WO2011065747A2 - 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법 - Google Patents

나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법 Download PDF

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WO2011065747A2
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김민곤
신용범
성윤주
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한국생명공학연구원
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates to a high-speed detection method of microorganisms using nanoparticles, and more particularly, to a nanoparticle to which the antibody specifically bound to the microorganism to be detected is immobilized to the microorganism to be detected to perform an immunological reaction, and a film for aggregation. After passing through the microorganisms gathered in one place, and captures the microorganisms that caused the immune reaction and the immobilized nanoparticles in the capture membrane, the present invention relates to a high-speed microbial detection method and microbial detection apparatus for measuring the presence and concentration of microorganisms.
  • Rapid measurement of microorganisms is a very important technique for diagnosing food poisoning bacteria, environmentally harmful bacteria, infectious organisms, and pathogenic viruses.
  • colony, DNA probe, and immunoassay methods are widely used as a method for examining the presence and concentration of commonly used pathogenic substances (microorganisms, proteins, etc.) (Jay JM. Modern Food Microbiology, 1986, 3rd, ed., P 95, Van Nostrand Reinhold Co., New York; Tenover FC., DNA Probes for Infectious Diseases, 1989, p 53 CRC Press, Boca Raton).
  • the colony method is a method of taking samples and culturing them in a selective medium so that only the microorganisms to be detected can survive, and then measuring the number of colonies formed by the microorganisms. This is disadvantageous because it takes a long time to select a medium for each microorganism.
  • DNA probe method includes real-time PCR (polymerase chain reaction) analysis method and nucleic acid binding analysis method (nucleic acidhybridization) method. It is a method of detection. This method has the advantage that the test time is shorter than that of the colony method, but expensive PCR equipment is used, and when detecting a small amount of microorganisms, it is necessary to perform a separate culture step to achieve high sensitivity (Ninet, B et al. , Appl Environ Microbiol, 58: 4055-4059,1992). If the incubation step is not included, dead cells can be detected, resulting in inaccurate results. In addition, when PCR is performed, false-positive is very frequent, which may increase the error range of detection and decrease the reliability of the analysis.
  • Immunoassays utilize antigen-antibody binding reactions, for example, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) using antibodies that specifically react to the surface antigens of the microorganisms to be detected are widely performed.
  • ELISAs enzyme-linked immunosorbent assays
  • the method is recognized as an alternative to the above two methods because it shows very high sensitivity in a short time. This method can minimize the occurrence of this problem because the antibody-producing cells (hybridoma) once developed allow continuous antibody production, but have the disadvantage of requiring high purity antigens, expensive equipment and long experiment time.
  • IMS immunomagnetic separation
  • SPR sensor technology detects microorganisms by using a phenomenon that changes the signal when a biological material such as protein is bound to the sensor surface. Compared with other detection methods, the detection time is shorter and the analysis procedure is simpler, but the antibody immobilized on the sensor surface Since the pathogenic microorganisms in the sample are much larger in size, the binding efficiency of the microorganisms to the antibodies by the immune response in the fluid flow of the SPR system is low. As a result, due to inefficient immune response and surface immobilization, the detection limit of pathogenic microorganisms is formed at a high level.
  • the present inventors have made diligent efforts to solve the above problems, and confirmed that the microorganism detection assay with high sensitivity is possible by using an immunoreaction with a fixed nanoparticle and a membrane filtration method.
  • the present invention has been completed.
  • the main object of the present invention is to provide a high-speed detection method of microorganisms using nanoparticles and membrane filtration method to which antibodies specifically bind to a microorganism to be detected.
  • Another object of the present invention is to provide a high-speed detection apparatus of a microorganism comprising nanoparticles to which an antibody specifically binding to a microorganism to be detected is immobilized.
  • the present invention also comprises a sample reaction unit comprising a nanoparticle is fixed to the antibody specifically binding to the microorganism to be detected; A film for agglomeration of microorganisms for aggregating a microorganism to be detected by receiving a reaction solution from the sample reaction unit; A microorganism capture filtration membrane that selectively collects and separates the aggregated microorganisms through the microorganism aggregation film; And it provides a microorganism detection device comprising a detection unit for confirming the presence or concentration of the microorganism.
  • 1 is a conceptual diagram capable of measuring the concentration of microorganisms by selective binding of the AuNP-antibody conjugate and the microorganism.
  • Figure 2 shows the result of using the antibody conjugates of AuNP- selective antibody to Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus by measuring the concentration of (A: 10 5 cfu, B : 10 4 cfu, C: 10 3 cfu, D: 10 2 cfu , E: without cells).
  • Figure 3 shows the results of cross-reaction with other fungi against the AuNP-antibody conjugate of the antibody selective to Staphylococcus aureus (A: 10 6 cfu S. aureus cells, B: 10 6 cfu E. coli cells, C: 10 6 cfu Salmonella cells, D: 10 6 cfu Listeria monocytogenes cells, E: without cells).
  • Figure 4 shows the results of cross-reaction in other strains using AuNP-antibody conjugates of antibodies selective for Listeria monocytogenes (AC: when reacted with AuNP-BSA conjugates, A: 10 5 cfu Listeria monocytogenes cells, B: AuNP-anti- Listeria monocytogenes , C: 10 5 cfu Listeria monocytogenes cells, DG: When reacted with AuNP-antibody conjugates D: 10 5 cfu Salmonella typimurium cells, E: 10 5 cfu Escherichia coli cells, F: 10 5 cfu Staphylococcus cells, G: 10 5 cfu Listeria monocytogenes cells).
  • AC when reacted with AuNP-BSA conjugates
  • A 10 5 cfu Listeria monocytogenes cells
  • B AuNP-anti- Listeria monocytogenes
  • C 10 5 cfu Listeria monocytogenes cells
  • DG When reacted with
  • 5 is a conceptual diagram capable of measuring the concentration of microorganisms by selective binding of MNP-antibody conjugates and microorganisms.
  • Figure 6 using MNP- antibody conjugates of the selective antibody to Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus is the measurement result of the concentration of (A: the absence of bacteria, B: 10 5 cfu, C : 10 6 cfu).
  • FIG. 7 is a photograph of a film-capturing filtration membrane for microbial aggregation prepared using a silver (Ag) screen printing paste.
