KR101256628B1 - 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법 - Google Patents
나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101256628B1 KR101256628B1 KR1020100117479A KR20100117479A KR101256628B1 KR 101256628 B1 KR101256628 B1 KR 101256628B1 KR 1020100117479 A KR1020100117479 A KR 1020100117479A KR 20100117479 A KR20100117479 A KR 20100117479A KR 101256628 B1 KR101256628 B1 KR 101256628B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- microorganism
- microorganisms
- nanoparticles
- antibody
- film
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 127
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 54
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 54
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims abstract description 31
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 39
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 claims description 15
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 13
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 claims description 13
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 13
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 7
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 3
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 claims description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 3
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 claims description 3
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 2
- 239000002998 adhesive polymer Substances 0.000 claims description 2
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 claims description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012473 microbial detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 17
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 15
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 15
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 3
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 2
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 2
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 2
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009766 low-temperature sintering Methods 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000011882 ultra-fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 검출 대상 미생물에 가하여 면역반응을 시키고, 응집용 필름을 통과시켜 미생물을 한곳에 모이게 한 후, 포획용 여과막에서 항체가 고정된 나노입자와 면역반응을 일으킨 미생물을 포획하여 미생물의 유무 및 농도를 측정하는 미생물 고속 검출방법 및 미생물 검출 장치에 관한 것이다.
본 발명은 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 이용함으로써, 기존의 검출 방법에 비해, 경제적이고 간단하게 미생물의 유무 및 농도를 측정할 수 있으며, 감도가 우수하여 적은 양의 미생물을 측정하는데 효과적이다.
본 발명은 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 이용함으로써, 기존의 검출 방법에 비해, 경제적이고 간단하게 미생물의 유무 및 농도를 측정할 수 있으며, 감도가 우수하여 적은 양의 미생물을 측정하는데 효과적이다.
Description
본 발명은 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 검출 대상 미생물에 가하여 면역반응을 시키고, 응집용 필름을 통과시켜 미생물을 한곳에 모이게 한 후, 포획용 여과막에서 항체가 고정된 나노입자와 면역반응을 일으킨 미생물을 포획하여 미생물의 유무 및 농도를 측정하는 미생물의 고속 검출방법 및 미생물 검출 장치에 관한 것이다.
미생물의 신속한 측정은 식중독균 진단, 환경 유해균 측정, 감염균 측정, 병원성 바이러스 진단 등에 매우 중요한 기술이다. 일반적으로 많이 사용되는 병원성 물질 (미생물, 단백질 등)의 유무 및 농도를 검사하기 위한 방법으로는 콜로니법, DNA 탐침(probe)법, 면역분석법 등이 많이 이용되고 있다(Jay JM. Modern Food Microbiology, 1986, 3rd, ed., p 95, Van Nostrand Reinhold Co., New York; Tenover FC., DNA Probes for Infectious Diseases, 1989, p 53 CRC Press, Boca Raton).
콜로니법은 시료를 채취하여 검출하고자 하는 미생물만이 생존할 수 있게 성분을 조성한 선택배지에서 배양한 후, 미생물이 형성하는 콜로니의 수를 측정하는 방법으로, 이 방법은 매우 정확하지만 측정에 오랜 시간이 소요되며 각각의 미생물에 대한 배지의 선택에 어려움이 있다는 단점이 있다.
DNA probe법은 실시간 PCR(중합효소연쇄반응, polymerase chain reaction) 분석 방법 및 핵산 결합 분석 방법(nucleic acidhybridization)을 포함하는 방법으로서, 미생물을 물리화학적으로 파괴한 후 세포 안의 DNA를 핵산 접합 반응에 의해 검출하는 방법이다. 이 방법은 콜로니법과 비교하여 검사 시간이 짧은 장점을 가지고 있지만 고가의 PCR 장비가 사용되고 적은 양의 미생물 검출 시, 높은 민감도를 달성하기 위해서 별도로 배양을 하는 단계를 병행해야한다(Ninet, B et al ., Appl Environ Microbiol, 58:4055-4059,1992). 만일 배양 단계가 포함되지 않는다면, 죽은 세포들이 검출될 수 있는데, 이로 인해 정확하지 않은 결과가 나타나게 된다. 또한 PCR을 수행할 경우 거짓-양성(false-positive)이 매우 빈번하여 검출의 오차 범위가 증가하고 분석의 신뢰도를 감소시킬 가능성을 가지고 있다.
면역분석법은 항원-항체 결합 반응을 이용한 것으로 예컨대, 검출하고자 하는 미생물의 표면 항원에 특이적으로 반응하는 항체를 이용한 효소 결합 면역 흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA)이 널리 수행되어지는데, 이 방법은 짧은 시간에 매우 높은 민감도를 나타내므로 상기한 두 방법의 대체 방법으로 인식되고 있다. 이 방법은 일단 개발된 항체 생산 세포 (hybridoma)는 지속적인 항체 생산을 가능하게 하므로 이 문제의 발생을 최소화할 수 있지만 고순도의 항원, 고가의 장비 및 긴 실험 시간을 필요로 하는 단점이 있다.
또 다른 항체에 기초한 분석 방법은 면역자기분리(immunomagnetic separation, IMS) 방법인데, 이 방법은 농축 시간을 단축시킬 수 있고, 자기 입자들이나 비드(bead)에 결합된 특정 항체들을 이용함으로써 박테리아를 선택적으로 포집할 수 있다(Lynch, MJ et al ., J Microbiol Methods 58:285-288, 2004; Notermans, S et al., Int J Food Microbiol , 12:91-102, 1991). IMS 는 선택적인 표적 유기체, 단백질 및 핵산을 포집하고 응축시키기 위해 사용된다(Favrin, SJ et al ., Int J Food Microbiol , 85:63-71, 2003; Feng P., ASM press , Washington D.C., 2001). 하지만 항체에 기초한 다른 분석 방법과 마찬가지로, 응축 단계를 필요로 하며 적은 양의 시료에 사용되도록 제한되는 단점이 있다.
