CN117589981A - 一种碳点-介孔硅复合荧光微球及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碳点‑介孔硅复合荧光微球及其制备方法与应用。所述制备方法包括：提供枝状介孔硅；使碳点前驱体与第一硅烷偶联剂发生水热反应，制得硅烷化碳点；以及，使所述硅烷化碳点与枝状介孔硅进行反应，制得碳点‑介孔硅复合荧光微球；其中，所述硅烷化碳点通过化学键的方式分散于枝状介孔硅的孔隙中。本发明利用碳点‑介孔硅复合荧光微球良好的荧光特性，结合碳点‑介孔硅复合荧光微球标记技术和侧流层析技术，在优化实验条件的基础上，构建荧光侧流层析试纸条。本发明提供的侧流层析高灵敏定量检测方法具有标记稳定性好、特异性强、灵敏度高以及定量准确的优势，可应用于生物医学、食品安全、环境监测等诸多相关领域。
Description
技术领域
本发明属于荧光材料与检测技术领域，涉及一种碳点-介孔硅复合荧光微球及其制备方法与应用，尤其涉及一种碳点-介孔硅复合荧光微球及其制备方法，及基于碳点-介孔硅复合荧光微球的侧流层析高灵敏定量检测方法。
背景技术
侧流层析(LFA)近年来发展迅速，已广泛应用于食品安全、疾病诊断、药物检测、环境监测等方面。与酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)等检测技术相比，LFA具有简单、快速、不依赖大型仪器设备、价格低廉等优点，可广泛应用于实时测试、现场测试和家庭自测。
AuNPs是横向流动免疫分析中应用最广泛的标记材料，并已商业化，但其缺点是灵敏度低。到目前为止，许多新的标记材料已被广泛应用于LFA，如量子点(QDs)、上转换材料、碳点(CDs)、时间分辨材料、磁性材料、纳米酶等。基于CDs的荧光分析具有灵敏度高、操作简单、成本低、结果输出快等显著优点，具有巨大的应用潜力。然而，基于CDs的荧光分析仍然难以检测低丰度的生物标志物，因此由基本纳米晶体信号衍生的二级纳米结构应运而生，也被广泛应用于LFAs。这种结构为纳米晶体的磁性/荧光协同性能和不同材料功能的集成提供了可能性。因此，提供一种新的复合荧光微球结构并应用于侧流层析标记与检测具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种碳点-介孔硅复合荧光微球及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种碳点-介孔硅复合荧光微球的制备方法，其包括：
提供枝状介孔硅；
使碳点前驱体与第一硅烷偶联剂发生水热反应，制得硅烷化碳点；
以及，使所述硅烷化碳点与枝状介孔硅进行反应，制得碳点-介孔硅复合荧光微球；其中，所述硅烷化碳点通过化学键的方式分散于枝状介孔硅的孔隙中。
本发明实施例还提供了前述的制备方法制得的碳点-介孔硅复合荧光微球，所述碳点-介孔硅复合荧光微球包括枝状介孔硅，及通过化学键的方式分散于所述枝状介孔硅所含孔隙中。
本发明实施例还提供了前述的碳点-介孔硅复合荧光微球于侧流层析技术中的应用。
本发明实施例还提供了一种非诊疗目的的基于碳点-介孔硅复合荧光微球的侧流层析高灵敏定量检测方法，其包括：
(1)提供前述的碳点-介孔硅复合荧光微球；
(2)在所述碳点-介孔硅复合荧光微球的表面修饰氨基；
(3)将待分析物对应的抗体或适配体采用化学交联的方式连接到步骤(2)所获碳点-介孔硅复合荧光微球表面，得到碳点-介孔硅复合荧光微球标记物；
(4)在层析膜上设置测试带和质控带，其中，所述质控带固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述测试带固定有能与待分析物结合或与步骤(3)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；
(5)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条，其中，所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性；
(6)将步骤(3)所获碳点-介孔硅复合荧光微球标记物与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度，并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明中的硅烷化碳点、枝状介孔硅尺寸均匀，制备重复性良好；同时硅烷化碳点与枝状介孔硅复合简单，复合后不会发生硅烷化碳点从孔道中泄漏的问题，这样可以保证复合微球具有较高的量子效率和良好的荧光稳定性；
(2)本发明制备的碳点-介孔硅复合荧光微球表面的修饰位点比单个的碳点颗粒更为丰富，有利于表面生物功能化；
(3)本发明的方法利用碳点-介孔硅复合荧光微球良好的荧光特性，结合碳点-介孔硅复合荧光微球标记技术和侧流层析技术，在优化实验条件的基础上，构建荧光侧流层析试纸条。本发明方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏度高。与常用的胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。同时，本发明采用的碳点-介孔硅复合荧光微球材料的制备步骤简单，量子效率高，且表面富含氨基，可进行表面修饰。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案中碳点-介孔硅复合荧光微球的制备及其与抗体偶联示意图；
图2是本发明一典型实施方案中一种免疫层析试纸条的组装示意图；
图3是本发明实施例1中基于竞争法原理的碳点-介孔硅复合荧光微球标记免疫层析技术及AFB1检测示意图；
图4a是本发明实施例1中枝状介孔硅的TEM图片；
图4b是本发明实施例1中碳点-介孔硅复合荧光微球的TEM图片；
图5是本发明实施例1中硅烷化碳点、枝状介孔硅、碳点-介孔硅复合荧光微球的红外光谱图；
图6a是本发明实施例1中免疫层析试纸条在不同浓度AFB1的图片(紫外灯照射下)；