  • the present invention provides a method for preparing a microorganism comprising: (a) mixing and reacting a nanoparticle-antibody conjugate specifically binding to a microorganism to be detected and a sample containing the microorganism to be detected; (b) sequentially passing the reaction solution through the microbial aggregation film and the microorganism capture filtration membrane to permeate the nanoparticle-antibody conjugate that has not reacted with the microorganism, and selectively separating the nanoparticle-antibody-microorganism complex; And (c) measuring the presence or concentration of the nanoparticle-antibody-microorganism complex trapped in the capture filtration membrane.
  • the microorganism to be detected may be food poisoning bacteria, viruses, infectious bacteria and the like, for example, E. coli, Listeria monobytogenes , Salmonella typhimurim , Staphylococcus aureus ), Norovirus, and the like.
  • the antibody that specifically binds to the microorganism to be detected can be used without limitation as long as it is an antibody known to specifically bind to microorganisms known in the art, for example, to detect a Staphylococcus species.
  • ab20002 Abcam
  • an antibody that specifically binds to the Staphylococcus species can be used.
  • the nanoparticles may be characterized in that the metal nanoparticles, quantum dot nanoparticles (Quantum Dot Nanoparticle) or magnetic nanoparticles (Magnetic Nanoparticle; MNP), the metal is gold (Au), silver (Ag) It may be selected from the group consisting of, and copper (Cu).
  • nanoparticle refers to an ultrafine particle having a size of about 1 nm to about 200 nm.
  • Very small sized nanoparticles have different properties from ordinary mass material. Nanoparticles have a significantly increased specific surface area compared to conventional materials. This high specific surface area has a different surface effect than conventional materials.
  • the particle size decreases, the number of molecules located on the surface increases. When the particle diameter is 5 nm, 50% of the molecules constituting the particle are located on the surface, and when the particle size is 2 nm, the ratio reaches 90%.
  • nanoparticles Because of the relatively high proportion of molecules on the surface, nanoparticles have a larger ratio of surface energy to binding energy than conventional materials.
  • the ratio of surface energy to binding energy increases from 5% to about 30% as the particle size decreases from 20 nm to 1 nm.
  • the atoms that make up a particle are in a stable state of energy where the attraction and repulsion are in equilibrium by interactions between surrounding atoms. Atoms on the surface, however, are in a high energy state because only the attraction of internal atoms exists. Due to the surface effect, the nanoparticles have properties such as surface activity, melting point drop, and low temperature sintering properties seen in the catalyst or surface reaction of the catalyst.
  • nano gold particles having a size of 20 nm are used, but the present invention is not limited thereto. It is apparent to those skilled in the art that nano gold particles may have any particle size that does not interfere with the immune response between the antibody and the analyte. . It is characterized in that it has a particle diameter of 5 to 100 nm size.
  • the nanoparticles may use magnetic nanoparticles. Due to the characteristics of the magnetic nanoparticles, in the high-speed detection method of microorganisms, after mixing and reacting samples, the magnetic nanoparticle-antibody-microorganism complex in the reaction solution is separated by a magnet, and then the separated complex is buffered. Re-suspension in solution can be further included to allow for more complete detection.
  • the present invention when detecting microorganisms using magnetic nanoparticles, after reacting by mixing the sample containing the magnetic nanoparticle-antibody conjugate and the microorganism to be detected, after separation using a magnet at room temperature The supernatant was removed, resuspended in a buffer solution, and sequentially passed through the microbial aggregation film and the microbial capture filtration membrane to identify nanoparticle-antibody-microorganism complexes trapped in the filtration membrane. It was also confirmed that possible. As a result, it was confirmed that separation and detection to obtain a target product from a suspension solution in which various impurities are mixed using magnetic force can be more preferably performed.
  • the nanoparticles may be used as quantum dot (quantum dot) nanoparticles, it can be characterized by detecting two or more microorganisms at the same time.
  • the quantum dot nanoparticles have unique optical characteristics as semiconductor nanoparticles. This results in powerful fluorescence of different wavelengths, even if the particle size is changed little by little or the composition is changed. After absorbing light, it emits fluorescent light with a wavelength different from that of the absorbed light. Therefore, when the quantum dot nanoparticles are used as the nanoparticles to which the antibody specifically binding to the microorganism to be detected is immobilized in the present invention, two or more microorganisms can be detected at the same time. Preparation of the quantum dot nanoparticles may be by a method known in the art.
  • the microbial aggregation film may be characterized in that it has a plurality of holes having a diameter of 0.1 to 5 mm.
  • the flocculating film is a device through which microorganisms pass before passing through the filtration membrane, and induces the microorganisms to concentrate in one place so that a larger signal can be obtained.
  • Existing immunofiltration was limited to detect 10 5 cfu microorganisms, but in one embodiment of the present invention it was confirmed that it can detect 10 2 cfu microorganisms using the film for aggregation.
  • the microbial aggregation film may be selected from the group consisting of PDMS (polydimethylsiloxane), adhesive polymer and aluminum tape, rubber and latex, and screen printing paste.
  • the microbial aggregation film is a film prepared by applying a screen printing paste such as silver paste or carbon paste in a shape having a predetermined size hole in the capture filter membrane by the screen printing technique.
  • a screen printing paste such as silver paste or carbon paste
  • the aggregation film and the capture filtration membrane can be integrally formed, and the screen printing technique can use a method well known in the art.
  • screen mesh woven from nylon, polyester or stainless steel is fixed to a frame such as wood or aluminum, and a valve is made on the surface by manual or photochemical methods to create a valve. It is a technique that a paste is printed on the printed material under the plate by blocking the part of the film and putting the screen printing paste into it, and pressing and moving the inside of the screen with a spatula called a squeegee. have.
  • the pore size of the capture filtration membrane is characterized in that 100 nm-10 ⁇ m.
  • the nanoparticles immobilized with the antibody not bound to the microorganism pass through the capture membrane, and the microorganisms not bound to the nanoparticles with the antibody immobilized do not show a signal even if they are caught by the capture membrane. Therefore, only the microorganisms in which the antibody binds to the immobilized nanoparticles show the inherent color, fluorescence, etc. of the nanoparticles immobilized on the capture filtration membrane.
  • a capture filtration membrane having a pore size of 1.2 ⁇ m but is not limited to those skilled in the art, it is obvious to those skilled in the art, preferably from 100 nm to 100 microorganisms are captured by the reaction with the nanoparticles immobilized antibody A capture filtration membrane selected from pore sizes between 10 ⁇ m can be used.
  • the capture filtration membrane may be a capture filtration membrane selected from the group consisting of nitrocellulose, polycarbonate, nylon, polyester, cellulose acetate, polysulfone and polyethanesulfone.
