗原,对待检样本进行定量和/或定性检测。
在本实用新型的一些具体实施方案中,设置于所述C反应区(8)的所述核孔膜免疫固相载体(2)为空白封闭核孔膜(2B),包被有不与待检样本特异性结合的抗体或抗原,避免所述T反应区(4)出现假阳性。
在本实用新型的一些具体实施方案中,设置于所述C反应区(8)的所述核孔膜免疫固相载体(2)为包被抗体/抗原的核孔膜(2A),包被有能够与待检样本特异性结合的抗体或抗原,对待检样本进行定量和/或定性检测。
在本实用新型的一些具体实施方案中,所述T区加样口(3)和/或所述C区加样口(7)可以根据需求做成与加样工具相匹配的形状或尺寸。
在本实用新型的一些具体实施方案中,所述T区出样口(6)和/或所C区出样口(10)可以根据需求做成与抽样工具相匹配的形状或尺寸。
基于上述,本实用新型还提供了荧光免疫试剂盒,包括所述的微流控荧光免疫分析试剂卡。
本实用新型公开了一种基于核孔膜免疫固相载体的单通道微流控荧光免疫分析试剂卡。核孔膜上有大量微孔(每平方厘米几百万至几千万个微孔),孔径均一,每个微孔都是直通微孔,每一片核孔膜就是一个微流控芯片。膜表面及孔壁可包被大量抗体/抗原,操作过程中采用纵向过滤,使待检样本中的待测物均匀过孔,保证待测物与膜表面及孔壁上的包被抗体/抗原充分接触反应,从而提高灵敏度。同时,由于膜上的大量微孔均为贯穿膜的直通微孔,膜光滑特性,容易清洗,待检样本中未偶联的荧光标记抗体/抗原或酶标抗原/抗体可被清洗干净,从而降低噪声信号,提高信噪比,减少假阳性检出率。
本试剂卡采用一个样本对应一个反应区、一条单通直流通道的双反应区结构设计,结构简单,可改装成单反应区,垂直通道连接接液管的单样本试剂卡;同时,可拓展成多排多联反应区,多样本检测,垂直单通道连接多孔板收集反应液,多联反应区可在荧光检测仪上进行荧光免疫检测,多孔板收集的反应液可在酶标仪上进行酶联免疫检测,从而实现多样本多用途的检测试剂卡,即多联检试剂卡。本试剂卡的设计结构简单、生产成本低、易于产业化,可广泛用于荧光免疫、酶联免疫等检测方法,经济效益和社会效益广阔。
综上,本实用新型提供的微流控免疫分析试剂卡内含T和C两个独立的微流控区,其中T区包括T加样口、T反应区、T区单通流道、T区出样口,C区包括C加样口、C反应区、C区单通流道、C区出样口。T反应区安装包被了相应抗体/抗原的核孔膜免疫固相载体,其功能是捕获待检样本中的抗原/抗体待测物,进行定性定量。待检样本经T加样口进入,流经T反应区时待测物被膜上的包被抗体/抗原捕获发生特异性免疫结合,待检样本中其他未偶联的待检样本经T区单通流道从T区出样口流出。C反应区安装有空白封闭的核孔膜免疫固相载体,待检样本从C区加样口进入,经C反应区、C区单通流道从C区出样口流出,其功能是检验荧光微球是否集聚(免疫荧光分析)或待检样品中未被结合的酶标抗原/抗体是否清洗干净(酶联免疫分析),验证T反应区是否出现假阳性。实际操作中采用流量泵控制待检样本流速,使待检样本按反应时间需求全部均匀的经过T反应区,确保T反应区的免疫反应充分进行,提高灵敏度。该实用新型设计的试剂卡具有结构简单,生产制造难度小、成本低,检测特异性好、灵敏度高,用途广泛,可用于荧光免疫法、酶联免疫法等的有益效果。
附图说明
为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示荧光免疫分析操作步骤示意图;
图2示酶联免疫分析操作步骤示意图;
图3示试验例1的标准曲线;
图4示试剂卡的结构示意图;其中,1-试剂卡本卡;2-包被抗体/抗原的核孔膜;2-空白封闭的核孔膜;3-T加样口;4-T反应区;5-T区单通流道;6-T出样口;7-C加样口;8-C反应区;9-C区单通流道;10-C区出样口;
图5示多联多样本多检测方法试剂卡示意图。
具体实施方式
本实用新型公开了微流控荧光免疫分析试剂卡以及试剂盒,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本实用新型。本实用新型的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本实用新型内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本实用新型技术。