图6b是本发明实施例1中免疫层析试纸条的T线与C线峰面积比值与AFB1浓度间的线性拟合结果图；
图7是本发明一典型实施方案中碳点-介孔硅复合荧光微球制备及其生物功能化探针的构建流程示意图。
附图说明：1-样品垫，2-结合垫，3-测试带，4-质控带，5-吸水垫，6-PVC底板。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是将大量CDs与单个多孔纳米材料进行组装是提高灵敏度的有效方法。该方法具有负载能力高、均匀性好、能够控制预合成的多孔纳米颗粒的尺寸以降低聚集性等优点。在众多的多孔纳米粒子中，枝状介孔二氧化硅纳米粒子(DMSNs)具有中心径向孔道结构，具有比表面积高、孔容大、易功能化等优点。这种特殊的孔隙结构允许其负载大量的活性位点(如有机分子、金属或金属氧化物纳米粒子)而不堵塞孔隙。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种碳点-介孔硅复合荧光微球的制备方法包括：
提供枝状介孔硅；
使碳点前驱体(以下可简称为RB)与第一硅烷偶联剂发生水热反应，制得硅烷化碳点；
以及，使所述硅烷化碳点与枝状介孔硅进行反应，制得碳点-介孔硅复合荧光微球；其中，所述硅烷化碳点通过化学键的方式分散于枝状介孔硅的孔隙中。
在一些优选实施方案中，所述枝状介孔硅的粒径为60～300nm，优选为250nm。
在一些优选实施方案中，所述枝状介孔硅的孔隙直径为3～25nm。
在一些优选实施方案中，所述硅烷化碳点的粒径为3nm。
在一些优选实施方案中，所述硅烷化碳点的发射波长为500～650nm。
在一些优选实施方案中，所述碳点-介孔硅复合荧光微球的发射波长与硅烷化碳点的发射波长相同。
在一些优选实施方案中，所述碳点-介孔硅复合荧光微球的发射波长范围为500～650nm；最佳发射波长为526nm。
在一些优选实施方案中，所述制备方法包括：将碳点前驱体、第一硅烷偶联剂溶于水并于160℃发生水热反应4h，制得所述硅烷化碳点。
进一步地，所述碳点前驱体具有如式(I)所示的结构：
进一步地，所述第一硅烷偶联剂包括N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧硅烷中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
在一些优选实施方案中，所述硅烷化碳点与枝状介孔硅是在碱性条件下通过化学键相连接的。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的制备方法制得的碳点-介孔硅复合荧光微球，所述碳点-介孔硅复合荧光微球包括枝状介孔硅，及通过化学键的方式分散于所述枝状介孔硅所含孔隙中。
进一步地，所述碳点-介孔硅复合荧光微球中枝状介孔硅与碳点的质量比为1∶50～10∶50。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的碳点-介孔硅复合荧光微球于侧流层析技术中的应用。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种非诊疗目的的基于碳点-介孔硅复合荧光微球的侧流层析高灵敏定量检测方法，其包括：
(1)提供前述的碳点-介孔硅复合荧光微球；
(2)在所述碳点-介孔硅复合荧光微球的表面修饰氨基；
(3)将待分析物对应的抗体或适配体采用化学交联的方式连接到步骤(2)所获碳点-介孔硅复合荧光微球表面，得到碳点-介孔硅复合荧光微球标记物(亦记为：抗体修饰的碳点-介孔硅复合荧光微球或适配体修饰的碳点-介孔硅复合荧光微球)；
(4)在层析膜上设置测试带和质控带，其中，所述质控带固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述测试带固定有能与待分析物结合或与步骤(3)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；
(5)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条，其中，所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性；
(6)将步骤(3)所获碳点-介孔硅复合荧光微球标记物与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度，并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
在一些优选实施方案中，步骤(3)包括：使所述碳点-介孔硅复合荧光微球与第二硅烷偶联剂反应进行所述表面修饰氨基。
进一步地，所述第二硅烷偶联剂包括APTES、APTMS、DAMO中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
在一些优选实施方案中，步骤(3)具体包括：
采用丁二酸酐法在所获表面修饰有氨基的碳点-介孔硅复合荧光微球的表面修饰羧基；
以及，采用化学交联将待分析物对应的抗体或适配体连接到所获碳点-介孔硅复合荧光微球表面，得到碳点-介孔硅复合荧光微球标记物。
进一步地，所述丁二酸酐法的反应为无水条件，溶剂包括DMF、二甲基亚砜、吡啶、甲苯中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步地，所述化学交联包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化偶联方法将待分析物对应的抗体或适配体与碳点-介孔硅复合荧光微球进行反应，反应所选缓冲液包括2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，pH值为6.0。
进一步地，所述方法还包括：活化羧基后用碱性物质调节pH值至7.0。
具体地，活化羧基后用0.1M氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
