CN106770135A - 金属增强荧光信号的编码微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

金属增强荧光信号的编码微球及其制备方法，涉及一种可以作为高通量多元蛋白质、基因分析或药物筛选等的编码悬浮载体，其特征在于在磁编码载体微球外面包覆金属纳米结构，这些金属纳米结构能够产生局域表面等离子体，并使局域表面等离子体共振吸收峰的位置与待检测荧光染料的发射光谱的位置重叠，从而增强荧光的信号，提高检测灵敏度。

Description

金属增强荧光信号的编码微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种利用在磁编码载体微球外面包覆金属纳米结构并产生局域表面等离子体，利用局域表面等离子共振效应增强荧光信号的编码微球及其制备方法。
背景技术
随着生物医学的迅速发展，在疾病检测、药物发现等领域都需要进行高通量的生物分析。虽然平面芯片技术被广泛的应用在高通量分析中，他们在反应速度上有一定限制，在可重复性和可靠性上有一定局限性。悬浮阵列是另外一项替代策略，探针分子载体则可以自由散布到反应体系中，不受空间位置的限制。对于悬浮阵列，主要有两个关键问题。一个是需要对流动载体进行编码。近年来各种新型的编码载体相继出现并得到了广泛应用。其中聚合物微球作为一种固相载体具有显著的优势，比如比表面积大、可以通过搅拌等辅助手段加快反应速度、表面结合的分子在反应后可以从溶液分离出来等等。此外，目标分子的分析是悬浮载体技术中另一个重要部分,通常通过标记在生物分子上的标记物质来检测。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种载体微球的荧光信号增强方式及其制备方法，这种聚合物编码微球直径在10μm～1000μm之间，可以作为高通量、高灵敏度生物分析的载体，制备方法简单高效。
技术方案：一种金属增强荧光信号的编码微球，为壳核结构，内核为磁性纳米结构，外面包裹一层聚合物外壳，在聚合物外壳上分布颗粒状或岛状的金属纳米结构；所述的金属纳米结构产生局域表面等离子体，且局域表面等离子体共振吸收峰的位置与待检测荧光染料发射光谱的位置重叠，从而使荧光信号得到增强。
所述的金属包括金、银、铂中任一种。
所述的金属纳米结构尺寸为30nm～300nm，金属纳米结构的间距为5nm～40nm。
所述的聚合物包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸羟乙基酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇、聚(N-异丙基丙烯酰胺)中的一种或多种混合物。
所述的磁性纳米结构包括四氧化三铁、氧化铁或其复合物。
所述的编码微球直径在10μm～1000μm之间，偏差在5％以内；
制备所述的金属增强荧光信号的编码微球的方法，先采用协流式微控法制备聚合物包裹磁性纳米结构得到磁编码载体微球，再在载体微球上负载金属纳米结构，具体步骤为：
(1)用氨基硅烷修饰制备好的磁编码载体微球；
(2)再接贵金属纳米种子：将第一步得到的修饰后的磁编码载体微球放入贵金属的酸性溶解液中，通过加热或还原剂进行还原并吸附金种，在磁编码载体微球表面得到贵金属纳米种子；
(3)最后将贵金属的酸性溶解液与弱还原剂再次反应，最终在磁编码载体微球表面生成相互之间有间隙的金属纳米结构并产生局域表面等离子体。
所述的还原剂包括氨水、硼氢化钠、柠檬酸三钠中的任意一种。
所述的弱还原剂包括羟胺、L-抗坏血酸、对苯二酚、临苯三酚、1,2,4-苯三酚中的任意一种。
所述的金属增强荧光信号的编码微球在核酸、蛋白、细胞的检测分析中的应用。
有益效果：本发明的金属增强荧光编码微球是通过表面的贵金属纳米结构产生局域表面等离子体，这些局域表面等离子体的共振吸收峰的位置与待检测荧光染料的吸收光谱重叠，从而增强荧光的信号，提高检测灵敏度。
本发明的编码载体微球是将磁性纳米结构包裹在聚合物微球内部，通过包裹磁性纳米结构的量的不同进而获得以磁含量作为特征编码的载体微球。
本发明的金属增强荧光信号的编码微球具有编码、译码简单、成本低、制作方便，检测灵敏度高等优点，可以应用于核酸、蛋白、细胞等多元生物分析领域。
附图说明
图1是本发明编码载体微球的剖面示意图。
其中，1代表颗粒或岛状金属纳米结构，2代表包裹有磁性纳米结构的聚合物内核。
图2是本发明编码载体微球的正面示意图。
其中，1表颗粒或岛状金属纳米结构，3代表金属纳米结构的间隙。
图3是编码微球装置示意图。
其中，4代表液滴生成装置的入口A，5代表液滴生成装置的入口B，6代表液滴生成装置的出口。
图4是编码微球检测装置示意图
其中，7代表编码微球的入口，8代表恒定均匀磁场的发生器，9代表磁含量较多的微球，10代表磁含量较少的微球，11代表磁含量更少的微球。
