KR20230001948A - 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자 및 이를 이용한 면역 검출 센서 - Google Patents
측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자 및 이를 이용한 면역 검출 센서 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자, 이를 포함하는 면역 검출 센서 및 상기 면역 검출용 이중 나노입자 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 제1결합 물질이 표지된(labeled) 제1나노입자; 및 타겟 검체와 특이적으로 결합하고, 제2결합 물질을 포함하는 바인더;가 표지된 제2나노입자를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자를 기술적 특징으로 하며, 본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자는 검출하고자 하는 항원 농도에 따라 신호증폭반응 사용 여부를 조절할 수 있고, 제조방법이 단순하고 간편하고, 정형질인 나노입자를 기준으로 분석을 진행하므로, 접합체 분석과 정량 과정에서의 정확성과 재현성이 우수하고, 초고감도 검출이 가능하고, 기존 기술 대비 상대적으로 짧은 시간 내에 저농도 항원까지 검출이 가능다는 장점이 있다.
Description
본 발명은 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자, 이를 포함하는 면역 검출 센서 및 상기 면역 검출용 이중 나노입자 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 제1결합 물질이 표지된(labeled) 제1나노입자; 및 타겟 검체와 특이적으로 결합하고, 제2결합 물질을 포함하는 바인더;가 표지된 제2나노입자를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자를 기술적 특징으로 한다.
항체-항원 반응을 신속하게 측정하는 방법으로 측면 흐름 분석(LFA, lateral flow assay) 시스템이 많이 사용된다. LFA는 일반적으로 액체 시료가 모세관 현상으로 흐를 수 있는 멤브레인에 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류층에는 접합체 패드와 시료 패드가 연결되어 있고, 멤브레인의 하류층에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 접합체 패드에는 시료물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 고정화된 금 나노입자 접합체가 건조되어 있다. 상기 멤브레인에는 시료물질과 특이적으로 반응하는 항체 및 금 나노입자에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화되어 있다. 상기 시료물질과 특이적으로 결합할 수 있는, 멤브레인에 고정화된 항체와 금 나노입자에 고정화된 항체는 시료물질에 대해 항원을 매개로 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 잘 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 LFA 장치에 액체 시료용액을 샘플 패드에 떨어뜨리면, 시료가 존재할 경우 시료에 선택성을 가지는 항체-금 나노입자와 멤브레인에 고정화된 항체가 항원을 매개로 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 멤브레인 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다. 이러한 방법은 항원 농도에 따라 신호 세기가 달라지므로 정량 가능하고, 일반적으로, 신호 세기는 항원 농도에 따라 Test Line에 고정되는 Nanoparticle (ex. AuNP, Latex bead 등) 색깔의 진하기에 따라 결정되어서, 대량생산이 가능하고, 검사의 신속성과 간편함 때문에 질병 진단과 현장 진단에 활발히 사용되고 있다.
하지만, 종래의 통상적인 LFA 방법은 나노입자-항체가 단일 개의 접합체를 형성하여 AuNP 색으로만 신호 검출 가능하기 때문에 낮은 민감도 (일반적으로, ~ 1 ng/mL)로 인해 고감도 검출을 필요로 하는 항원에는 적용이 어려운 한계점이 있다. 이러한 LFA의 감도 향상을 위해 나노입자-항체-효소 접합체가 제안되었고, 효소 종류에 따라 다양한 기질을 사용할 수 있고, 이로 인해 발색, 발광, 침전 반응 등에 의한 신호 증폭이 가능하고, 접합체 1개에 포함된 효소 개수가 많아짐에 따라 신호 세기도 함께 증가하여, 저농도 항원도 손쉽게 검출 가능하게 되었다.