  • the step of selectively separating the step (b) may be characterized by using a vacuum, centrifugation or absorption method.
  • the nanoparticle-antibody-microorganism complex when it is filtered through the flocculating film to the capture filtration membrane, it may be selectively separated by applying a vacuum, centrifugation, or absorption by the filtration membrane.
  • a vacuum is applied to the nanoparticle-antibody-microorganism complex so as to be well adsorbed on the filtration membrane, but various conventionally known adsorption methods may be used.
  • magnetic nanoparticles can be analyzed by excluding a microorganism that is not analyte by selectively attracting the complex using a magnet.
  • the measurement of the step (c) is characterized by measuring using a CCD camera or absorbance.
  • the nanoparticle-antibody-microorganism complex spot was identified through a CCD camera, but in addition, nanoparticles such as gold and silver exhibited an intrinsic absorbance in the UV-Vis region among the wavelengths of light due to surface plasmon phenomenon. do. Therefore, the nanoparticles according to the present invention are nanoparticles that absorb light at a specific wavelength, and can measure the concentration of microorganisms according to the degree of absorbance by measuring the absorbance at a wavelength according to the characteristics of the nanoparticles.
  • a sample reaction unit including a nanoparticle is fixed to the antibody specifically binding to the microorganism to be detected;
  • a film for agglomeration of microorganisms which aggregates the microorganisms to be detected by receiving a reaction solution from the sample reaction unit;
  • a microorganism capture filtration membrane that selectively collects and separates the aggregated microorganisms through the microorganism aggregation film;
  • a microorganism detection apparatus including a detection unit for confirming the presence or concentration of the microorganisms.
  • the sample reaction part means a portion including nanoparticles to which an antibody that specifically binds to the detection target microorganism is fixed, which reacts with the sample containing the detection target microorganism.
  • the sample reaction unit may be any device as long as it is a device capable of mixing the two materials. For example, an experiment tube may be used.
  • the detection unit may be any device capable of measuring the presence or concentration of the nanoparticles-antibodies-microorganisms, but CCD image measurement, CMOS image measurement, CCD fluorescence measurement, PMT fluorescence measurement, etc. are preferable. Do.
  • it may be a CCD camera or a device for measuring absorbance.
  • the characteristics of the nanoparticles, the microbial aggregation film and the microorganism capture filtration membrane are as described above.
  • the microorganism to be detected may be food poisoning bacteria, viruses, infectious bacteria, and the like, for example, E. coli, Listeria monobytogenes , Salmonella typhimurim , Staphylococcus aureus ), Norovirus, and the like.
  • the microorganism detection device may be configured to separate the sample reaction unit, the aggregation film, the capture filtration membrane, the detection unit, or may be integrally formed.
  • the film may be a film prepared by applying a screen printing paste such as silver paste or carbon paste in a shape having a predetermined size hole in the capture filtration membrane by a screen printing technique.
  • a screen printing paste such as silver paste or carbon paste in a shape having a predetermined size hole in the capture filtration membrane by a screen printing technique.
  • Microbial aggregation film was prepared by the following method.
  • the PDMS solution (Sylgard 184A, Dow Corning, USA) and the curing agent (Sylgard 184B, Dow Corning, USA) are mixed in a ratio of 10: 1 and poured into a flat petri dish 150 mm in diameter. And the bubble in a liquid mixture is removed using a vacuum pump, and it hardens
  • Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium were inoculated into the BHI (brain heart infusion) broth and incubated in a shaking incubator at 37 ° C for 18-24 hours.
  • Escherichia coli was inoculated in LB (Luria Bertani) broth and Staphylococcus aureus in NB (nutrient broth) and cultured under the same conditions.
  • cfu colony forming unit
  • each solid plate medium was diluted in 10 5 to 10 9 steps, inoculated and inoculated with 100 ⁇ L of the culture solution, and then incubated at 37 ° C. for 16 to 24 hours to be formed. The colonies were counted and then multiplied by the dilution factor to determine viable counts.
  • the absorbance was measured at 600 nm wavelength with an appropriate amount in the liquid medium of the culture in the culture of the bacteria.
  • AuNP-conjugate solution was successfully prepared.
  • 1 is a conceptual diagram which can measure the concentration of microorganisms by the selective binding of such AuNP-antibody conjugates and microorganisms.
  • the injection of the mixture into the tool of B causes the microorganisms to be filtered out, and the unreacted AuNP-antibody conjugate passes, as in A. Only microorganisms with selective binding can identify AuNP color.
  • the capture filtration membrane was dried by applying a 1% BSA solution (dissolved in distilled water) to a nitrocelluolose (NC) membrane (Millipore) having a pore size of 1.2 ⁇ m.
  • NC nitrocelluolose
  • the NC membrane was placed on a filter mounted on a branched 100 mL Erlenmeyer flask, and the PDMS film prepared in Example 1 was covered on the NC membrane.
  • the concentration of Staphylococcus aureus was confirmed by passing the mixed solution of the AuNP-antibody conjugate and Staphylococcus aureus through a PDMS film hole while vacuuming through the branches of the flask.
  • the AuNP-antibody conjugate was used to change only the type of bacteria according to the same procedure as in Experimental Example 3-2. The experiment was conducted.
  • AuNP was not found in Listeria monocytogenes, Salmonella typimurium, and Escherichia coli , and it was confirmed that AuNP was selectively expressed against Staphylococcus aureus (A: 10 6 cfu S. aureus cells, B: 10 6 cfu E. coli cells, C: 10 6 cfu Salmonella cells, D: 10 6 cfu Listeria monocytogenes cells, E: without cells).
  • Staphylococcus aureus A: 10 6 cfu S. aureus cells
  • B 10 6 cfu E. coli cells
  • C 10 6 cfu Salmonella cells
  • D 10 6 cfu Listeria monocytogenes cells
  • E without cells
  • the AuNP-antibody conjugate of Listeria monocytogenes and the selective antibody was used. The experiment was carried out by changing only the type of bacteria according to the same procedure as 2 and 3-3.
  • the MNP-conjugate solution was prepared successfully.
  • 5 is a conceptual diagram which can measure the concentration of the microorganism by the selective binding of the MNP-antibody conjugate and the microorganism.
  • the MNP-antibody conjugate and the sample are mixed and reacted to form a form like A, the mixture is collected by a magnet, and then the solution suspended in an aqueous solution is injected into the tool of B to filter out microorganisms and not reacted.
