KR101573896B1 - 자성 나노입자와 고점성(高粘性) 용액을 이용한 피펫 기반 병원성 단백질 및 미생물 검출방법 - Google Patents
자성 나노입자와 고점성(高粘性) 용액을 이용한 피펫 기반 병원성 단백질 및 미생물 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 병원성 단백질 및 미생물의 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 피펫과고점성 용액 및 자성나노입자를 이용하여 음식물 등에 포함된 미생물이나 병원성 단백질을 신속하게 검출하고 정량화시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에 따른 방법은 병원성 물질을 포함하는 시료에 병원성 물질에 결합가능한 자성 나노입자를 투입하여 결합시키는 단계; 자성 나노입자를 분리하는 단계; 분리된 자성 나노입자를 자력을 이용하여 고점성 액체에 투과시켜 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 분리하는 단계; 및 분리된 병원성 물질이 결합된 자성 나노입자를 분석하는 단계를 포함하는 병원성 물질의 측정 방법을 제공한다.
본 발명에서는 고점성 유체에서 분리상으로 존재하는 자성나노입자가 결합된 병원성 물질을 피펫을 이용해서 선택적으로 분리할 수 있는 방법이 제시되었으며, 이로 인해 자성나노입자가 결합된 병원성 물질을 고점성 유체로부터 분리하는 과정에서 발생하는 오차를 줄일 수 있게 된다. 또한, 본 발명에서는 고점성 유체로부터 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 이용하여 신호증폭을 통해서 정량 분석의 정확도를 향상시킬 수 있는 방법이 제시되었다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에 따른 방법은 병원성 물질을 포함하는 시료에 병원성 물질에 결합가능한 자성 나노입자를 투입하여 결합시키는 단계; 자성 나노입자를 분리하는 단계; 분리된 자성 나노입자를 자력을 이용하여 고점성 액체에 투과시켜 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 분리하는 단계; 및 분리된 병원성 물질이 결합된 자성 나노입자를 분석하는 단계를 포함하는 병원성 물질의 측정 방법을 제공한다.
본 발명에서는 고점성 유체에서 분리상으로 존재하는 자성나노입자가 결합된 병원성 물질을 피펫을 이용해서 선택적으로 분리할 수 있는 방법이 제시되었으며, 이로 인해 자성나노입자가 결합된 병원성 물질을 고점성 유체로부터 분리하는 과정에서 발생하는 오차를 줄일 수 있게 된다. 또한, 본 발명에서는 고점성 유체로부터 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 이용하여 신호증폭을 통해서 정량 분석의 정확도를 향상시킬 수 있는 방법이 제시되었다.
Description
본 발명은 병원성 단백질 및 미생물의 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 피펫과고점성 용액 및 자성나노입자를 이용하여 음식물 등에 포함된 미생물이나 병원성 단백질을 신속하게 검출하고 정량화시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.
농식품 중 위해 물질 오염과 잦은 식중독 사고 발생으로 있으며, 최근 10여 년간 세계적으로 증가하고 있는 추세이다. 이에 따라 농식품의 유통전 가공/생산 공정에서 식중독균 오염을 조기에 신속하게 진단하여 식중독의 발생을 방지하고, 식중독 발생에 따른 사회적 비용을 저감시킬 수 있는 진단 방법에 대한 요구가 늘어나고 있다. 종래 배양 및 생화학적 검사를 통한 방식이 존재하지만, 3~5일 정도의 시간이 소요되는 방식으로서 사전에 유통 전 측정 및 진단에 의한 식중독 사고를 방지하기에 적합하지 않다는 문제가 있어 왔다.
이를 해결하기 위한 방안으로 대한민국에게 허여된 대한민국 특허 등록 제1149418호에서는 항체가 포함된 형광나노입자 결합물을 세균 집단에 투입시켜, 상기 형광나노입자 결합물과 부착시킨 다음, 특정세균과 미부착된 형광나노입자 결합물을 제거하고, 형광의 세기를 측정하여 특정세균의 양(量)을 정량화시키는 방법을 개시하고 있다. 이를 위해, 형광나노입자(QD)의 표면에 생체분자인 아비딘층을 형성시킨 후 상기 아비딘층에 바이오틴이 결합된 항체를 반응시켜 형성함으로서 상기 특정세균이 항체와 반응하여 결합하는 방식을 개시하고 있다.