본 발명은 종래의 알려진 방식이 갖는 기술적 한계를 극복하면서 샘플 내 미량의 검체를 높은 정확도 및 낮은 비용으로 진단 또는 검출할 수 있는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자, 이를 포함하는 면역 검출 센서 및 상기 면역 검출용 이중 나노입자 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1나노입자 및 제2나노입자가 결합된 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자를 제공하며, 구체적으로 제1나노입자에는 제1결합 물질이 표지되고(labeled); 상기 제2나노입자는 타겟 검체와 특이적으로 결합하고, 제2결합 물질을 포함하는 바인더가 표지될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서를 제공한다.
상기 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서는
(i) 흡수성 샘플 패드;
(ii) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자를 포함하는 접합 패드;
(iii) 검출부위; 및
(iv) 흡수 패드를 순차적으로 일단으로부터 타단 방향으로 배치하여 포함할 수 있다.
상기 검출 부위는 제1바인더와 결합되는 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 제2바인더가 고정된 테스트 영역 및 상기 타겟 검체와 특이적으로 결합하지 않으나 상기 제1바인더와 특이적으로 결합하는 제3바인더가 고정된 컨트롤 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자 제조방법을 제공하고, 상기 제조방법은
1) 제1나노입자 및 제1결합 물질을 접합시키는 단계;
2) 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 바인더 및 제2결합 물질을 접합시키는 단계;
3) 상기 바인더 및 제2나노입자를 접합시키는 단계;
4) 상기 제1결합 물질 및 제2결합 물질을 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제조방법은 5) 상기 제1결합 물질 및 제2결합 물질을 결합시킨 후 결합되지 않은 제1결합 물질 및 제2결합 물질을 제거시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제거 단계는 원심분리를 이용하여 결합되지 않은 제1결합 물질 및 제2결합 물질을 제거할 수 있으며, 상기 결합된 나노입자의 크기가 각각 15nm 및 40nm인 경우 6,000 ~ 7,000 xg, 바람직하게는 6,777 xg의 속도로 원심분리하여 결합하지 않은 물질을 분리할 수 있으며, 상기 결합된 나노입자의 크기가 각각 40nm 및 40nm인 경우 2,000 ~ 3,000 xg, 바람직하게는 2,339 xg의 속도로 원심분리하여 결합하지 않은 물질을 분리할 수 있다. 상기의 원심분리 속도에서 이미 결합한 물질은 응집되지 않고 결합하지 않은 물질을 최대한 제거할 수 있다.
상기 4) 단계 이후, 5) 단계 이전에 나노입자의 표면 중 상기 제1결합 물질 또는 바인더가 표지되지 않은 않은 부분에 차단제를 고정시키는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 실리카 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1나노입자 및 제2나노입자의 직경은 5 ~ 100 nm, 10 ~ 50 nm, 15 ~ 40 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것을 아니다.
상기 제1나노입자 및 제2나노입자의 직경은 동일할 수 있다.
상기 제1결합 물질과 제2결합 물질의 상호 결합에 의하여 상기 제1 및 제2나노입자가 서로 접합하는 것을 특징으로 한다.
상기 제1결합 물질과 제2결합 물질은 타겟 항원이 아닌 항원-항체 쌍, 서로 상보적인 뉴클레오티드 사슬 쌍, 압타머와 표적 물질 쌍, 서로 결합하는 펩티드 쌍, 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘과 비오틴 쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노입자의 표면 중 상기 제1결합 물질 또는 바인더가 표지되지 않은 않은 부분에 차단제가 고정될 수 있다.
상기 차단제는 소 혈청 알부민, 난 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자는 검출하고자 하는 항원 농도에 따라 신호증폭반응 사용 여부를 조절할 수 있고, 제조방법이 단순하고 간편하고, 정형질인 나노입자를 기준으로 분석을 진행하므로, 접합체 분석과 정량 과정에서의 정확성과 재현성이 우수하고, 초고감도 검출이 가능하고, 기존 기술 대비 상대적으로 짧은 시간 내에 저농도 항원까지 검출이 가능다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 모식도를 나타낸다; 왼쪽은 기존에 사용되는 단일 금 나노입자의 모식도이고, 오른쪽은 본 발명의 이중 나노입자의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 TEM 이미지를 나타내는 사진이다; A) 15 nm 단일 금나노입자; B) 40 nm 단일 금나노입자; C) 40 - 15 nm 이중 금나노입자; D) 40 - 40 nm 이중 금나노입자.