SPR 센서 기술은 단백질과 같은 생체물질이 센서 표면에 결합될 경우 신호 변화를 일으키는 현상을 이용하여 미생물을 검출하는 방법으로 다른 검출방법에 비하여 검출 시간이 짧고 분석절차가 간단하지만 센서 표면에 고정화된 항체보다 시료의 병원성 미생물의 크기가 상대적으로 훨씬 크므로 SPR 시스템의 유체 흐름 속에서 면역 반응에 의한 미생물의 항체에 대한 결합 효율이 낮게 나타난다. 결국 비효율적 면역 반응 및 표면 고정화로 인하여 병원성 미생물의 검출한계는 높은 수준으로 형성되는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자와의 면역반응 및 멤브레인 여과법을 이용하여 고감도의 미생물 검출 분석이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자 및 멤브레인 여과법을 이용한 미생물의 고속 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 포함하는 미생물의 고속 검출 장치를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, (a) 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 나노입자-항체 접합체 및 검출 대상 미생물이 함유된 시료를 혼합하여 반응시키는 단계; (b) 상기 반응액을 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜, 미생물과 반응하지 않은 나노입자-항체 접합체를 투과시키고, 나노입자-항체-미생물 복합체를 선택적으로 분리시키는 단계; 및 (c) 상기 포획용 여과막에 포획된 나노입자-항체-미생물 복합체의 유무 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 포함하는 시료반응부; 상기 시료반응부로부터 반응액을 수용하여 검출 대상 미생물을 응집하는 미생물 응집용 필름; 상기 미생물 응집용 필름을 통과하여 응집된 미생물들을 포획하여 선택적으로 분리하는 미생물 포획용 여과막; 및 상기 미생물의 유무 또는 농도를 확인하기 위한 검출부를 포함하는 미생물의 검출장치를 제공한다.
본 발명은 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 이용함으로써, 복잡하고 시간이 오래 걸리는 탐지기능물질의 2차 반응을 거치지 않고 나노입자를 바로 확인 할 수 있도록 하여 경제적이고 간단하게 미생물의 유무 및 농도를 측정하는데 효과가 있다. 또한, 기존 면역여과법으로는 미생물을 105 cfu까지 측정할 수 있었으나 본 발명은 102 cfu까지 측정할 수 있어 적은 양의 미생물을 측정하는데 효과가 있다.
도 1은 AuNP-항체 접합체와 미생물의 선택적인 결합에 의해 미생물의 농도를 측정할 수 있는 개념도이다.
도 2는 Staphylococcus aureus에 선택적인 항체의 AuNP-항체 접합체를 사용하여 Staphylococcus aureus를 농도별로 측정한 결과이다 (A: 105 cfu, B: 104 cfu, C: 103 cfu, D: 102 cfu, E: 세포가 없는 경우).
도 3은 Staphylococcus aureus에 선택적인 항체의 AuNP-항체 접합체에 대해서 다른 균류와 교차반응이 일어나는지 확인한 결과이다 (A: 106 cfu S. aureus cells, B: 106 cfu E. coli cells, C: 106 cfu Salmonella cells, D: 106 cfu Listeria monocytogenes cells, E: 세포가 없는 경우).
도 4는 Listeria monocytogenes에 선택적인 항체의 AuNP-항체 접합체를 사용하여 다른 균주에서 교차반응이 일어나는지 확인한 결과이다 (A-C: AuNP-BSA 접합체와 반응한 경우, A:105 cfu Listeria monocytogenes cells, B: AuNP-anti-Listeria monocytogenes , C: 105 cfu Listeria monocytogenes cells, D-G: AuNP-항체 접합체와 반응한 경우 D: 105 cfu Salmonella typimurium cells, E: 105 cfu Escherichia coli cells, F: 105 cfu Staphylococcus cells, G: 105 cfu Listeria monocytogenes cells).
도 5는 MNP-항체 접합체와 미생물의 선택적인 결합에 의해 미생물의 농도를 측정할 수 있는 개념도이다.
도 6은 Staphylococcus aureus에 선택적인 항체의 MNP-항체 접합체를 사용하여 Staphylococcus aureus 농도에 따른 측정 결과이다 (A: 균이 없는 경우, B: 105 cfu, C: 106 cfu).
도 7은 은(Ag) 스크린 프린팅용 페이스트를 이용하여 제조한 미생물 응집용 필름-포획용 여과막을 촬영한 사진이다.
도 2는 Staphylococcus aureus에 선택적인 항체의 AuNP-항체 접합체를 사용하여 Staphylococcus aureus를 농도별로 측정한 결과이다 (A: 105 cfu, B: 104 cfu, C: 103 cfu, D: 102 cfu, E: 세포가 없는 경우).
도 3은 Staphylococcus aureus에 선택적인 항체의 AuNP-항체 접합체에 대해서 다른 균류와 교차반응이 일어나는지 확인한 결과이다 (A: 106 cfu S. aureus cells, B: 106 cfu E. coli cells, C: 106 cfu Salmonella cells, D: 106 cfu Listeria monocytogenes cells, E: 세포가 없는 경우).
도 4는 Listeria monocytogenes에 선택적인 항체의 AuNP-항체 접합체를 사용하여 다른 균주에서 교차반응이 일어나는지 확인한 결과이다 (A-C: AuNP-BSA 접합체와 반응한 경우, A:105 cfu Listeria monocytogenes cells, B: AuNP-anti-Listeria monocytogenes , C: 105 cfu Listeria monocytogenes cells, D-G: AuNP-항체 접합체와 반응한 경우 D: 105 cfu Salmonella typimurium cells, E: 105 cfu Escherichia coli cells, F: 105 cfu Staphylococcus cells, G: 105 cfu Listeria monocytogenes cells).
