KR20190070726A - 자성 나노입자 및 이를 이용한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법 - Google Patents

자성 나노입자 및 이를 이용한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자성 나노입자 및 이를 이용한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자성 나노입자를 포함하는 코어(core) 및 상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)로 이루어지며, 백금이 7 중량% 내지 30 중량%의 양으로 포함된, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체; 이의 제조 방법; 및 이를 이용한 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법에 관한 것이다.

Description

자성 나노입자 및 이를 이용한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법{Magnetic nanoparticles and method for amplification of signal in lateral flow assay by using the same}
본 발명은 분석물을 고감도로 검출하기 위한 자성 나노입자 및 이를 이용한 측방유동(Lateral flow) 방식의 분석에서의 신호 증폭 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게, 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 신호를 효과적으로 증폭시키는 기술에 관한 것이다.
면역크로마토그래피 분석법은 생물학적 물질 또는 화학적 물질이 서로 특이적으로 부착하는 성질을 이용하여 분석 물질을 단시간에 정성 및 정량적으로 검사할 수 있는 방법으로, 특히 샌드위치형 면역분석법은 존재 여부 및 농도 조사의 대상이 되는 분석물의 제 1 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체가 고체 지지체에 고정화 되고, 분석물의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체를 이용하는 것으로서 잘 알려져 있다.
이러한 분석을 위한 장치로는 분석 스트립 또는 상기 분석 스트립을 하우징 내부에 장착해 조립한 형태의 분석 장치가 일반적으로 사용된다. 이때 분석물을 포함하는 유체를 다공성 스트립 한편에 적용하면 모세관 현상에 의해 유체가 흘러가면서 분석 대상물이 표지체를 포함하는 항체 및 고정화 항체에 결합하여 분석법을 완성한다.
보다 상세하게 측방유동(Lateral flow) 장치는 일반적으로 액체 시료가 모세관 현상으로 흐를 수 있는 다공성 막인 멤브레인에 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류 측에는 샘플 패드와 접합 패드가 구비되어 있으며, 하류 측에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 샘플패드는 분석물을 포함하는 액체 시료를 흡수하고 균일한 유동을 보장하며, 접합 패드에는 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 표지체가 건조되어 있다. 상기 멤브레인에는 분석물에 선택적으로 결합하는 고정화된 항체 및 표지체에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화되어 각각 탐지 부 및 컨트롤 부를 형성한다. 상기 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 멤브레인에 고정화된 항체와 표지체에 고정화된 항체는 분석물에 대해 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서 분석물을 포함하는 액체 시료를 샘플패드에 떨어뜨리면, 분석물에 선택성을 가지는 항체-표지체와 멤브레인에 고정화된 항체가 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 멤브레인 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다.
도 1은 종래 면역검출법(Lateral flow immunoassay, LFIA) 칩의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다. 면역검출법 은 진단 방법의 간편성과 검출 물질의 다양성, 경제적 측면의 장점으로 인해 현장진단 (Point-of-Care) 시장에서 가장 널리 사용되고 있는 바이오 진단 시스템으로, 주로 면역검출법을 기반으로 분석물을 검출하고 짧은 시간 내에 즉각적인 항원 존재 유무를 알 수 있기 때문에 병원이나 기관뿐만 아니라 가정용 의료진단 키트로도 개발되어 사용되고 있다.
종래 기술로서 1차 접합체와 항원이 결합된 후 2차 접합체가 추가로 결합하고 이들이 최종적으로 멤브레인에 고정화된 항체에 결합하는 면역크로마토그래피의 신호증폭 방법이 개시되어 있으나, 종래의 면역 크로마토그래피 방법으로 측정할 수 있는 감도가 낮아 더 높은 감도를 요구하는 시료의 경우 측정하기 어려운 문제가 있다. 나아가, 한국특허출원 제2009-0047004호에서는 접합 패드 및 상기 멤브레인 중 어느 것에도 접촉되지 않도록 구성된 신호 증폭 패드를 추가로 형성하여 이용하여 감도를 향상시키는 방법을 제공하고 있으나, 이 경우 신호 증폭 패드가 추가적으로 구비되어야 하며, 사용자가 신호 증폭 패드를 멤브레인에 접촉시키기 위한 공정이 추가적으로 필요한 문제가 있다.
이에, 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 신호를 효과적으로 증폭시키는 기술이 개발되는 경우에는 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명의 한 측면은 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자를 제공하는 것이다.