도 3은 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 흡수 스펙트럼을 나타내는 그래프이다 단일 금나노입자, 제1결합물질이 결합된 제1 나노입자, 제2결합물질이 결합된 제2나노입자, 이중 금나노입자의 흡수 스펙트럼이 모두 동일하여 나노입자의 특성은 변하지 않았음.
도 4는 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 검출 감도 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 특이성 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 바이러스 샘플 테스트 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 TEM 이미지를 나타내는 사진이다; A) 15 nm 단일 금나노입자; B) 40 nm 단일 금나노입자; C) 40 - 15 nm 이중 금나노입자; D) 40 - 40 nm 이중 금나노입자.
도 3은 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 흡수 스펙트럼을 나타내는 그래프이다 단일 금나노입자, 제1결합물질이 결합된 제1 나노입자, 제2결합물질이 결합된 제2나노입자, 이중 금나노입자의 흡수 스펙트럼이 모두 동일하여 나노입자의 특성은 변하지 않았음.
도 4는 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 검출 감도 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 특이성 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 바이러스 샘플 테스트 결과를 나타낸다.
본 명세서에서 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
<제조예>
1. 이중 금 나노입자 합성
이중 금 나노입자 합성을 위해 ① 스트렙트아비딘이 표지된 금 나노입자 접합체(AuNP-STA) 및 ② 비오틴화된 항체 표지 금 나노입자 접합체(AuNP-ⓑAb) 두 가지 유형의 금 나노입자 접합체를 사용했다.
AuNP-STA 접합체의 경우, 스트렙타비딘(10μl, 1mg·mL-1)을 AuNP 콜로이드(직경 40nm, 1X AuNP, λmax OD = 1.0, 1mL) 및 보레이트 버퍼(100μl, 0.1 M, pH 8.5)에 추가하고, 상기 혼합물을 실온에서 30 분동안 반응시켰다.
반응 후 AuNP 표면을 차단하기 위해 1X PBS(phosphate buffered saline, 10μl, 100mg·mL-1)에 녹인 소 혈청 알부민을 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
반응 후, 상기 혼합물을 6,448 xg, 10℃에서 15분 동안 냉장된 마이크로 원심 분리기를 사용하여 원심 분리하였다.
상층액을 제거한 후, AuNP 접합체의 펠렛을 보레이트 완충액(1mL, 10mM, pH 8.5)으로 현탁시켰다. 원심 분리 및 현탁 단계를 3번 반복 후, 다음 단계를 위해 보레이트 완충액(1mL, 1X)으로 재현탁했다.
AuNP-ⓑAb 접합체의 경우 먼저 비오틴화된 항체를 생산하였다. 1차 아미노기(-NH2) 반응성 비오틴(20μl, 5mg·mL-1)을 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 항체 용액(100μl, 1mg·mL-1)에 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 30분 동안 반응시키면, 항체와 비오틴 사이에 안정적인 아미드 결합이 형성된다.
반응 후, 혼합물을 원심 분리 필터와 냉장 마이크로 원심 분리기를 이용하여 15,602 xg, 10℃에서 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후, 샘플을 PBS(400μl, 1X)로 현탁시켰다. 원심 분리 및 현탁 단계를 3번 반복 후, 비오틴화된 항체 샘플을 원심 필터에서 수득하였다.
상기 비오틴화된 항체(10μl, 1mg·mL-1)를 AuNP 콜로이드(직경 15nm, 40nm, 1X AuNP, λmax OD = 1.0, 1mL)와 보레이트 버퍼(100 μl, 0.1 M, pH 8.5)의 혼합물에 첨가했다. 그 후 단계는 위에서 설명한 것과 동일하게 진행하였다.
