KR100924514B1 - 단백질 시료의 미세전기탈염장치, 이를 포함하는 랩온어칩및 이들의 적용 방법 - Google Patents

단백질 시료의 미세전기탈염장치, 이를 포함하는 랩온어칩및 이들의 적용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 시료의 수평 흐름에 직교하는 방향으로 전기장을 형성시키는 전극이 연결된 자유흐름 전기영동 챔버를 포함하며, 상기 전기영동 챔버의 양 말단에 각각 주입구 및 배출구가 연결된 것을 특징으로 하는 단백질 시료의 미세전기탈염장치, 이를 포함하는 랩온어칩 및 이들을 적용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 별도의 전처리 과정이 없이 미세전기탈염장치 또는 상기 미세전기탈염장치를 포함하는 랩온어칩 상에서 적은 양의 단백질 시료를 사용하면서도, 단시간에 효율적으로 단백질로부터 염을 제거할 수 있으므로, 고속처리, 고순도 및 높은 재현성으로 원하는 시료의 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다.
미세전기탈염장치, 자유흐름 전기영동 챔버, 랩온어칩, 단백질 정제, 전기장

Description

단백질 시료의 미세전기탈염장치, 이를 포함하는 랩온어칩 및 이들의 적용 방법{A MICROELECTRO­DESALTING DEVICE OF PROTEIN SAMPLE, A LAB­ON­A­CHIP COMPRISING SAID DEVICE AND AN APPLICATION METHOD THEREOF}
도 1은 본 발명의 미세전기탈염과정을 도식화한 개념도이다.
도 2는 본 발명에 사용되는 단백질 시료의 미세전기탈염장치의 평면도 및 단면도를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 단백질 시료의 미세전기탈염장치를 이용하여, 전기장을 변화시키면서 단백질 시료의 거동변화를 나타낸 이미지 그림이다.
도 4는 전기장의 변화에 따른 요소염의 제거효율 및 단백질의 회수정도를 도시한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 단백질 시료의 미세전기탈염장치를 이용하여 90V 전기장 조건에서 탈염과정을 수행한 단백질 시료의 말디토프 질량분석(MALDI-TOF-MS)의 결과이다.
도 6은 본 발명의 단백질 시료의 미세전기탈염장치를 통해 탈염된 융합 단백질의 미세접촉인쇄한 후의 녹색 형광 이미지이다.
도 7은 본 발명의 단백질 시료의 미세전기탈염장치를 통해 탈염된 융합 단백 질의 항원-항체 특이반응 결과를 나타내는 표면자기공명 분석결과이다.
본 발명은 단백질 시료의 미세전기탈염장치(microelectro-desalting device), 이를 포함하는 랩온어칩(lab-on-a-chip) 및 이들을 적용하는 방법에 관한 것이다.
포스트 게놈시대를 맞이하고 있는 현실에서, 방대한 양의 생물정보들을 초고속ㆍ고감도로 분석ㆍ탐색ㆍ활용할 수 있는 새로운 패러다임의 툴(tool)이 요구된다. 이러한 요구에 따라, 최근 생명공학 분야에서 미세유체소자를 이용한 분석기술에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 이와 같은 미세유체소자를 이용한 분석 방법은 적은 양의 시료만으로 단시간에 여러 가지 진단과 검사를 간편하게 수행할 수 있다는 장점이 있어, 차세대 분석 시스템으로 랩온어칩에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
바이오칩(bio-chip)은 유리, 실리콘 또는 플라스틱으로 된 수 cm2 크기의 칩 상에 분석에 필요한 여러 가지 장치들을 마이크로 머시닝 기술을 이용하여 집적시킨 화학 마이크로 프로세서로서, 고속, 고효율, 저비용의 자동화된 분석이 가능하다. 즉, 시료분석에 수반되는 모든 과정들을 연속적으로 처리함으로써, 극미량의 시료에 대해 신속하면서도 정확하게 진단할 수 있게 된다. 이를 통해 시료분석 및 질병진단에 대한 비용이 절감되며, 미량의 시료를 사용하므로 시료 채취의 한계가 있는 경우에도 활용이 가능하다. 또한, 생성되는 폐기물의 양이 매우 작아 환경 친화적인 분석 기술이며, 결과의 재현성과 안전성이 우수하다.