도 5는 MNP-항체 접합체와 미생물의 선택적인 결합에 의해 미생물의 농도를 측정할 수 있는 개념도이다.
도 6은 Staphylococcus aureus에 선택적인 항체의 MNP-항체 접합체를 사용하여 Staphylococcus aureus 농도에 따른 측정 결과이다 (A: 균이 없는 경우, B: 105 cfu, C: 106 cfu).
도 7은 은(Ag) 스크린 프린팅용 페이스트를 이용하여 제조한 미생물 응집용 필름-포획용 여과막을 촬영한 사진이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 나노입자-항체 접합체 및 검출 대상 미생물이 함유된 시료를 혼합하여 반응시키는 단계; (b) 상기 반응액을 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜, 미생물과 반응하지 않은 나노입자-항체 접합체를 투과시키고, 나노입자-항체-미생물 복합체를 선택적으로 분리시키는 단계; 및 (c) 상기 포획용 여과막에 포획된 나노입자-항체-미생물 복합체의 유무 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 대상 미생물은 식중독균, 바이러스, 감염균 등일 수 있으며, 예컨대, 대장균, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monobytogenes), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurim), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 노로바이러스 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체는, 본 기술분야에 공지된 미생물들에 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 항체라면 제한없이 이용가능하고, 예컨대, 스테필로코커스 종을 검출하기 위해, 스테필로코커스 종과 특이적으로 결합하는 항체로 알려진 ab20002 (Abcam 사) 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 나노입자는 금속 나노입자, 양자점 나노입자 (Quantum Dot Nanoparticle) 또는 자기 나노입자 (Magnetic Nanoparticle;MNP)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 금속은 금 (Au), 은(Ag), 및 구리(Cu)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
여기서, “나노입자”란 크기가 1 nm에서 200 nm 정도의 크기를 가지는 극미세 입자를 말한다. 아주 작은 크기의 나노입자들은 일반적인 덩어리 물질과는 다른 특성을 가진다. 나노입자는 기존 물질에 비해 현저히 증가된 비표면적을 가진다. 이러한 높은 비표면적 때문에 기존 물질과는 다른 표면효과를 가지게 되는데, 입자의 크기가 작아질수록 표면에 위치한 분자의 수가 증가한다. 입자의 입경이 5 nm가 되면 입자를 구성하는 분자 중 50%가 표면에 위치하게 되고, 입자의 크기가 2 nm가 되면 그 비율은 90%에 이른다.
표면에 위치한 분자의 비율이 상대적으로 높기 때문에 나노입자들은 기존 물질에 비해 표면에너지의 결합에너지에 대한 비가 더 커지게 된다. 표면에너지의 결합에너지에 대한 비율은 입자의 크기가 20 nm에서 1 nm로 작아질수록 5% 에서 약 30% 로 증가하게 된다. 입자를 구성하고 있는 원자들은 주변의 원자들 간의 상호 작용에 의해 인력과 반발력이 평형을 이루는 에너지의 안정 상태에 있게 된다. 하지만 표면에 위치한 원자는 내부 원자에 의한 인력만 존재하므로 고 에너지 상태에 놓이게 있다. 이러한 표면 효과로 인해 나노입자는 촉매나 촉매의 표면반응에서 보이는 표면활성, 녹는점 강하, 저온 소결성 등의 성질을 가지게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 20 ㎚ 크기의 나노 금입자를 사용하였으나 이에 한정되지 않으며, 나노 금 입자는 항체와 분석물질의 면역반응을 방해하지 않는 어떤 입자경도 가질 수 있음은 당업자에게 자명한 사항이다. 바람직하게는 5 내지 100 ㎚ 크기의 입자경을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 나노입자는 자기 나노입자를 사용할 수 있다. 자기 나노입자의 특성에 의해, 미생물의 고속 검출방법에 있어, 시료를 혼합하여 반응시키는 단계 이후에, 상기 반응액 중 자기나노입자-항체-미생물 복합체를 자석으로 분리한 다음, 분리된 복합체를 완충용액에 재현탁시키는 단계를 추가로 포함하여 보다 완벽한 검출을 도모할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 자기 나노입자를 이용하여 미생물을 검출할 때, 자기나노입자-항체 접합체 및 검출 대상 미생물이 포함된 시료를 혼합하여 반응한 이후, 상온에서 자석을 이용하여 분리한 후 상등액을 제거하고, 완충용액에 재현탁시킨 후, 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜 걸과적으로 여과막에 포획된 나노입자-항체-미생물 복합체를 확인하였으며, 그 농도별로 검출이 가능함도 확인하였다. 이로써, 자기력을 이용하여 여러가지 불순물이 섞여있는 현탁 용액으로부터 목적물을 얻어내는 분리 및 검출이 보다 바람직하게 이루어질 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 나노입자로 양자점 (quantum dot) 나노입자를 사용할 수 있으며, 이로써 2종 이상의 미생물을 동시에 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
여기서, 상기 양자점 나노입자는 반도체 나노입자로 독특한 광학적인 특징을 가지고있다. 이는 입자의 크기를 조금씩 변화시키거나 조성을 조금만 바꾸어도 서로 다른 파장의 강력한 형광을 발현하게 된다. 빛을 흡수한 뒤에, 흡수한 빛과는 다른 파장의 형광빛을 발하게 되는데 이를 쉽게 조절할 수 있기 때문에 다양한 응용이 가능하다. 따라서, 본 발명에서 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 양자점 나노입자를 사용하였을 경우, 2종 이상의 미생물을 동시에 검출할 수 있다. 상기 양자점 나노입자의 제조는 당해업계에 알려진 방법에 의할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 0.1 내지 5 ㎜의 직경을 가지는 다수의 구멍을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 응집용 필름은 미생물이 여과막을 통과하기 전에 통과하는 장치로서, 미생물을 한곳에 집중하여 모일 수 있도록 유도하여 보다 큰 신호를 얻을 수 있도록 한다. 응집용 필름 구멍의 크기가 작을수록 미생물이 더욱 집중하여 모일 수 있으므로 큰 신호를 얻을 수 있다. 기존 면역여과법으로는 105 cfu의 미생물을 검출하는 것이 한계였으나 본 발명의 일 실시예에서는 응집용 필름을 이용하여 102 cfu의 미생물을 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 PDMS (polydimethylsiloxane), 접착성이 있는 고분자 및 알루미늄 테이프, 고무 및 라텍스, 및 스크린 프린팅용 페이스트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 일 양태로, 상기 미생물 응집용 필름은, 은 페이스트 또는 탄소 페이스트와 같은 스크린 프린팅용 페이스트를 상기 포획용 여과막에 일정한 크기의 구멍을 가진 모양으로 스크린 프린팅 기법으로 도포하여 제조한 필름일 수 있다. 이로써, 응집용 필름과 포획용 여과막을 일체형으로 구성할 수 있으며, 스크린 프린팅 기법은 당해 업계에 널리 알려진 방법을 이용할 수 있다.