AuNP-STA와 AuNP-ⓑAb의 두 접합체를 함께 혼합하고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후, 비오틴(10μl, 100mg·mL-1)과 소 혈청 알부민(10μl, 1mg·mL-1)을 연속적으로 첨가하여 유리 스트렙타비딘 결합 부위와 금 나노 입자 표면을 각각 차단했다.
상기 혼합물을 상온에서 각각 30분 동안 반응시킨 후 2,339 xg, 10℃에서 15분 동안 마이크로 원심 분리기를 사용하여 원심 분리하였다.
세척 후, 상기 이중 금 나노입자 접합체를 최종적으로 재현탁하고 저장 완충액(1X PBS 중 5% 트레할로스, 0.5% 단백질 세이버, 0.2% 트윈-20, 1% 트리톤 X100)으로 10배 농축했다.
2. 측방유동흐름 면역센서 구성
LIF 스트립 센서를 수행하기 위해, 컨쥬게이트 패드와 샘플 패드를 먼저 컨쥬게이트 패드 차단 버퍼(1X PBS 중 0.05% 카제인, 1% 탈지유, 1% 폴리비닐피롤리돈, 평균 Mw ~ 29000 및 0.1% 트윈20)와 샘플 패드 차단 버퍼(1X PBS에서 1% 카제인)로 전처리를 수행하였다. 상기 전처리 버퍼를 적용한 후 컨쥬게이트 패드와 샘플 패드를 완벽하게 건조했다.
항-마우스 IgG 항체 1mg·mL-1 및 항-SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 항체 1mg·mL-1을 멤브레인(0.7μl·cm-1)에 고정하여 대조군과 테스트 라인을 고정하였고, 각 라인 사이의 거리는 약 4mm였다.
저장 완충액과 함께 모든 AuNP 컨쥬게이트 용액(300μl, 5 배 농도)을 전처리된 컨쥬게이트 패드(300 x 5mm2)에 적용했다.
상기 멤브레인과 컨쥬게이트 패드를 37℃에서 15분 동안 건조시킨 후, 흡수 패드를 상기 멤브레인 상단에 2mm 겹쳐서 부착하였다. 상기 컨쥬게이트 패드는 또한 멤브레인의 바닥에 부착되었고, 전처리된 샘플 패드가 그 아래에 위치하여 샘플을 적용할 수 있도록 하였다. 조립된 스트립은 사용하기 전에 습도 조절 챔버(21℃ 및 23% 상대 습도)에 보관되었다.
3. 민감도 및 특이성 테스트
SARS-Cov2 뉴클레오캡시드 단백질 샘플을 1% TritonX-100 in Tris(0.1 M, pH 8) 버퍼를 사용하여 농도별로 희석했다. 100 μl의 준비된 샘플 용액을 스트립의 샘플 패드에 떨어뜨린 후, 실온에서 15분 동안 반응시켰다.
센서의 특이성을 확인하기 위하여, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 및 인간 코로나 바이러스 229E로부터 추출한 뉴클레오캡시드 단백질 샘플도 10ng·mL-1 농도의 동일한 버퍼에서 준비되었다. 모든 이미지는 분석 후 ChemiDoc MP 이미징 시스템을 사용하여 얻었다.
4. 바이러스 분석
정상적인 타액은 MyBioSoruce에서 구입했으며, 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 단백질은 12, 23, 45, 90, 180, 355 TCID50/mL의 농도로 이 유체에 스파이크되었다. 준비된 샘플은 상기 기술한 면역 센서의 샘플 패드에 떨어뜨린 후, 실온에서 15분동안 반응시켰다.