최근에는 분석에 필요한 모든 과정, 즉 용액의 이동, 시료의 반응, 주입, 분리 및 검출 등의 과정이 하나의 칩에서 통합되어 수행될 수 있는 바이오칩에 대한 연구가 진행되고 있다. 바이오칩의 궁극적 목표는 칩 위에서 극소량의 샘플을 작은 칩에서 신속하게 분리하고 최대한 정밀하게 검출함으로써 신약개발을 위한 HTS(high throughput screening) 및 현장진료진단을 구현하는 것이다. 이 기술은 최근 급속히 성장하는 제약 산업 분야에서 신약탐색에 필요한 비용과 시간을 줄일 수 있는 중요한 기술로 부상하고 있다.
샘플 내 세포를 포함한 생물학적 분자의 농축 및 탈염과정은 현재 연구개발 중인 바이오칩을 포함한 바이오칩의 소형화에 큰 장애가 되고 있으며, 대부분 아직까지 칩 외부에서 전처리 과정을 통해 샘플 내의 분석대상물질을 농축 및 정제하고 있다. 이는 추가적인 비용과 시간소모를 유발하고 있다.
생체 분자를 분석대상으로 하는 바이오칩의 시료는 혈액, 조직세포 추출물, 혈청 DNA, 단백질 등 정제된 샘플에서부터 비 정제된 샘플이 될 수 있는데, 현재는 보다 높은 민감도를 가지기 위해서 샘플을 바이오칩 외부에서 1차 전처리과정을 통해서 농축 및 정제과정을 거치는 것이 대부분이다. 전처리과정은 바이오칩을 소형화, 휴대화시키는데 있어서 가장 큰 장애가 되고 있으며, 비용 및 분석시간 소모의 주원인이 되고 있다.
여러 성분이 혼합된 샘플에서 분석 대상 분자를 농축 및 정제할 수 있는 미세전기탈염장치를 바이오칩에 적용함으로써 종래에는 칩외부(off-chip)에서 전처리 과정을 수행하여 분석 샘플을 제조했던 것에 비해서, 분석시간, 비용을 절감할 수 있고, 휴대 가능한 형태의 미소유체 소자를 제조할 수 있다는 효과가 있다.
또한, 단백질 등의 고분자량 생체 시료를 분석하기 위해 현재 많이 사용되는 분석방법 중의 하나가 말디토프 질량분석법이다. 그러나, 겔 전기영동이나 화학적 세포파쇄 등에 의해 분리된 단백질에는 염, 금속이온과 같은 저분자량의 불순물이 많이 포함되어 있어 이들을 제거하지 않으면 질량분석기의 검출 감도가 매우 낮거나 전혀 결과를 얻을 수 없게 된다. 따라서 단백질로부터 불순물을 제거할 수 있는 여러 가지 전처리 방법이 개발되어 왔으나, 이들 방법들은 시간이 오래 걸리고, 전처리에 요구되는 시료의 양이 많다는 등의 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 별도의 전처리 과정이 없이 적은 양의 단백질 시료를 사용하면서도 단시간에 효율적으로 단백질로부터 염을 제거하여, 고속처리, 고순도 및 높은 재현성으로 원하는 시료의 분석을 수행할 수 있는 단백질 시료의 미세전기탈염장치 및 이를 포함하는 랩온어칩을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 미세전기탈염장치 및 랩온어칩을 사용하 여 단백질 시료를 처리하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명, 단백질 시료의 미세전기탈염장치는, 단백질 시료의 수평 흐름에 직교하는 방향으로 전기장을 형성시키는 전극이 연결된 자유흐름 전기영동 챔버(free-flow electrophoretic chamber)를 포함하며, 상기 전기영동 챔버의 양 말단에 각각 주입구(inlet) 및 배출구(outlet)가 연결된 것을 특징으로 한다.
정제하고자 하는 단백질 시료는 자유흐름 전기영동 챔버의 한쪽 말단에 연결되어 있는 주입구를 통하여 주입되는데, 상기 주입구는 바람직하게는 세 개의 마이크로 실린지 펌프에 연결되며, 가운데 펌프를 통하여 단백질 시료가 주입되며, 양쪽의 펌프를 통하여 완충액이 주입된다.
