KR20180073353A - 나노 필터를 이용한 핵산 추출 장치 및 방법 - Google Patents

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김현미
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이경균
김용태
이석재
신용범
이재종
안준형
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서울대학교산학협력단
한국과학기술원
한국기계연구원
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Abstract

본 발명은 하면에 균일한 나노사이즈의 포어를 갖는 나노필터가 구비되고 제1액체가 담지될 수 있는, 상기 제1액체 내에 침지될 수 있는 제1전극을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 제1웰을 갖는 제1용기; 및 상기 제1웰이 수용될 수 있고 제2액체가 담지될 수 있는 상기 제2액체 내에 침지될 수 있는 제2전극을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 제2웰을 갖는 제2용기 포함하는, 핵산 추출 용기를 제공한다.

Description

나노 필터를 이용한 핵산 추출 장치 및 방법{Method and device for extracting nucleic acids using nano-filters}
본 발명은 핵산 추출 장치 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 나노 필터를 이용한 핵산 추출 장치 및 방법에 관한 것이다.
최근 세포, 박테리아 또는 바이러스와 같은 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 기술에 관하여 많은 연구가 이루어지고 있다. 일반적으로, 생물학적 물질에서 핵산을 분리하는 방식은 세 가지로 나눌 수 있는데 마그네틱 비드를 사용하여 자석으로 흡착된 핵산을 분리해내는 방법, 실리카겔이 충진된 컬럼을 이용해서 용액을 용출하는 방법으로 컬럼 내에 DNA가 포함된 액체를 충진한 후 음압을 가하여 액체를 제거한 후 DNA를 실리카겔로부터 떨어뜨리는 방법, 그리고 최근에는 최근에는 핵산과 특이적으로 결합하는 실리카나 유리섬유를 멤브레인으로 제조한 후, 상기 멤브레인이 하면에 구비된 필터 키트를 전기영동용 튜브에 삽입한 후 원심분리를 이용하여 DNA 분자를 분리하는 방법 등 사용되기도 한다. 상기 실리카나 유리섬유는 단백질, 세포 대사 물질들과 결합 비율이 낮으므로 상대적으로 높은 농도의 핵산을 얻을 수 있다. 그러나, 자성입자를 이용하는 대부분의 핵산 추출 장비는 종래의 기술을 단순히 자동화 한 것으로, 장비의 부피가 크고, 추출 과정 중 피펫 등에 묻은 용액이 다른 시험용기에 떨어져, 교차오염이 발생할 수 있다는 문제점이 있고 원심분리방식은 처리할 수 있는 시료의 개수가 제한되어 있으며 유리섬유를 이용하는 방법은 많은 처리 단계를 수행해야 하기 때문에 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 이외에도 현재의 핵산 추출방법은 시료의 종류에 따라 제거 효율이 달라진다거나 추출되는 핵산의 양이 감소한다거나 실험시간의 증가 등의 문제점을 초래할 수 있다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2015-0127917호는 자성입자를 이용한 핵산의 추출 및 증폭 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 복잡한 핵산 추출 공정으로 인해 많은 시간이 소요되고 생산 효율이 낮은 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 저 전력으로도 매우 신속하고 효율적으로 핵산을 분리할 수 있는 나노 필터를 이용한 핵산 추출 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 하면에 균일한 나노사이즈의 포어를 갖는 나노필터가 구비되고 제1액체가 담지될 수 있는, 상기 제1액체 내에 침지될 수 있는 제1전극을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 제1웰을 갖는 제1용기; 및 상기 제1웰이 수용될 수 있고 제2액체가 담지될 수 있는 상기 제2액체 내에 침지될 수 있는 제2전극을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 제2웰을 갖는 제2용기 포함하는, 핵산 추출 용기가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 균일한 나노사이즈의 포어를 갖는 나노필터를 경계로 구분된 두 구획에 각각 추출대상이 되는 핵산 분자를 포함하는 시료를 포함하는 제1액체 및 추출 후의 핵산분자를 담지하기 위한 제2액체를 위치시키는 단계; 상기 제1액체 및 상기 제2액체에 각각 음극 및 양극 전극을 담지시키는 단계; 상기 음극 및 양극 전극에 직류전원을 연결하여 직류전류를 인가하는 단계; 및전류 인가를 중단하고 상기 제2액체를 회수하는 단계를 포함하는 핵산분자의 추출방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 나노필터를 이용하여 종래의 방법보다 저 전력으로도 매우 신속하고 효율적으로 핵산을 분리하여 단위시간당 고순도의 핵산을 추출할 수 있는 효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 종래 핵산을 추출하는 방법과 본 발명의 나노필터를 이용하여 핵산을 추출하는 방법을 비교한 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)의 구조를 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 복수로 구성된 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(200)의 구조를 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)에 내장되는 균일한 나노 포어를 갖는 나노필터(150)의 제조공정을 도시한 개요도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 상기 제조공정이 완료된 나노필터(150)의 뒷면을 전자주사현미경(SEM)으로 배율을 달리하여 찍은 사진으로 각각 20k(a), 50k(b) 및 100k(c)배율을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)를 이용하여 세포 파쇄액으로부터 DNA를 추출하는 공정을 나타내는 개요도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)를 이용하여 세포 파쇄액으로부터 DNA를 추출하는 공정을 나타내는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 추출한 DNA를 이용하여 전기영동을 통해 증폭을 관찰한 겔 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)를 이용하여 시간에 따라 DNA 추출 수율을 분석한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)를 통해 추출한 DNA를 real-time PCR로 정량분석한 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "핵산(nucleic acid)"은 푸린염기 및 피리미딘 염기,당, 인산으로 이루어진 고분자물질로 발견자 F. Miescher는 세포핵에서 발견한 신물질을 뉴클레인(nuclein)이라 하였고 후에 핵에 다량으로 존재하는 산성물질이라는 뜻으로 핵산이란 명칭이 붙었다. 염기, 펜토오스 및 인산으로 구성된 뉴클레오티드가 인산디에스테르결합으로 중합되어 긴사슬모양의 분자를 형성하고 있다. 핵산분자에는 5'→ 3' 이라는 방향성(극성; polarity)이 있고 이것은 핵산구조나 기능에 관련된 중요한 특성 중의 하나로 당부분이 데옥시리보오스인 데옥시리보핵산(DNA), 리보오스인 리보핵산(RNA)으로 대별된다.