이에 본 발명의 또 다른 측면은 상기 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 신호를 효과적으로 증폭시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 자성 나노입자를 포함하는 코어(core); 및 상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)로 이루어지며, 백금이 7 중량% 내지 30 중량%의 양으로 포함된, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체가 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, (a) 자성 나노입자를 제조하는 단계; (b) 상기 자성 나노입자를 분산 용매에 분산시켜 자성 나노입자가 분산된 용액을 제조하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 제조된 용액에 백금(Pt)염과, 안정제의 기능을 동시에 수행하는 환원제를 Pt와 자성 나노입자의 몰비가 Pt 1몰 기준으로 자성 나노입자 1몰 초과 내지 10몰 미만이 되도록 첨가하여 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질을 고정하는 단계; 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 고정된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체와 분석물을 결합하는 단계; 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축하는 단계; 및 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 측방유동 (Lateral flow) 면역 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법이 제공된다.
본 발명에 의하면 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에 항체를 고정하고, 나노입자의 자성을 이용해 항원을 농축한 후 효소 모방 활성을 갖는 백금으로 신호 증폭시켜 기존 금 나노 입자 기반의 면역진단법(LFIA, lateral flow immunoassay) 법에 비해 고 민감도를 갖는 면역진단 시스템을 획득할 수 있다. 한편, 코어-쉘 구조의 나노입자 기반 면역진단법은 일반 가정에서도 사용할 수 있을 만큼 간단하며, 신속하고 높은 민감도를 갖는 현장진단 바이오센서로서, 그 응용분야가 심장질환진단, 호르몬 검사, 조기 암진단 및 여러 감염병 등 매우 다양하므로, 진단기기 전문 기업에 기술 이전을 통하여 실용화 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 종래 면역검출법(Lateral flow immunoassay, LFIA) 면역 크로마토그래피 장치의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 면역검출법(Lateral flow immunoassay, LFIA)이 적용되는 면역 크로마토그래피 장치의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의한 효소 모방 자성나노입자 기반 LFIA 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 (a) Fe3O4 NPs, (b) MPt/CS-7 NPs, (c) MPt/CS-15 NPs, (d) MPt/CS-30 NPs 의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 (a) Fe3O4 NPs, (b) MPt/CS-7 NPs, (c) MPt/CS-15 NPs, (d) MPt/CS-30 NPs 의 XRD 패턴(pattern)을 나타낸 것이.
도 6은 Fe3O4 NPs, MPt/CS-7 NPs, MPt/CS-15 NPs, MPt/CS-30 NPs의 hCG 항체 고정량을 나타난 것이다.
도 7은 MPt/CS-7 NPs의 시간에 따른 자성 분리(magnetic separation optical) 광학 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 자성 분리(magnetic separation) 된 Fe3O4 NPs, MPt/CS-7 NPs, MPt/CS-15 NPs, MPt/CS-30 NPs의 시간에 따른 상층액(supernatant)에서의 상대적인 흡광도(absorbance) 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 MPt/CS-7 NPs 의 hCG 농도에 따른 (a) 디지털 이미지 및 (b) 그레이 스케일(gray scale) 이미지를 나타낸 것이다.
도 10은 이미징 프로그램 분석에 의한 검출 한계 테스트 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 신호증폭 방법은 측방유동(Lateral flow)에서 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 신호를 효과적으로 증폭시키는 기술에 관한 것이다.
본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 자성 나노입자를 포함하는 코어(core); 및 상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)로 이루어지며, 백금이 7 중량% 내지 30 중량%의 양으로 포함된 것이다.
보다 상세하게, 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 자성 나노입자를 포함하는 코어(core) 및 상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell) 을 포함한다.
상기 자성 나노입자는 Fe2O3 및 Fe3O4 중에서 선택된 산화철; 및 CoFe2O4, 및 MnFe2O4 중에서 선택된 페라이트(ferrite)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
즉, 상기 자성 나노입자는 산화철 및 페라이트(ferrite) 중 어느 하나일 수 있으며, 이때 상기 페라이트는 산화철에서 Fe 하나가 다른 금속원소로 치환된 형태이다. 상기 페라이트는 CoFe2O4, MnFe2O4, 등이 가능할 수 있다. 상기 산화철은 Fe2O3, Fe3O4, 등이 가능할 수 있다.
본 발명의 상기 자성 나노입자는 평균 직경이 0.1 내지 5nm일 수 있고, 바람직하게는 0.5 내지 4nm, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 3nm일 수 있다. 한편, 상기 코어의 직경은 8 내지 12nm일 수 있고, 바람직하게는 9 내지 11nm, 더욱 바람직하게는 9.5 내지 10.5nm일 수 있다.
나아가, 상기 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 표면에 기능기를 추가로 포함 할 수 있으며, 기능기는 표면안정제인 시트르산나트륨의 카르복실산에서 기인할 수 있다. 상기 기능기는 검출 항체의 고정 수단으로써 공유결합 또는 이온성의 전기적 인력을 제공할 수 있다. 예를 들어 상기 기능기는 카르복실기일 수 있다.
이하, 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.