상기 자유흐름 전기영동 챔버 내에는 전극부위에서 발생하는 기포가 챔버 내로 유입되는 것을 방지하기 위한 일정한 형상의 다수의 미세 필러(pillar)가 형성될 수 있다. 이와 같은 미세 필러를 형성하여 둠으로써 시료가 기포의 영향을 받지 않고 원활하게 이동할 수 있다.
상기 자유흐름 전기영동 챔버에는 유체의 삼투 흐름에 의해 시료의 흐름이 변화되는 것을 방지하기 위한 재순환 미세 채널(recycling micro channel)이 형성될 수 있다. 전기장이 인가된 자유흐름 전기영동 챔버 내에서, 주변 pH 변화에 따라 전하를 띠는 단백질은 전하특성이 없는 염과 다른 거동을 보이면서 유체흐름의 분리가 일어나지만, 전기장을 인가하는 초기에는 일시적으로 단백질의 흐름 변화와 병행하여 전하특성이 없는 염이 끌려가는 현상이 관찰되었다. 이러한 현상으로 인한 자유흐름 전기영동 챔버안에서의 유체흐름이 흐트러지지 않고 안정적으로 유지될 수 있도록 재순환 미세채널을 도입하였다.
본 발명, 단백질 시료의 미세전기탈염장치는 도 2에 상세히 묘사되어 있다. 일반적으로, 단백질은 주변의 pH 변화에 따라 전하를 띠는 특성이 있으므로, 상기 미세전기탈염장치에 주입된 단백질 시료는 전기장이 형성된 자유흐름 전기영동 챔버를 통과하는 과정에서 전기장의 세기에 따라 전하 특성이 없는 염과 전하를 띠는 단백질로 분리되면서 자유흐름 전기영동 챔버를 통과하게 된다.
도 1을 참조하여 이를 보다 구체적으로 설명하면, 마이크로 실린지 펌프의 압력 차이를 이용하여 주입된 유체의 흐름은 수력학적 힘(hydrodynamic force; FHD)에 의해 주입구로부터 자유흐름 전기영동 챔버를 통하여 배출구 방향으로 수평으로 흘러가게 된다. 이때 주입구를 지나 전기장이 인가되어 있는 자유흐름 전기영동 챔버 내로 시료가 유입되면서 음전하를 띠는 단백질 시료는 양극(anode electrode)으로 향해 유체의 흐름이 이동하게 되고, 전하를 갖지 않는 염은 농도차이에 의한 확산에 의해 약간의 거동이 있을 뿐 큰 흐름의 변화를 보이지는 않고 수평으로 이동하게 된다. 즉, 전하를 띠는 단백질의 경우에는 아래의 식과 같이 전기장의 힘과 수력학적 힘의 합력에 의한 전기수력학적 힘의 합을 받게 된다.
FEHD = FE + FHD
단백질이 양극으로 편향하는 정도는 전압의 세기가 증가할수록 커지는데, 이는 전하를 띠고 있는 단백질의 끌림 속도(draft velocity; Ud ,i)는 아래의 식과 같이 전기영동 이동상수(electrophoretic mobility; ui)와 인가된 전기장의 세기(FE ,i)의 곱에 비례하여 증가하기 때문이다.
Ud ,i = ui x FE ,i
이러한 특성을 이용하여 전기장이 형성된 자유흐름 전기영동 챔버로 유입된 시료는 단백질과 염으로 각각 분리되어 이동하면서 신속한 단백질 정제가 가능하게 되는 것이다.
전기장에 의해 단백질의 흐름과 염의 흐름을 분리 후, 출구부분에 미세 패턴되어 있는 예를 들어, 10개의 100㎛ 출구채널에서 각 시료의 분획을 얻어서 시료의 탈염정도를 분석하였다.
상기 자유흐름 전기영동 챔버를 통하여 단백질과 염으로 분리되어 배출구 쪽으로 유출되는 정제된 단백질은, 예를 들어 말디토프 질량분석기, 미세접촉프린팅 및 표면자기공명 분석 등에 적용될 수 있다.
본 발명, 단백질 시료의 미세전기탈염장치는 통상의 포토리쏘그래피(photolithography) 공정으로 제조될 수 있으며, 상기 장치의 재질은 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는 폴리디메틸실록산(PDMS)이다.
