KR20200065502A - 삼상 계면 유동을 이용하여 병원성 미생물의 검출 방법 - Google Patents

삼상 계면 유동을 이용하여 병원성 미생물의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 병원성 미생물을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다공성 멤브레인 패드 및 상기 다공성 멤브레인 패드에 연접하는 흡수패드를 포함하는 멤브레인 스트립을 제공하는 단계; 병원성 미생물을 포함하는 액체 시료 및 병원성 미생물과 결합 가능한 입자를 혼합하여 병원성 미생물-입자 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 멤브레인 스트립의 다공성 멤브레인 패드를 병원성 미생물-입자 복합체가 포함된 액체 시료에 담그는 단계를 포함하며, 상기 멤브레인 스트립의 폭은 1 내지 4mm인 병원성 미생물의 검출 방법을 제공한다.

Description

삼상 계면 유동을 이용하여 병원성 미생물의 검출 방법 {Detection method of pathogenic microorganism using three-phase interfacial flow}
본 발명은 다공성 멤브레인의 삼상 계면 유동을 이용하여 병원성 미생물을 간편하게 농축하는 기술을 토대로 사용자 친화적으로 병원성 미생물을 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게, 본 발명은 병원성 미생물이 들어있는 용액의 메니스커스와 다공성 멤브레인의 경계에서 발생하는 모세관력을 이용하여 미생물을 농축하고, 이를 통해 광학 신호를 형성하는 병원성 미생물 검출 방법에 관한 것이다.
병원균 감염에 의해 발생하는 패혈증, 식중독 등의 다양한 질병으로 인한 피해가 전 세계적으로 꾸준하게 발생하고 있다. 이러한 감염병을 조기에 진단하여 치료효율 증대와 비용절감을 가능케 하는 편리하면서도 신속하고 민감한 검출 방법에 대한 요구가 늘어나고 있다.
종래에는 공개특허 제2016-0047725호와 같이 항체가 고정된 나노입자를 이용하여 병원균을 검출할 수 있는 방법을 사용하고 있으며, 특히 자성을 가지는 나노입자를 사용할 경우 자기장을 이용하여 병원균과 결합한 입자를 분리할 수 있어, 혈액이나 식품 등의 복합시료 검사에 적용될 수 있다.
또한, 식중독 균을 검출하고자 하는 경우 자성나노입자를 이용하여 대용량의 식품시료로부터 균을 포집, 정제 및 농축시킬 수 있으며, 이후 추가적으로 검출 신호를 형성하는 물질을 균과 결합시켜 균의 농도를 측정할 수 있다.
그러나 추가 물질을 결합시키는 복합적인 과정은 기술의 재현성과 편이성 및 신속성을 떨어뜨리는 원인이 되며, 추가 물질에 항체 고정을 필요로 하여 비용을 증가시키고 보관시간을 단축시키는 단점이 있다.
본 발명은 용액의 메니스커스와 다공성 멤브레인의 경계에서 발생하는 모세관력을 이용하여 용액에 분산되어 있는 병원성 미생물을 멤브레인 표면에 농축하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 본 발명은 다공성 멤브레인 패드 및 상기 다공성 멤브레인 패드에 연접하는 흡수패드를 포함하는 멤브레인 스트립을 제공하는 단계; 병원성 미생물을 포함하는 액체 시료 및 병원성 미생물과 결합 가능한 입자를 혼합하여 병원성 미생물-입자 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 멤브레인 스트립의 다공성 멤브레인 패드를 병원성 미생물-입자 복합체가 포함된 액체 시료에 담그는 단계를 포함하며, 상기 멤브레인 스트립의 폭은 1 내지 4mm인 병원성 미생물의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면 용액의 메니스커스와 다공성 멤브레인의 삼상 계면에서 집중적으로 발생하는 유동을 이용하여 다공성 멤브레인 위에 병원성 미생물을 선형으로 농축하여, 간편하게 병원성 미생물을 검출할 수 있다.