<실험예>
1. 이중 금 나노입자 TEM 이미지
이중 금 나노입자 접합체의 크기와 형태는 Tecnai 현미경, 모델 G2 F30 S-Twin을 사용하여 투과 전자 현미경(TEM)으로 조사되었으며 접합체의 흡광도 스펙트럼은 BioTek 세포 이미징 다중 모드 판독기, 모델 cytation 5를 사용하여 측정되었다.
도 2를 참고하면, 이중 나노입자가 잘 만들어졌는지 확인하기 위하여, 두 가지 크기의 단일 나노입자 ((a) 15 nm 및 (b) 40 nm)와 이를 이용하여 합성된 이중 나노입자 ((c) 40 - 15 nm 및 (d) 40 - 40 nm))의 크기와 형태를 투과 전자 현미경으로 확인하였다.
단일 나노입자의 경우 각각의 입자들이 따로 떨어져 있는 반면, 이중 나노입자의 경우 제1결합물질이 결합된 나노입자를 중심으로 제2결합물질이 결합된 나노입자가 그 주위에 결합하여 이중 나노입자를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.
2. 이중 금 나노입자의 흡수 스펙트럼
도 3을 참고하면, 합성된 이중 나노입자의 입자 특성이 변하지 않았음을 확인하기 위하여, 단일 나노입자, 제1결합물질이 결합된 단일 나노입자, 제2결합물질이 결합된 단일 나노입자, 그리고 합성된 이중 나노입자의 흡수 스펙트럼을 비교하였다.
각각 입자의 흡수 스펙트럼은 동일하였고, 합성된 이중 나노입자의 입자 특성이 변하지 않았음을 확인할 수 있었다.
3. 이중 금 나노입자의 검출 감도 측정
도 4를 참고하면, 합성된 이중 나노입자와 개발된 센서의 검출 감도를 측정하기 위하여 15 nm 단일 나노입자, 40 nm 단일 나노입자, 40 - 15 nm 이중 나노입자, 그리고 40 - 40 nm 이중 나노입자를 사용하여 검출 감도를 측정하였다.
SARS-Cov2 뉴클레오캡시드 단백질 샘플을 버퍼에 농도 별로 희석 후 스트립에 떨어뜨리고 검출 감도를 확인한 결과, 합성된 40 - 40 nm 이중 나노입자의 경우 검출 감도가 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. (15 nm 단일 나노입자 검출감도- 791 pg·mL-1, 40 nm 단일 나노입자 검출감도- 305 pg·mL-1, 40 - 15 nm 이중 나노입자 검출감도- 372 pg·mL-1, 40 - 40 nm 이중 나노입자 검출감도- 42 pg·mL-1 )
4. 이중 금 나노입자의 특이성 측정
도 5를 참고하면, 합성된 이중 나노입자와 개발된 센서의 특이성을 확인하기 위하여, 40 - 40 nm 이중 나노입자를 이용하여 특이성을 확인하였다.
인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 및 인간 코로나 바이러스 229E로부터 추출한 뉴클레오캡시드 단백질 샘플을 10ng·mL-1 농도로 버퍼에 준비하고 스트립에 떨어뜨린 후 결과를 확인하였다. 그 결과, 합성된 이중 나노입자와 개발된 센서는 SARS-Cov2 뉴클레오캡시드 단백질 샘플에서만 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
5. 이중 금 나노입자의 바이러스 샘플 테스트 결과
도 6을 참고하면, 합성된 이중 나노입자와 개발된 센서가 실제 바이러스 파티클을 검출할 수 있는지 확인하기 위하여 40 - 40 nm 이중 나노입자와 타액에 분산된 실제 바이러스 파티클을 이용하여 결과를 확인하였다.