본 문서에서 사용되는 "반도체소자(semiconductor device)"는 반도체를 소재로 하여 만든 회로소자이며 여기에 사용되는 반도체는 규소, 저마늄, 갈륨비소 등이다. 대부분의 용도에서 열전자소자를 대체해 오고 있다. 이들의 반도체에는 n형ㅇp형ㅇ진성(眞性) 등 성질상 구분이 있으며, 그들을 단체(單體)로 또는 몇 개를 서로 접합해서 사용한다. 다이오드나 트랜지스터ㅇ사이리스터 등과 빛이나 방사선을 검출하는 것, 온도를 느끼는 것, 자기장이나 압력에 민감한 것 등 여러 가지 특성의 것이 있는데, 각 방면에서 널리 사용되고 있다.
본 문서에서 사용되는 "웨이퍼(wafer)"는 반도체 직접 회로를 만드는 재료가 되는 얇은 원판으로 실리콘(Si)이나 갈륨 아세나이드(GaAs) 등을 성장시켜 얻은 ingot(단결정 기둥)을 적당한 지름으로 얇게 썬 둥근 판을 말한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 하면에 균일한 나노사이즈의 포어를 갖는 나노필터가 구비되고 제1액체가 담지될 수 있는, 상기 제1액체 내에 침지될 수 있는 제1전극을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 제1웰을 갖는 제1용기; 및 상기 제1웰이 수용될 수 있고 제2액체가 담지될 수 있는 상기 제2액체 내에 침지될 수 있는 제2전극을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 제2웰을 갖는 제2용기 포함하는, 핵산 추출 용기가 제공된다.
상기 핵산 추출 용기에 있어서, 상기 제1액체는 증류수, 완충액, 또는 PCR 반응액일 수 있고 상기 제1전극은 전원공급장치의 양극에 연결될 수 있으며 상기 제2액체는 핵산 분자를 포함하는 시료일 수 있다.
상기 핵산 추출 용기에 있어서, 상기 제1액체는 핵산 분자를 포함하는 시료일 수 있고 상기 핵산 분자를 포함하는 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 땀, 눈물 또는 조직 또는 세포 파쇄액일 수 있으며 상기 제2액체는 증류수, 완충액, 또는 PCR 반응액일 수 있다.