图5是局域表面等离子体的共振吸收峰与荧光染料发射光谱关系示意图(以荧光染料Cy5和IR800为例)。
其中，横坐标代表波长，纵坐标代表吸光度，12代表局域表面等离子体的共振吸收峰，13代表Cy5的发射光谱，14代表IR800的发射光谱。
图6是对于荧光染料IR800来说，以金纳米结构作为表面等离子体，不同反应浓度情况下荧光增强效果的示意图。
其中，横坐标代表不同共振吸收的编码载体，纵坐标代表荧光强度，15代表接金种浓度为300μM，长金浓度为400μM体的载体微球，16代表接金种浓度为200μM，长金浓度为400μM体的载体微球，17代表接金种浓度为300μM，长金浓度为300μM体的载体微球，18代表未修饰表面等离子体的载体微球。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明实施例提供如下技术方案：
如图1所示，在一个实施例中，提供一种金属增强荧光信号的编码微球，编码微球的内核为包裹有磁性纳米结构的聚合物微球，外壳为颗粒或岛状的金属纳米结构。以磁性纳米结构的含量作为载体的编码，以局域表面等离子共振效应增强标记生物分子的荧光信号。
优选的，所述的载体微球直径在10μm～1000μm之间，偏差在5％以内；
优选的，所述的金属增强荧光信号中金属纳米结构尺寸为30nm～300nm，金属纳米结构的间距为5nm～40nm
优选的，所述的磁编码载体微球为将磁性纳米结构包裹在聚合物微球内部，通过包裹磁性纳米结构的量不同获得以磁含量作为特征编码的载体微球；
优选的，所述载体微球表面金属纳米结构的局域表面等离子共振波长与荧光染料分子的吸收带或发射带一致时荧光得到增强；
优选的，载体微球的金属纳米岛结构长径为100～300nm左右，宽度和间隙在10～30nm之间时，该载体对荧光染料IR800的荧光信号增强10倍以上。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种制备所述金属增强荧光信号的编码微球的方法，先采用协流式微控法制备聚合物包裹磁性纳米结构得到磁编码载体微球，再在载体微球上负载金属纳米结构，具体步骤为：
(1)用氨基硅烷修饰制备好的磁编码微球；
(2)通过两步法(①接贵金属纳米种子；②纳米种子生长)，首先将贵金属的酸性溶解液，如氯金酸(HAuCl4)、氯铂酸(H2PtCl6)、硝酸银(AgNO3)等通过加热或还原剂如氨水(NH3·H2O)，硼氢化钠(NaBH4)，柠檬酸三钠等进行还原并吸附金种；
(3)用硼氢化钠(NaBH4)还原金属纳米颗粒的种子；
(4)然后将贵金属的酸性溶解液，如氯金酸(HAuCl4)、氯铂酸(H2PtCl6)、硝酸银(AgNO3)等与弱还原剂如羟胺(NH2OH)、L-抗坏血酸、苯酚(如对苯二酚、临苯三酚、1,2,4-苯三酚等)等再次反应，生成相互之间有间隙的金属纳米粒并产生局域表面等离子体。
采用协流式微控法制备聚合物包裹磁性纳米结构得到磁编码载体微球的方法参考申请号2016103480989，发明名称为一种磁含量编码的聚合物载体微球及其制备方法具体实施方式和实施例1中记载的方法，具体步骤为：
(1)将磁性纳米结构均匀分散到聚合物溶液中或聚合物的前聚体中，其中的含量为聚合物的0.01～100％wt；
(2)通过注射泵向微球生成装置的入口A中注入3％wt～10％wt的聚乙烯醇溶液或者甲基硅油或正十六烷；
(3)把含有磁性纳米结构的聚合物溶液注入到生成装置的入口B，使通过生成装置的出口在聚乙烯醇溶液或者甲基硅油或正十六烷中分散成一个个微球，然后通过紫外光固化或热固化得到大小均一的磁性微球；通过调节入口两相的流速来控制磁编码微球的大小；
优选的，所述的磁编码载体微球中聚合物的组成材料为聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(ETPTA)、聚甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚乙二醇(PEG)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)中的一种或多种混合物，磁性纳米结构为四氧化三铁、氧化铁及其复合物；
优选的，所述液滴生成装置为协流式微流控装置，材料选用二氧化过硅、玻璃、特氟龙、聚二甲基硅氧烷的一种或多种。
采用磁含量计检测的方法对不同编码微球的磁含量进行检测，达到解码的目的，具体步骤为：
(1)在不同磁含量的编码微球上接上不同抗体；
(2)通过双抗夹心免疫荧光法，利用抗原，血清或组织液等进行反应；
(3)将反应结束后的编码微球放入装置内；
(4)将装置水平放置；
(5)通过注射泵将反应后混合在一起的编码微球以恒定的速度注入通道内；
(6)使编码微球逐个流过磁含量计，磁含量计会根据微球磁含量的不同产生不同强度的响应信号，从而测出磁性纳米粒子的量进行解码。
实施例1三种不同编码的载体微球的制备：