또한, Jun ha 등은 Biomaterials 32 (2011) 1177~1184의 "A multicomponent recognition and separation system established via fluorescent, magnetic, dualencoded multifunctional bioprobes" 논문에서 3 마이크로미터 크기의 카르복실말단 자성 입자에 형광 입자 및 항체를 결합하여 특정 세균과 결합시킨 후, 자력을 이용하여 분리하는 방식을 개시하고 있다.
그러나, 이러한 방식은 항체에 세균이 결합된 입자와 세균이 결합되지 않은 입자를 효율적으로 분리하기가 어려울 뿐만 아니라, 정량을 위해서는 별도의 형광입자가 필요하다는 문제가 있었다. 이에 따라, 항체에 세균이 결합된 입자와 세균이 결합되지 않은 입자를 효과적으로 분리하여 간편하게 정량화할 수 있는 새로운 방법에 대한 요구가 계속되고 있었다.
이를 개선하기 위해서, 본 발명자들은 대한민국 특허출원 2012-0134544호에서 세균을 측정하는 시료에 세균에 결합가능한 자성 나노입자를 투입하여 결합시키는 단계; 자성 나노입자를 분리하는 단계; 자력을 이용하여 분리된 자성 나노입자를 고점성 액체에 투과시켜 세균이 결합된 자성 나노 입자와 세균이 결합되지 않는 자성 나노입자를 분리하는 단계; 및 세균이 결합된 자성 나노입자를 정량하는 단계로 이루어진 방법을 제안하였다.
이 방식은 세균이 결합되지 않은 자성 나노입자가 고점성 액체가 담겨진 마이크로튜브에서 띠 형태를 띠면서 세균이 결합되는 자성 나노 입자로부터 명확하게 분리된다는 장점이 있지만, 도 1에서와 같이 마이크로튜브 속에서 결합체를 분리하였기 때문에 결합체에 대한 정량적 측정을 위해 상부에 남아있는 미결합 자성 나노입자 제거 과정을 거쳐야 했으며 이로 인하여 식중독균 농도간 측정 오차가 큰 단점이 있었다. 또한, 분리되는 식중독균이 결합된 자성 나노입자 자체의 농도가 미량이어서, 흡광도 분석에의한 정량화가 쉽지 않다는 문제가 있었다. 한편, 식중독균이 아닌 다른 병원성 물질에 대한 분석 방법에 대한 요구도 계속되고 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 병원성 물질을 분리하여 정량화할 수 있는 새로운 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 고점성 액체의 하부에 분리된 병원성 물질이 결합된 자성나노입자들을 정확하고 용이하게 분리할 수 있는 새로운 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 과제는 병원성 물질이 결합된 자성나노입자들을 정확하게 정량화할 수 있는 새로운 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은
병원성 물질을 포함하는 시료에 병원성 물질에 결합가능한 자성 나노입자를 투입하여 결합시키는 단계;
자성 나노입자를 분리하는 단계;
분리된 자성 나노입자를 자력을 이용하여 고점성 액체에 투과시켜 분리하는 단계; 및
병원성 물질이 결합된 자성 나노입자를 정량화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 병원성 물질이란 식중독균을 포함하는 병원성 미생물 혹은 병원성 단백질 등을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 상기 병원성 물질이란 식중독균을 포함하는 병원성 미생물 혹은 병원성 단백질 등을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 상기 병원성 미생물은 식품 등에 포함되어 식중독을 일으킬 수 있는 식중독균일 수 있으며, 일예로 살모넬라균, 황색포도상구균, 장염비브리오, 리스테리아균, 병원대장균, 장관출혈성 대장균 O157, 캠필로벡터균, 바실러스세레우스균, 웰슈군, 보틀루리스균 등이다.
본 발명에 있어서, 상기 병원성 단백질은 인체에서 질병을 유발하거나 질병으로 인해 발생할 수 있는 단백질들로 이해되며, 일 예로 alpha-fetoprotein(AFP), prostate-specific antigen (PSA), Interleukin-5, Interleukin-6, carcinoembryonic antigen (CEA)이다.