상기 핵산 추출 용기에 있어서, 상기 포어는 3 내지 300 nm의 직경을 가질을 수 있고, 10 내지 280 nm, 25 내지 270 nm, 50 내지 250 nm 또는 100 내지 220 nm의 직경을 가질 수 있으며, 상기 나노필터의 두께는, 10 nm 내지 5 μm일 수 있으며 상기 나노필터의 소재는 반도체, 금속, 금속질화물, 반도체질화물, 금속황화물, 반도체황화물, 금속인화물, 반도체인화물, 금속비소화물, 반도체비소화물, 금속산화물, 또는 반도체산화물일 수 있으며, 기판(substrate) 상에 화학적 기상증착법(chemical vapor deposition; CVD)이나 물리적 기상증착법(physical vapr deposition; PVD) 등의 박막형성방법을 통해 박막을 형성할 수 있는 물질은 어떤 것이라도 사용이 가능하다
상기 핵산 추출 용기에 있어서, 상기 금속은 티타늄, 구리, 은, 금, 갈륨, 인듐, 몰리브덴, 주석, 알루미늄, 아연, 루세늄, 탄탈륨 또는 텅스텐일 수 있고 상기 반도체는 도핑되거나 도핑되지 않은 실리콘, 게르마늄, 갈륨 화합물, 실리콘카바이드(SiC), 셀레늄, 질화붕소(BN), 인화붕소(BP), 비소화붕소(BAs)일 수 있으며 상기 금속질화물은 티타늄나이트라이드(TiN), 알루미늄나이트라이드(AlN), 탄탈륨나이트라이드(TaN), 인듐나이트라이드(InN), 갈륨나이트라이드(GaN)일 수 있고, 상기 반도체질화물은 실리콘나이트라이드(SiNx)일 수 있으며, 상기 금속인화물은 인화알루미늄(AlP), 인화인듐(InP), 인화갈륨(GaP)일 수 있고, 상기 금속 황화물은 몰리브덴디설파이드(MoS)일 수 있으며, 상기 금속비소화물은 갈륨아세나이드(GaAs), 인듐아세나이드(InAs), 알루미늄아세나이드(AlAs) 또는 카드뮴아세나이드(Cd3As2)일 수 있으며, 상기 금속인화물은 코발트포아스파이드(CoP), 인화철(FeP), 니켈포스파이드(NiP), 바나듐포스파이드(VP), 텅스텐포스파이드(WP)알루미늄포스파이드(AlP), 인듐포스파이드(InP)일 수 있고, 상기 금속산화물은 제1산화구리(Cu2O), 제2산화구리(CuO), 비스무스옥사이드(Bi2O3), 티타늄옥사이드(TiO2), 하프늄옥사이드(HfO2)일 수 있으며, 상기 반도체산화물은 실리콘옥사이드(SiO2) 또는 게르마늄옥사이드(GeO2)일 수 있다.
상기 핵산 추출 용기에 있어서, 상기 제1웰 및 상기 제2웰은 6웰, 12웰, 24웰, 48웰, 96웰, 192웰 또는 384웰로 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 균일한 나노사이즈의 포어를 갖는 나노필터를 경계로 구분된 두 구획에 각각 추출대상이 되는 핵산 분자를 포함하는 시료를 포함하는 제1액체 및 추출 후의 핵산분자를 담지하기 위한 제2액체를 위치시키는 단계; 상기 제1액체 및 상기 제2액체에 각각 음극 및 양극 전극을 담지시키는 단계; 상기 음극 및 양극 전극에 직류전원을 연결하여 직류전류를 인가하는 단계; 및전류 인가를 중단하고 상기 제2액체를 회수하는 단계를 포함하는 핵산분자의 추출방법이 제공된다.
상기 추출방법에 있어서, 상기 직류전류의 전압은 0.1 내지 200 V일 수 있고상기 제1액체는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 땀, 눈물 또는 조직 또는 세포 파쇄액이리 수 있으며 상기 제2액체는 증류수, 완충액, 또는 PCR 반응액일 수 있다.
더 바람직하게는 상기 직류전류의 전압은 0.2 내지 150 V일 수 있고, 0.3 내지 110 V일 수 있고, 또는 0.4 내지 100 V일 수 있다. 또는 상기 직류전류의 전압은 0.1 내지 2.0 V, 0.1 내지 1.8 V, 0.3 내지 1.7 V, 0.4 내지 1.6 V, 0.5 내지 1.5 V일 수 있다. 특히 본 발명의 방법은 저전압으로 작동이 가능하다는 것이 매우 큰 장점으로서 1.5 V 건전지를 전원으로 한 휴대용 장비를 통해 야외 현장에서 미확인 시료의 핵산을 신속하게 추출하는데 사용될 수 있기 때문에, 환경오염 여부 또는 생태환경 상태를 확인하는데 매우 효율적으로 사용될 수 있다. 아울러, 메타게놈(methagenome)의 신속한 분리를 통해 메타게놈의 연구에 매우 효율적으로 사용될 수 있다.
상기 추출방법에 있어서, 상기 포어는 3 내지 300 nm의 직경을 갖을 수 있고 상기 나노필터의 두께는, 10 nm 내지 5 μm일 수 있으며 상기 나노필터의 소재는 반도체, 금속, 금속질화물, 반도체질화물, 금속황화물, 반도체황화물, 금속인화물, 반도체인화물, 금속비소화물, 반도체비소화물, 금속산화물, 또는 반도체산화물일 수 있다.
본 발명자들은 종래 핵산을 추출하기 위해 사용하는 방법인 용해 완충액(lysis buffer)을 이용해 배양된 대장균(E. coli) 세포를 세포 용해물(cell lysate) 형태로 제조하고 상기 세포 용해물을 원심분리하여 실리카 멤브레인(silica membrane)에 DNA를 흡착시켜 용출버퍼(elusion buffer)를 처리하여 상기 DNA를 실리카 멤브레인으로부터 분리하는 방법이 세포 용해 단계에서 사용하는 용해 완충액이나 세포 찌꺼기(cell debris)들이 깨끗하게 제거되지 않거나 실리카 멤브레인 표면에 DNA를 고정시키기 위한 카오트로픽 시약(chaotropic reagent)을 사용하면 다음 실험에 영향을 미쳐 PCR 증폭(amplification)이 원활하게 진행되지 않을 가능성이 있고 60% 이하의 낮은 추출 효율을 나타내며 다양한 시약 사용과 시간 소요로 인해 현장에서 바로 사용할 수 있는 현장 검출(on-site detection)이 불가능한 단점이 있는 등 여러 문제점이 발생하는 것을 인지하고 이를 해결하고자 예의 노력한 결과, 균일한 포어 크기를 갖는 나노 필터를 이용하여 고순도의 핵산을 저전력으로도 신속하고 효율적으로 추출하는 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)를 개발하게 되었다(도 1).