즉, 본 발명은 복잡한 처리 과정이나 고가의 거대한 분석 장비 없이도 간단한 다공성 멤브레인 스트립 및 자성나노입자를 이용하여 신속하고 민감하게 병원성 미생물을 농축 및 검출할 수 있는 사용자 친화적인 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 제조예2에 따른 멤브레인 스트립의 구조를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예1에 따라, 멤브레인 스트립 및 용액의 메니스커스의 경계에서 형성되는 삼상 계면의 유동방향을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예1에 따라, 멤브레인 스트립의 테스트 라인에서 대장균-금/자성나노입자 복합체가 농축되는 형태를 개략적으로 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예1에 따라, 대장균의 농도 별 멤브레인 스트립의 테스트 라인 색상의 변화를 나타낸다.
도 5는 도4의 각 농도 별 대장균에 대해 시험한 멤브레인 스트립의 테스트 라인 진하기를 그레이 값으로 변환한 그래프를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예1에 따라, 멤브레인 스트립 폭에 따른 멤브레인 스트립의 테스트 라인 색상의 변화를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "병원성 미생물-입자 복합체"는 병원성 미생물과 입자가 결합된 형태를 의미하며, 예를 들어 "대장균-금/자성나노입자 클러스터 복합체"는 대장균과 금/자성나노입자 클러스터가 결합하여 복합체를 형성한 것을 의미한다.
본 발명은 다공성 멤브레인의 작은 기공이 병원성 미생물-입자 복합체의 흐름을 막아 발생하는 복합체의 축적에 의한 색 변화를 통해 병원성 미생물을 검출하는 방법을 제공한다.
보다 상세하게 본 발명은 다공성 멤브레인 패드 및 상기 다공성 멤브레인 패드에 연접하는 흡수패드를 포함하는 멤브레인 스트립을 제공하는 단계; 병원성 미생물을 포함하는 액체 시료에 병원성 미생물과 결합 가능한 입자를 혼합하여 병원성 미생물-입자 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 멤브레인 스트립의 다공성 멤브레인 패드를 병원성 미생물-입자 복합체가 형성된 시료에 담그는 단계를 포함하며, 상기 멤브레인 스트립의 폭은 1 내지 4mm인 병원성 미생물의 검출 방법을 제공한다.
상기 다공성 멤브레인 패드는 병원성 미생물-입자 복합체가 통과되지 못하는 스트립 형태의 다공성 박막으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 나이트로셀룰로오스 멤브레인으로 이루어진 패드일 수 있다. 나아가 상기 흡수패드는 지속적으로 액체의 유동을 유도하는 패드라면 제한되지 않으며, 예를 들어 셀룰로오스 멤브레인을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 액체 시료는 물, 우유 또는 이들의 혼합을사용할 수 있으며, 예를 들어 증류수 및 탈이온수로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 우유가 포함된 액체 시료를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 병원성 미생물이란 식중독 균을 포함할 수 있다. 상기 병원성 미생물은 식품 등에 포함되어 식중독을 일으킬 수 있는 식중독 균일 수 있으며, 예를 들어, 살모넬라균, 황색포도상구균, 장염비브리오, 리스테리아균, 병원대장균, 장관출혈성 대장균 O157:H7, 캠필로벡터균, 바실러스세레우스균, 웰슈군, 보틀루리스균 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 병원성 미생물과 결합 가능한 입자는 금속 나노입자 및 이의 표면에 배치된 항체, 앱타머 또는 분자각인고분자를 포함할 수 있으며, 상기 항체, 앱타머 또는 분자각인고분자는 병원성 미생물과 결합할 수 있는 것이다. 예를 들어, 싸이올기를 가지는 항체를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금속 나노입자는 자성 나노입자, 자성 나노입자와 비자성 나노입자의 복합체, 자성 나노입자와 비자성 나노입자의 클러스터 또는 코팅된 자성 나노입자일 수 있으며, 예를 들어, 상기 자성 나노입자는 사산화삼철(Fe3O4)와 같이 자력에 반응하여 자성을 띠는 미세입자일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비자성 나노입자는 금 나노입자일 수 있으며, 상기 코팅된 자성 나노입자는 금으로 코팅된 철 나노입자일 수 있다. 산화철 나노입자 표면에 금 나노입자를 코팅할 경우 가시성이 높아지며, 금은 항체 등의 표면에 있는 싸이올기와 반응성이 높아 항체와 화학적으로 결합하기 유용하기 때문이다.