본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법은 (a) 자성 나노입자를 제조하는 단계; (b) 상기 자성 나노입자를 분산 용매에 분산시켜 자성 나노입자가 분산된 용액을 제조하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 제조된 용액에 백금(Pt)염과, 안정제의 기능을 동시에 수행하는 환원제를 Pt와 자성 나노입자의 몰비가 Pt 1몰 기준으로 자성 나노입자 1몰 초과 내지 10몰 미만이 되도록 첨가하여 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 것이다.
즉, 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 먼저 자성 나노입자를 포함하는 코어(core)를 제조하고, 상기 코어의 표면에 백금(Pt) 나노입자를 코팅하여 백금 쉘(shell)을 형성함으로써 제조할 수 있다.
좀 더 상세하게 설명하면, 먼저, 자성 나노입자를 제조한다(단계 a).
상기 자성 나노입자의 제조 단계를 좀 더 상세하게 설명하면, 자성을 갖는 금속의 염을 포함하는 용액을 준비한다(단계 a-1). 다음으로, 상기 용액에 염기성 용액을 첨가하여 염기성 조건 하에서 자성 나노입자를 침전시켜 자성 나노입자를 제조한다(단계 a-2).
상기 자성을 갖는 금속의 염은 FeCl3, 또는/및 FeCl2 등이 가능할 수 있으며, 바람직하게는 FeCl3 및 FeCl2를 적절한 비율로 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 침전은 50 내지 100℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 60 내지 95℃, 더욱 바람직하게는 70 내지 90℃에서 수행될 수 있다. 상기 침전은 2 내지 6시간 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 3 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 3시간 30분 내지 4시간 30분 동안 수행될 수 있다. 그러나, 상기 침전의 수행 시간이 반드시 이에 한정되는 것은 아니며 상기 침전의 수행 온도에 따라 달라질 수 있다.
상기 염기성 용액은 암모니아, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 수산화나트륨, 또는 수산화칼륨 등의 수용액일 수 있으며, 바람직하게는 암모니아 수용액일 수 있다. 상기 염기성 조건은 pH가 8 내지 12일 수 있으며, 바람직하게는 9 내지 11, 더욱 바람직하게는 9.5 내지 10.5일 수 있다.
다음으로, 상기 자성 나노입자를 분산 용매에 분산시켜 자성 나노입자가 분산된 용액을 제조한다(단계 b).
상기 분산 용매는 히드록실아민 히드로클로라이드(NH2OH·HCl), 테트라메틸 암모늄 히드록사이드(TMAOH) 등이 가능할 수 있고, 바람직하게는 히드록실아민 히드로클로라이드 및 테트라메틸 암모늄 히드록사이드를 혼합하여 사용할 수 있다.
후속적으로, 상기 자성 나노입자가 분산된 용액에 백금(Pt)염과 환원제를 첨가하여 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 제조한다(단계 c).
상기 백금염은 H2PtCl6·6H2O, 또는 K2PtCl4 등이 가능할 수 있고, 바람직하게는 H2PtCl6·6H2O일 수 있다.
상기 환원제는 안정제의 기능을 동시에 수행할 수 있는 것이며, 시트르산나트륨, 아스코르브산, 등이 가능할 수 있다. 상기 환원제는 바람직하게는 시트르산나트륨과 아스코르브산을 동시에 사용할 수 있다.
상기 첨가는 1 내지 3시간 동안 천천히 수행될 수 있으며, 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분, 더욱 바람직하게는 1시간 45분 내지 2시간 15분 동안 수행될 수 있다.
상기 첨가 이후에 상기 자성 나노입자의 표면에 백금 나노입자가 코팅될 수 있도록 반응 시간이 필요할 수 있으며, 상기 반응 시간은 2시간 내지 6시간, 바람직하게는 3시간 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 3시간 30분 내지 4시간 30분일 수 있다.
특히, 본 발명에 있어서 상기 (b)에서 제조된 용액에 백금(Pt)염과, 안정제의 기능을 동시에 수행하는 환원제는 Pt와 자성 나노입자의 몰비가 Pt 1몰 기준으로 자성 나노입자 1몰 초과 내지 10몰 미만이 되도록 첨가하여 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)에 있어서, 백금이 7 중량% 내지 30 중량%의 양으로 포함될 수 있도록 한다.
본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에 있어서, 백금이 7 중량% 미만인 경우에는 자성나노입자-백금 코어쉘 복합체의 촉매활성이 낮아 문제가 있으며, 30 중량% 초과인 경우 백금입자가 따로 형성된다는 문제가 있다.
본 발명의 다른 견지에 의하면 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 신호를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 방법이 제공된다.