本实用新型提供的微流控荧光免疫分析试剂卡以及试剂盒中,所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本实用新型:
本实用新型提供的这种基于核孔膜免疫固相载体的微流控荧光免疫分析试剂卡,包括试剂卡本体,其内包含T区加样口3、T反应区4、T区单通流道5、T区出样口6、C区加样口7、C反应区8、C区单通流道9、C区出样口10。
其中,T区加样口3和C区加样口7可以根据需求做成与加样工具相匹配的尺寸。
其中,T区出样口6和C区出样口10可以根据需求做成与抽样工具相匹配的尺寸。
其中,T区单通流道5为T反应区4的待检样本流道,连接T反应区4和T区出样口6。
其中,C区单通流道9为C反应区8的待检样本流道,连接C反应区8和C区出样口10。
其中,T区单通流道5和C区单通流道9为独立的两个流道,互不交叉。
本实用新型公开了一种基于核孔膜的微流控免疫分析试剂卡,其内含T和C两个独立的微流控区,其中T区包括T加样口3、T反应区4、T区单通流道5、T区出样口6,C区包括C加样口7、C反应区8、C区单通流道9、C区出样口10。T反应区4安装包被了相应抗体/抗原的核孔膜免疫固相载体,其功能是捕获待检样本中的抗原/抗体待测物,进行定性定量。待检样本经T区加样口3进入,流经T反应区4时待测物被膜上的包被抗体/抗原捕获发生特异性免疫结合,待检样本中其他未偶联的待检样本经T区单通流道5从T区出样口流出6。C反应区8安装有空白封闭的核孔膜免疫固相载体2,待检样本从C区加样口进入7,经C反应区8、C区单通流道9从C区出样口10流出,其功能是检验荧光微球是否集聚(免疫荧光分析)或待检样品中未被结合的酶标抗原/抗体是否清洗干净(酶联免疫分析),验证T反应区4是否出现假阳性。实际操作中采用流量泵控制待检样本流速,使待检样本按反应时间需求全部均匀的经过T反应区4,确保T反应区4的免疫反应充分进行,提高灵敏度。该实用新型设计的试剂卡具有结构简单,生产制造难度小、成本低,检测特异性好、灵敏度高,用途广泛,可用于荧光免疫法、酶联免疫法等的有益效果。
其中:
用于免疫荧光分析的试剂卡:
其中,T反应区4安装包被了相应抗体/抗原的核孔膜免疫固相载体2,如镀金核孔膜、接枝改性核孔膜、接枝改性镀金核孔膜等。T反应区4的功能是捕获待检样本中的抗原/抗体待测物,使其与膜上的包被抗体/抗原发生特异性结合,进行定性定量。
其中,C反应区8安装与T反应区对应的无包被可与待检样本中抗原/抗体偶联的抗体/抗原,但空白封闭了不与抗原/抗体反应的封闭蛋白,通常为1%BSA(牛血清蛋白)的核孔膜免疫固相载体2,其功能是检验荧光微球是否集聚,确保T反应区不出现假阳性;另外,C反应区8可安装与T反应区相同的包被了相应抗体/抗原的核孔膜免疫固相载体2,其功能与T反应区4相同,可进行多样本检测。
T反应区4待检样本的流向:T区加样口3→T反应区4→T区单通流道5→T区出样口6。待检样本从T区加样口3进入,待测物流经T反应区4与核孔膜上包被的抗体/抗原发生特异性结合形成双抗夹心,并偶联在核孔膜上,其他待检样本经T区单通流道5从T区出样口6流出。向T反应区4加入清洗液,将核孔膜上未偶联的荧光标记抗体/抗原清洗干净,清洗液经T区单通流道5从T区出样口6流出。即可对T反应区4的特异性结合物进行荧光响应值检测。
C反应区8作为验证区时待检样本流向:C区加样口7→C反应区8→C区单通流道9→C区出样口10。待检样本从C区加样口7进入,经C反应区8、C区单通流道9从C区出样口10流出。向C反应区8加入清洗液,将核孔膜未偶联的荧光标记抗体/抗原清洗干净,清洗液经C区单通流道9从C区出样口10流出。由于C反应区8的核孔膜上包被有封闭蛋白,不与待检样本发生特异性结合,且由于膜光滑的特性,膜表面及孔壁上的未偶联的抗原/抗体都能被清洗液清洗干净,所以C反应区8的荧光响应值为0;如果C反应区8的荧光响应值不为0,则表明待检样本中的荧光微球集聚,T反应区8的检测结果可能是假阳性。当C反应区8作为多样本测试时,方法与T反应区4同。
本试剂卡通过在加样口或出样口处连接流量泵的方式控制待检样本流速,确保待测物按预设的反应时间要求均匀过膜,与核孔膜上的包被抗体/抗原充分接触反应,提高灵敏度。