본 발명에 있어서, 고점성 액체를 투과시켜 분리하는 단계는 피펫을 기반으로 하여 이루질 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서, 고점성 액체를 피펫팁에 충진한 후, 상기 분리된 자성나노입자들을 고점성 액체의 상단에 위치시킨 후, 하부에서 자력을 가하여 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 피펫팁의 하부로 모은 후 피펫을 이용해서 피펫팁 외부로 배출할 수 있다. 마이크로 피펫팁을 사용할 경우 소량으로도 육안으로 정성적 관측이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 정량화 단계는 병원성 물질이 결합된 자성나노입자들을 별도의 신호증폭과정 없이 정량분석하는 것이 가능하다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 정량분석은 자외선-가시광선 흡광도 분석을 통해서 이루어질 수 있다.
또한, 상기 정량화 단계는 신호 증폭을 통해서 보다 정확한 증량이 가능하다. 발명의 실시에 있어서, 본 발명에 쓰인 자성 나노입자는 자성 분리 외에도 인공 효소의 역할을 할 수 있으며, 과산화수소(H2O2)가 존재할 때, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB)를 산화시켜 푸른 색을 띄게 만든다. 이 발색은 결합체에 대한 흡광도 신호를 증대시킬 수 있어 매우 낮은 AFP 농도에 대해서도 흡광도 신호를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 자성 나노 입자는 자력에 반응하는 자성을 띤 미세입자로 이해된다.
본 발명에 있어서, 상기 자성 나노 입자는 병원성 물질에 하나 이상의 나노 입자들이 부착될 수 있도록 병원성 물질 보다 작은 미세 입자들이 사용될 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서, 1~10000 나노미터, 바람직하게는 50~1000 나노미터이며, 보다 더 바람직하게는 하나의 병원성 물질에 여러 개의 입자들이 결합될 수 있도록 100~500 나노미터 크기를 가지는 것이 바람직하다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 자성 나노입자들은 공지된 방법을 통해서 제조해서 사용하는 것도 가능하며, 상업적으로 구입해서 사용할 수 있으며, 일예로 상기 자성 나노입자로는 γ-Fe2O3 를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 병원성 물질, 일 예로 세균에 결합가능한 자성 나노입자는 표면 또는 내부에 세균과 결합할 수 있는 기능기가 형성되어 세균에 결합될 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 세균에 결합될 수 있는 기능기는 세균에 결합가능한 항체들이며, 특정 세균에 결합할 수 있는 다양한 항체들이 공지되어 있다. 나노 입자의 표면에 세균이 결합 가능한 항체를 형성하는 방법은, 본 발명에서 전체로 참고문헌으로 도입되는 Jun ha 등은 Biomaterials 32 (2011) 1177~1184의 "A multicomponent recognition and separation system established via fluorescent, magnetic, dualencoded multifunctional bioprobes" 논문에 기재되어 있다. 본 발명의 일 실시에 있어서, 상기 항체들은 세균에 결합할 수 있는 공지된 항체를 사용할 수 있다. 세균과 자성 나노입자의 결합은 항원-항체 결합으로 이루어질 수 있으며, 하나의 세균에 다수의 자성입자들이 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자성 나노 입자의 분리는 자력에 의해서 이루어지며, 병원성 물질이 결합된 자성 나노 입자와 병원성 물질이 결합되지 않은 비결합 자성 나노 입자들이 혼합된 형태로 함께 분리된다.