  • the MNP-antibody conjugate passes through, and the microorganism with selective binding as in A can identify the MNP color.
  • Example 4 10 ⁇ L (0, 10 5 , 10 6 cfu) of a solution in which Staphylococcus aureus cultured by the method described in Example 2 was suspended in a 0.1% BSA (dissolved in PBS-0.05% Tween 20 buffer) solution and Example 4- 30 ⁇ L of the MNP-anti- Staphylococcus aureus (Abcam) conjugate solution prepared by the method of 1 and 160 ⁇ L of 0.1% BSA (dissolved in PBS-0.05% Tween 20 buffer) solution were mixed and gently shaken for 30 minutes. After 30 minutes, the magnetic nanoparticle complex reacted with Staphylococcus aureus using a magnet at room temperature was separated by a magnet for 5 minutes, and then the supernatant was removed. 200 ⁇ L of 0.1% BSA (dissolved in PBS-0.05% Tween 20 buffer) solution was added and mixed.
  • 0.1% BSA dissolved in PBS-0.05% Tween 20 buffer
  • the capture filtration membrane was dried by applying a 1% BSA solution (dissolved in distilled water) to a nitrocelluolose (NC) membrane (Millipore) having a pore size of 1.2 ⁇ m.
  • NC nitrocelluolose
  • the NC membrane was placed on a filter mounted on a branched 100 mL Erlenmeyer flask, and the PDMS film prepared in Example 1 was covered on the NC membrane.
  • the concentration of Staphylococcus aureus was confirmed by passing the mixed solution of the MNP-antibody conjugate and Staphylococcus aureus through a PDMS film hole while vacuuming through the branches of the flask.
  • the silver paste was applied to the small pore side of the polysulfone membrane (Pall life sciences, 0.45 ⁇ m pore). Screen printing was done.
  • the microbial high speed detection method and apparatus using the nanoparticles of the present invention can be usefully used for economical and simple detection of the microorganism to be detected.
  • the present invention is economical and simple by using nanoparticles immobilized with an antibody that specifically binds to a microorganism to be detected, so that nanoparticles can be immediately identified without undergoing a second reaction of a complex and time-consuming detection agent. It is effective to measure the presence and concentration of microorganisms.
  • the conventional immunofiltration method was able to measure up to 10 5 cfu microorganisms, but the present invention can measure up to 10 2 cfu is effective in measuring a small amount of microorganisms.

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Abstract

본 발명은 나노입자를 이용한 미생물 고속 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 검출 대상 미생물에 가하여 면역반응을 시키고, 응집용 필름을 통과시켜 미생물을 한곳에 모이게 한 후, 포획용 여과막에서 항체가 고정된 나노입자와 면역반응을 일으킨 미생물을 포획하여 미생물의 유무 및 농도를 측정하는 미생물 고속 검출방법 및 미생물 검출 장치에 관한 것이다. 본 발명은 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 이용함으로써, 기존의 검출 방법에 비해, 경제적이고 간단하게 미생물의 유무 및 농도를 측정할 수 있으며, 감도가 우수하여 적은 양의 미생물을 측정하는데 효과적이다.

Description

나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법
본 발명은 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 검출 대상 미생물에 가하여 면역반응을 시키고, 응집용 필름을 통과시켜 미생물을 한곳에 모이게 한 후, 포획용 여과막에서 항체가 고정된 나노입자와 면역반응을 일으킨 미생물을 포획하여 미생물의 유무 및 농도를 측정하는 미생물 고속 검출방법 및 미생물 검출 장치에 관한 것이다.
미생물의 신속한 측정은 식중독균 진단, 환경 유해균 측정, 감염균 측정, 병원성 바이러스 진단 등에 매우 중요한 기술이다. 일반적으로 많이 사용되는 병원성 물질 (미생물, 단백질 등)의 유무 및 농도를 검사하기 위한 방법으로는 콜로니법, DNA 탐침(probe)법, 면역분석법 등이 많이 이용되고 있다(Jay JM. Modern Food Microbiology, 1986, 3rd, ed., p 95, Van Nostrand Reinhold Co., New York; Tenover FC., DNA Probes for Infectious Diseases, 1989, p 53 CRC Press, Boca Raton).
콜로니법은 시료를 채취하여 검출하고자 하는 미생물만이 생존할 수 있게 성분을 조성한 선택배지에서 배양한 후, 미생물이 형성하는 콜로니의 수를 측정하는 방법으로, 이 방법은 매우 정확하지만 측정에 오랜 시간이 소요되며 각각의 미생물에 대한 배지의 선택에 어려움이 있다는 단점이 있다.
DNA probe법은 실시간 PCR(중합효소연쇄반응, polymerase chain reaction) 분석 방법 및 핵산 결합 분석 방법(nucleic acidhybridization)을 포함하는 방법으로서, 미생물을 물리화학적으로 파괴한 후 세포 안의 DNA를 핵산 접합 반응에 의해 검출하는 방법이다. 이 방법은 콜로니법과 비교하여 검사 시간이 짧은 장점을 가지고 있지만 고가의 PCR 장비가 사용되고 적은 양의 미생물 검출 시, 높은 민감도를 달성하기 위해서 별도로 배양을 하는 단계를 병행해야 한다(Ninet, B et al., Appl Environ Microbiol, 58:4055-4059,1992). 만일 배양 단계가 포함되지 않는다면, 죽은 세포들이 검출될 수 있는데, 이로 인해 정확하지 않은 결과가 나타나게 된다. 또한 PCR을 수행할 경우 거짓-양성(false-positive)이 매우 빈번하여 검출의 오차 범위가 증가하고 분석의 신뢰도를 감소시킬 가능성을 가지고 있다.
면역분석법은 항원-항체 결합 반응을 이용한 것으로 예컨대, 검출하고자 하는 미생물의 표면 항원에 특이적으로 반응하는 항체를 이용한 효소 결합 면역 흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA)이 널리 수행되어지는데, 이 방법은 짧은 시간에 매우 높은 민감도를 나타내므로 상기한 두 방법의 대체 방법으로 인식되고 있다. 이 방법은 일단 개발된 항체 생산 세포 (hybridoma)는 지속적인 항체 생산을 가능하게 하므로 이 문제의 발생을 최소화할 수 있지만 고순도의 항원, 고가의 장비 및 긴 실험 시간을 필요로 하는 단점이 있다.