用于酶联免疫分析的试剂卡:
其中,T反应区4安装包被了相应抗体/抗原的核孔膜免疫固相载体2,如镀金核孔膜、接枝改性核孔膜、接枝改性镀金核孔膜等。T反应区4的功能是捕获待检样本中的抗原/抗体待测物,使其与膜上的包被抗体/抗原发生特异性结合,进行定性定量。
其中,C反应区8安装与T反应区4对应的包被有不与抗体/抗原反应的空白封闭(1%BSA)的核孔膜免疫固相载体2,其功能是验证待检样品中未被结合的酶标抗体/抗原是否清洗干净,确保T反应区不出现假阳性;另外,C反应区8可安装与T反应区4相同的包被了相应抗体/抗原的核孔膜免疫固相载体2,其功能与T反应区4相同,可进行多样本检测。
T反应区4待检样本的流向:T区加样口3→T反应区4→T区单通流道5→T区出样口6。
C反应区8作为验证区时待检样本流向:C区加样口7→C反应区8→C区单通流道9→C区出样口10。
操作步骤:(1)将待检样本分别加到T区和C区,待测物经T反应区4与核孔膜上包被的抗体/抗原发生特异性结合形成偶联的酶抗原抗体结合物,并偶联在核孔膜上,其他待检样本经单通流道从出样口流出;C区因是包被了封闭蛋白的免疫固相载体,因此不会与待检样本中的酶标抗原/抗体偶联,而经单通流道从出样口流出。(2)清洗:将核孔膜上未偶联的酶标抗原/抗体清洗干净,清洗液经单通流道从出样口流出。(3)显色反应:清洗后加入显色液进行显色反应,收集显色液加入终止液,用酶标仪检测显色液的吸光值(OD值)。
由于C反应区8的核孔膜上包被有封闭蛋白,不与待检样本发生特异性结合,且由于膜光滑的特性,膜表面及孔壁上的未偶联结合物都能被清洗液清洗干净,所以C反应区8的OD值为0;如果C反应区的OD值不为0,则表明未偶联的酶标物未被清洗干净,T反应区的检测结果可能是假阳性。当C反应区8作为多样本测试时,方法与T反应区4同。
本试剂卡通过在加样口或出样口处连接流量泵的方式控制待检样本流速,确保待测物均匀过膜,与核孔膜上的包被抗体/抗原充分接触反应,提高灵敏度。
试验例1
荧光免疫分析法的灵敏度试验:将包被有新冠抗体的镀金核孔膜通过超声焊接在试剂卡T反应区,将检测浓度为0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml的新冠合成抗原溶液和标记抗体混合液待检样本经注射泵以1ml/h的速度经过T反应区30min,加入清洗液清洗,检测T反应区的荧光响应值(OD值),重复检测2次,记录OD值,以OD值作为纵坐标Y轴,新冠合成抗原待检样本浓度为横坐标X轴做Lorentz拟合标准曲线,得出标准曲线线性方程:y=-16474.9+[(2×8269571)/π]×{208/[4×
(x-76.22)2+2082]}(R=0.9848)。
用制备好的试剂卡重复检测同一份阴性样品8次,记录OD值,计算评均值和标准差SD值,将平均值±2SD值代入标准曲线方程后,所计算出的浓度即为本试剂卡的最低检测限。本试验平均OD值为0,标准差SD为0,将平均值±2SD代入标准曲线方程,得出本试剂卡的最低检测限为0.3pg/ml。而该重组抗原待检样本用其他常规荧光免疫试剂卡检测,检测限为12.5pg/ml。
试验例2
酶联免疫分析法的灵敏度试验:将包被有新冠抗体的核孔膜通过超声焊接在试剂卡T反应区,将检测浓度分别为0ng/ml、0.001ng/ml、0.01ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml的新冠合成抗原-HRP溶液以1ml/h的速度分别经过T反应区和C反应区30min,加入清洗液清洗,加入显色液显色10min,保留显色液,向显色液中加入终止液,用酶标仪检测显色液的OD值,根据试验例1的方法计算得出本试剂卡的检测限为0.1pg/ml。常规聚苯乙烯96孔板的最低检测限约为10pg/ml。
试验例3
荧光免疫分析法的低噪声试验:将包被有新冠抗体并经1%牛血清蛋白封闭的镀金核孔膜通过超声焊接在试剂卡C反应区,将10μg/ml的标记有荧光微球的新冠抗体溶液以1ml/h的速度经过C反应区30min,重复8个平行样,加入清洗液清洗,检测C反应区的荧光响应值(OD值),结果OD值均为0。
试验例4