상기 방법에 있어서, 상기 직류전류를 인가하는 단계는 30초 내지 20분간, 1 내지 10분간, 1 내지 3분간 또는 1 내지 5분간 수행될 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 여러 실시예들을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려 이들 실시예들은 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다. 또한, 도면에서 각 층의 두께나 크기는 설명의 편의 및 명확성을 위하여 과장된 것이다.
명세서 전체에 걸쳐서, 막, 영역 또는 기판과 같은 하나의 구성요소가 다른 구성요소 "상에", "연결되어", "적층되어" 또는 "커플링되어" 위치한다고 언급할 때는, 상기 하나의 구성요소가 직접적으로 다른 구성요소 "상에", "연결되어", "적층되어" 또는 "커플링되어" 접촉하거나, 그 사이에 개재되는 또 다른 구성요소들이 존재할 수 있다고 해석될 수 있다. 반면에, 하나의 구성요소가 다른 구성요소 "직접적으로 상에", "직접 연결되어", 또는 "직접 커플링되어" 위치한다고 언급할 때는, 그 사이에 개재되는 다른 구성요소들이 존재하지 않는다고 해석된다. 균일한 부호는 균일한 요소를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 제 1, 제 2 등의 용어가 다양한 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부분들을 설명하기 위하여 사용되지만, 이들 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부분들은 이들 용어에 의해 한정되어서는 안됨은 자명하다. 이들 용어는 하나의 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분을 다른 영역, 층 또는 부분과 구별하기 위하여만 사용된다. 따라서, 이하 상술할 제 1 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분은 본 발명의 가르침으로부터 벗어나지 않고서도 제 2 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분을 지칭할 수 있다.
또한, "상의" 또는 "위의" 및 "하의" 또는 "아래의"와 같은 상대적인 용어들은 도면들에서 도해되는 것처럼 다른 요소들에 대한 어떤 요소들의 관계를 기술하기 위해 여기에서 사용될 수 있다. 상대적 용어들은 도면들에서 묘사되는 방향에 무게추가하여 소자의 다른 방향들을 포함하는 것을 의도한다고 이해될 수 있다. 예를 들어, 도면들에서 소자가 뒤집어 진다면(turned over), 다른 요소들의 상부의 면 상에 존재하는 것으로 묘사되는 요소들은 상기 다른 요소들의 하부의 면 상에 방향을 가지게 된다. 그러므로, 예로써 든 "상의"라는 용어는, 도면의 특정한 방향에 의존하여 "하의" 및 "상의" 방향 모두를 포함할 수 있다. 소자가 다른 방향으로 향한다면(다른 방향에 대하여 90도 회전), 본 명세서에 사용되는 상대적인 설명들은 이에 따라 해석될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
이하, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들을 개략적으로 도시하는 도면들을 참조하여 설명한다. 도면들에 있어서, 예를 들면, 제조 기술 및/또는 공차(tolerance)에 따라, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명 사상의 실시예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 되며, 예를 들면 제조상 초래되는 형상의 변화를 포함하여야 한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)의 원리와 구조를 개략적으로 도시하고 있다. 본 발명의 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)는 제2액체(135)로부터 별도의 핵산 추출 또는 정제하는 과정 없이 내장된 균일한 나노포어(nano pore)을 갖는 필터를 이용하여 전기장(electric field)을 걸어서 상기 나노필터를 통하여 나노크기(nono size)의 핵산만을 선별적으로 이동시키는 새로운 방식의 핵산 추출 또는 정제장치이다. 핵산의 추출은 생물학적 연구분야에서 필수적인 단계로 DNA 증폭을 위한 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 위해 다량의 정제된 핵산을 필요로 하는데 종래에는 연구인력의 수작업으로 생물학적 물질 또는 핵산을 분리하였으나 상기 방법은 복잡한 과정으로 인해 많은 시간이 소요됨에 따라 고 비용이 발생하고 낮은 생산 수율을 나타내는 등 여러 한계가 존재하였다. 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 생물학적 시료로부터 목적하는 생물학적 물질 또는 핵산을 추출하기 위한 자동화 장치의 제조에 관한 많은 연구가 수행되고 있는데 이러한 점에서 본 발명의 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)는 종래의 복잡한 과정 및 낮은 생산 수율 등 여러 한계점을 극복한 핵산 추출장치라 할 수 있다.