본 발명에 있어서, 상기 멤브레인 스트립은 병원성 미생물을 포함하는 액체 시료의 메니스커스와 맞닿은 테스트 영역(다공성 멤브레인 패드의 일부)과, 측방 유동을 지속적으로 유도하는 흡수패드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 테스트 영역은 액체 시료의 메니스커스와 다공성 멤브레인 패드가 만나 선형의 삼상 계면을 이루는 부분으로, 테스트 영역 위로는 기공 구조에 의한 모세관 압력이, 테스트 영역 아래로는 기공 구조에 의한 점성 스트레스가 작용하여 삼상 계면 부근에서만 시료 용액이 위쪽 방향으로 빠르게 흡수되는 현상이 일어날 수 있다.
이 때, 상기 다공성 멤브레인의 기공 크기는 병원성 미생물-입자 복합체 입경 크기의 15 내지 100% 크기일 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 80%일 수 있다. 상기 다공성 멤브레인의 기공 크기가 병원성 미생물-입자 복합체 입경 크기의 15% 미만인 경우 병원성 미생물과 결합되지 않은 입자까지 상기 테스트 영역에 농축되어 병원성 미생물이 검출되었는지 확인하기 어려운 문제가 있으며, 100%를 초과하는 경우 병원성 미생물-입자 복합체가 상기 테스트 영역에 농축되지 않는 문제가 있다.
나아가, 상기 다공성 멤브레인은 0.2 내지 10㎛의 기공을 가질 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 5㎛의 기공을 갖는다. 상기 기공이 0.2㎛ 미만이면 병원성 미생물과 결합하지 않은 입자들이 기공을 통과하지 못하고 상기 테스트 영역에 농축되는 문제가 생길 수 있으며, 10㎛를 초과하는 경우에는 병원성 미생물-입자 복합체가 농축되지 않고 기공을 통과하는 문제가 생길 수 있다.
나아가, 상기 멤브레인 스트립의 폭은 1 내지 4mm이며, 바람직하게는 2 내지 4mm이다. 상기 폭이 1mm 미만인 경우 멤브레인 스트립이 너무 얇아 다루기 어렵고 병원성 미생물-입자의 복합체가 농축된 테스트 라인을 육안으로 확인하기 힘든 문제가 있으며, 4mm를 초과하는 경우 액체 시료의 메니스커스와 다공성 멤브레인 패드가 만나 이루는 삼상 계면이 불분명해지며, 나아가 모세관 현상이 잘 일어나지 않아 상기 테스트 라인에 병원성 미생물-입자의 복합체가 농축되기 어려운 문제가 있어 병원성 미생물의 검출이 어려운 문제가 있다.
따라서, 본 발명의 병원성 미생물 검출 방법은 용액의 메니스커스와 모세관 현상을 이용하여 병원성 미생물을 용이하게 검출할 수 있으며, 이를 위해서는 멤브레인 스트립의 폭을 상기와 같은 범위로 조절해야 하는 것이다.
한편, 병원성 미생물-입자 복합체를 형성하는 단계에 후속적으로 상기 병원성 미생물-입자 복합체를 농축하는 단계 및 농축된 병원성 미생물-입자 복합체를 정제하는 단계를 수행할 수 있다. 예를 들어, 대장균-금/자성나노입자 클러스터로 형성된 복합체를 형성하는 경우, 자석을 이용하여 상기 대장균-금/자성나노입자 클러스터 복합체를 포집하여 농축한 다음, 정제수를 이용하여 세척하는 과정에 의해 불순물을 제거하여 정제할 수 있다.
상기와 같이 병원성 미생물-입자 복합체를 형성한 다음 상기 병원성 미생물-입자 복합체를 농축 및 정제하는 단계를 포함하는 경우, 다공성 멤브레인에서 병원성 미생물이 더욱 뚜렷하게 검출될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
제조예1: 병원성 미생물-입자 복합체 제조
<자성나노입자의 제조>
Fe3O4 자성나노입자는 수열 합성법(Hydrothermal method)을 이용하여 합성된다. 먼저 먼저 1.08g의 FeCl3·6H2O, 2.35g의 구연산 나트륨(sodium citrate), 0.72g의 요소(urea), 0.65g의 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)를 40mL의 증류수에 녹인 다음 오토클레이브 용기에 옮겨 200℃ 온도에서 3시간 30분 동안 유지시킴으로써 합성 반응을 일으킨다.