1.将平均粒径为170nm的四氧化三铁粒子分别按质量分数0.1％、0.5％、0.9％的比例加入到ETPTA中，并分散均匀，配置成三种不同磁性纳米结构含量的ETPTA溶液；
2.通过注射泵向微球生成装置的入口A中注入质量分数为4％的聚乙烯醇水溶液，入口B注入磁性纳米结构含量为0.1％的ETPTA溶液，使通过生成装置的出口在4％聚乙烯醇中分散成一个个微球，通过入口两相的流速调节微球的大小；
3.通过紫外光照使微球聚合，得到磁含量为0.1％wt的聚合物载体微球；
4.重复步骤2，3，以同样方法制备磁含量为0.5％wt和0.9％wt的聚合物载体微球。
实施例2三种不同共振吸收的载体微球的制备：
1.将平均粒径为170nm的四氧化三铁粒子分别按质量分数0.5％wt的比例加入到ETPTA中，并分散均匀，配置成三种不同磁性纳米结构含量的ETPTA溶液；
2.通过注射泵向微球生成装置的入口A中注入4％聚乙烯醇，入口B注入磁性纳米结构含量为0.5％的ETPTA溶液，使通过生成装置的出口在4％聚乙烯醇中分散成一个个微球，通过入口两相的流速调节微球的大小；
3.通过紫外光照使微球聚合，得到磁含量为0.5％的聚合物载体微球；
4.用氨基硅烷修饰制备好的磁编码微球；
5.将氨基修饰后的微球分别加入到200μM，300μM，400μM的氯金酸溶液中，加入一定量的氨水，剧烈反应，通过调节氯金酸浓度可以改变金纳米结构的间隙；
6.将在200μM氯金酸中反应的磁性载体微球取出，用NaBH4还原；
7.将步骤6中还原后的磁性载体微球取出，加入到400μM的氯金酸溶液中，加入等量的NH2OH促使金纳米结构生长，形成局域表面等离子体。通过调节氯金酸的浓度和反应时间可以控制金纳米结构的尺寸及形貌；
8.重复步骤6，7，以同样方法制备得到接金种浓度为300μM和400μM、磁含量为0.5％的聚合物载体微球。
实施例3三种不同编码的载体微球的解码与检测：
1.将磁含量为0.5％、1％、1.5％的编码微球通过免疫荧光反应接上相应的抗原(待测物)，抗体(荧光标签为IR800)；
2.将反应后的编码微球通过注射泵以恒定的速度注入毛细管内；
3.编码微球逐个流过磁含量计，测出磁性纳米粒子的量进行解码；
4.同时对编码微球的荧光强度进行检测，从而检测出待测抗原的浓度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种金属增强荧光信号的编码微球，其特征在于，为壳核结构，内核为磁性纳米结构，外面包裹一层聚合物外壳，在聚合物外壳上分布颗粒状或岛状的金属纳米结构；所述的金属纳米结构产生局域表面等离子体，局域表面等离子体在近红外区域发生共振吸收，当共振吸收峰的位置与荧光染料的发射光谱的位置发生重叠时实现荧光增强。
2.根据权利要求1所述的金属增强荧光信号的编码微球，其特征在于，所述的金属包括金、银、铂中任一种。
3.根据权利要求1所述的金属增强荧光信号的编码微球，其特征在于，所述的金属纳米结构尺寸为30nm～300nm，金属纳米结构的间距为5nm～40nm。
4.根据权利要求1所述的金属增强荧光信号的编码微球，其特征在于，所述的聚合物包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸羟乙基酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇、聚(N-异丙基丙烯酰胺)中的一种或多种混合物。
5.根据权利要求1所述的金属增强荧光信号的编码微球，其特征在于，所述的磁性纳米结构包括四氧化三铁、氧化铁或其复合物。
6.根据权利要求1所述的金属增强荧光信号的编码微球，其特征在于，所述的编码微球直径在10μm～1000μm之间，偏差在5％以内。
7.制备权利要求1～6任一所述的金属增强荧光信号的编码微球的方法，先采用协流式微控法制备聚合物包裹磁性纳米结构得到磁编码载体微球，其特征在于，再在载体微球上负载金属纳米结构，具体步骤为：
(1)用氨基硅烷修饰制备好的磁编码载体微球；
(2)再接贵金属纳米种子：将第一步得到的修饰后的磁编码载体微球放入贵金属的酸性溶解液中，通过加热或还原剂进行还原并吸附金种，在磁编码载体微球表面得到贵金属纳米种子；
(3)最后将贵金属的酸性溶解液与弱还原剂再次反应，最终在磁编码载体微球表面生成相互之间有间隙的金属纳米结构并产生局域表面等离子体。
8.如权利要求7所述的制备金属增强荧光信号的编码微球的方法，其特征在于，所述的还原剂包括氨水、硼氢化钠、柠檬酸三钠中的任意一种。
9.如权利要求7所述的制备金属增强荧光信号的编码微球的方法，其特征在于，所述的弱还原剂包括羟胺、L-抗坏血酸、对苯二酚、临苯三酚、1,2,4-苯三酚中的任意一种。
10.权利要求1～6任一所述的金属增强荧光信号的编码微球在核酸、蛋白、细胞的检测分析中的应用。
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