본 발명의 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법은 상기 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질을 고정하는 단계; 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 고정된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체와 분석물을 결합하는 단계; 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축하는 단계; 및 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를, 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site)를 구비하는 측방유동 (Lateral flow) 면역 크로마토그래피에 적용하는 단계; 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체가 탐지부(detection site)에 결합된 후 발색 기질을 탐지부에 가하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 측방유동 크로마토그래피는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 고정된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 이용하며, 이때 상기 표지된 상기 복합체는 효소 모방 무기 나노입자를 포함하는 것으로, 상기 단백질 효소 무기 나노입자는 표적물질과 결합하여 반응부에서 고정된 후, 발색기질과 반응하여 산화반응을 촉매함으로써 검출 신호를 증폭시킬 수 있는 것이다.
이론적으로 한정된 것은 아니지만, 상기 효소 모방 무기 나노입자들은 표지된 검출항체가 액상 시료에 포함된 표적 물질과 결합하고, 액상시료와 함께 반응부로 이동하여, 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site)에 분석물과 결합함으로서 탐지부에 고정되어 검출 신호를 나타내게 되며, 이와 같이 탐지부에 고정된 효소 모방 무기나노입자들이 발색기질을 산화시켜 검출 신호를 증폭시키게 된다.
효소 모방 무기 나노입자들은 기존의 면역분석에서 시그널 증폭법으로 사용되는 효소-기질 반응에서, 기질과 반응할 수 있는 장소가 대부분 가려져 있는 단백질 효소와는 달리 반응 표면이 전체적으로 노출되어 있기 때문에 반응 효율을 훨씬 높아 발색 특성이 현저하게 향상된다. 또한 단백질 효소는 단백질 특성에 의해 주변 환경 (온도, pH 등)에 영향을 많이 받지만 무기 나노입자는 상대적으로 매우 안정적으로 활성을 유지하고 오랜 기간 보존될 수 있다.
특히, 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축한 후 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 탐지부(detection site)를 구비하는 측방유동 (Lateral flow) 면역 크로마토그래피에 적용하는 것이다.
이와 같은 방법에 의해 본 발명의 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법은 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축하는 단계를 포함하여, 발색을 현저하게 향상시킬 수 있다.
상기 측방유동 면역 크로마토그래피에 적용하는 단계는 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 액체 시료와 함께 적용하여 수행될 수 있으며, 이때 사용될 수 있는 액체 시료는 특히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 소듐아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer), 포스페이트 버퍼(phosphate buffer) 등을 사용할 수 있으나, 분석물, 발색 반응 및 전체적인 면역분석의 결과에 영향을 주지 않는 어떠한 성분을 사용할 수 있다.
상기 '효소 모방 무기 나노입자'는 단백질효소와 유사하게 다양한 기질의 화학반응을 촉매하는 물질을 의미한다. 상기 용어'발색 기질'은 상기 효소 모방 나노입자의 촉매 작용에 의해 반응 전 물질과 반응 후 물질의 발색 변화가 일어나는 물질을 의미한다.
상기 용어'발색 변화' 또는 '증폭'은 색의 발현, 발색 파장 변화, 및 발색 강도 변화 중 하나 이상을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 '분석물(표적물질)'은 항원 단백질, 리간드, DNA, 환경 호르몬, 환경 오염 물질, 및 바이러스 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 검출항체와 결합할 수 있는 물질이라면 그 종류는 제한되지 않으며, 바람직하게 상기 분석물은 DNA, 환경호르몬, 항원 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
한편, 상기 결합부위는 단백질 리간드(Ligand), DNA 서열 및 RNA 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1 이상이며, 상기 특이적 결합물질은 상기 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 바이러스 파아지, 핵산분자 앱타머(Aptamer) 및 합텐(hapten;DNP)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 용어 "제1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질"이란 표적물질과 결합할 수 있는 항체, 항체의 단편인 Fab 또는 항체의 재조합 물질을 의미한다. 결합은 화학적 결합 및 물리적 결합 모두 가능하다.
용어 "제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질"은 표적물질, 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 결합은 화학적 결합 및 물리적 결합 모두 가능하나, 특별한 화학 반응 없이 결합이 이루어질 수 있는 물리적 결합이 바람직하다. 상기 반응물질의 예로는 항체, 항체의 단편인 Fab나 재조합 scFv 등 일 수 있으며, 리셉터 또는 리셉터의 단편일 수 있다.