在一些优选实施方案中，步骤(3)中所述待分析物对应的抗体或适配体包括抗原、半抗原、单克隆抗体、多克隆抗体或适配体，且不限于此。
进一步地，所述碳点-介孔硅复合荧光微球标记物中抗体包括抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，标记的能识别黄曲霉毒素B1的DNA链的序列如SEQ ID NO.1所示；具体序列为5’-HOOC-A12-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-GGC-CCA-CA-3’。
在一些优选实施方案中，步骤(4)中，基于抗原-抗体的试纸条质控带与基于适配体的试纸条质控带的固定材料不同。
进一步地，基于抗原-抗体的试纸条质控带为能与荧光标记抗体结合的抗体，而基于适配体的试纸条质控带为碳点-介孔硅复合荧光微球荧光标记DNA的互补链(与链霉亲和素结合)。
进一步地，基于抗原-抗体检测黄曲霉毒素B1的试纸条测试带固定有AFB1-BSA，质控带固定有山羊抗小鼠IgG。
进一步地，基于适配体检测黄曲霉毒素B1的试纸条测试带固定有AFB1-BSA，质控带固定有与碳点-介孔硅复合荧光微球荧光标记DNA链的互补链，具体序列如SEQ ID NO.2所示；具体5’-biotin-TGT-GGG-CCT-AGC-GAA-GGG-CAC-GAG-ACA-CAG-AGA-GAC-AAC-ACG-ACG-TGC-CCA-AC-3’。
在一些优选实施方案中，所述测试带与质控带的间隔距离为4mm。
在一些优选实施方案中，步骤(6)包括：将步骤(3)所获碳点-介孔硅复合荧光微球标记物与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条的样品垫，，反应20或30分钟后，利用荧光分析仪进行测试。
具体地，20μL荧光标记物与50μL样品混合，添加到样品垫上后需等待30min。
在一些优选实施方案中，所述待分析物包括生化标志物。
进一步地，所述生化标志物包括小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒，且不限于此。
更进一步地，所述待分析物包括黄曲霉毒素B1、金黄色葡萄球菌或大肠杆菌，且不限于此。
本发明提供的基于碳点-介孔硅复合荧光微球免疫层析高灵敏定量检测的方法是一种以碳点-介孔硅复合荧光微球为荧光信号的、在免疫层析试纸条上实现分析物快速灵敏检测的新方法。
这种方法是将分析物的配体(如适配体、抗体等)修饰碳点-介孔硅复合荧光微球，分析物的另一配体固定在层析膜上，利用配体作用，如竞争法或夹心法原理结合碳点-介孔硅复合荧光微球的荧光性质检测样本中是否含有分析物。
在一些较为具体的实施方案中，所述非诊疗目的的基于碳点-介孔硅复合荧光微球的侧流层析高灵敏定量检测方法包括：
步骤1)合成粒径为3nm左右的硅烷化碳点；
步骤2)合成粒径约为250nm左右的枝状介孔硅；
步骤3)将步骤1)和步骤2)所获得的产物通过化学键连接的方式合成碳点-介孔硅复合荧光微球，并在其表面修饰氨基；
步骤4)用化学交联将分析物对应的抗体或适配体连接到碳点-介孔硅复合荧光微球表面，得到抗体或适配体修饰的碳点-介孔硅复合荧光微球；
步骤5)在层析膜上设有测试带和质控带，其中质控带固定有能与所述抗体或适配体特异性结合的生物分子，测试带固定有能与分析物结合或与步骤4)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；
步骤6)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性；
步骤7)将碳点-介孔硅复合荧光微球标记物与样品混合，滴加到试纸条上进行层析，样本流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带荧光信号强度，并以荧光强度得到积分曲线，进而以ST/SC实现分析物的定量检测。
本发明提供的碳点-介孔硅复合荧光微球免疫层析高灵敏定量检测的方法是一种以碳点-介孔硅复合荧光微球为荧光信号的、在免疫层析试纸条上实现分析物快速灵敏检测的新方法。
这种方法是将分析物的配体(如适配体、抗体等)修饰碳点-介孔硅复合荧光微球，分析物的另一配体固定在层析膜上，利用配体作用，如竞争法或夹心法原理结合碳点-介孔硅复合荧光微球的荧光性质检测样本中是否含有分析物。
本发明层析试纸条用于定量样本中的至少一种分析物。分析物包括小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物。
本发明碳点-介孔硅复合荧光微球免疫层析高灵敏定量检测的方法能够解决现有技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不准确的不足和缺陷，可实现对微量样本的检测。由于此碳点-介孔硅复合荧光微球受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10～1000倍。
本发明所用碳点-介孔硅复合荧光微球是由RB和硅烷偶联剂经水热法合成的硅烷化碳点与枝状介孔硅通过化学键的方式连接复合而成，且碳点-介孔硅复合荧光微球具有较强的光稳定性以及抗光漂白能力。
作为优选，在本发明的一个实施例中，RB为30mg，硅烷偶联剂为1mL为最佳比例，经水热法合成了粒径在3nm左右的荧光微球。
作为优选，在本发明的一个实施例中，硅烷化碳点与枝状介孔硅质量1∶10为最佳比例，且先组装碳点再修饰氨基。
在一些实施例中，所述分析物包括有黄曲霉毒素B1(AFB1)，金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌等。
在本发明的一个实施例中，所述碳点-介孔硅复合荧光微球标记的配体为抗黄曲霉毒素B1抗体，测试带(亦记为：检测线)上固定的AFB1-BSA，质控带(亦记为：质控线)固定能与抗AFB1抗体结合的抗体。
在本发明的另一个实施例中，所述碳点-介孔硅复合荧光微球标记的配体为能识别黄曲霉毒素B1的DNA链，检测线上固定的AFB1-BSA，质控线固定与链霉亲和素结合的互补链。