장치의 구조는 도 2에 도시한 바와 같이, 용액을 수용할 수 있는 공간과 상기 공간의 바닥에 균일한 나노포어를 갖는 나노필터(nanofilter, 150)가 내장(embed)되어 있는 제1웰(125)이 상부에 구성되어 있고 제1웰(125)에 추출이 된 핵산 분자를 보관하기 위한 제1액체(127)를 주입하기 위해 선택적으로 개폐가 가능한 덮개(140)가 있으며 제1웰(125) 내부에는 외부의 전원공급장치(155)와 연결되는 양극(anode, 115)이 설치되어 있다. 또한 세포파쇄액 등 핵산분자를 포함하는 시료인 제2액체(135)을 담지할 수 있는 공간을 갖고 상기 제1웰(125)이 수용될 수 있으며, 전원공급장치(155)로부터 연결되는 음극(cathode, 120)이 설치되어 있는 제2웰(130)로 구성되어 있다. 상기 장치를 이용하여 핵산을 추출하기 위해서는 제2웰(130)에 세포파쇄액과 같은 추출 대상 핵산 분자를 포함하고 있는 제1액체(127)를 주입하고 제1웰(125)에는 추출된 핵산 분자를 저장하기 위한 증류수, 완충액 또는 PCR 반응액과 같은 제2액체(127)을 주입하여 결합한 후 양 전극에 DC 전류를 공급해주면 극히 짧은 시간(1 분 내외) 경과 후에 따라 제1액체(127) 내의 음전하를 띄고 있는 핵산분자가 인가된 직류 전류에 의해 양극(115)쪽인 제1웰(125)로 이동하게 되는데 이때 제1웰(125)의 하면에 설치된 나노필터(nanofilter, 150)를 통해서 제2액체(135)에 속에 포함된 여러 생물학적 물질 중 나노 크기(nano size)를 가진 핵산(nucleic acid)만 나노필터(150)를 통과하게 된다. 따라서 고순도의 핵산을 별도의 추출 장치나 추출과정 없이 신속하고 효율적으로 추출할 수 있고 상기 추출된 핵산을 바로 연구에 이용할 수 있다. 선택적으로, 제1액체(127)와 제2액체(135)의 위치를 서로 바꾸어도 무방하며, 이 경우 양극(115)이 제2웰(130)에 위치하고 음극(120)이 제1웰(125)에 위치하면 된다. 이 때 상기 핵산 분자를 포함하는 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 땀, 눈물 또는 조직 또는 세포 파쇄액일 수 있고 인가되는 전류의 전압은 0.1 내지 200 V를 사용할 수 있으며 전류 인가시간은 30초 내지 5분의 시간으로, 인가되는 전류의 전압 및 샘플의 양 또는 추출량에 따라 적절히 조절될 수 있다. 또한, 전력공급으로 위해서 전극(120, 115)이 연결된 전선의 타말단에는 전력공급장치(155)의 포트에 연결될 수 있는 플러그(미도시)가 구성되어 있어 간편하게 연결하여 사용가능하고 전력공급장치(155)는 일반 또는 전용모두 사용가능하다. 상기 나노포어를 갖는 나노필터의 제조과정은 도 5에서 상세히 설명하기로 한다.
도 2는 본 발명의 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)의 구성 및 원리를 이해하기 쉽게 단일구성으로 도시한 것으로 이는 샘플의 양이나 연구자의 목적에 따라 복수의 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)를 연결하여 핵산 추출의 효율성을 도모할 수 있는데 이는 도 3을 참고하면 쉽게 이해할 수 있다. 도 3에 도시한 바와 같이, 단일구성이 아닌 복수의 결합 형태로 구성된 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(200)를 도시하고 있다. 핵산을 추출하는 방식은 도 2의 단일구성과 마찬가지로 제2웰(130)에 제2액체(135)를 주입하고 제1웰(125)에 제1액체(127)를 주입해주고 덮개(140)를 제1웰(125) 상부에 결합한다. 덮개(140)에는 제1웰(125)에 양전하를 공급하기 위해 양극(115)가 각각 웰에 전력을 공급할 수 있게끔 구성되어 있고 제2웰(130) 하부에는 음전하를 공급하기 위해 음극(120)이 각각 구성되어 있다. 복수의 추출장치는 단일 시료로부터 다량의 핵산을 한번에 추출하거나 다종의 시료를 동시에 추출하기 위한 목적에 적합하나 그 만큼 시료의 주입, 전력의 공급 및 추출액의 회수에 있어서 세심한 주의가 필요하다. 도 3은 복수형태의 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(200)의 구성을 쉽게 이해하기 위하여 소정 개수의 결합형태를 도시하였으나 이는 샘플의 양이나 연구자의 목적에 따라 조절될 수 있고 예컨대 6웰, 12웰, 24웰, 48웰, 96웰, 192웰 또는 384웰과 같이 병렬과 직렬로 결합을 부가하여 제작될 수 있다. 이때 상기 웰의 소재는 유리(glass), 철(iron) 또는 수지제(resin)일 수 있고 상기 철은 탄소강(carbon steel), 스테인레스(stainless steel) 또는 합금(alloy steel)일 수 있다. 또한 상기 수지제(resin)는 열가소성 수지(thermoplastic resin) 또는 열경화성 수지(thermosetting resin)일 수 있고 상기 열가소성 수지(thermoplastic resin)는 폴리염화비닐(polyvinyl chloride), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 아크릴(acrylic), 나일론(nylon) 또는 PET(polyethylene terephthalate)일 수 있으며 상기 열경화성 수지(thermosetting resin)는 페놀(phenol), 멜라민(melamine) 또는 에폭시(epoxy)일 수 있다.