용어'효소-기질 반응'이란 효소에 의해서 촉매 작용이 이루어지는 기질의 반응 뿐만아니라, 효소 모방 나노입자에 의해서 촉매 작용이 이루어지는 발색 기질의 반응을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명에 있어서, 발색기질은 효소 모방 무기 나노입자가 산화촉매로 작용하여 산화 후 무기 나노입자가 존재하는 위치에서 침전 및 불용화되면서 발색하여, 검출신호를 육안으로 인식할 수 있을 정도로 증폭시키게 된다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 발색기질은 상기 발색 기질은 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), DAB(3,3'-Diaminobenzidine) 및 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있으며, 예를 들어 과산화 효소 모방 무기 나노입자일 경우, 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 표면에는 검출 항체를 고정시킬 수 있는 기능기들이 존재할 수 있다. 상기 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 표면에 존재하는 기능기는 검출 항체의 고정 수단으로써 공유결합 또는 이온성의 전기적 인력을 제공할 수 있는 카르복실산기 (Carboxylic acid group)인 것이 바람직하다. 이 경우 IgG 항체에 풍부하게 존재하는 아민기 (-NH2, amine group)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 액상에 포함되어 수 마이크로미터 직경의 모세관로를 통해서 측방유동 크로마토그래피의 접합부로 이동할 수 있도록 단분산된 나노입자인 것이 바람직하다. 상기 단분산성이라 함은 나노입자의 크기와 구조가 균일한 정도를 나타내는 척도로서, 실질적으로 균일한 것을 의미한다.
상기 단분산성 무기 나노입자의 제조 방법은 본 발명에서 전체로 참고문헌으로 도입된 문헌[(J. Am. Chem. Soc., Shouheng Sun 외, 단분산성의 MFe2O4 (M = Fe, Co, Mn) 나노입자 : 2004, Vol.126, 273-279 쪽]을 이용해서 제조할 수 있다.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 단분산성 무기 나노입자의 합성은 유기용매 내에서 계면활성제를 이용하여 단분산성을 향상시킨 합성법을 이용하여 제조될 수 있다.
검출 항체를 무기 나노입자 표면에 고정시킨 후 수크로오즈와 소혈청알부민이 포함된 생리식염수에 분산시켜 유리 섬유로 이루어진 접합부에 고르게 흡수시켜 건조시켰다. 유리섬유는 단백질에 대해서 친화능력이 낮기 때문에 건조된 상태의 항체-무기 나노입자는 유리섬유 속에서 분석물의 유체를 만났을 때 수화된 후 쉽게 테스트 패드로 빠져나갈 수 있다.
분석물의 검출을 위하여 분석물이 함유된 체액을 측면유동 면역발색칩에 흘려주고 침전성의 불용 기질을 사용하여 효소-기질 반응을 보내주면 발색 시그널이 증폭되면서 성공적으로 검출 감도를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 상기 측방유동 면역 크로마토그래피는, 도2에 나타낸 바와 같이, 분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드; 상기 샘플 패드에 접촉하며, 상기 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site) 및 컨트롤부를 포함하는 멤브레인; 및 상기 멤브레인의 하류에 설치되어 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 측방유동 크로마토그래피는 표적 물질을 포함하는 액상 시료가 다공성 매질을 통해 이동하면서 고정된 검출물질과 반응하여 육안으로 식별할 수 있도록 검출시 발색 신호를 나타내는 키트를 의미한다.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 측면 유동 면역 발색 칩은 표적물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부를 포함하는 시료 패드, 무기 나노입자가 결합된 표적물질과 결합할 수 있는 검출물질이 고정된 탐지부 및 오류 확인을 위한 컨트롤부를 포함하는 멤브레인(실험 패드) 및 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수부를 포함하는 흡수 패드를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 측방유동 크로마토그래피의 분석 키트의 각각 샘플부, 탐지부, 컨트롤부 및 흡수부는 미세관을 통하여 서로 연결되거나, 또는 멤브레인로 서로 연결되며, 상기 멤브레인은 천연 또는 합성 재료의 다공질 재료일 수 있으며, 니트로셀룰로오스 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 신호증폭 방법은 측방유동(Lateral flow) 방식의 분석법에 적용될 수 있는 것으로, 상기 측방유동(Lateral flow) 방식은 수직유동(vertical flow)이나 통과유동(flow though) 방식을 포함한다. 상기 수직유동 방식의 경우, 시료는 병렬로 배치된 다공성 막 등에 수직으로 쌓인다.
한편, 상기 측방유동방식은 항체-항원 반응에 국한되지 않는 것으로, 본 명세서에서 언급되는 '결합부위(리간드)'는 다양한 분석물에 있어서 단백질 리간드 (Ligand), 핵산(DNA 또는 RNA) 분자 서열의 결합부위 등을 포함하고, '특이적 결합물질'은 상기 결합부위에 선택적, 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 바이러스 파아지, 핵산분자 앱타머(Aptamer), 합텐(hapten;DNP) 등을 포함하는 생체분자를 모두 포함하는 것으로, 나아가 상기 기재 사항에 특히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 분석물은 면역학적 반응, 즉 항원항체 반응에 의해 제 1항체 및 제 2항체와 결합하고 샌드위치형 면역 복합체를 형성할 수 있는 것이면 특히 제한되지 아니하며, 예를 들어 단백질 또는 DNA, 환경호르몬 등을 포함하는 환경오염 물질, 바이러스 등에 대해 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서 항원 및 항체는 항원-항체 반응에 의해 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 아니하며, 분석물이 항체인 경우에는 이와 특이적으로 결합하는 물질을 항원으로 할 수 있다. 상기 항원 및 항체는 분석물에 따라 공지의 항원 및 항체를 채용할 수 있다. 나아가, 분석물을 '결합부위(리간드)'로 인식하여 선택적으로 결합하는 '특이적 결합물질'의 반응도 넓은 의미에서 항원-항체 반응에 포함되는 것으로 본다.