本发明采用化学交联将分析物的配体连接到碳点-介孔硅复合荧光微球表面，得到配体修饰的碳点-介孔硅复合荧光微球，其中配体能与分析物特异性结合。
本发明中的化学交联为，当碳点-介孔硅复合荧光微球表面有活性基团，可与配体或质控分子直接反应时，不需用化学交联剂，反之用化学交联剂把配体修饰到碳点-介孔硅复合荧光微球表面。
在一些较为具体的实施方案中，本发明中的碳点-介孔硅复合荧光微球制备及其生物功能化探针的构建流程示意图如图7所示。
在本发明的实施例中采用化学交联法对碳点-介孔硅复合荧光微球进行蛋白质或核酸分子修饰的方法为：利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将碳点-介孔硅复合荧光微球表面的官能团(如羧基、氨基)与蛋白质分子(如抗原、抗体等)或DNA链表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。
作为优选，在本发明的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行修饰，一般步骤为：将碳点-介孔硅复合荧光微球溶液与EDC和NHS混合，然后加入一定量的蛋白质或DNA，以缓冲液为反应介质，孵育4h，加入BSA封闭，以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到蛋白质或核酸修饰的碳点-介孔硅复合荧光微球。
为了降低对碳点-介孔硅复合荧光微球荧光信号的影响，本发明采用弱荧光层析膜、低荧光底板和低荧光扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种荧光侧流层析试纸条，包括：沿设定方向依次连接的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫设置于底板上，所述层析膜为弱荧光层析膜，所述层析膜上设置有测试带和质控带，其中质控带固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述测试带固定有能与待分析物结合或与抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体。
进一步地，所述荧光侧流层析试纸条还包括卡壳，所述底板和卡壳具有低荧光特性，为了降低对碳荧光微球荧光信号的影响，本发明采用弱荧光层析膜、低荧光底板和低荧光扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。
进一步地，所述试纸条中测试带、质控带等限定均如前所述，此处不再赘述。
在一些优选实施方案中，基于抗原-抗体的试纸条质控带与基于适配体的试纸条质控带的固定材料不同。
进一步地，基于抗原-抗体的试纸条质控带为能与荧光标记抗体结合的抗体，而基于适配体的试纸条质控带为碳点-介孔硅复合荧光微球荧光标记DNA的互补链(与链霉亲和素结合)。
进一步地，基于抗原-抗体检测黄曲霉毒素B1的试纸条测试带固定有AFB1-BSA，质控带固定有山羊抗小鼠IgG。
进一步地，基于适配体检测黄曲霉毒素B1的试纸条测试带固定有AFB1-BSA，质控带固定有与碳点-介孔硅复合荧光微球荧光标记DNA链的互补链，具体序列如SEQ ID NO.2所示；具体5’-biotin-TGT-GGG-CCT-AGC-GAA-GGG-CAC-GAG-ACA-CAG-AGA-GAC-AAC-AC
G-ACG-TGC-CCA-AC-3’。
具体的，请参阅图2所示，为荧光侧流层析试纸条的组装示意图，其包括样品垫1、结合垫2、测试带(T线)3、质控带(C线)4、吸水垫5和PVC底板6。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例1
基于抗原-抗体竞争法检测黄曲霉毒素B1
(一)碳点-介孔硅复合荧光微球(DMSNs-CDs)的合成及修饰
30mg RB粉末用9mL去离子水充分溶解，向溶液中加入1 mL TMS-EDA。混合液在室温下搅拌均匀后转入25mL水热反应釜，放入烘箱中，在160℃下反应4h。反应结束后，待反应釜冷却至室温再取出。将反应液经0.22μm滤膜过滤后用2000Da的透析袋透析3天。纯化后的产物经冷冻干燥得到橘红色固体，即硅烷化CDs。
68mg的TEA溶于25mL水中，并在80℃下搅拌30min使其充分溶解。向溶中加入380mgCTAB和168mg水杨酸钠后继续搅拌1h。将4mL TEOS匀速滴加到上述混合液中，并在80℃下继续搅拌2h。反应完成后，加入乙醇稀释混合液并通过离心收集沉淀(10000rpm，10min)。沉淀用乙醇洗两次，再将沉淀分散到20mL乙醇溶液(含有1.25mL浓盐酸)中，并在60℃下冷凝回流24h以提取残留的有机模板。将混合液经离心收集粗产物，用水和乙醇洗涤后得到纯化的DMSNs。
50mg DMSNs和5mg硅烷化CDs溶于50mL乙醇溶液中并超声10min，使它们完全溶解。向混合液中加入1.25mL氨水，在室温下搅拌24h。为了在DMSNs表面修饰氨基，向溶液中加入100μL APTES继续搅拌12h。反应完成后，将混合液离心收集沉淀(10000rpm，10min)，并用水和乙醇清洗后获得纯化的DMSNs-CDs。
将5mg DMSNs-CDs分散到25mL DMF中，加入25mg丁二酸酐，充分溶解后在室温下振荡反应2h。反应物经离心收集沉淀并用H2O洗涤两次后获得DMSNs-CDs-COOH。
DMSNs-CDs-COOH溶于500μL MES缓冲溶液(10mM，pH＝6.1)中，加入60μL EDC(10mg/mL)和30μL NHS(10mg/mL)，并将混合液在室温下振荡反应30min以活化羧基。调节反应液pH至弱碱性并加入20μg抗AFB1抗体，继续在室温下孵育4h。通过离心(12000rpm，10min)除去未结合的抗AFB1抗体并用磷酸盐缓冲溶液(PBS)(10mM，pH＝7.4)沉淀洗两次以获得纯化的DMSNs-CDs-mAbs。最后将产物分散在1mL PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，含有1％BSA)中，并在4℃下保存以备使用。