또한, 본 발명은 상기 미세전기탈염장치를 사용하여 단백질 시료로부터 염을 제거시키는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 방법은 바람직하게는, 과량의 염이 포함된 단백질 시료와 완충액이 세 개의 마이크로 실린지 펌프를 통하여 주입구로 주입되는 단계; 주입된 단백질 시료와 완충액이 자유흐름 전기영동 챔버 내로 흐르는 과정에서 챔버 내에 형성되어 있는 전기장에 의하여 전하를 띠는 단백질과 전하를 띠지 않는 염으로 분리되어 이동되는 단계; 및 정제된 단백질만을 배출구를 통하여 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 미세전기탈염장치 내에서의 시료의 유속은 10~30㎕/분인 것이 바람직하며, 자유흐름 전기영동 챔버 내의 전압은 0~150V인 것이 바람직한데, 상기 유속 및 전압의 범위를 벗어나는 경우에는 고도로 정제된 단백질을 분리하기 어렵다.
정제된 단백질은, 예를 들어 말디토프 질량분석기, 미세접촉 프린팅, 표면자기공명을 이용하여 목적 단백질의 활성 및 항원-항체 특이반응 등의 바이오센서 기술을 사용한 분석에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미세전기탈염장치를 포함하는 랩온어칩을 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 랩온어칩에 적용될 수 있는 기술의 예는 특별히 한정되지는 않으며, 당분야에서 통상적으로 알려진 기술이면 어떠한 것이라도 적용될 수 있으며, 바람직하게는 단백질 시료의 고속검색(Highthroughput screening), 미세패턴제조(Micro-contactprinting), 바이오센서(Biosensor) 등이다. 상기와 같은 적용 기술들은, 예를 들어 식품 및 제약 분야에서 빠른 시간 내에 여러 생체분자의 특성을 분석해는 연구에 적용될 수 있다.
이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
[ 실시예 ]
1. 미세전기탈염장치의 제조
미세전기탈염장치는 반도체 제조에 사용되는 포토리쏘그래피 공정을 이용하여 제조하였다. 리플리커를 제조하기 위하여, 먼저 실리콘 기판 위에 네거티브 포토레지스트(negative photoresist)를 40㎛의 두께로 코팅한 후, 80℃에서 15분 동안 가열하여 코팅된 포토레지스트에 함유되어 있는 용매를 제거하고, 포토레지스트층을 형성시켰다. 포토레지스트층을 형성한 다음, 일반적으로 포토리쏘그래피 공정에 쓰이는 필름 마스크를 이용하여, 포토레지스트층을 소정 패턴으로 식각하여 몰드를 제조하였다. 다음으로, PDMS 폴리머와 경화제(curing agent)를 중량비 10:1로 혼합하여 몰드에 부은 다음, 몰드를 진공오븐에 넣고 30분 동안 진공상태를 유지하며 기포를 제거하였다. 70℃ 오븐에서 2시간 동안 가열하여 경화시킨 다음, 경화된 PDMS 리플리커를 오븐에서 꺼내어 몰드로부터 분리하고, 표면을 플라즈마로 처리 후, 유리에 접착시켰다.
2. 단백질 시료 및 완충액
단백질 시료는 GBP-EGFP-6His을 이용하였다. 단백질 샘플은 pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)의 DNA게놈을 이용하여 PCR 증폭을 이용해서 실험에 적용하였다. GBP-EGFP-6His 단백질 시료의 농도는 50㎍/㎖의 단백질 시료를 8M 요소에 혼합하여 염이 과량으로 포함된 단백질 샘플로 이용하였다. 실험에 사용된 완충용액은 10mM Tris-HCl(pH 8.0)를 이용하였다.
3. 자유흐름 전기영동 챔버 내의 전기장의 변화에 따른 단백질 시료의 거동 변화 측정
상기 준비된 미세전기탈염장치를 사용하여 하여, 전기장(0~150V)을 변화시키면서 GBP-EGFP-6His 단백질 시료의 거동변화 관찰하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 전기장의 세기가 증가할수록 단백질의 양극으로의 편향 정도는 커짐을 알 수 있었다.