도 2는 본 발명의 측방유동(Lateral flow) 분석 장치 내 각각의 구성의 예시적인 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이며, (10)은 샘플 패드, (12)은 멤브레인, (13)는 탐지부, (14)는 컨트롤부, (15)은 흡수 패드를 나타내며, 도 1의 종래 측방유동(Lateral flow) 분석 장치에 비하여 접합 패드(11)가 생략될 수 있다.
상기 샘플 패드(sample pad)는 분석물을 포함하는 액체 시료가 처음 흡수되는 부분으로, 멤브레인의 한쪽 끝단을 그대로 사용하거나 별도의 부재로 구성될 수 있고 분석물을 포함하는 시료를 흡수하여 모세관 현상에 의해 분석물을 접합패드로 이동시킨다.
상기 멤브레인(membrane)은 액체 시료의 유동성을 확보할 수 있는 재질이라면 특히 제한되지 아니하며, 다공성 막으로 이루어지는 것이 바람직하다. 보다 상세하게, 항체 또는 특이적 결합물질, 및 효소 단백질을 고정화하고 비특이적 반응을 최소화하는 니트로셀룰로스, 셀룰로스, PVDF(Poly-vinylidene fluoride), PET(poly(ethylene terephthalate)), PES(polyethersulfone), 유리섬유, 나일론 등과 같이 일정한 미세 구멍(Micropore) 크기의 조절이 가능한 소수성 다공성 막을 사용할 수 있다.
상기 멤브레인은 접합체가 결합된 분석물의 제 2 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 되어 있는 탐지부(detection site) 및 이에 대한 대조군으로서 오류로 인한 반응 유무를 파악하기 위한 컨트롤부(control site)를 포함한다. 탐지부는 테스트 결과의 판독을 위해 결과를 보여주는 부분이다. 컨트롤부는 금나노입자 접합체와 포획항체 또는 고정된 제 2 특이적 결합물질의 오류를 확인하기 위해 구성되며 이동성을 가진 물질들이 탐지부/컨트롤부까지 오류 없이 반응이 제대로 진행되었는지 여부를 확인하기 위한 것이다.
흡수 패드(absorbing pad)는 모세관 현상에 의해 반응 후 남은 잔여물을 충분히 흡수할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않으며, 예를 들어 셀룰로오스, 무명. 친수다공성 폴리머 등을 사용할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 자성 나노입자-백금 코어-쉘 복합체 제조
(1) Fe3O4 나노입자(NPs) 합성
FeCl3 및 FeCl2 를 FeCl3:FeCl2=2:1의 몰비로 포함하는 30% 암모니아수를 이용한 pH 10 조건의 수용액에서, 90℃ 온도 하에서 4시간 반응 후 균일하게 침전시킴으로써 Fe3O4 NPs를 합성할 수 있었다. TEM(JEOL EM-2010 microscope) 이미지를 통하여 무기 Fe3O4 NPs의 존재를 도 4와 같이 확인하였고, 도 5의 XRD (Rigaku D/Max 2500) 데이터를 통해 Fe3O4와 Pt의 존재를 확인하였다.
(2) 자성 나노입자-백금 코어-쉘(MPt/CS NPs)의 합성
상기 (1)에서 합성된 Fe3O4 NPs 50 mg에, 하이드록실 아민 하이드로클로라이드(NH2OH·HCl) 50 mg과 테트라메틸 암모늄하이드록사이드(TMAOH) 136 mg이 녹아있는 수용액 75 mL를 넣어 분산시킨 후에, 아르곤 기체 조건 하의 80 ℃에서 H2PtCl6·6H2O와 환원제이자 표면 안정제인 구연산나트륨(sodium citrate) 15 mM의 수용액 100 mL를 2시간 동안 천천히 넣어준 후 3시간 반응을 진행시킴으로써 MPt/CS NPs를 제조할 수 있다.
이 때, H2PtCl6 ·6H2O를 넣어주는 양을 Pt : Fe3O4 NPs = 1:10, 1:3, 1:1 몰비로 맞춰줘 각각 7wt%, 15wt%, 30wt%의 백금이 코팅된 MPt/CS NPs (MPt/CS-7 NPs, MPt/CS-15 NPs, MPt/CS-30 NPs)를 합성하였다.