(二)AFB1-BSA人工抗原的合成
-AFB1肟(AFB1O)的制备
a)500μL CMO(8mg/mL，溶于吡啶)溶解1mg AFB1，置于28℃摇床，150rpm，反应24h。
b)上述离心管中加入1.5mL超纯水，用NaOH(0.1mol/L)将pH调至8.0
c)上述离心管中加入2mL甲苯，剧烈震荡3min，静置分层，将水相吸取到干净的离心管中。
d)NaOH(0.1mol/L)将pH调至8.0
e)上述离心管中加入2mL乙酸乙酯，剧烈震荡3min，静置分层，将上层吸取到干净的离心管中。下层继续加入2mL乙酸乙酯，继续震荡重复前一步操作，收集上层。
f)上述离心管中加入1.5mL超纯水，剧烈震荡，静置分层后将上层弃掉。
g)通过真空干燥将上述混合物彻底干燥，得到肟化产物。
-AFB1肟与BSA偶联物的制备
a)将肟化产物用500μL DMF溶解后，加入2.5mg NHS、10mg EDC置于25℃摇床，120rpm，反应16h。
b)1mL BSA(6mg/mL，溶于0.13mol/L的NaHCO3)加到上述述离心管中置于37℃摇床，120rpm，反应8h。
c)4℃环境下，在0.01mol/LPBS(pH 7.4)中透析2d(24h更换一次透析液)，置于-20℃备用。
(三)免疫层析试纸条的构建
将由玻璃纤维制成的样品垫用20mmol/L硼酸钠缓冲液(pH 8.0)饱和，其中含有1.0％(w/v)BSA，0.25％Tween-20和0.1％(w/v)NaN3，并在60℃下放置干燥2小时。将0.8mg/mL的AFB1-BSA偶联物和0.8mg/mL的山羊抗小鼠IgG以0.74μL/cm的密度喷涂到NC膜上分别作为测试线(T线)和对照线(C线)。然后将所制备的NC膜在37℃下过夜干燥。LFIA试纸条是通过将样品垫，NC膜和吸收垫粘贴到PVC背衬卡上而彼此重叠2mm而构成的。将组装好的条切成4mm宽，将其包装在装有干燥剂的塑料袋中以备进一步使用。
(四)AFB1检测
以PBS作为稀释液，将AFB1标准溶液配制系列浓度如下：0ng/mL，0.05ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，10ng/mL。将样品(50μL AFB1标准品或预处理颗粒样品)与20μLDMSNs-CDs-mAbs混合在96孔板的孔中。孵育5min后，将试条垂直插入混合溶液中，反应30min后从孔板上取下。测试条安装在塑料壳中后，用紫外分析仪观察可视化结果。对于定量结果，将检测条插入荧光免疫层析仪进行分析，将T线和C线的荧光强度转换成一个积分区域来表示结果。为了减少干扰，提高信噪比(SNR)值，计算了T线和C线的荧光强度之比(ST/SC比)。通过绘制标准曲线量化ST/SC与AFB1浓度的关系。
结果表明，该荧光免疫试纸条对于AFB1的检测范围为0.05-10ng/mL，检测限为0.05ng/mL，相关系数为0.9919，可用于检测AFB1。
实施例2
基于适配体竞争法检测黄曲霉毒素B1
(一)碳点-介孔硅复合荧光微球(DMSNs-CDs)的合成及修饰
30mg RB粉末用9mL去离子水充分溶解，向溶液中加入1mL TMS-EDA。混合液在室温下搅拌均匀后转入25mL水热反应釜，放入烘箱中，在160℃下反应4h。反应结束后，待反应釜冷却至室温再取出。将反应液经0.22μm滤膜过滤后用2000Da的透析袋透析3天。纯化后的产物经冷冻干燥得到橘红色固体，即硅烷化CDs。
68mg的TEA溶于25mL水中，并在80℃下搅拌30min使其充分溶解。向溶中加入380mgCTAB和168mg水杨酸钠后继续搅拌1h。将4mL TEOS匀速滴加到上述混合液中，并在80℃下继续搅拌2h。反应完成后，加入乙醇稀释混合液并通过离心收集沉淀(10000rpm，10min)。沉淀用乙醇洗两次，再将沉淀分散到20mL乙醇溶液(含有1.25mL浓盐酸)中，并在60℃下冷凝回流24h以提取残留的有机模板。将混合液经离心收集粗产物，用水和乙醇洗涤后得到纯化的DMSNs。
50mg DMSNs和5mg硅烷化CDs溶于50mL乙醇溶液中并超声10min，使它们完全溶解。向混合液中加入1.25mL氨水，在室温下搅拌24h。为了在DMSNs表面修饰氨基，向溶液中加入100μL APTES继续搅拌12h。反应完成后，将混合液离心收集沉淀(10000rpm，10min)，并用水和乙醇清洗后获得纯化的DMSNs-CDs。
60μL EDC(2mg/mL)和30μL NHS(2mg/mL)添加到400μL羧基修饰的适配体(2nmol/mL)反应0.5h。5mg DMSNs-CDs加入到500μL MES(0.5mM，pH 6.1)缓冲溶液混合，摇床反应过夜。用超纯水清洗后存储在Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 7.4)。
其中，检测探针DNA序列为：
5’-HOOC-A12-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-CTA-GGC-CCA-CA-3；
互补探针序列为：
5’-biotin-TGT-GGG-CCT-AGC-GAA-GGG-CAC-GAG-ACA-CAG-AGA-GAC-AAC-ACG-TGC-CCA-AC-3’。
(二)AFB1-BSA人工抗原的合成
-AFB1肟(AFB1O)的制备
a)500μL CMO(8mg/mL，溶于吡啶)溶解1mgAFB1，置于28℃摇床，150rpm，反应24h。
b)上述离心管中加入1.5mL超纯水，用NaOH(0.1mol/L)将pH调至8.0
c)上述离心管中加入2mL甲苯，剧烈震荡3min，静置分层，将水相吸取到干净的离心管中。
d)NaOH(0.1mol/L)将pH调至8.0