스크린 프린팅 기법의 일례로, 나일론(Nylon), 데트론(Polyester) 또는 스테인레스 스틸등으로 짜여진 스크린 망사를 나무나 알루미늄 등의 틀에 고정시켜 그 위에 수공적 또는 광화학적 방법으로 판막을 만들어 필요한 화상 이외의 부분을 막고 그 안에 스크린 프린팅용 페이스트를 넣어, 스퀴지(Squeegee)라 불리는 주걱으로 스크린 내면을 가압하면서 움직이면 페이스트는 판막이 없는 부분의 망사를 통과하여 판 밑에 놓여 있는 피인쇄체에 프린팅되는 기법일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포획용 여과막의 세공크기는 100 nm - 10 μm인 것을 특징으로 한다.
미생물과 결합하지 않은 항체가 고정된 나노입자는 포획용 여과막을 통과하고, 항체가 고정된 나노입자와 결합하지 않은 미생물은 포획용 여과막에 걸리더라도 신호를 보이지 않게 된다. 따라서, 항체가 고정된 나노입자와 결합한 미생물만이 포획용 여과막에 항체가 고정된 나노입자가 가진 고유의 색깔, 형광 등을 보이게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 세공크기가 1.2 μm인 포획용 여과막을 사용하였으나 이에 한정되지 않음은 당업자에게 자명한 사항이며, 바람직하게는 항체가 고정된 나노입자와 반응한 미생물이 포획되는 100 nm 내지 10 μm사이의 세공크기에서 선택되는 포획용 여과막을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포획용 여과막은 니트로셀룰로스, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리에스터, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리술폰 및 폴리에탄술폰로 구성된 군에서 선택되는 포획용 여과막을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 선택적으로 분리하는 단계는, 진공, 원심분리 또는 흡수법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
다시 말해, 응집용 필름을 거쳐 포획용 여과막으로 나노입자-항체-미생물 복합체가 걸러질때, 진공을 걸어주거나, 원심분리를 하거나, 또는 여과막에 흡수되는 원리를 이용하여 선택적으로 분리할 수 있다. 하기 실시예에서는, 진공을 걸어주어 나노입자-항체-미생물 복합체가 여과막에 잘 흡착되도록 하였으나, 이 외에도 여러 가지 종래 알려진 흡착 방법이 이용될 수 있다. 경우에 따라서는, 자기 나노입자의 경우, 자석을 이용하여 상기 복합체를 선택적으로 끌어당김으로써 분석대상이 아닌 미생물을 배제하여 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 측정은, CCD 카메라 또는 흡광도를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 한다.
하기 실시예에서는 CCD 카메라를 통해서 나노입자-항체-미생물 복합체 spot을 확인하였으나, 이 외에도, 금, 은과 같은 나노입자는 표면 플라즈몬 현상에 의하여 빛의 파장 중 UV- Vis 영역에서 고유의 흡광도를 나타내게 된다. 따라서 본 발명에 따른 나노입자는 특정 파장에서 빛을 흡수하는 나노입자로서, 나노입자의 특성에 따른 파장에서 흡광도를 측정하여 흡광도의 정도에 따라 미생물의 농도를 측정할 수 있다.
본 발명은, 다른 관점에서, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 포함하는 시료반응부; 상기 시료반응부로부터 반응액을 수용하여 검출 대상 미생물들을 응집하는 미생물 응집용 필름; 상기 미생물 응집용 필름을 통과하여 응집된 미생물들을 포획하여 선택적으로 분리하는 미생물 포획용 여과막; 및 상기 미생물의 유무 또는 농도를 확인하기 위한 검출부를 포함하는 미생물 검출 장치에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 시료 반응부는 검출 대상 미생물이 포함된 시료와 반응하는, 상기 검출대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 포함하는 부분을 의미한다. 상기 시료반응부는 상기 두 물질을 혼합할 수 있는 장치이면 어떠한 것이든 가능하며, 예컨대, 실험용 튜브 등이 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출부는 상기 나노입자-항체-미생물의 유무 또는 농도를 측정할 수 있는 장치라면 어떠한 것이든 가능하나, CCD 이미지 측정, CMOS 이미지 측정, CCD 형광 측정, PMT 형광측정 등이 바람직하다. 예컨대, CCD 카메라 또는 흡광도를 측정하는 장치일 수 있다. 본 발명에 있어서, 나노입자, 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 대한 특징은 상기 기재된 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 대상 미생물은 식중독균, 바이러스, 감염균 등일 수 있으며, 예컨대, 대장균, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monobytogenes), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurim), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 노로바이러스 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물 검출 장치는 시료반응부, 응집용 필름, 포획용 여과막, 검출부가 분리되어 구성되어 있거나, 일체형으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 은 페이스트 또는 탄소 페이스트와 같은 스크린 프린팅용 페이스트를 상기 포획용 여과막에 일정한 크기의 구멍을 가진 모양으로 스크린 프린팅 기법으로 도포하여 제조한 필름일 수 있다. 이로써, 응집용 필름과 포획용 여과막을 일체형으로 구성할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
미생물 응집용
PDMS
(
polydimethylsiloxane
) 필름 제작
미생물 응집용 필름을 아래와 같은 방법으로 제조하였다.