본 발명에 있어서, 병원성 물질이 결합된 자성나노입자와 병원성 물질이 비결합된 자성 나노 입자의 혼합물을 자력을 이용하여 고점성 액체를 통과시키면, 동일한 자력에 대해서 상이한 거동, 즉, 고정성 액체를 통과하는 거리가 달라지면서 서로 분리되게 된다. 예를 들어, 하나의 식중독균에는 다수의 자성 나노입자가 결합 가능하며, 이에 따라 생성된 식중독균-자성 나노입자 결합체(이하 결합체)는 비결합 자성나노입자에 대해 상대적으로 크기가 큰 하나의 입자와 같은 거동을 보이게 된다. 따라서 결합체는 비결합 자성 나노입자에 비해 외부에서 가해지는 자기장에 의해 더 큰 자기력을 가지게 되며, 자성 나노입자들이 고점성 용액을 통과하도록 유도했을 때 결합체들만이 고점성 액체를 통과하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 고점성 액체는 물보다 높은 점도를 가지는 액체를 의미하며, 자성 나노입자들의 분리에 적합한 액체의 점도는 자력이나 이동하는 거리 등에 의해서 결정될 수 있다. 바람직하게는 물의 점도에 비해서 10~1000배, 자성 나노입자들이 짧은 거리를 이용하면서 분리될 수 있도록 바람직하게는 20~200 배 정도의 점도를 가지는 것이 좋다. 예를 들어 상온에서 약 20~100 밀리파스칼·초(mPa·s) 범위를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 고점성 액체로는 본 발명에서 전체로 참고문헌으로 도입되는 Chuanbin Mao 등은 Adv. Mater. 2011, 23, 4880~4885의 "Viscosity Gradient as a Novel Mechanism for the Centrifugation-Based Separation of Nanoparticles" 논문에서 개시된 바와 같이, 폴리비닐피롤리돈 수용액을 사용할 수 있으며, 폴리비닐피롤리돈의 분자량은 5,000~30,000, 바람직하게는 6,000~20,000의 범위, 일예로 분자량 10,000 정도의 폴리비닐피롤리돈을 10~60 중량%의 농도로 사용할 수 있다.
본 발명은 일 측면에서, 피분석 물질을 포함하는 시료에 상기 피분석물질에 결합가능한 자성나노입자를 투입하여 결합시키고, 상기 자성나노입자들을 분리하는 단계; 및
분리된 자성나노입자들을 자석을 이용하여 피펫팁에 충진된 고점성 액체를 투과시켜, 자성나노입자들이 결합된 시료들을 피펫팁의 하부로 선택적으로 분리하는 단계를 포함하는 자성나노입자를 이용한 시료분석 방법을 제공한다.
본 발명은 다른 일 측면에 있어서, 병원성 물질이 결합된 자성나노입자와 비결합된 자성나노입자을 포함하는 시료를 자석을 이용하여 고점성 액체를 투과시켜 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 분리하는 것을 특징으로 하는 자성나노입자를 이용한 시료분석 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 이용하여 발색단을 가지는 화합물을 발색시켜 정량화하는 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 함량을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 고점성 유체에서 분리상으로 존재하는 자성나노입자가 결합된 병원성 물질을 피펫을 이용해서 선택적으로 분리할 수 있는 방법이 제시되었으며, 이로 인해 자성나노입자가 결합된 병원성 물질을 고점성 유체로부터 분리하는 과정에서 발생하는 오차를 줄일 수 있게 된다.
또한, 본 발명에서는 고점성 유체로부터 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 이용하여 신호증폭을 통해서 정량 분석의 정확도를 향상시킬 수 있는 방법이 제시되었다.
또한, 본 발명을 통해서 자성나노입자를 이용하여 피분석 물질이 포함된 시료에서 피분석 물질을 분리하고, 이를 정량화시킬 수 있는 일반적인 방법이 제공되었다.
본 발명에 따른 분석 방법은 원심분리기나 흡광기와 같은 별도의 고가 장비가 없이도 자성나노입자와 피펫, 자석과 같은 기본적인 장비를 통해서 비교적 정확한 정성적 분석이 가능하다는 효과가 있다.
도 1은 종래 마이크로튜브를 이용한 (a) 자성 나노입자를 이용한 식중독균 분리 (b) 자석을 이용한 식중독균-자성 나노입자 집합체 분리 모식도이다.
도 2는 종래 마이크로튜브와 고점성 용액을 이용한 분리법과 피펫을 이용한 검출법의 비교모식도이다.
도 3은 고점성 용액을 이용한 피펫 기반 식중독균 분리 검출 장치 사진이다.
도 4은 고점성 용액을 이용한 피펫 기반 식중독균 검출법 모식도이다.
도 5는 식중독균 농도별 실제 분리 사진이다.