e)上述离心管中加入2mL乙酸乙酯，剧烈震荡3min，静置分层，将上层吸取到干净的离心管中。下层继续加入2mL乙酸乙酯，继续震荡重复前一步操作，收集上层。
f)上述离心管中加入1.5mL超纯水，剧烈震荡，静置分层后将上层弃掉。
g)通过真空干燥将上述混合物彻底干燥，得到肟化产物。
-AFB1肟与BSA偶联物的制备
a)将肟化产物用500μL DMF溶解后，加入2.5mg NHS、10mg EDC置于25℃摇床，120rpm，反应16h。
b)1mL BSA(6mg/mL，溶于0.13mol/L的NaHCO3)加到上述述离心管中置于37℃摇床，120rpm，反应8h。
c)4℃环境下，在0.01mol/LPBS(pH 7.4)中透析2d(24h更换一次透析液)，置于-20℃备用。
(三)免疫层析试纸条的构建
将由玻璃纤维制成的样品垫用20mmol/L硼酸钠缓冲液(pH 8.0)饱和，其中含有1.0％(w/v)BSA，0.25％Tween-20和0.1％(w/v)NaN3，并在60℃下放置干燥2小时。为了将互补探针固定在NC膜上，我们使用链霉亲和素作为中间体，使生物素与NC膜发生结合反应。具体方法为：在生物素修饰的互补探针(干粉)中加入20μL链霉亲和素(1mg/mL)，摇匀后静置40min，得到100μM的捕获探针和互补探针溶液。然后将AFB1-BSA作为T线，将检测探针固定在NC膜上作为C线，在37℃烘箱中烘干。LFIA试纸条是通过将样品垫，NC膜和吸收垫粘贴到PVC背衬卡上而彼此重叠2mm而构成的。将组装好的试纸条切成4mm宽，将其包装在装有干燥剂的塑料袋中以备进一步使用。
(四)AFB1检测
以PBS作为稀释液，将AFB1标准溶液配制系列浓度如下：0ng/mL，0.01ng/mL，0.02ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL。将样品(60μL AFB1标准品或预处理颗粒样品)与10μL DMSNs-CDs-DNA混合在96孔板的孔中。孵育5min后，将试条垂直插入混合溶液中，反应30min后从孔板上取下。测试条安装在塑料壳中后，用紫外分析仪观察可视化结果。对于定量结果，将检测条插入荧光免疫层析仪进行分析，将T线和C线的荧光强度转换成一个积分区域来表示结果。为了减少干扰，提高信噪比(SNR)值，计算了T线和C线的荧光强度之比(ST/SC比)。通过绘制标准曲线量化ST/SC与AFB1浓度的关系。
实施例3
基于双抗夹心法检测PSA抗原
(一)碳点-介孔硅复合荧光微球(DMSNs-CDs)的合成及修饰
30mg RB粉末用9mL去离子水充分溶解，向溶液中加入1mL TMS-EDA。混合液在室温下搅拌均匀后转入25mL水热反应釜，放入烘箱中，在160℃下反应4h。反应结束后，待反应釜冷却至室温再取出。将反应液经0.22μm滤膜过滤后用2000Da的透析袋透析3天。纯化后的产物经冷冻干燥得到橘红色固体，即硅烷化CDs。
68mg的TEA溶于25mL水中，并在80℃下搅拌30min使其充分溶解。向溶中加入380mgCTAB和168mg水杨酸钠后继续搅拌1h。将4mL TEOS匀速滴加到上述混合液中，并在80℃下继续搅拌2h。反应完成后，加入乙醇稀释混合液并通过离心收集沉淀(10000rpm，10min)。沉淀用乙醇洗两次，再将沉淀分散到20mL乙醇溶液(含有1.25mL浓盐酸)中，并在60℃下冷凝回流24h以提取残留的有机模板。将混合液经离心收集粗产物，用水和乙醇洗涤后得到纯化的DMSNs。
50mg DMSNs和5mg硅烷化CDs溶于50mL乙醇溶液中并超声10min，使它们完全溶解。向混合液中加入1.25mL氨水，在室温下搅拌24h。为了在DMSNs表面修饰氨基，向溶液中加入100μL APTES继续搅拌12h。反应完成后，将混合液离心收集沉淀(10000rpm，10min)，并用水和乙醇清洗后获得纯化的DMSNs-CDs。
将5mg DMSNs-CDs分散到25mL DMF中，加入25mg丁二酸酐，充分溶解后在室温下振荡反应2h。反应物经离心收集沉淀并用H2O洗涤两次后获得DMSNs-CDs-COOH。
将5mg DMSNs-CDs-COOH溶于5mL PBS缓冲液(1X)中，得到DMSNs-CDs-COOH悬浮液(1mg/mL)。然后将溶液的pH调节至pH 5.0以使DMSNs-CDs的羧基质子化。之后，将EDC(19mg)和NHS(22mg)的混合物添加到该溶液中，以在室温下搅拌30分钟激活DMSNs-CDs羧基。然后，将DMSNs-CDs悬浮液的pH调节至7.0。向上述活化溶液中加入50μg PSA抗体，在室温下连续搅拌2小时，得到DMSNs-CDs-抗体偶联物。添加25μL 1％BSA反应1h封闭未反应的羧基位点。将获得的DMSNs-CDs-PSA抗体偶联物溶液在4℃下保持过夜，然后使用100K离心超滤管以4000rpm的速度离心20分钟，并在4℃下黑暗保存直至使用。
(二)免疫层析试纸条的构建
将由玻璃纤维制成的样品垫用20mmol/L硼酸钠缓冲液(pH 8.0)饱和，其中含有1.0％(w/v)BSA，0.25％Tween-20和0.1％(w/v)NaN3，并在60℃下干燥放置2小时。将小鼠PSA单克隆抗体(0.8mg/mL)和山羊抗小鼠IgG抗体(0.5mg/mL)分别置于NC膜上作为T线和C线。将所制备的NC膜在37℃下过夜干燥。然后，将组装有样品垫，NC膜和吸收垫的塑料衬板切成4毫米宽的横向流动条。
(三)PSA抗原的检测
以PBS作为稀释液，将PSA抗原标准溶液配制系列浓度如下：0ng/mL，0.01ng/mL，0.02ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL。将样品(60μL PSA标准品或预处理样品)与10μLDMSNs-CDs-mAbs混合在96孔板的孔中。孵育5min后，将试条垂直插入混合溶液中，反应30min后从孔板上取下。测试条安装在塑料壳中后，用紫外分析仪观察可视化结果。对于定量结果，将检测条插入荧光免疫层析仪进行分析，将T线和C线的荧光强度转换成一个积分区域来表示结果。为了减少干扰，提高信噪比(SNR)值，计算了T线和C线的荧光强度之比(ST/SC比)。通过绘制标准曲线量化ST/SC与PSA抗原浓度的关系。