(3) MPt/CS의 촉매 상수 분석
MPt/CS의 과산화효소 모방 활성은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)를 이용하여, 적외선 분광분석(UV-Visible) 측정기를 통해 측정하였다.
TMB에 대한 활성은 100 μL의 H2O2 (1M), 100 uL의 TMB (31.25 μM ~1200 μM), 30 uL를 770 μL의 소듐 아세테이트 버퍼를 큐벳에 넣고, 1분간 652 nm 에서의 흡광도(absorbance) 차이를 측정하였다.
이때 측정된 초기 동역학적 반응속도 데이터를 이용해, 다음의 미카엘리스-멘텐 식을 통해 각각의 상수를 측정할 수 있다.
Figure pat00001
각 효소모방촉매의 촉매활성 상수
[E] (M) K m (mM) V max (nM/s) k cat (s-1) k eff (106) Pt/나노입자 상대비율
MPt/CS-30 2.89×10-10 0.055 634.6 2196 39.94 5.5
MPt/CS-15 3.78×10-10 0.029 255.9 677 23.34 2.4
MPt/CS-7 4.60×10-10 0.028 257.1 559 19.95 1
Fe3O4 5.64×10-9 0.014 314.1 56 4 0
촉매 활성 분석 결과, Fe3O4 NPs에 Pt를 7중량% 도입한 경우에 비하여 15 중량% 및 30 중량%를 도입한 경우에 촉매 활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
2. 면연분석 칩( LFI chip)의 제조
기존에 상용화된 임신진단테스트 LFI 칩(BioCard, 일양바이오)을 변형하여 사용하였다.
먼저, 상용화된 임신진단테스트 LFI 칩(BioCard, 일양바이오)의 접합 패드(conjugation pad)를 조심스럽게 제거한 후 깨끗하게 씻어서 골드 나노 입자를 없애 준 후, 데시케이터에서 24시간 동안 보관하여 완전히 건조하고, 다시 접합패드를 스트립(strip)의 시료 패드(sample pad)와 실험 패드(test pad, 멤브레인) 사이에 장착시킨 후, 패드 사이가 잘 이어질 수 있도록 고정시켜 준 다음 측방유동 분석을 시도할 수 있다.
다만, 본 실험은 상용화된 임신진단테스트를 이용하기 위해 접합 패드를 세척하여 사용하였으나, 본 발명이 적용될 수 있는 면연분석 칩은 도 2에 도식적으로 나타낸 바와 같이, 접합 패드가 생략될 수 있다.
3. 자성 나노입자-백금 코어-쉘 복합체을 이용한 면역분석에서의 신호 증폭 효과 확인
(1) MPt/CS NPs 표면에 hCG 항체(Ab) 고정
1.(2)에 의해 합성된 후 분산된 7wt%, 15wt% 및 30wt%의 백금이 코팅된 MPt/CS-7 NPs, MPt/CS-15 NPs 및 MPt/CS-30 NPs에 화학적 결합이 아닌 물리적 결합 (physical adsorption)을 이용하여 단순히 나노 입자와 항체를 섞어주는 과정만으로 고정화를 완성하였다.
보다 상세하게, 1.(2)에 의해 최종적으로 합성된 뒤 물 (deionized water)에 분산된 MPt/CS NPs (7.0mg/ml)에 검출 항체인 β-hCG 단일 항체 (5mg/ml) 를 넣어서 잘 섞어 준 후 24시간 동안 4 ℃에서 로테이터에 장착하여 반응시켰다.
그 후 PBS에 희석된 0.1 wt% tween20 및 3 wt% BSA로 항체가 고정되지 않은 부분을 BSA로 블록킹(blocking)시켰다. 필요에 따라 1일 4 ℃에서 로테이터에 장착한 후 후속 반응을 수행할 수 있다. 그 후, PBS에 희석된 0.1 wt% tween20 및 3 wt% BSA로 3번 씻어 주고 (14,000rpm, 30분, 4 ℃) 7.0mg/ml의 농도로 보관하였다.
각 나노 입자(Particle) 당 고정된 hCG 항체 고정량을 상용키트인 Bradford assay 을 이용하여 분석한 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과 각 나노 입자에 항원이 고정량된 것을 확인할 수 있었으며, Fe3O4 NPs는 다수의 항원을 잡지 못하여 고정량이 적은 것을 확인할 수 있었다.
(2) Fe3O4 나노 입자의 포화 자화도를 이용한 항원의 포집 및 농축
상기 3.(1)에 의해 β-hCG 단일 항체가 고정된 MPt/CS NPs을 15ml 에 희석되어 있는 hCG (1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0 ng/ml)에 각각 15 μl 씩 넣어 준 후 2시간 동안 충분히 셰이킹(shaking) 인큐베이터로 반응시켜, MPt/CS NPs에 고정된 단일 항체가 hCG 단백질을 잡을 수 있게 해주었다.