PDMS 용액(Sylgard 184A, Dow Corning, USA)과 경화제(Sylgard 184B, Dow Corning, USA)를 10:1의 비율로 혼합하여 지름 150 ㎜의 평평한 패트리 접시에 붓는다. 그리고 진공 펌프를 이용하여, 혼합액 내의 기포를 제거하고, 60 ℃에서 24시간 경화시킨다. 이후 경화된 PDMS 필름을 상온에서 식힌 후, 지름 1.5 ㎜의 천공기를 이용하여 7개의 구멍을 뚫었다.
그 결과, 구멍을 가진 PDMS 필름을 제조하였음을 확인하였다.
미생물 배양
Listeria monocytogenes와 Salmonella typhimurium 균은 stock을 받아 BHI (brain heart infusion) broth에 균을 접종하여 37 °C, shaking incubator에서 18~24시간 동안 배양하였다. Escherichia coli는 LB (Luria Bertani) broth에, Staphylococcus aureus는 NB (nutrient broth)에 접종하여 상기와 같은 조건으로 배양하였다. 배양한 균들의 cfu(colony forming unit) 측정을 위해서 각각의 고체 평판배지에 105~109 단계로 희석하여 배양액 100 μL씩 접종하여 도말한 후, 37 ℃에서 16~24시간 배양하여, 형성되는 콜로니를 계수한 후 희석배수 곱하여 생균수를 측정하였다. 또한, 배양중인 균의 액체 배지에서 적당량을 흡광 광도계로 600 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
금 나노입자(이하,
AuNP
)-항체 접합체를 이용한 미생물의 고속 검출
3-1:
AuNP
-항체 접합체 제조
20 ㎚ AuNP 용액(BB International) 1 mL에 borate 완충용액(0.1 M, pH 8.5) 0.1 mL과 Staphylococcus aureus에 선택성을 가지는 항체(Abcam, ab20002) 10 μg을 첨가하였다. 30분 후, 1% BSA(bovine serum albumin)용액(pH 8.5, 10 mM carbonate 완충용액에 녹인 것) 0.1 mL을 첨가하여 30분 동안 정치시켰다. 상기 용액을 4 °C에서 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 0.1% BSA (pH 8.5, 10 mM carbonate 완충용액에 녹인 것)용액 1 mL을 첨가하여 혼합 후, 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상기 과정을 한 번 더 반복 후 최종적으로 0.1% BSA (PBS 완충용액으로 녹인 것)용액을 0.5 mL 첨가하여 혼합 후 냉장고에 보관하였다.
그 결과, AuNP-접합체 용액을 성공적으로 제조하였다. 이와 같은 AuNP-항체 접합체와 미생물의 선택적인 결합에 의해 미생물의 농도를 측정할 수 있는 개념도를 도 1에 도시하였다. AuNP-항체 접합체와 시료를 혼합하여 반응하면 A와 같은 형태를 형성하게 되며, 상기 혼합액을 B의 도구에 주입하면 미생물이 걸러지게 되며, 반응하지 않은 AuNP-항체 접합체는 통과하고, A에서와 같이 선택적인 결합이 이루어진 미생물만이 AuNP 색깔을 확인할 수 있다.
1: AuNP-항체 접합체
11: 미생물
21: 응집용 필름
31: 미생물 포집용 여과막
41: 진공이나 흡착성 막을 이용한 수용액 흡수 흐름
3-2:
Staphylococcus
aureus
균의 고속 검출
실시예 2에 기재된 방법으로 배양된 Staphylococcus aureus 균을 PBS에 현탁시킨 용액 100 μL(0-105 cfu)와 실시예 3-1의 방법으로 제조된 AuNP-항체 접합체 용액 50 μL를 각각 혼합하여 30분 동안 약하게 흔들어 주었다.
포획용 여과막은 Pore 크기가 1.2 ㎛인 nitrocelluolose(NC) 막(Millipore)에 1% BSA 용액(증류수에 녹인 것)을 도포한 후, 건조시킨 것을 사용하였다. 가지가 있는 100 mL 삼각 플라스크에 장착한 필터 위에 상기 NC 막을 올려놓고, NC 막 위에 실시예 1에서 제작된 PDMS 필름을 덮었다. 플라스크의 가지를 통해 진공을 걸어주면서, PDMS 필름 구멍으로 상기 AuNP-항체 접합체와 Staphylococcus aureus의 혼합용액을 통과시켜 Staphylococcus aureus의 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, Staphylococcus aureus가 없는 경우 AuNP-항체 접합체가 여과용 멤브레인에 남아있지 않은 것을 확인하였고 Staphylococcus aureus의 농도가 증가할 수 록 여과용 멤브레인에 남아있는 AuNP의 양이 증가하는 것을 확인하였다 (A: 105 cfu, B: 104 cfu, C: 103 cfu, D: 102 cfu, E: 세포가 없는 경우). 이로써 미생물을 농도별로 측정할 수 있는 것을 확인하였으며 최소 102 cfu까지 측정이 가능함을 알 수 있다. 이는 기존의 면역여과법을 사용하여 측정할 수 있었던 최소 농도인 105 cfu보다 1000배나 높은 감도로써 기존 면역여과법보다 훨씬 뛰어난 감도를 가진 것을 확인할 수 있었다.
3-3: 다른 균과의 교차반응 확인
본 발명의 미생물 검출방법이 나노입자-항체 접합제 선택적으로 미생물을 검출 할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 AuNP-항체 접합체를 사용하여 상기 실험예 3-2와 동일한 절차에 따라 균의 종류만 변화시켜 실험을 진행하였다.