实施例4
基于双抗夹心法检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)
(一)碳点-介孔硅复合荧光微球(DMSNs-CDs)的合成及修饰
30mg RB粉末用9mL去离子水充分溶解，向溶液中加入1mL TMS-EDA。混合液在室温下搅拌均匀后转入25mL水热反应釜，放入烘箱中，在160℃下反应4h。反应结束后，待反应釜冷却至室温再取出。将反应液经0.22μm滤膜过滤后用2000Da的透析袋透析3天。纯化后的产物经冷冻干燥得到橘红色固体，即硅烷化CDs。
68mg的TEA溶于25mL水中，并在80℃下搅拌30min使其充分溶解。向溶中加入380mgCTAB和168mg水杨酸钠后继续搅拌1h。将4mL TEOS匀速滴加到上述混合液中，并在80℃下继续搅拌2h。反应完成后，加入乙醇稀释混合液并通过离心收集沉淀(10000rpm，10min)。沉淀用乙醇洗两次，再将沉淀分散到20mL乙醇溶液(含有1.25mL浓盐酸)中，并在60℃下冷凝回流24h以提取残留的有机模板。将混合液经离心收集粗产物，用水和乙醇洗涤后得到纯化的DMSNs。
50mg DMSNs和5mg硅烷化CDs溶于50mL乙醇溶液中并超声10min，使它们完全溶解。向混合液中加入1.25mL氨水，在室温下搅拌24h。为了在DMSNs表面修饰氨基，向溶液中加入100μL APTES继续搅拌12h。反应完成后，将混合液离心收集沉淀(10000rpm，10min)，并用水和乙醇清洗后获得纯化的DMSNs-CDs。
将5mg DMSNs-CDs分散到25mL DMF中，加入25mg丁二酸酐，充分溶解后在室温下振荡反应2h。反应物经离心收集沉淀并用H2O洗涤两次后获得DMSNs-CDs-COOH。
DMSNs-CDs-COOH分散到300μL MES缓冲溶液(10mM，pH＝6.1)中，加入1mg EDC和1mg NHS后，将混合液置于摇床，并在室温下孵育30min以活化羧基。将反应液的pH值调节至弱碱性，加入0.5mg万古霉素后，继续在摇床上孵育3h。通过离心(12000rpm，10min)去除未结合的万古霉素并用H2O洗两次以获得纯化的DMSNs-CDs-VAN。最后将产物分散在1mL PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，含有1％BSA)中，并在4℃下保存以备使用。
(二)免疫层析试纸条的构建
将由玻璃纤维制成的样品垫用20mmol/L硼酸钠缓冲液(pH 8.0)饱和，其中含有1.0％(w/v)BSA，0.25％Tween-20和0.1％(w/v)NaN3，并在60℃下干燥放置2小时。将小鼠S.aureus单克隆抗体(1mg/mL)和山羊抗小鼠IgG抗体(0.8mg/mL)分别置于NC膜上作为T线和C线。将所制备的NC膜在37℃下过夜干燥。然后，将组装有样品垫，NC膜和吸收垫的塑料衬板切成4mm宽的横向流动条。
(三)S.aureus的检测
制备以下浓度的菌液：0、10、102、103、104、105、106、107cfu/mL。将样品(50μLS.aureus菌液或实际样品)和20μL DMSNs-CDs-VAN加入到96孔板中，孵育5min后将试纸条插入孔中等待30min。待反应稳定后将试纸条装入塑料卡壳，在365nm的紫外灯暗箱中观察视觉结果。至于定量结果则用荧光免疫层析仪进行检测，以T线的荧光强度转换成信号峰的积分面积表示。S.aureus的标准曲线是以T线信号峰积分面积与S.aureus浓度之间的关系建立的。
结果表明，该荧光免疫试纸条对S.aureus的检测范围为102-106cfu/mL，检测限为102cfu/mL，相关系数为0.9896，可用于检测S.aureus。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种碳点-介孔硅复合荧光微球的制备方法，其特征在于包括：
提供枝状介孔硅；
使碳点前驱体与第一硅烷偶联剂发生水热反应，制得硅烷化碳点；
以及，使所述硅烷化碳点与枝状介孔硅进行反应，制得碳点-介孔硅复合荧光微球；其中，所述硅烷化碳点通过化学键的方式分散于枝状介孔硅的孔隙中。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述枝状介孔硅的粒径为60～300nm；和/或，所述枝状介孔硅的孔隙直径为3～25nm；和/或，所述硅烷化碳点的粒径为3nm；
和/或，所述硅烷化碳点的发射波长为500～650nm；
和/或，所述碳点-介孔硅复合荧光微球的发射波长与硅烷化碳点的发射波长相同；
和/或，所述碳点-介孔硅复合荧光微球的发射波长范围为500～650nm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：将碳点前驱体、第一硅烷偶联剂溶于水并于160℃发生水热反应4h，制得所述硅烷化碳点；
优选的，所述碳点前驱体具有如式(I)所示的结构：
优选的，所述第一硅烷偶联剂包括N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧硅烷中的任意一种或两种以上的组合；
和/或，所述硅烷化碳点与枝状介孔硅是在碱性条件下通过化学键相连接的。
4.由权利要求1-3中任一项所述的制备方法制得的碳点-介孔硅复合荧光微球，其特征在于：所述碳点-介孔硅复合荧光微球包括枝状介孔硅，及通过化学键的方式分散于所述枝状介孔硅所含孔隙中；优选的，所述碳点-介孔硅复合荧光微球中枝状介孔硅与碳点的质量比为1∶50～10∶50。
5.权利要求4所述的碳点-介孔硅复合荧光微球于侧流层析技术中的应用。
6.一种荧光侧流层析试纸条，其特征在于包括：沿设定方向依次连接的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫设置于底板上，所述层析膜为弱荧光层析膜，所述层析膜上设置有测试带和质控带，其中质控带固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述测试带固定有能与待分析物结合或与抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体。