또 다른 항체에 기초한 분석 방법은 면역자기분리(immunomagnetic separation, IMS) 방법인데, 이 방법은 농축 시간을 단축시킬 수 있고, 자기 입자들이나 비드(bead)에 결합된 특정 항체들을 이용함으로써 박테리아를 선택적으로 포집할 수 있다(Lynch, MJ et al., J Microbiol Methods 58:285-288, 2004; Notermans, S et al., Int J Food Microbiol, 12:91-102, 1991). IMS 는 선택적인 표적 유기체, 단백질 및 핵산을 포집하고 응축시키기 위해 사용된다(Favrin, SJ et al., Int J Food Microbiol, 85:63-71, 2003; Feng P., ASM press, Washington D.C., 2001). 하지만 항체에 기초한 다른 분석 방법과 마찬가지로, 응축 단계를 필요로 하며 적은 양의 시료에 사용되도록 제한되는 단점이 있다.
SPR 센서 기술은 단백질과 같은 생체물질이 센서 표면에 결합될 경우 신호 변화를 일으키는 현상을 이용하여 미생물을 검출하는 방법으로 다른 검출방법에 비하여 검출 시간이 짧고 분석절차가 간단하지만 센서 표면에 고정화된 항체보다 시료의 병원성 미생물의 크기가 상대적으로 훨씬 크므로 SPR 시스템의 유체 흐름 속에서 면역 반응에 의한 미생물의 항체에 대한 결합 효율이 낮게 나타난다. 결국 비효율적 면역 반응 및 표면 고정화로 인하여 병원성 미생물의 검출한계는 높은 수준으로 형성되는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자와의 면역반응 및 멤브레인 여과법을 이용하여 고감도의 미생물 검출 분석이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 주된 목적은 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자 및 멤브레인 여과법을 이용한 미생물의 고속 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 포함하는 미생물의 고속 검출 장치를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, (a) 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 나노입자-항체 접합체 및 검출 대상 미생물이 함유된 시료를 혼합하여 반응시키는 단계; (b) 상기 반응액을 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜, 미생물과 반응하지 않은 나노입자-항체 접합체를 투과시키고, 나노입자-항체-미생물 복합체를 선택적으로 분리시키는 단계; 및 (c) 상기 포획용 여과막에 포획된 나노입자-항체-미생물 복합체의 유무 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 포함하는 시료반응부; 상기 시료반응부로부터 반응액을 수용하여 검출 대상 미생물을 응집하는 미생물 응집용 필름; 상기 미생물 응집용 필름을 통과하여 응집된 미생물들을 포획하여 선택적으로 분리하는 미생물 포획용 여과막; 및 상기 미생물의 유무 또는 농도를 확인하기 위한 검출부를 포함하는 미생물의 검출장치를 제공한다.
도 1은 AuNP-항체 접합체와 미생물의 선택적인 결합에 의해 미생물의 농도를 측정할 수 있는 개념도이다.
도 2는 Staphylococcus aureus에 선택적인 항체의 AuNP-항체 접합체를 사용하여 Staphylococcus aureus를 농도별로 측정한 결과이다 (A: 105 cfu, B: 104 cfu, C: 103 cfu, D: 102 cfu, E: 세포가 없는 경우).
도 3은 Staphylococcus aureus에 선택적인 항체의 AuNP-항체 접합체에 대해서 다른 균류와 교차반응이 일어나는지 확인한 결과이다 (A: 106 cfu S.aureus cells, B: 106 cfu E.coli cells, C: 106 cfu Salmonella cells, D: 106 cfu Listeria monocytogenes cells, E: 세포가 없는 경우).
도 4는 Listeria monocytogenes에 선택적인 항체의 AuNP-항체 접합체를 사용하여 다른 균주에서 교차반응이 일어나는지 확인한 결과이다 (A-C: AuNP-BSA 접합체와 반응한 경우, A:105 cfu Listeria monocytogenes cells, B: AuNP-anti-Listeria monocytogenes, C: 105 cfu Listeria monocytogenes cells, D-G: AuNP-항체 접합체와 반응한 경우 D: 105 cfu Salmonella typimurium cells, E: 105 cfu Escherichia coli cells, F: 105 cfu Staphylococcus cells, G: 105 cfu Listeria monocytogenes cells).
도 5는 MNP-항체 접합체와 미생물의 선택적인 결합에 의해 미생물의 농도를 측정할 수 있는 개념도이다.
도 6은 Staphylococcus aureus에 선택적인 항체의 MNP-항체 접합체를 사용하여 Staphylococcus aureus 농도에 따른 측정 결과이다 (A: 균이 없는 경우, B: 105 cfu, C: 106 cfu).
도 7은 은(Ag) 스크린 프린팅용 페이스트를 이용하여 제조한 미생물 응집용 필름-포획용 여과막을 촬영한 사진이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 나노입자-항체 접합체 및 검출 대상 미생물이 함유된 시료를 혼합하여 반응시키는 단계; (b) 상기 반응액을 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜, 미생물과 반응하지 않은 나노입자-항체 접합체를 투과시키고, 나노입자-항체-미생물 복합체를 선택적으로 분리시키는 단계; 및 (c) 상기 포획용 여과막에 포획된 나노입자-항체-미생물 복합체의 유무 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 대상 미생물은 식중독균, 바이러스, 감염균 등일 수 있으며, 예컨대, 대장균, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monobytogenes), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurim), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 노로바이러스 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체는, 본 기술분야에 공지된 미생물들에 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 항체라면 제한없이 이용가능하고, 예컨대, 스테필로코커스 종을 검출하기 위해, 스테필로코커스 종과 특이적으로 결합하는 항체로 알려진 ab20002 (Abcam 사) 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 나노입자는 금속 나노입자, 양자점 나노입자 (Quantum Dot Nanoparticle) 또는 자기 나노입자 (Magnetic Nanoparticle;MNP)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 금속은 금 (Au), 은(Ag), 및 구리(Cu)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
여기서, “나노입자”란 크기가 1 nm에서 200 nm 정도의 크기를 가지는 극미세 입자를 말한다. 아주 작은 크기의 나노입자들은 일반적인 덩어리 물질과는 다른 특성을 가진다. 나노입자는 기존 물질에 비해 현저히 증가된 비표면적을 가진다. 이러한 높은 비표면적 때문에 기존 물질과는 다른 표면효과를 가지게 되는데, 입자의 크기가 작아질수록 표면에 위치한 분자의 수가 증가한다. 입자의 입경이 5 nm가 되면 입자를 구성하는 분자 중 50%가 표면에 위치하게 되고, 입자의 크기가 2 nm가 되면 그 비율은 90%에 이른다.