총 4종류의 균, Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes, Salmonella typimurium , Escherichia coli에 대해 AuNP-anti-Staphylococcus aureus 접합체와 반응시킨 후 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, Listeria monocytogenes, Salmonella typimurium, Escherichia coli 에서는 AuNP가 나타나지 않았고 Staphylococcus aureus에 대해 선택적으로 AuNP가 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (A: 106 cfu S.aureus cells, B: 106 cfu E. coli cells, C: 106 cfu Salmonella cells, D: 106 cfu Listeria monocytogenes cells, E: 세포가 없는 경우). 이로써, 본 발명에 따른 검출방법이 특정 균 특이적으로 사용할 수 있는 방법임을 검증하였다.
3-4:
Listeria
monocytogenes
균의 검출 및 다른 균과의 교차반응 확인
본 발명의 미생물 면역검출방법이 AuNP-항체 접합제가 선택적으로 미생물을 검출 할 수 있는지 확인하기 위하여, Listeria monocytogenes와 선택성을 가지는 항체(Abcam, ab30747)의 AuNP-항체 접합체를 사용하여 상기 실험예 3-2 및 3-3과 동일한 절차에 따라 균의 종류만 변화시켜 실험을 진행하였다.
Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes, Salmonella typimurium , Escherichia coli에 대해 AuNP-anti-Listeria monocytogenes 접합체와 반응시킨 후 검출을 분석하였다. 대조 실험을 위해 접합체 제조과정에서 AuNP-항체 접합체 대신 AuNP-BSA 접합체를 합성하여 반응시킨 후 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Listeria monocytogenes만 선택적으로 검출하는 것을 확인할 수 있었다 (A-C: AuNP-BSA 접합체와 반응한 경우, A:105 cfu Listeria monocytogenes cells, B: AuNP-anti-Listeria monocytogenes , C: 105 cfu Listeria monocytogenes cells, D-G: AuNP-항체 접합체와 반응한 경우 D: 105 cfu Salmonella typimurium cells, E: 105 cfu Escherichia coli cells, F: 105 cfu Staphylococcus cells, G: 105 cfu Listeria monocytogenes cells).
자기나노입자(이하,
MNP
)-항체 접합체를 이용한 미생물의 고속 검출
4-1: 자기나노입자(
MNP
)-항체 접합체 제조
100 nm MNP 용액(Chemicell) 100 μL에 최종 농도가 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 66.7 mg/mL와 항체 100 μg/mL이 되도록 첨가하였다. 2시간 후, 상기 용액을 상온에서 자석을 이용하여 자기나노입자를 2분 동안 분리한 후 상등액을 제거하였다. PBS 용액 200 μL를 첨가하여 혼합 후, 다시 자석을 이용하여 MNP를 2분 동안 분리한 후 상등액을 제거하였다. 상기 과정을 한 번 더 반복 후 최종적으로 0.1% BSA(PBS 완충용액으로 녹인 것)용액을 0.4 mL 첨가하여 혼합 후, 0.2 μm 주사기 필터로 거른 후에 냉장고에 보관하였다.
그 결과, MNP-접합체 용액을 성공적으로 제조하였다. 이와 같은 MNP-항체 접합체와 미생물의 선택적인 결합에 의해 미생물의 농도를 측정할 수 있는 개념도를 도 5에 도시하였다. MNP-항체 접합체와 시료를 혼합하여 반응하면 A와 같은 형태를 형성하게 되며, 상기 혼합액을 자석으로 모은 후, 다시 수용액으로 현탁시킨 용액을 B의 도구에 주입하면 미생물이 걸러지게 되며, 반응하지 않은 MNP-항체 접합체는 통과하고, A에서와 같이 선택적인 결합이 이루어진 미생물은 MNP 색깔을 확인할 수 있다.
51: MNP-항체 접합체
11: 미생물
21: 응집용 필름
31: 미생물 포집용 여과막
41: 진공이나 흡착성 막을 이용한 수용액 흡수 흐름
4-2:
Staphylococcus
aureus
균의 고속 검출
실시예 2에 기재된 방법으로 배양된 Staphylococcus aureus를 0.1% BSA (PBS-0.05% Tween 20 완충용액으로 녹인 것) 용액에 현탁시킨 용액 10 μL (0, 105, 106 cfu)와 실시예 4-1의 방법으로 제조된 MNP-anti-Staphylococcus aureus (Abcam) 접합체 용액 30 μL와 0.1% BSA (PBS-0.05% Tween 20 완충용액으로 녹인 것)용액 160ul을 각각 혼합하여 30분 동안 약하게 흔들어 주었다. 30분 후, 상기 용액을 상온에서 자석을 이용하여 Staphylococcus aureus 와 반응한 자기나노입자 복합체를 5분 동안 자석으로 분리한 후 상등액을 제거하였다. 0.1% BSA (PBS-0.05% Tween 20 완충용액으로 녹인 것)용액 200 μL를 첨가하여 혼합하였다.
포획용 여과막은 Pore 크기가 1.2 ㎛인 nitrocelluolose(NC) 막(Millipore)에 1% BSA 용액(증류수에 녹인 것)을 도포한 후, 건조시킨 것을 사용하였다. 가지가 있는 100 mL 삼각 플라스크에 장착한 필터 위에 상기 NC 막을 올려놓고, NC 막 위에 실시예 1에서 제작된 PDMS 필름을 덮었다. 플라스크의 가지를 통해 진공을 걸어주면서, PDMS 필름 구멍으로 상기 MNP-항체 접합체와 Staphylococcus aureus의 혼합용액을 통과시켜 Staphylococcus aureus의 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, Staphylococcus aureus의 농도가 증가할수록 여과용 멤브레인에 남아있는 MNP의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 이로써 미생물을 농도별로 측정할 수 있는 것을 확인하였으며 이는 자기력을 이용하여 여러 가지 불순물들이 섞여 있는 현탁 용액으로부터 목적물을 얻어낼 수 있는 분리기술의 장점을 확인할 수 있었다 (A: 균이 없는 경우, B: 105 cfu, C: 106 cfu).