7.一种非诊疗目的的基于碳点-介孔硅复合荧光微球的侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于包括：
(1)提供权利要求4所述的碳点-介孔硅复合荧光微球；
(2)在所述碳点-介孔硅复合荧光微球的表面修饰氨基；
(3)将待分析物对应的抗体或适配体采用化学交联的方式连接到步骤(2)所获碳点-介孔硅复合荧光微球表面，得到碳点-介孔硅复合荧光微球标记物；
(4)在层析膜上设置测试带和质控带，其中，所述质控带固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述测试带固定有能与待分析物结合或与步骤(3)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；
(5)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条，其中，所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性；
(6)将步骤(3)所获碳点-介孔硅复合荧光微球标记物与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度，并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
8.根据权利要求7所述的侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于，步骤(3)包括：使所述碳点-介孔硅复合荧光微球与第二硅烷偶联剂反应进行所述表面修饰氨基；优选的，所述第二硅烷偶联剂包括APTES、APTMS、DAMO中的任意一种或两种以上的组合；
和/或，步骤(3)具体包括：
采用丁二酸酐法在所获表面修饰有氨基的碳点-介孔硅复合荧光微球的表面修饰羧基；
以及，采用化学交联将待分析物对应的抗体或适配体连接到所获碳点-介孔硅复合荧光微球表面，得到碳点-介孔硅复合荧光微球标记物；
优选的，所述丁二酸酐法的反应为无水条件，溶剂包括DMF、二甲基亚砜、吡啶、甲苯中的任意一种或两种以上的组合；优选的，所述化学交联包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化偶联方法将待分析物对应的抗体或适配体与碳点-介孔硅复合荧光微球进行反应，反应所选缓冲液包括2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，pH值为6.0；优选的，所述方法还包括：活化羧基后用碱性物质调节pH值至7.0。
9.根据权利要求7所述的侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述待分析物对应的抗体或适配体包括抗原、半抗原、单克隆抗体、多克隆抗体或适配体；优选的，所述碳点-介孔硅复合荧光微球标记物中抗体包括抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，标记的能识别黄曲霉毒素B1的DNA链的序列如SEQ ID NO.1所示；
和/或，步骤(4)中，基于抗原-抗体的试纸条质控带与基于适配体的试纸条质控带的固定材料不同；优选的，基于抗原-抗体的试纸条质控带为能与荧光标记抗体结合的抗体，而基于适配体的试纸条质控带为碳点-介孔硅复合荧光微球荧光标记DNA的互补链；优选的，基于抗原-抗体检测黄曲霉毒素B1的试纸条测试带固定有AFB1-BSA，质控带固定有山羊抗小鼠IgG；优选的，基于适配体检测黄曲霉毒素B1的试纸条测试带固定有AFB1-BSA，质控带固定有与碳点-介孔硅复合荧光微球荧光标记DNA链的互补链，具体序列如SEQ ID NO.2所不；
和/或，所述测试带与质控带的间隔距离为4mm。
10.根据权利要求7所述的侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于，步骤(6)包括：将步骤(3)所获碳点-介孔硅复合荧光微球标记物与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条的样品垫，反应20min后，利用荧光分析仪进行测试；
和/或，所述待分析物包括生化标志物，优选包括小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒。
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| CN202210954220.2A CN117589981A (zh) | 2022-08-09 | 2022-08-09 | 一种碳点-介孔硅复合荧光微球及其制备方法与应用 |
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Family Applications (1)
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| CN202210954220.2A Pending CN117589981A (zh) | 2022-08-09 | 2022-08-09 | 一种碳点-介孔硅复合荧光微球及其制备方法与应用 |
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2022
- 2022-08-09 CN CN202210954220.2A patent/CN117589981A/zh active Pending
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