도 6은 식중독균 농도별 분리된 식중독균-자성 나노입자의 흡광도 (A: 최하위 15L, B: 차하위 15L, C: 차상위 15L, D: 최상위 45L) (좌), A에 대한 식중독균 농도별 흡광도 이다.
도 7은 고점성 용액을 이용한 피펫 기반 AFP 검출법 모식도이다.
도 8은 AFP 농도별 실제 분리 사진이다.
도 9는 분리된 AFP-자성 나노입자를 TMB, H2O2 용액과 섞은 직후 (좌), 10분 동안 발색시킨 결과 (우)의 사진이다.
도 10은 10분 발색 후 AFP 농도별 흡광도(흑색: 100 ng/mL, 적색: 10 ng/mL, 녹색: 1 ng/mL, 청색: 0.1 ng/mL, 하늘색: 0 ng/mL, 보라색: reference) (좌) AFP 농도별 652 nm에서의 흡광도 (우)이다.
도 11은 비교실시에 따른 원심분리와 자석을 이용한 분리후 상태를 나타내는 사진이다.
도 2는 종래 마이크로튜브와 고점성 용액을 이용한 분리법과 피펫을 이용한 검출법의 비교모식도이다.
도 3은 고점성 용액을 이용한 피펫 기반 식중독균 분리 검출 장치 사진이다.
도 4은 고점성 용액을 이용한 피펫 기반 식중독균 검출법 모식도이다.
도 5는 식중독균 농도별 실제 분리 사진이다.
도 6은 식중독균 농도별 분리된 식중독균-자성 나노입자의 흡광도 (A: 최하위 15L, B: 차하위 15L, C: 차상위 15L, D: 최상위 45L) (좌), A에 대한 식중독균 농도별 흡광도 이다.
도 7은 고점성 용액을 이용한 피펫 기반 AFP 검출법 모식도이다.
도 8은 AFP 농도별 실제 분리 사진이다.
도 9는 분리된 AFP-자성 나노입자를 TMB, H2O2 용액과 섞은 직후 (좌), 10분 동안 발색시킨 결과 (우)의 사진이다.
도 10은 10분 발색 후 AFP 농도별 흡광도(흑색: 100 ng/mL, 적색: 10 ng/mL, 녹색: 1 ng/mL, 청색: 0.1 ng/mL, 하늘색: 0 ng/mL, 보라색: reference) (좌) AFP 농도별 652 nm에서의 흡광도 (우)이다.
도 11은 비교실시에 따른 원심분리와 자석을 이용한 분리후 상태를 나타내는 사진이다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 상세하게 기재하고 있지만, 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이며, 본 발명의 범위는 특허청구범위에 의해서 정하여짐을 유의하여야 한다.
실시예 1 : 식중독균의 분석
시약 및 장비
아이언(III) 클로라이드(Iron(III) chloride, FeCl3), 요소(Urea), 소디움 시트레이트(Sodium citrate), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 아미노프로필 트라이에톡시실레인 ([3-Aminopropyl]triethoxysilane, APTES), 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde), 소혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA)은 시그마-알드리치 社에서 구매되었다. 폴리에틸렌 글리콜은 Fluka 社에서 구매되었다.
식중독균에 대한 항체는 Abcam Inc. 社에서 구매되었다.
탈이온증류수는 상용 초순수제조장치(Human Science 社, 한국)를 이용하여 얻어졌고 자성 나노 입자 클러스터 합성 및 Phosphate 버퍼 용액을 만드는데 사용되었다.
비결합 식중독균 및 비결합 자성나노입자의 분리에 사용된 네오듐 자석은 서울자석 社에서 구매한 것으로 가우스미터를 이용하여 측정한 자석의 세기는 30 밀리테슬라이다.
분리된 식중독균-자성 나노 입자 결합체에 대한 정량 측정은 Ocean Optics 社의 자외선-가시광선 분광계를 이용한 흡광도 측정을 통하여 이루어졌다.