도 4는 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)에 내장되는 균일한 나노 포어를 갖는 나노필터(150)의 제조공정을 개략적으로 도시하고 있다. 상기 제조공정은 일반적인 반도체소자(semiconductor device) 제조공정과 동일한 것으로 먼저, 반도체의 재료가 되는 웨이퍼(wafer)의 상,하부 멤브레인에 고온(800 ~ 1200℃)에서 산소나 수증기를 뿌려 얇고 균일한 반도체 물질인 실리콘나이트라이드(Silicon Nitride, SiN)를 나노크기로 증착시키는 산화공정을 실시한다. 이 후 상기 멤브레인에 감광물질(photoresist)를 코팅하여 주고 빛을 받으면 화학반응을 일으켜서 성질이 변하는 원리를 이용하여 얻고자 하는 패턴(pattern)의 마스크(mask)를 사용하여 빛을 선택적으로 조사 후 상기 마스크의 패턴과 동일한 패턴을 형성시키는 광식각공정(photolithograpy)을 수행한다. 상기와 같은 공정으로 200 나노미터의 포어를 만들고 화학물질을 사용해서 감광물질(photoresist)가 없는 노출된 부분만을 부식시키는 에칭(etching) 공정을 수행한다. 이어서, 감광물질(photoresist)을 웨이퍼 표면에 고르게 도포하고 후면의 SiN를 에칭하여 나노필터(150)의 제조공정이 완료된다.
도 5는 후면 부식(backside etch) 후 상기 제조공정이 완료된 나노필터(150)의 후면을 주사전자현미경(SEM)으로 배율을 달리하여 찍은 사진이다. 상기 제조된 나노필터(150)의 소재는 반도체, 금속, 금속질화물, 반도체질화물, 금속황화물, 반도체황화물, 금속인화물, 반도체인화물, 금속비소화물, 반도체비소화물, 금속산화물, 또는 반도체산화물일 수 있고, 상기 반도체는 도핑되거나 도핑되지 않은 실리콘, 게르마늄, 갈륨 화합물, 실리콘카바이드(SiC), 셀레늄, 질화붕소(BN), 인화붕소(BP), 비소화붕소(BAs)일 수 있으며 상기 금속질화물은 티타늄나이트라이드(TiN), 알루미늄나이트라이드(AlN), 탄탈륨나이트라이드(TaN), 인듐나이트라이드(InN), 갈륨나이트라이드(GaN)일 수 있고, 상기 반도체질화물은 실리콘나이트라이드(SiNx)일 수 있으며, 상기 금속인화물은 인화알루미늄(AlP), 인화인듐(InP), 인화갈륨(GaP)일 수 있고, 상기 금속 황화물은 몰리브덴디설파이드(MoS)일 수 있으며, 상기 금속비소화물은 갈륨아세나이드(GaAs), 인듐아세나이드(InAs), 알루미늄아세나이드(AlAs) 또는 카드뮴아세나이드(Cd3As2)일 수 있으며, 상기 금속인화물은 코발트포아스파이드(CoP), 인화철(FeP), 니켈포스파이드(NiP), 바나듐포스파이드(VP), 텅스텐포스파이드(WP)알루미늄포스파이드(AlP), 인듐포스파이드(InP)일 수 있고, 상기 금속산화물은 제1산화구리(Cu2O), 제2산화구리(CuO), 비스무스옥사이드(Bi2O3), 티타늄옥사이드(TiO2), 하프늄옥사이드(HfO2)일 수 있으며, 상기 반도체산화물은 실리콘옥사이드(SiO2) 또는 게르마늄옥사이드(GeO2)일 수 있다. 상기 나노필터(150)의 두께는 10 nm 내지 5 μm일 수 있으나, 적절히 조절되어 제작될 수 있고 포어의 크기도 3 내지 300 nm의 직경으로 시료의 종류와 연구자의 목적에 따라 적절히 조절될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 나노필터의 제조
실리콘 웨이퍼(직경 50 mm)에 저압 화학증착법(low pressure chemical vapor deposition, LPCVD)으로 약 500 nm 두께의 실리콘 나이트라이드(SiNx)층을 증착하였다. 그런 다음 증착된 실리콘 나이트라이드층에 감광물질을 도포한 후, 직경 200 nm의 원형 몰드로 imprinting하여 상기 감광물질 층에 패턴이 형성되도록 하였다. 그런 다음 패턴이 형성된 감광물질층에 대하여 노광 및 현상을 수행하였다(도 4의 왼쪽). 이어, 실리콘 나이트라이드층에 대한 부분 건식 에칭을 수행하였다.