스크린
프린팅용
페이스트를 이용한 미생물 응집용 필름의 제조
다양한 크기(0.15, 0.3, 0.5, 0.75 mm)의 3개 구멍을 가진 필름이 제조되도록 메쉬를 제작한 후, 폴리술폰 멤브레인(Pall life sciences, 0.45 μm pore)의 공극이 작은 면에, 실버 페이스트를 스크린 프린팅 하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 필름과 여과막이 일체형으로 구성된 일체형 응집용 필름-포획용 여과막을 얻었다. 또한, 본 기술을 이용할 경우 약 0.1 mm 크기의 작은 구멍을 가진 응집용 필름을 얻을 수 있었다.
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 나노입자를 이용한 미생물 고속검출방법 및 장치는 검출대상 미생물의 경제적이고 간단한 검출에 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (15)
- 다음의 단계를 포함하는, 금속 나노입자, 양자점 (quantum dot) 나노입자 및 자기 나노입자로 구성된 군에서 선택되는 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법:
(a) 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 나노입자-항체 접합체 및 검출 대상 미생물이 함유된 시료를 혼합하여 반응시키는 단계;
(b) 상기 반응에 의해 수득되는 반응액을 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜, 미생물과 반응하지 않은 나노입자-항체 접합체를 투과시키고, 나노입자-항체-미생물 복합체를 선택적으로 분리시키는 단계; 및
(c) 상기 포획용 여과막에 포획된 나노입자-항체-미생물 복합체의 유무 또는 농도를 측정하는 단계.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 금속은 금, 은 및 구리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 자기 나노입자이며, 상기 (a) 단계는 시료를 혼합하여 반응시키는 단계 이후에, 상기 반응에 의해 수득되는 반응액 중 자기나노입자-항체-미생물 복합체를 자석으로 분리한 다음, 분리된 복합체를 완충용액에 재현탁시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 양자점 나노입자이며,
2종 이상의 미생물을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 0.1 내지 5 ㎜의 직경을 가지는 다수의 구멍을 가지는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 PDMS (polydimethylsiloxane), 접착성이 있는 고분자 및 알루미늄, 고무 및 라텍스, 및 스크린 프린팅용 페이스트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 상기 포획용 여과막에 스크린 프린팅용 페이스트를 스크린 프린팅 기법으로 도포하여 제조한 필름인 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포획용 여과막의 세공크기가 100 nm 내지 10 μm인 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포획용 여과막은 니트로셀룰로스, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리에스터, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리술폰 및 폴리에탄술폰으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 선택적으로 분리하는 단계는, 진공, 원심분리 또는 흡수법을 이용하는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 측정은, CCD 카메라 또는 흡광도를 이용하는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
- 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 금속 나노입자, 양자점 (quantum dot) 나노입자 및 자기 나노입자로 구성된 군에서 선택되는 나노입자를 포함하는 시료반응부;
상기 시료반응부로부터 반응액을 수용하여 검출 대상 미생물을 응집하는 미생물 응집용 필름;
상기 미생물 응집용 필름을 통과하여 응집된 미생물들을 포획하여 선택적으로 분리하는 미생물 포획용 여과막; 및
상기 미생물의 유무 또는 농도를 확인하기 위한 검출부
를 포함하는 미생물의 검출장치.
- 삭제
- 제13항에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 상기 포획용 여과막에 스크린 프린팅용 페이스트를 스크린 프린팅 기법으로 도포하여 제조한 필름인 것을 특징으로 하는 미생물의 검출장치.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20090114138 | 2009-11-24 | ||
| KR1020090114138 | 2009-11-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110058711A KR20110058711A (ko) | 2011-06-01 |
| KR101256628B1 true KR101256628B1 (ko) | 2013-04-19 |
Family
ID=44067098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020100117479A KR101256628B1 (ko) | 2009-11-24 | 2010-11-24 | 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8597897B2 (ko) |
| KR (1) | KR101256628B1 (ko) |
| WO (1) | WO2011065747A2 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150041988A (ko) | 2013-10-10 | 2015-04-20 | 한양대학교 산학협력단 | 금속나노입자를 이용한 미생물 검출방법 및 미생물 검출키트 |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101444424B1 (ko) * | 2011-10-14 | 2014-09-29 | 한국생명공학연구원 | 두 종 입자를 이용한 다기능 생체물질 접합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 다기능 생체물질 접합체 |
| DK3489685T3 (da) | 2011-11-21 | 2023-12-04 | Zoetis Services Llc | Signalforstærkning i sidestrømning og tilsvarende immunoassays |
| WO2014005299A1 (en) * | 2012-07-04 | 2014-01-09 | Empire Technology Development Llc | Quantum dot-protein complexes, films, and methods of use |
| CN103091465B (zh) * | 2013-01-29 | 2015-04-15 | 南昌大学 | 一种基于Fe3O4@Au纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法 |
| CN104634975A (zh) * | 2013-11-08 | 2015-05-20 | 北京易斯威特生物医学科技有限公司 | 诺如病毒检测试剂盒及检测方法 |
| TWI691716B (zh) | 2014-08-13 | 2020-04-21 | 美商艾巴希斯公司 | 電漿特異性結合搭配物檢定中之信號放大 |
| CN104975065B (zh) * | 2015-06-11 | 2018-02-06 | 唐锋 | 一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法 |
| DK3331818T3 (da) | 2015-08-04 | 2024-08-12 | Zoetis Services Llc | Signalforstærkning i opløsningsbaserede plasmoniske assays med specifkke bindingspartnere |
| CN105424930A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-03-23 | 天津科技大学 | 一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法 |
| WO2017132319A2 (en) * | 2016-01-27 | 2017-08-03 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods of attaching probes to microorganisms and methods of use thereof |
| KR20180073353A (ko) * | 2016-12-22 | 2018-07-02 | 서울대학교산학협력단 | 나노 필터를 이용한 핵산 추출 장치 및 방법 |