Fe3O4 자성 나노입자 클러스터(이하 자성 나노 입자) 합성 및 항체 고정
Fe3O4 자성 나노입자는 one-pot solvothermal method를 이용하여 합성되었다. 먼저 4 밀리몰의 아이언 클로라이드와 12 밀리몰의 요소 그리고 8 밀리몰의 소디움 시트레이트를 80 밀리리터의 물에 녹인다. 그 후, 자석막대를 이용하여 계속 섞어주면서 0.6 그램의 폴리아크릴아마이드를 첨가한다. 이렇게 만들어진 반응 용액을 100 밀리리터 부피의 테프론 재질의 오토클레이브 용기에 옮기고 온도를 섭씨 200 도로 12 시간 동안 유지시킴으로써 합성반응을 일으킨다. 그 후 용액을 상온까지 식힌 뒤 합성된 입자들을 자석을 이용하여 모은 뒤 나머지 반응물질들을 버리고 에탄올과 물을 이용하여 수 번 씻어냄으로써 최종적으로 Fe3O4 자성 나노입자를 얻을 수 있다. 이 때 얻어진 나노입자의 크기는 약 200 나노미터이다.
합성된 자성 나노입자는 APTES와 글루타르알데하이드와 각각 반응시킴으로써 표면에 아민기가 활성화되고 항체와 결합할 수 있게 된다. 그 후 항체와 자성 나노입자를 섞어 항체를 입자 표면에 고정시킨 뒤 BSA 처리를 하여 비선택성 접합(non-specific binding)을 방지함으로써 항체고정을 완료한다.
고점성 용액 준비
본 실험에는 폴리에틸렌 글리콜이 사용되었으며, 수평균 분자량은 8000으로 30 wt%(weight percent)의 농도로 물에 녹임으로써 고점성 용액을 만들 수 있다. 이 고점성 용액의 점도는 상온에서 약 50 밀리파스칼 초(mPa·s)로 보통 물의 점도(0.89 mPa·s)에 비해 약 50 배 이상 높다.
식중독균 검출
본 실험은 살모넬라균[Salmonella typhimurium]을 대상으로 진행된 실험이며 항체가 고정된 자성 나노입자를 식중독균이 들어있는 용액과 섞음으로써 식중독균과 자성 나노입자를 결합시킨 후, 자석을 이용하여 자성 나노입자를 분리해낸다.
그 후, 분리해낸 10g의 입자를 50L의 phosphate buffer 용액에 분산시킨 뒤, 마이크로피펫을 이용하여 50L를 피펫팁에 빨아들인 후, 준비된 고점성 액체 80L를 빨아들여, 도 3에서와 같이 마이크로피펫팁의 상부에 분리된 자성입자층이 존재하고 하부에 고점성 유체층이 존재하도록 하였다.
마이크로 피펫을 10 분동안 네오듐 자석 위에 올려놓아 도 4 및 도 5에서와 같이 고점성 유체의 하부, 즉 피펫팁의 좁은 하부에 모이도록 하여, 식중독균의 존재에 대해 정성적으로 분석하고, 분석피펫을 눌러서 배출하였다. 이를 이용하여 정량분석을 실시하였다.
정량분석 1
피펫의 부피 조절 바퀴를 이용하여 피펫팁의 하부 15L만을 배출하여 플라스틱 큐벳 (BRAND社)에서 총 70L로 묽힌 후, Oceanoptics 社의 UV-visible spectrometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 70L는 흡광도 측정을 위한 최소 부피이며, 식중독균 농도가 높아짐에 따라 배출되는 자성 나노입자의 양이 많아지므로, 결과적으로 측정되는 흡광도도 증가하였다.
정량 분석 2
배출된 Fe3O4 자성 나노입자는 인공효소로 작용하여 과산화수소수가 존재할 시, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB)라는 물질을 산화시켜, 무색에서 청색의 색을 나타나게 한다. 상기에서 배출된 15L를 25L의 0.1 M H2O2와 30L의 5 mM TMB 용액과 섞어 발색 10분 동안 발색을 일으킨 후, 그 흡광도를 측정하였다. 이와 같이 측정된 흡광도는 발색 없이 측정되었을 때보다 훨씬 향상된 신호를 보였으며 향상된 정도는 검출 대상의 농도가 높아짐에 따라 증가하였다.
실시예 2 : 병원성 단백질의 분석
본 실험은 병원성 단백질 alpha-fetoprotein(AFP)을 대상으로 진행된 실험이며 항체가 고정된 자성 나노입자를 AFP가 들어있는 용액과 섞음으로써 AFP와 자성 나노입자를 결합시킨 후, 자석을 이용하여 자성 나노입자를 분리해낸다.