표면에 위치한 분자의 비율이 상대적으로 높기 때문에 나노입자들은 기존 물질에 비해 표면에너지의 결합에너지에 대한 비가 더 커지게 된다. 표면에너지의 결합에너지에 대한 비율은 입자의 크기가 20 nm에서 1 nm로 작아질수록 5% 에서 약 30% 로 증가하게 된다. 입자를 구성하고 있는 원자들은 주변의 원자들 간의 상호 작용에 의해 인력과 반발력이 평형을 이루는 에너지의 안정 상태에 있게 된다. 하지만 표면에 위치한 원자는 내부 원자에 의한 인력만 존재하므로 고 에너지 상태에 놓이게 있다. 이러한 표면 효과로 인해 나노입자는 촉매나 촉매의 표면반응에서 보이는 표면활성, 녹는점 강하, 저온 소결성 등의 성질을 가지게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 20 ㎚ 크기의 나노 금입자를 사용하였으나 이에 한정되지 않으며, 나노 금 입자는 항체와 분석물질의 면역반응을 방해하지 않는 어떤 입자경도 가질 수 있음은 당업자에게 자명한 사항이다. 바람직하게는 5 내지 100 ㎚ 크기의 입자경을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 나노입자는 자기 나노입자를 사용할 수 있다. 자기 나노입자의 특성에 의해, 미생물의 고속 검출방법에 있어, 시료를 혼합하여 반응시키는 단계 이후에, 상기 반응액 중 자기나노입자-항체-미생물 복합체를 자석으로 분리한 다음, 분리된 복합체를 완충용액에 재현탁시키는 단계를 추가로 포함하여 보다 완벽한 검출을 도모할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 자기 나노입자를 이용하여 미생물을 검출할 때, 자기나노입자-항체 접합체 및 검출 대상 미생물이 포함된 시료를 혼합하여 반응한 이후, 상온에서 자석을 이용하여 분리한 후 상등액을 제거하고, 완충용액에 재현탁시킨 후, 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜 걸과적으로 여과막에 포획된 나노입자-항체-미생물 복합체를 확인하였으며, 그 농도별로 검출이 가능함도 확인하였다. 이로써, 자기력을 이용하여 여러가지 불순물이 섞여있는 현탁 용액으로부터 목적물을 얻어내는 분리 및 검출이 보다 바람직하게 이루어질 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 나노입자로 양자점 (quantum dot) 나노입자를 사용할 수 있으며, 이로써 2종 이상의 미생물을 동시에 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
여기서, 상기 양자점 나노입자는 반도체 나노입자로 독특한 광학적인 특징을 가지고있다. 이는 입자의 크기를 조금씩 변화시키거나 조성을 조금만 바꾸어도 서로 다른 파장의 강력한 형광을 발현하게 된다. 빛을 흡수한 뒤에, 흡수한 빛과는 다른 파장의 형광빛을 발하게 되는데 이를 쉽게 조절할 수 있기 때문에 다양한 응용이 가능하다. 따라서, 본 발명에서 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 양자점 나노입자를 사용하였을 경우, 2종 이상의 미생물을 동시에 검출할 수 있다. 상기 양자점 나노입자의 제조는 당해업계에 알려진 방법에 의할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 0.1 내지 5 ㎜의 직경을 가지는 다수의 구멍을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 응집용 필름은 미생물이 여과막을 통과하기 전에 통과하는 장치로서, 미생물을 한곳에 집중하여 모일 수 있도록 유도하여 보다 큰 신호를 얻을 수 있도록 한다. 응집용 필름 구멍의 크기가 작을수록 미생물이 더욱 집중하여 모일 수 있으므로 큰 신호를 얻을 수 있다. 기존 면역여과법으로는 105 cfu의 미생물을 검출하는 것이 한계였으나 본 발명의 일 실시예에서는 응집용 필름을 이용하여 102 cfu의 미생물을 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 PDMS (polydimethylsiloxane), 접착성이 있는 고분자 및 알루미늄 테이프, 고무 및 라텍스, 및 스크린 프린팅용 페이스트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 일 양태로, 상기 미생물 응집용 필름은, 은 페이스트 또는 탄소 페이스트와 같은 스크린 프린팅용 페이스트를 상기 포획용 여과막에 일정한 크기의 구멍을 가진 모양으로 스크린 프린팅 기법으로 도포하여 제조한 필름일 수 있다. 이로써, 응집용 필름과 포획용 여과막을 일체형으로 구성할 수 있으며, 스크린 프린팅 기법은 당해 업계에 널리 알려진 방법을 이용할 수 있다.
스크린 프린팅 기법의 일례로, 나일론(Nylon), 데트론(Polyester) 또는 스테인레스 스틸등으로 짜여진 스크린 망사를 나무나 알루미늄 등의 틀에 고정시켜 그 위에 수공적 또는 광화학적 방법으로 판막을 만들어 필요한 화상 이외의 부분을 막고 그 안에 스크린 프린팅용 페이스트를 넣어, 스퀴지(Squeegee)라 불리는 주걱으로 스크린 내면을 가압하면서 움직이면 페이스트는 판막이 없는 부분의 망사를 통과하여 판 밑에 놓여 있는 피인쇄체에 프린팅되는 기법일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포획용 여과막의 세공크기는 100 nm - 10 μm인 것을 특징으로 한다.
미생물과 결합하지 않은 항체가 고정된 나노입자는 포획용 여과막을 통과하고, 항체가 고정된 나노입자와 결합하지 않은 미생물은 포획용 여과막에 걸리더라도 신호를 보이지 않게 된다. 따라서, 항체가 고정된 나노입자와 결합한 미생물만이 포획용 여과막에 항체가 고정된 나노입자가 가진 고유의 색깔, 형광 등을 보이게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 세공크기가 1.2 μm인 포획용 여과막을 사용하였으나 이에 한정되지 않음은 당업자에게 자명한 사항이며, 바람직하게는 항체가 고정된 나노입자와 반응한 미생물이 포획되는 100 nm 내지 10 μm사이의 세공크기에서 선택되는 포획용 여과막을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포획용 여과막은 니트로셀룰로스, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리에스터, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리술폰 및 폴리에탄술폰로 구성된 군에서 선택되는 포획용 여과막을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 선택적으로 분리하는 단계는, 진공, 원심분리 또는 흡수법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
다시 말해, 응집용 필름을 거쳐 포획용 여과막으로 나노입자-항체-미생물 복합체가 걸러질때, 진공을 걸어주거나, 원심분리를 하거나, 또는 여과막에 흡수되는 원리를 이용하여 선택적으로 분리할 수 있다. 하기 실시예에서는, 진공을 걸어주어 나노입자-항체-미생물 복합체가 여과막에 잘 흡착되도록 하였으나, 이 외에도 여러 가지 종래 알려진 흡착 방법이 이용될 수 있다. 경우에 따라서는, 자기 나노입자의 경우, 자석을 이용하여 상기 복합체를 선택적으로 끌어당김으로써 분석대상이 아닌 미생물을 배제하여 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 측정은, CCD 카메라 또는 흡광도를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 한다.