그런 다음 뒷면(backside)에 감광물질을 도포한 후, 노광 및 현상을 하여 실리콘 나이트라이드층을 노출시킨 후 드라이 에칭을 수행하여 뒷면의 실리콘 나이트라이드층을 제거하고 수산화칼륨(KOH)를 이용한 습식에칭 공정을 이용하여 실리콘 기판층을 제거하였다. 이어, 감광물질을 박리시켰고, 실리콘 나이트라이드 층에 대하여 뒷면 건식 에칭을 수행하여 완전히 타공이 된 약 300 nm 두께를 갖는 실리콘 나이트라이드 나노필터를 제조하였다.
상기 제조된 나노필터를 주사전자현미경으로 관찰한 결과 균일한 200 nm 직경의 나노포어가 정상적으로 형성되어 있음을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 2: 나노필터를 이용한 핵산 추출 용기의 제작
본 발명자들은 PDMS 블럭(polydemthylsilosane)에 펀칭을 하여 하부가 완전히 뚫리지 않은 웰 형성 PDMS 블럭을 제조한 후 상기 웰 형성 PDMS 블럭 위에 상기 실시예 1에서 제조된 실리콘 나이트라이드 나노필터(700 X 700 μm)를 올려놓은 후 나노필터 위에 PDMS 소재의 격벽을 쌓아 상부웰을 형성하였다. 그런 다음 상부웰에 백금 전극이 위치하도록 스탠드를 이용하여 고정하고, 웰 형성 PDMS 블럭에 백금 전극을 꽂아 하부웰에 백금 전극이 위치하게 한 후 상기 상부웰 및 하부웰에 연결된 백금 전극을 각각 직류 전원공급장치(power supply)의 양극과 음극에 연결하였다.
실험예 1: DNA 추출 및 증폭
상기 실시예 2에서 제조된 핵산 추출 용기(100)을 이용하여 세포 파쇄액으로부터 DNA를 추출하고, 상기 추출된 DNA를 이용하여 증폭여부를 검증하였다. 하부웰인 제2웰(130)에 대장균(E. coli) 세포를 세포용혈 완충용액(lysis buffer)을 이용하여 파쇄한 세포파쇄물(cell lysate) 300 ㎕을 주입하였다(도 6). 그런 다음 상기 실시예 1에서 제조된 나노필터를 PDMS 블럭 위에 올려놓고, PDMS 소재의 격벽을 위에 올려놓아 상부웰인 제1웰(125)을 형성한 후 PCR 반응용액 300 ㎕를 주입하였다. 그런 다음 직류 전원공급장치(155)를 통해 전압을 50V 및 100V 두 가지로 나누어 직류 전류를 1분간 인가하였다(도 7). 추출을 완료한 후, 상부웰의 용액을 PCR 반응용 튜브로 옮겨서 대장균 특이적인 하기 프라이머 세트를 첨가한 후 PCR 반응을 수행하였다(표 1 참조). 그 결과, 도 8에 나타난 것과 같이, 50V 및 100V의 직류전류를 1분간 가하여 추출된 DNA를 주형으로 한 PCR 반응이 성공적으로 수행되었음을 확인할 수 있었다. 도 8의 1번 레인의 경우 전류를 가하지 않은 상부웰에 담긴 용액을 이용한 음성대조군의 결과이다.
프라이머 염기서열(5'->3') 서열번호
Forward GGG CAG TTA TTT TGC TGT GGA 1
Reverse TGT TGC CGT ATT AAC GAA CCC 2
Taqman FAM-CTA TCA GGC GCG TTT TGA CCA TCT TCG-TAMRA 3
실험예 2: 저전력 핵산 추출 및 실시간 PCR 반응
본 발명자들은 상기 결과로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출방법이 건전지와 같은 저전력으로도 수행될 수 있는지 확인하기 위해, 사용 전압을 1.0 V로 낮추어 실험예 1과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세포 파쇄물 대신 이미 농도를 알고 있는 DNA 수용액(65.8 ng/㎕) 150 ㎕을 웰 형성 PDMS 블럭의 제2웰(130)에 주입한 후, 상기 실시예 1에서 제조된 나노필터를 블럭 위에 올려 놓은 후 PCR 반응액 20 ㎕를 나노필터 위에 점적하였다. 그런 다음, 상기 실험예 2와 같이 백금 전극을 연결한 후 1.0V의 직류 전류를 각각 1분, 2분, 3분, 5분, 7분 및 10분간 인가하였다. 그 후, 상부의 PCR 반응액을 회수하여 OD260 및 OD280을 구하여 DNA의 순도의 양을 측정하였다.