최종적으로 Fe3O4 자성나노입자를 얻으며 나노입자의 크기는 약 165nm이다. 상기 자성나노입자의 가시성을 향상시키기 위하여 상기 자성나노입자에 금나노입자를 결합시킨다.
<금나노입자의 제조>
금나노입자는 80mL의 증류수에 소디움 시트레이트 트리베이직 디하이드레이트(Sodium citrate tribasic dehydrate) 0.02g, 염화금(III) 0.01g, 소디움 보로하이드라이드(Sodium borohydride, NaBH4) 0.75mg을 녹인 뒤 5 분 동안 섞어주어 합성한다.
<금/자성나노입자 클러스터 제조>
상기 금/자성나노입자 클러스터를 제조하기 위하여, 상기 자성나노입자 8mg과 (3-aminopropyl)triethoxysilane 400μL를 40mL 에탄올에 넣어 1 시간 반응시킨다. 상기와 같은 반응을 통해 자성나노입자의 표면에 아민기가 형성된다.
따라서, 상기 금 나노입자 제조 시 금 나노입자에 생성된 카복실기와 상기 자성나노입자 표면에 형성된 아민기가 반응하여 금/자성나노입자 클러스터를 형성할 수 있다.
이 때, 상기와 같은 클러스터를 제조하기 위해 상기 아민기를 가지는 자성 나노입자 8 mg과 금 나노입자 용액 80 mL를 25℃ 온도에서 3 시간 이상 섞어주어 약 180nm 크기의 금/자성나노입자를 얻는다. 상기 반응에 의해 자성나노입자의 표면을 금 나노입자 수 백개가 덮고 있는 형태의 금/자성나노입자 클러스터가 생성된다.
<병원성 미생물-입자 복합체 제조>
증류수를 이용하여 상기 금/자성나노입자 클러스터를 세 번 씻어낸 뒤 싸이올 기를 가지는 항-대장균 항체 40μg을 넣어 금 나노입자의 표면에 항체를 고정시킨다. 금/자성나노입자 클러스터의 비특이적 결합을 막기 위하여 소혈청알부민 10μg을 넣어준 뒤 추후 실험 전까지 냉장보관 한다.
제조예2: 멤브레인 스트립의 제작
접착성을 가지는 받침 스트립 카드 위에 30 mm 길이의 나이트로셀룰로오스 멤브레인을 붙인 뒤, 25 mm 길이의 흡수 패드를 앞의 나이트로셀룰로오스 멤브레인과 5 mm 겹치도록 붙인다. 이후 3 mm의 폭으로 절단하여 측방 유동을 위한 멤브레인 스트립을 준비한다. 상기와 같은 방법에 의해 제조된 멤브레인 스트립을 도 1에 나타내었다.
실시예1: 멤브레인 스트립을 이용한 병원성 대장균 검출
본 실험은 식중독을 일으키는 병원성 대장균 [Escherichia coli O157:H7]을 대상으로 진행되었다. 제조예1에서 합성된 항체가 고정된 금/자성나노입자 클러스터를 포함하는 용액을 대장균을 포함하는 우유 시료에 투입하여 대장균-금/자성나노입자 복합체를 형성시켰다.
상기 액체 시료에서 자석을 이용하여 상기 복합체를 포집한 뒤 증류수로 정제한 후 0.5% 트윈 20(TWEEN® 20, Tween 20)이 들어있는 증류수 200μL로 농축하였다. 이 후 병원성 미생물 검출을 위하여 제조예2에서 제조된 멤브레인 스트립의 한 쪽 끝을 농축된 시료 용액에 담그고, 용액을 흡수시켰다. 이 때 멤브레인의 모세관력이 용액의 메니스커스 부근에서 멤브레인의 위쪽 방향으로 작용하여 용액과 용액 내의 입자들이 멤브레인과 용액의 메니스커스가 만나는 경계로 향하게 되었다. 이와 같은 현상을 개략적으로 도2에 나타내었다.