하기 실시예에서는 CCD 카메라를 통해서 나노입자-항체-미생물 복합체 spot을 확인하였으나, 이 외에도, 금, 은과 같은 나노입자는 표면 플라즈몬 현상에 의하여 빛의 파장 중 UV- Vis 영역에서 고유의 흡광도를 나타내게 된다. 따라서 본 발명에 따른 나노입자는 특정 파장에서 빛을 흡수하는 나노입자로서, 나노입자의 특성에 따른 파장에서 흡광도를 측정하여 흡광도의 정도에 따라 미생물의 농도를 측정할 수 있다.
본 발명은, 다른 관점에서, 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 포함하는 시료반응부; 상기 시료반응부로부터 반응액을 수용하여 검출 대상 미생물들을 응집하는 미생물 응집용 필름; 상기 미생물 응집용 필름을 통과하여 응집된 미생물들을 포획하여 선택적으로 분리하는 미생물 포획용 여과막; 및 상기 미생물의 유무 또는 농도를 확인하기 위한 검출부를 포함하는 미생물 검출 장치에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 시료 반응부는 검출 대상 미생물이 포함된 시료와 반응하는, 상기 검출대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 포함하는 부분을 의미한다. 상기 시료반응부는 상기 두 물질을 혼합할 수 있는 장치이면 어떠한 것이든 가능하며, 예컨대, 실험용 튜브 등이 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출부는 상기 나노입자-항체-미생물의 유무 또는 농도를 측정할 수 있는 장치라면 어떠한 것이든 가능하나, CCD 이미지 측정, CMOS 이미지 측정, CCD 형광 측정, PMT 형광측정 등이 바람직하다. 예컨대, CCD 카메라 또는 흡광도를 측정하는 장치일 수 있다. 본 발명에 있어서, 나노입자, 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 대한 특징은 상기 기재된 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 대상 미생물은 식중독균, 바이러스, 감염균 등일 수 있으며, 예컨대, 대장균, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monobytogenes), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurim), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 노로바이러스 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물 검출 장치는 시료반응부, 응집용 필름, 포획용 여과막, 검출부가 분리되어 구성되어 있거나, 일체형으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 은 페이스트 또는 탄소 페이스트와 같은 스크린 프린팅용 페이스트를 상기 포획용 여과막에 일정한 크기의 구멍을 가진 모양으로 스크린 프린팅 기법으로 도포하여 제조한 필름일 수 있다. 이로써, 응집용 필름과 포획용 여과막을 일체형으로 구성할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 미생물 응집용 PDMS(polydimethylsiloxane) 필름 제작
미생물 응집용 필름을 아래와 같은 방법으로 제조하였다.
PDMS 용액(Sylgard 184A, Dow Corning, USA)과 경화제(Sylgard 184B, Dow Corning, USA)를 10:1의 비율로 혼합하여 지름 150 ㎜의 평평한 패트리 접시에 붓는다. 그리고 진공 펌프를 이용하여, 혼합액 내의 기포를 제거하고, 60 ℃에서 24시간 경화시킨다. 이후 경화된 PDMS 필름을 상온에서 식힌 후, 지름 1.5 ㎜의 천공기를 이용하여 7개의 구멍을 뚫었다.
그 결과, 구멍을 가진 PDMS 필름을 제조하였음을 확인하였다.
실시예 2 미생물 배양
Listeria monocytogenes와 Salmonella typhimurium 균은 stock을 받아 BHI (brain heart infusion) broth에 균을 접종하여 37 °C, shaking incubator에서 18~24시간 동안 배양하였다. Escherichia coli는 LB (Luria Bertani) broth에, Staphylococcus aureus는 NB (nutrient broth)에 접종하여 상기와 같은 조건으로 배양하였다. 배양한 균들의 cfu(colony forming unit) 측정을 위해서 각각의 고체 평판배지에 105~109 단계로 희석하여 배양액 100 μL씩 접종하여 도말한 후, 37 ℃에서 16~24시간 배양하여, 형성되는 콜로니를 계수한 후 희석배수 곱하여 생균수를 측정하였다. 또한, 배양중인 균의 액체 배지에서 적당량을 흡광 광도계로 600 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 3 금 나노입자(이하, AuNP)-항체 접합체를 이용한 미생물의 고속 검출
3-1: AuNP-항체 접합체 제조
20 ㎚ AuNP 용액(BB International) 1 mL에 borate 완충용액(0.1 M, pH 8.5) 0.1 mL과 Staphylococcus aureus에 선택성을 가지는 항체(Abcam, ab20002) 10 μg을 첨가하였다. 30분 후, 1% BSA(bovine serum albumin)용액(pH 8.5, 10 mM carbonate 완충용액에 녹인 것) 0.1 mL을 첨가하여 30분 동안 정치시켰다. 상기 용액을 4 °C에서 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 0.1% BSA (pH 8.5, 10 mM carbonate 완충용액에 녹인 것)용액 1 mL을 첨가하여 혼합 후, 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상기 과정을 한 번 더 반복 후 최종적으로 0.1% BSA (PBS 완충용액으로 녹인 것)용액을 0.5 mL 첨가하여 혼합 후 냉장고에 보관하였다.
그 결과, AuNP-접합체 용액을 성공적으로 제조하였다. 이와 같은 AuNP-항체 접합체와 미생물의 선택적인 결합에 의해 미생물의 농도를 측정할 수 있는 개념도를 도 1에 도시하였다. AuNP-항체 접합체와 시료를 혼합하여 반응하면 A와 같은 형태를 형성하게 되며, 상기 혼합액을 B의 도구에 주입하면 미생물이 걸러지게 되며, 반응하지 않은 AuNP-항체 접합체는 통과하고, A에서와 같이 선택적인 결합이 이루어진 미생물만이 AuNP 색깔을 확인할 수 있다.