| JP7308148B2 (ja) | 2017-01-30 | 2023-07-13 | ゾエティス サービシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー | 溶液ベースのプラズモン特異的結合パートナーアッセイおよび金属ナノ構造体 |
| KR102041611B1 (ko) * | 2018-01-03 | 2019-11-06 | 한국과학기술원 | 복합 나노구조체를 이용하여 유해바이오 물질을 포집 및 진단하기 위한 시스템 및 방법 |
| KR102271188B1 (ko) * | 2019-12-13 | 2021-06-30 | 성균관대학교산학협력단 | 형광 이미징 기반 미생물 검출 장치 및 이의 제조방법 |
| CN112067799B (zh) * | 2020-09-03 | 2022-06-14 | 南昌大学 | 基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法 |
| KR102433429B1 (ko) * | 2020-09-08 | 2022-08-16 | 한국화학연구원 | 카르복실화 산화철 나노입자로 표지된 나노자성 항체와 이의 제조 방법 |
| KR102537287B1 (ko) * | 2021-04-23 | 2023-05-26 | 재단법인대구경북과학기술원 | 미생물 능동 채취 마이크로 구조체 및 이를 이용한 미생물 능동 채취 방법 |
| CN113367734B (zh) * | 2021-06-09 | 2022-11-15 | 江南大学 | 一种肠道微生物原位检测机器人及方法 |
| CN117554606A (zh) * | 2023-10-13 | 2024-02-13 | 北京大学 | 多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020091628A (ko) * | 2001-05-31 | 2002-12-06 | 국방과학연구소 | 다중필터를 이용한 경쟁여과면역분석법 및 이에 이용되는면역분석용 키트 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080032420A1 (en) | 2004-03-30 | 2008-02-07 | Lambert James L | Surface Enhanced Raman Scattering and Multiplexed Diagnostic Assays |
| US7699979B2 (en) | 2005-01-07 | 2010-04-20 | Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Separation system and efficient capture of contaminants using magnetic nanoparticles |
-
2010
- 2010-11-24 KR KR1020100117479A patent/KR101256628B1/ko active IP Right Grant
- 2010-11-24 WO PCT/KR2010/008356 patent/WO2011065747A2/ko active Application Filing
- 2010-11-24 US US13/511,574 patent/US8597897B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020091628A (ko) * | 2001-05-31 | 2002-12-06 | 국방과학연구소 | 다중필터를 이용한 경쟁여과면역분석법 및 이에 이용되는면역분석용 키트 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Vol. 12, No. 3, Pages 418-425(2003.03.). * |
| Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Vol. 12, No. 3, Pages 418-425(2003.03.).* |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150041988A (ko) | 2013-10-10 | 2015-04-20 | 한양대학교 산학협력단 | 금속나노입자를 이용한 미생물 검출방법 및 미생물 검출키트 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8597897B2 (en) | 2013-12-03 |
| WO2011065747A2 (ko) | 2011-06-03 |
| US20130065220A1 (en) | 2013-03-14 |
| KR20110058711A (ko) | 2011-06-01 |
| WO2011065747A3 (ko) | 2011-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101256628B1 (ko) | 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법 | |
| Jia et al. | Molecular imprinting technology for microorganism analysis | |
| Fu et al. | Application progress of microfluidics-integrated biosensing platforms in the detection of foodborne pathogens | |
| KR101444424B1 (ko) | 두 종 입자를 이용한 다기능 생체물질 접합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 다기능 생체물질 접합체 | |
| Jia et al. | An immunofiltration strip method based on the photothermal effect of gold nanoparticles for the detection of Escherichia coli O157: H7 | |
| CN102590506A (zh) | 一种快速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法 | |
| US20060129327A1 (en) | Ultrasensitive sensor and rapid detection of analytes | |
| Hartwell et al. | Flow based immuno/bioassay and trends in micro-immuno/biosensors | |
| CA2406133A1 (en) | Biosensor and related method | |
| CN101432739A (zh) | 超灵敏传感器和分析物的快速检测 | |
| KR102561659B1 (ko) | 미생물 항원의 회수법 | |
| CN102645536A (zh) | 一种检测金黄色葡萄球菌的方法 | |
| CN102565389A (zh) | 一种用于沙门菌快速检测的Nano/ALISA方法和试剂盒 | |
| US9404921B2 (en) | Process for detecting cells from a sample | |
| Dey et al. | Recent progress of functionalized nanomaterials-based biosensing for monitoring of food-and water-borne pathogens | |
| Yi et al. | A portable toolbox based on time-resolved fluoroimmunoassay and immunomagnetic separation for Cronobacter sakazakii on-site detection in dairy | |
| KR101573896B1 (ko) | 자성 나노입자와 고점성(高粘性) 용액을 이용한 피펫 기반 병원성 단백질 및 미생물 검출방법 | |
| KR101523822B1 (ko) | 자성 나노입자와 고점성(高粘性) 용액을 이용한 식중독균 검출방법 | |
| Sharma et al. | Identification of analyte of interest through lateral flow assay | |
| KR20200065502A (ko) | 삼상 계면 유동을 이용하여 병원성 미생물의 검출 방법 | |
| JP2002181823A (ja) | 微生物の検出方法 | |
| CN118362729A (zh) | 一种基于一维纳米光子结构的细菌可视化检测方法 | |
| JP4189950B2 (ja) | 有毒物質の迅速的検出法 | |
| Simalai | EVALUATION OF IMMOBILIZATION PROTOCOLS OF A FLUORESCENCE-BASED IMMUNOSENSOR USED TO DETECT INFECTIOUS DISEASES | |
| Pan | Development and Applications of Foam-Based ELISA: An Innovation in Biosensing Platform |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160406 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170328 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190311 Year of fee payment: 7 |