총 6가지 농도 12, 23, 45, 90, 180, 355 TCID50/mL로 준비된 타액에 분산된 샘플을 스트립에 떨어뜨린 후 결과를 확인하였다. 그 결과, 육안으로 약 90 TCID50/mL 바이러스 파티클을 검출할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 대표적인 실시예들을 상세하게 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상술한 실시예에 대하여 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 그러므로 본 발명의 권리범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
Claims (16)
- 제1결합 물질이 표지된(labeled) 제1나노입자; 및
타겟 검체와 특이적으로 결합하고, 제2결합 물질을 포함하는 바인더;가 표지된 제2나노입자를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제1항에 있어서,
상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 실리카 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제1항에 있어서,
상기 제1나노입자 및 제2나노입자의 직경은 5 ~ 100 nm인 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제1항에 있어서,
상기 제1나노입자 및 제2나노입자의 직경은 동일한 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제1항에 있어서,
상기 제1결합 물질과 제2결합 물질의 상호 결합에 의하여 상기 제1 및 제2나노입자가 서로 접합하는 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제1항에 있어서,
상기 제1결합 물질과 제2결합 물질은 타겟 항원이 아닌 항원-항체 쌍, 서로 상보적인 뉴클레오티드 사슬 쌍, 압타머와 표적 물질 쌍, 서로 결합하는 펩티드 쌍, 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘과 비오틴 쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제1항에 있어서,
상기 바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체인 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제1항에 있어서,
상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제1항에 있어서,
상기 나노입자의 표면 중 상기 제1결합 물질 또는 바인더가 표지되지 않은 않은 부분에 차단제가 고정되어 있는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제7항에 있어서,
상기 차단제는 소 혈청 알부민, 난 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
- (i) 흡수성 샘플 패드;
(ii) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자를 포함하는 접합 패드;
(iii) 검출 부위; 및
(iv) 흡수 패드를, 순차적으로 일단으로부터 타단 방향으로 배치하여 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
- 제12항에 있어서,
상기 검출 부위는 제1바인더와 결합되는 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 제2바인더가 고정된 테스트 영역 및 상기 타겟 검체와 특이적으로 결합하지 않으나 상기 제1바인더와 특이적으로 결합하는 제3바인더가 고정된 컨트롤 영역을 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
- 1) 제1나노입자 및 제1결합 물질을 접합시키는 단계;
2) 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 바인더 및 제2결합 물질을 접합시키는 단계;
3) 상기 바인더 및 제2나노입자를 접합시키는 단계;및
4) 상기 제1결합 물질 및 제2결합 물질을 결합시키는 단계를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 제조 방법.
- 제14항에 있어서,
상기 4) 단계 이후에 나노입자의 표면 중 상기 제1결합 물질 또는 바인더가 표지되지 않은 않은 부분에 차단제를 고정시키는 단계를 더 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 제조 방법.
- 제15항에 있어서,
상기 차단계 고정 단계 이후에, 상기 제1결합 물질 및 제2결합 물질을 결합시킨 후 결합되지 않은 제1결합 물질 및 제2결합 물질을 제거시키는 단계를 더 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자의 제조 방법.
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| KR1020210085085A KR20230001948A (ko) | 2021-06-29 | 2021-06-29 | 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자 및 이를 이용한 면역 검출 센서 |
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| KR1020210085085A KR20230001948A (ko) | 2021-06-29 | 2021-06-29 | 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 이중 나노입자 및 이를 이용한 면역 검출 센서 |
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| WO2024151021A1 (ko) * | 2023-01-09 | 2024-07-18 | 한국재료연구원 | 다결정 구조체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립 및 이의 제조방법 |
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| KR101273964B1 (ko) | 2010-12-30 | 2013-06-11 | 주식회사 중겸 | 단백질 ｇ다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자 및 이의 제조방법과 이를 이용한 검출용 면역센서 및 이를 이용한 면역검출방법 |
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| US20020164659A1 (en) * | 2000-11-30 | 2002-11-07 | Rao Galla Chandra | Analytical methods and compositions |
| CN102227631B (zh) * | 2008-11-28 | 2014-04-23 | 英佛皮亚有限公司 | 免疫层析测试中信号放大的方法以及使用该方法的免疫层析试剂盒 |
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Patent Citations (1)
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