荧光免疫分析法的低信噪声试验:将包被有封闭牛血清蛋白的镀金核孔膜通过超声焊接在试剂卡C反应区,将10μg/ml的标记有荧光微球的新冠抗体溶液以1ml/h的速度经过C反应区30min,重复8个平行样,加入清洗液清洗,检测C反应区的荧光响应值(OD值),结果OD值均为0。
试验例5
酶联免疫分析法的低噪声试验:将包被有封闭牛血清蛋白的核孔膜通过超声焊接在试剂卡C反应区,将100ng/ml的新冠合成抗原-HRP溶液以1ml/h的速度经过C反应区30min,重复8个平行样,加入清洗液清洗,清洗后加入显色液显色10min,保留显色液,向显色液中加入终止液,用酶标仪检测显色液的OD值,结果OD值均为0。
以上所述仅是本实用新型的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本实用新型原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。
Claims (10)
1.微流控荧光免疫分析试剂卡,其特征在于,包括试剂卡本体(1)和核孔膜免疫固相载体(2);
所述试剂卡本体设置有:T反应部和C反应部;
所述T反应部包括:T区加样口(3)、T反应区(4)、T区单通流道(5)、T区出样口(6);
所述C反应部包括:C区加样口(7)、C反应区(8)、C区单通流道(9)、C区出样口(10);
所述核孔膜免疫固相载体(2)包括镀金核孔膜、接枝改性核孔膜、接枝改性镀金核孔膜中的任意一种或多种;
所述核孔膜免疫固相载体(2)设置于所述T反应区(4)和/或所述C反应区(8)。
2.如权利要求1所述的微流控荧光免疫分析试剂卡,其特征在于,所述T区单通流道(5)为所述T反应区(4)的待检样本流道,连接所述T反应区(4)和所述T区出样口(6)。
3.如权利要求2所述的微流控荧光免疫分析试剂卡,其特征在于,所述C区单通流道(9)为所述C反应区(8)的待检样本流道,连接所述C反应区(8)和所述C区出样口(10)。
4.如权利要求3所述的微流控荧光免疫分析试剂卡,其特征在于,所述T区单通流道(5)与所述C区单通流道(9)为独立的两个流道,互不连通。
5.如权利要求4所述的微流控荧光免疫分析试剂卡,其特征在于,设置于所述T反应区(4)的所述核孔膜免疫固相载体(2)为包被抗体/抗原的核孔膜(2A),包被有能够与待检样本特异性结合的抗体或抗原,对待检样本进行定量和/或定性检测。
6.如权利要求5所述的微流控荧光免疫分析试剂卡,其特征在于,设置于所述C反应区(8)的所述核孔膜免疫固相载体(2)为空白封闭核孔膜(2B),包被有不与待检样本特异性结合的抗体或抗原,避免所述T反应区(4)出现假阳性。
7.如权利要求5所述的微流控荧光免疫分析试剂卡,其特征在于,设置于所述C反应区(8)的所述核孔膜免疫固相载体(2)为包被抗体/抗原的核孔膜(2A),包被有能够与待检样本特异性结合的抗体或抗原,对待检样本进行定量和/或定性检测。
8.如权利要求6或7所述的微流控荧光免疫分析试剂卡,其特征在于,所述T区加样口(3)和/或所述C区加样口(7)可以根据需求做成与加样工具相匹配的形状或尺寸。
9.如权利要求6或7所述的微流控荧光免疫分析试剂卡,其特征在于,所述T区出样口(6)和/或所C区出样口(10)可以根据需求做成与抽样工具相匹配的形状或尺寸。
10.荧光免疫试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1至9任一项所述的微流控荧光免疫分析试剂卡。
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- 2021-09-03 CN CN202122127269.4U patent/CN215415464U/zh active Active
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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GR01 | Patent grant | ||
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