그 결과, 시간에 따라 DNA의 농도가 증가하는 것을 관찰하였고(도 9A) 핵산의 순도를 나타내는 지표인 A260/280 값이 2.0에 가깝게 나타나 순도가 매우 높음을 알 수 있었다(도 9B). 또한, 본 발명자들은 1.0V의 직류전류를 9분간 인가하여 추출된 DNA를 주형으로 하여 실시간 PCR 반응을 수행한 결과, 추출전 DNA를 주형으로 한 실시간 PCR 결과와 동일한 결과를 산출하였다(도 10). 이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법 및 장치가 세포 파쇄액과 같은 증폭 대상 핵산분자가 존재하는 시료로부터 DNA나 RNA와 같은 핵산분자를 신속하게 추출할 수 있을 뿐만 아니라 추출된 핵산을 이용하여 실시간 PCR과 같은 정밀한 분석작업을 수행할 수 있을 정도로 순도가 높음을 의미하는 것이다.
결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 균일한 포어 크기를 갖는 나노필터를 이용한 핵산 추출 장치(100)를 이용하여 다양한 생물학적 시료로부터 고순도의 핵산을 저전력으로도 신속하고 효율적으로 추출할 수 있으므로, 1.5 V 건전지를 전원으로 사용하는 휴대용 장비를 제조하여 현장에서 신속하게 핵산을 추출한 후 실험실로 이동한 후 실험에 사용하거나, 현장에서 바로 검출에 활용하는 이른바 현장 검출(on-site detection)을 위한 목적으로 사용가능하다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Method and device for extracting nucleic acids using nano-filters <130> PD16-5433 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward <400> 1 gggcagttat tttgctgtgg a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse <400> 2 tgttgccgta ttaacgaacc c 21 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman <400> 3 ctatcaggcg cgttttgacc atcttcg 27

Claims (19)

  1. 하면에 균일한 나노사이즈의 포어를 갖는 나노필터가 구비되고 제1액체가 담지될 수 있는, 상기 제1액체 내에 침지될 수 있는 제1전극을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 제1웰을 갖는 제1용기; 및
    상기 제1웰이 수용될 수 있고 제2액체가 담지될 수 있는 상기 제2액체 내에 침지될 수 있는 제2전극을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 제2웰을 갖는 제2용기 포함하는, 핵산 추출 용기.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1액체는 증류수, 완충액, 또는 PCR 반응액인, 핵산 추출 용기.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1전극은 전원공급장치의 양극에 연결되는, 핵산 추출 용기.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제2액체는 핵산 분자를 포함하는 시료인, 핵산 추출 용기.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1액체는 핵산 분자를 포함하는 시료인, 핵산 추출 용기.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 핵산 분자를 포함하는 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 땀, 눈물 또는 조직 또는 세포 파쇄액인, 핵산 추출 용기.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 제2액체는 증류수, 완충액, 또는 PCR 반응액인, 핵산 추출 용기.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제2전극은 전원공급장치의 음극에 연결되는, 핵산 추출 용기.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 포어는 3 내지 300 nm의 직경을 갖는, 핵산 추출 용기.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 나노필터의 두께는, 10 nm 내지 5 μm인, 핵산 추출 용기.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 나노필터의 소재는 반도체, 금속, 금속질화물, 반도체질화물, 금속황화물, 반도체황화물, 금속인화물, 반도체인화물, 금속비소화물, 반도체비소화물, 금속산화물, 또는 반도체산화물인, 핵산 추출 용기.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제1웰 및 상기 제2웰은 6웰, 12웰, 24웰, 48웰, 96웰, 192웰 또는 384웰로 구성되는, 용기.
  13. 균일한 나노사이즈의 포어를 갖는 나노필터를 경계로 구분된 두 구획에 각각 추출대상이 되는 핵산 분자를 포함하는 시료를 포함하는 제1액체 및 추출 후의 핵산분자를 담지하기 위한 제2액체를 위치시키는 단계;
    상기 제1액체 및 상기 제2액체에 각각 음극 및 양극 전극을 담지시키는 단계;
    상기 음극 및 양극 전극에 직류전원을 연결하여 직류전류를 인가하는 단계; 및
    전류 인가를 중단하고 상기 제2액체를 회수하는 단계를 포함하는 핵산분자의 추출방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 직류전류의 전압은 0.1 내지 200 V인, 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 제1액체는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 땀, 눈물 또는 조직 또는 세포 파쇄액인, 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 제2액체는 증류수, 완충액, 또는 PCR 반응액인, 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 포어는 3 내지 300 nm의 직경을 갖는, 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 나노필터의 두께는 10 nm 내지 5 μm인, 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 나노필터의 소재는 반도체, 금속, 금속질화물, 반도체질화물, 금속황화물, 반도체황화물, 금속인화물, 반도체인화물, 금속비소화물, 반도체비소화물, 금속산화물, 또는 반도체산화물인, 방법.



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