4. 자유흐름 전기영동 챔버 내의 전기장의 변화에 따른 염의 제거 효율 및 단백질 회수 정도 측정
상기 3과 동일한 방법(전기장 0~150V)으로 GBP-EGFP-6His 단백질 시료를 미세전기탈염장치에 적용한 후 단백질 및 염을 각각 회수하였다. 단백질의 농도분석은 Lowry방법을 이용하여 분석하였으며, 요소의 농도분석은 Hypersil NH2-2 APS-2(Phenomenex, USA)컬럼을 이용하여 HPLC로 흡광도 195nm에서 분석하였다. 이동상의 조건은 acetonitrile/distilled water (85:15, v/v)을 이용하였고, 이동상의 유속은 1.0㎖/분이었다. 도 4에서 보는 바와 같이 전압이 세질수록 단백질 시료로부터 요소의 제거효율이 증가하고 있음을 확인할 수 있다. 반면에, 단백질의 회수율은 감소함을 볼 수 있었다.
5. 정제된 GBP - EGFP -6 His 단백질의 질량 분석
챔버 내의 전기장의 세기를 90V로 하여 GBP-EGFP-6His 단백질을 정제하고, 말디토프 질량분석을 수행하였다. 분석기로 MALDI-TOF-MS(Shimadzu, Axima CFR V2.1.0, Japan)를 이용하였고, 매트릭스(matrix)는 sinapinic acid를 이용하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 과량의 요소를 포함하고 있는 단백질 시료의 경우 단백질의 질량분석 피크가 확인되지 않았지만, 본 발명의 미세전기탈염장치를 사용하여 염을 제거한 단백질의 경우 단백질 피크가 뚜렷하게 확인되고 있음을 볼 수 있었다.
6. 정제된 GBP - EGFP -6 His 단백질의 미세패턴 형광이미지 실험
상기 5와 동일한 방법으로 단백질 시료를 정제하여, 50㎛ 폭의 선과 10㎛의 사각형 미세패턴 형광이미지를 관찰하였다. 도 6에서 보는 바와 같이, 염이 제거된 단백질이 금 금속표면에 올바르게 결합하고 있음을 형광이미지를 통해 관찰할 수 있었다.
7. 정제된 GBP - EGFP -6 His 단백질의 표면자기공명 실험
상기 5와 동일한 방법으로 단백질 시료를 정제하여, 표면자기공명 실험을 수행하였다. 도 7에서 굵은 실선은 탈염된 단백질 시료를 이용한 표면자기공명 결과이며, 가는 실선은 초기 과량의 요소를 포함하고 있는 단백질 시료의 표면자기공명 결과를 나타내고 있다. 도 7에서 보는 바와 같이 탈염된 단백질 시료의 경우, 금 금속표면에 단백질이 올바르게 결합하고 있음을 확인할 수 있으며, 세척(W) 단계에서도 단백질의 결합이 떨어지지 않고 안정적으로 유지하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 항원-항체반응에서도 탈염된 단백질 시료에서는 반응이 효과적으로 진행되고 있음을 그래프 상에서 확인할 수 있었다. 반면에, 초기시료인 과량의 요소를 함유하고 있는 단백질 시료의 경우 금 금속표면에 단백질 결합이 이루어지지 않았고, 따라서 항원-항체 반응도 일어나지 않았다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 의한 미세전기탈염장치 또는 이를 포함하는 랩온어칩을 단백질 시료에 적용하면, 별도의 전처리 과정이 없이 적은 양의 시료를 사용하면서도, 단시간에 효율적으로 단백질로부터 염을 제거할 수 있으므로, 고속처리, 고순도 및 높은 재현성으로 원하는 시료의 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다.

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  7. 단백질 시료의 수평 흐름에 직교하는 방향으로 전기장을 형성시키는 전극이 연결된 자유흐름 전기영동 챔버를 포함하며,
    상기 자유흐름 전기영동 챔버의 양 말단에 각각 주입구 및 배출구가 연결되고,
    상기 자유흐름 전기영동 챔버 내에는 전극부위에서 발생하는 기포가 챔버 내로 유입되는 것을 방지하기 위하여 다수의 미세 필러가 형성된 단백질 시료의 미세전기탈염장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 랩온어칩.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 미세전치탈염장치에 분석하고자 하는 단백질 시료의 고속검색장치가 연결된 것을 특징으로 하는 랩온어칩.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 미세전치탈염장치에 분석하고자 하는 단백질 시료의 패턴제조장치가 연결된 것을 특징으로 하는 랩온어칩.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 미세전기탈염장치에 바이오센서가 연결된 것을 특징으로 하는 랩온어칩.
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