이 때 테스트 라인에서 발생하는 삼상 계면에서의 유동에 의해 대장균-금/자성나노입자 복합체의 농축 및 이에 따른 색 변화를 관찰하였다. 테스트 라인에서의 대장균-금/자성나노입자 복합체의 개략적인 유동을 도3에 나타내었다.
한편, 대장균과 결합하지 않은 금/자성나노입자는 멤브레인의 기공을 통과하여 테스트라인에 농축되지 않는 반면, 대장균-금/자성나노입자 복합체는 그 크기로 인해 멤브레인의 기공을 통과하지 못하여 테스트 라인에서 농축되면서 색의 띠었다.
따라서 상기와 같이 대장균의 농도에 따라 멤브레인 스트립의 테스트 라인에 대장균-금/자성나노입자 복합체가 농축되는 정도를 도 4에 나타내었다. 도 4에 보이는 바와 같이, 대장균의 농도가 증가할수록 상기 테스트 라인에 대장균-금/자성나노입자 복합체가 더 많이 축적되고, 테스트 라인에서의 색 변화가 증가함을 알 수 있었다.
도 5는 도 4의 각 농도 별 대장균에 대해 시험한 멤브레인 스트립의 테스트 라인 진하기를 그레이 값으로 변환한 그래프를 나타낸다.
비교예1
나이트로셀룰로오스 멤브레인 기공을 금/자성나노입자보다 작은 것으로 선택하고, 제조예2에서 폭을 6mm로 하여 제작한 멤브레인 스트립을 금/자성나노입자 클러스터가 포함된 용액에 담가 삼상계면에서 금/자성나노입자가 축적되어 생기는 테스트 라인의 형태를 관찰하였다.
그 결과 도 6에 보이는 바와 같이, 멤브레인 스트립의 폭이 넓을수록 테스트라인의 색 변화는 흐릿해져, 금/자성나노입자 클러스터가 농축되기 어려운 것을 알 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (9)

  1. 다공성 멤브레인 패드 및 상기 다공성 멤브레인 패드에 연접하는 흡수패드를 포함하는 멤브레인 스트립을 제공하는 단계;
    병원성 미생물을 포함하는 액체 시료 및 병원성 미생물과 결합 가능한 입자를 혼합하여 병원성 미생물-입자 복합체를 형성하는 단계; 및
    상기 멤브레인 스트립의 다공성 멤브레인 패드를 병원성 미생물-입자 복합체가 포함된 액체 시료에 담그는 단계를 포함하며,
    상기 멤브레인 스트립의 폭은 1 내지 4mm인, 병원성 미생물의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 액체 시료는 물, 우유 또는 이들의 혼합을 용매로 포함하는, 병원성 미생물의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 살모넬라균, 황색포도상구균, 장염비브리오, 리스테리아균, 병원대장균, 장관출혈성 대장균 O157, 캠필로벡터균, 바실러스세레우스균, 웰슈군, 보틀루리스균으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 병원성 미생물의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 병원성 미생물과 결합 가능한 입자는 금속 나노입자 및 이의 표면에 배치된 항체, 앱타머, 분자각인고분자 또는 이들의 조합을 포함하는, 병원성 미생물의 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 자성 나노입자, 자성 나노입자와 비자성 나노입자의 복합체, 자성 나노입자와 비자성 나노입자의 클러스터 또는 코팅된 자성 나노입자인, 병원성 미생물의 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 비자성 나노입자는 금 나노입자인, 병원성 미생물의 검출 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 코팅된 자성 나노입자는 금으로 코팅된 철 나노입자인, 병원성 미생물의 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다공성 멤브레인의 기공 직경은 병원성 미생물-입자 복합체 입경의 15 내지 100% 크기인, 병원성 미생물의 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 다공성 멤브레인은 직경이 0.2 내지 10㎛인 기공을 갖는, 병원성 미생물의 검출 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20220026428A (ko) * 2020-08-25 2022-03-04 한국과학기술연구원 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 특이적으로 결합하는 앱타머 및 이를 이용한 검출 방법

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