그 후 항원-항체-MPt/CS NPs 복합체를 포집 및 농축하기 위해 예를 들어 도 7과 같이 자석을 바이알(vial) 한쪽에 위치시켜 20분 동안 반응시켰다. 도 8은 시간에 따른 상층액 내 흡광도(absorbance)의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
그 후 상층액은 모두 버리고 항원-항체-MPt/CS NPs 복합체를 10 wt% 수크로오스(sucrose), 0.1wt % tween20, 3wt % BSA를 포함하는 PBS 50μl 에 현탁(suspension)시켜 놓았다.
(3) 측방유동 분석(Lateral flow assay)
10 wt% 수크로오스(sucrose), 0.1 wt % tween20, 3 wt % BSA를 포함하는 PBS 50μl 에 현탁되어 있는 항원-항체-MPt/CS NPs 복합체를 LFI 칩의 시료 패드에 떨어뜨려 흘려주고 5분간 검출 반응이 일어날 수 있도록 해주었다.
그 후 소듐 아세테이트(sodium acetate) 60 μl 로 씻어준 후 기질이 포함되어 있는 AEC용액 (AEC, 0.03% H2O2, 50mM sodium acetate buffer, pH 4.5) 50 μl 를 실험 패드(test pad, 멤브레인)에 떨어 뜨려 Pt NPs 와 AEC 간의 효소-기질 반응이 일어날 수 있도록 5분 동안 진행하였다. 그 결과는 스마트폰 (Galaxy S4 SHV-E00S, Samsung)으로 이미징 후 이미지 프로그램 (Image J, NIH)으로 정량 분석하였다.
MPt/CS-15 NPs 을 이용하여 LFIA를 진행한 결과 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이0.1ng/ml까지 육안으로 확인 가능하였고, 이미징 프로그램으로 분석 결과 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이 20 pg/ml의 검출 한계를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
한편, MPt/CS-7 NPs 을 이용하여 LFIA를 진행, 이미징 프로그램으로 분석 결과 40 pg/ml의 검출 한계를 갖는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, MPt/CS-30 NPs 을 이용하여 LFIA를 진행, 이미징 프로그램으로 분석 결과 40 pg/ml의 검출 한계를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 이들 결과는 도 10에 함께 나타내었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
10 : 시료 패드 11 : 접합 패드
12 : 멤브레인 13 : 탐지부
14 : 컨트롤부 15 : 흡수 패드

Claims (14)

  1. 자성 나노입자를 포함하는 코어(core); 및
    상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)로 이루어지며, 백금이 7 중량% 내지 30 중량%의 양으로 포함된, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 Fe2O3 및 Fe3O4 중에서 선택된 산화철; 및 CoFe2O4 및 MnFe2O4 중에서 선택된 페라이트(ferrite)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상인, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 평균 직경이 0.1 내지 5nm인, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체.
  4. (a) 자성 나노입자를 제조하는 단계;
    (b) 상기 자성 나노입자를 분산 용매에 분산시켜 자성 나노입자가 분산된 용액을 제조하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 제조된 용액에 백금(Pt)염과, 안정제의 기능을 동시에 수행하는 환원제를 Pt와 자성 나노입자의 몰비가 Pt 1몰 기준으로 자성 나노입자 1몰 초과 내지 10몰 미만이 되도록 첨가하여 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 자성을 갖는 금속의 염이 FeCl3 및 FeCl2 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 분산 용매가 히드록실아민 히드로클로라이드(NH2OH·HCl) 및 테트라메틸 암모늄 히드록사이드(TMAOH) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 백금염이 H2PtCl6 ·6H2O 및 K2PtCl4 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 환원제가 시트르산나트륨 및 아스코르브산 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질을 고정하는 단계;
    제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 고정된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체와 분석물을 결합하는 단계;
    분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축하는 단계;
    농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를, 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site)를 구비하는 측방유동 (Lateral flow) 면역 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및
    농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체가 탐지부(detection site)에 결합된 후 발색 기질을 탐지부에 가하는 단계
    를 포함하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 측방유동 면역 크로마토그래피에 적용하는 단계는 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 액체 시료와 함께 적용하여 수행되는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 결합부위는 단백질 리간드(Ligand), DNA 서열 및 RNA 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1 이상이며, 상기 특이적 결합물질은 상기 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 바이러스 파아지, 핵산분자 앱타머(Aptamer) 및 합텐(hapten;DNP)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 분석물은 DNA, 환경호르몬, 항원 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 발색 기질은 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), DAB(3,3'-Diaminobenzidine) 및 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 측방유동 면역 크로마토그래피는,
    분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드;
    상기 샘플 패드에 접촉하며, 상기 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site) 및 컨트롤부를 포함하는 멤브레인; 및
    상기 멤브레인의 하류에 설치되어 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드
    를 포함하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
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