그 후, 분리해낸 10g의 입자를 50L의 phosphate buffer 용액에 분산시킨 뒤, 마이크로피펫을 이용하여 50L를 피펫팁에 빨아들인 후, 준비된 고점성 액체 80L를 빨아들여, 도 3에서와 같이 마이크로피펫팁의 상부에 분리된 자성입자층이 존재하고 하부에 고점성 유체층이 존재하도록 하였다.
마이크로 피펫을 10 분동안 네오듐 자석 위에 올려놓아 도 4 및 도 5에서와 같이 고점성 유체의 하부, 즉 피펫팁의 좁은 하부에 모이도록 하여, AFP의 존재에 대해 정성적으로 분석하고, 분석피펫을 눌러서 배출하였다. 이를 이용하여 정량분석을 실시하였다.
비교실시예
상기 실시예에서 피펫 용기를 원심 분리기를 이용해서 분리시킨 것을 제외하고는 실시예와 동일하게 실시하였다. 도 11에서 도시된 바와 같이, 자성 나노 입자들이 상층부에서 하층부까지 연속적으로 띠를 이루고 있어 세균이 부착된 자성 나노 입자로부터 세균이 부착되지 않은 자성 나노 입자를 분리하기 어려웠다.
Claims (16)
- 병원성 물질을 포함하는 시료에 병원성 물질에 결합가능한 자성 나노입자를 투입하여 결합시키는 단계;
자성 나노입자를 분리하는 단계;
분리된 자성 나노입자를 자력을 이용하여 고점성 액체에 투과시켜 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 분리하는 단계; 및
분리된 병원성 물질이 결합된 자성 나노입자를 분석하는 단계를 포함하고,
분리된 자성나노입자가 피펫팁에 충진된 고점성 액체를 투과하면서 피펫 팁의 하부에 병원성 물질이 결합된 자성나노입자들이 분리되어 모이는 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정방법. - 제1항에 있어서, 상기 병원성 물질은 병원성 미생물 또는 병원성 단백질인 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 피펫팁의 하부에 모인 병원성 물질이 결합된 자성나노입자들을 피펫을 눌러 배출하는 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 병원성 물질이 결합된 자성 나노입자들을 자외선-가시광선 흡광을 이용해서 정량하는 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 병원성 물질이 결합된 자성 나노입자들을 이용하여 화합물을 발색시키고, 발색된 화합물을 분석하여 병원성 물질을 정량하는 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 병원성 물질은 살모넬라균, 황색포도상구균, 장염비브리오, 리스테리아균, 병원대장균, 장관출혈성 대장균 O157, 캠필로벡터균, 바실러스세레우스균, 웰슈군, 보틀루리스균으로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 병원성 물질은 alpha-fetoprotein(AFP), prostate-specific antigen (PSA), IL-5, IL-6, carcinoembryonic antigen (CEA) 로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 병원성 단백질인 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 자성나노입자에는 병원성 물질에 결합될 수 있는 항체가 결합된 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 고점성 액체의 점도는 물의 20~100 배인 것을 특징으로 하는 병원성물질의 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 고점성 액체는 고분자 용액인 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정세균측방법.
- 제6항에 있어서, 병원성 물질이 결합된 자성나노입자를 투입하여 과산화수소의 존재하에서 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB)을 변색시켜 흡광도 신호를 측정하여 정량하는 것을 특징으로 하는 병원성 물질의 측정 방법.
- 피분석 물질을 포함하는 시료에 상기 피분석물질에 결합가능한 자성나노입자를 투입하여 결합시키고, 상기 자성나노입자들을 분리하는 단계;
분리된 자성나노입자들을 자석을 이용하여 피펫팁에 충진된 고점성 액체를 투과시켜, 자성나노입자들이 결합된 시료들을 피펫팁의 하부로 선택적으로 분리하는 단계; 및
피펫을 눌러서 하부에 분리된 피분석 물질이 결합된 자성나노입자들을 배출하는 단계를 포함하는 자성나노입자를 이용한 시료분석 방법.
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Publications (2)
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