1: AuNP-항체 접합체
11: 미생물
21: 응집용 필름
31: 미생물 포집용 여과막
41: 진공이나 흡착성 막을 이용한 수용액 흡수 흐름
3-2: Staphylococcus aureus균의 고속 검출
실시예 2에 기재된 방법으로 배양된 Staphylococcus aureus 균을 PBS에 현탁시킨 용액 100 μL(0-105 cfu)와 실시예 3-1의 방법으로 제조된 AuNP-항체 접합체 용액 50 μL를 각각 혼합하여 30분 동안 약하게 흔들어 주었다.
포획용 여과막은 Pore 크기가 1.2 ㎛인 nitrocelluolose(NC) 막(Millipore)에 1% BSA 용액(증류수에 녹인 것)을 도포한 후, 건조시킨 것을 사용하였다. 가지가 있는 100 mL 삼각 플라스크에 장착한 필터 위에 상기 NC 막을 올려놓고, NC 막 위에 실시예 1에서 제작된 PDMS 필름을 덮었다. 플라스크의 가지를 통해 진공을 걸어주면서, PDMS 필름 구멍으로 상기 AuNP-항체 접합체와 Staphylococcus aureus의 혼합용액을 통과시켜 Staphylococcus aureus의 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, Staphylococcus aureus가 없는 경우 AuNP-항체 접합체가 여과용 멤브레인에 남아있지 않은 것을 확인하였고 Staphylococcus aureus의 농도가 증가할 수 록 여과용 멤브레인에 남아있는 AuNP의 양이 증가하는 것을 확인하였다 (A: 105 cfu, B: 104 cfu, C: 103 cfu, D: 102 cfu, E: 세포가 없는 경우). 이로써 미생물을 농도별로 측정할 수 있는 것을 확인하였으며 최소 102 cfu까지 측정이 가능함을 알 수 있다. 이는 기존의 면역여과법을 사용하여 측정할 수 있었던 최소 농도인 105 cfu보다 1000배나 높은 감도로써 기존 면역여과법보다 훨씬 뛰어난 감도를 가진 것을 확인할 수 있었다.
3-3: 다른 균과의 교차반응 확인
본 발명의 미생물 검출방법이 나노입자-항체 접합제 선택적으로 미생물을 검출 할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 AuNP-항체 접합체를 사용하여 상기 실험예 3-2와 동일한 절차에 따라 균의 종류만 변화시켜 실험을 진행하였다.
총 4종류의 균, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typimurium, Escherichia coli에 대해 AuNP-anti-Staphylococcus aureus 접합체와 반응시킨 후 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, Listeria monocytogenes, Salmonella typimurium, Escherichia coli에서는 AuNP가 나타나지 않았고 Staphylococcus aureus에 대해 선택적으로 AuNP가 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (A: 106 cfu S.aureus cells, B: 106 cfu E.coli cells, C: 106 cfu Salmonella cells, D: 106 cfu Listeria monocytogenes cells, E: 세포가 없는 경우). 이로써, 본 발명에 따른 검출방법이 특정 균 특이적으로 사용할 수 있는 방법임을 검증하였다.
3-4: Listeria monocytogenes균의 검출 및 다른 균과의 교차반응 확인
본 발명의 미생물 면역검출방법이 AuNP-항체 접합제가 선택적으로 미생물을 검출 할 수 있는지 확인하기 위하여, Listeria monocytogenes와 선택성을 가지는 항체(Abcam, ab30747)의 AuNP-항체 접합체를 사용하여 상기 실험예 3-2 및 3-3과 동일한 절차에 따라 균의 종류만 변화시켜 실험을 진행하였다.
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typimurium, Escherichia coli에 대해 AuNP-anti-Listeria monocytogenes 접합체와 반응시킨 후 검출을 분석하였다. 대조 실험을 위해 접합체 제조과정에서 AuNP-항체 접합체 대신 AuNP-BSA 접합체를 합성하여 반응시킨 후 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Listeria monocytogenes만 선택적으로 검출하는 것을 확인할 수 있었다 (A-C: AuNP-BSA 접합체와 반응한 경우, A:105 cfu Listeria monocytogenes cells, B: AuNP-anti-Listeria monocytogenes, C: 105 cfu Listeria monocytogenes cells, D-G: AuNP-항체 접합체와 반응한 경우 D: 105 cfu Salmonella typimurium cells, E: 105 cfu Escherichia coli cells, F: 105 cfu Staphylococcus cells, G: 105 cfu Listeria monocytogenes cells).
실시예 4 자기나노입자(이하, MNP)-항체 접합체를 이용한 미생물의 고속 검출
4-1: 자기나노입자(MNP)-항체 접합체 제조
100 nm MNP 용액(Chemicell) 100 μL에 최종 농도가 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 66.7 mg/mL와 항체 100 μg/mL이 되도록 첨가하였다. 2시간 후, 상기 용액을 상온에서 자석을 이용하여 자기나노입자를 2분 동안 분리한 후 상등액을 제거하였다. PBS 용액 200 μL를 첨가하여 혼합 후, 다시 자석을 이용하여 MNP를 2분 동안 분리한 후 상등액을 제거하였다. 상기 과정을 한 번 더 반복 후 최종적으로 0.1% BSA(PBS 완충용액으로 녹인 것)용액을 0.4 mL 첨가하여 혼합 후, 0.2 μm 주사기 필터로 거른 후에 냉장고에 보관하였다.
그 결과, MNP-접합체 용액을 성공적으로 제조하였다. 이와 같은 MNP-항체 접합체와 미생물의 선택적인 결합에 의해 미생물의 농도를 측정할 수 있는 개념도를 도 5에 도시하였다. MNP-항체 접합체와 시료를 혼합하여 반응하면 A와 같은 형태를 형성하게 되며, 상기 혼합액을 자석으로 모은 후, 다시 수용액으로 현탁시킨 용액을 B의 도구에 주입하면 미생물이 걸러지게 되며, 반응하지 않은 MNP-항체 접합체는 통과하고, A에서와 같이 선택적인 결합이 이루어진 미생물은 MNP 색깔을 확인할 수 있다.
51: MNP-항체 접합체
11: 미생물
21: 응집용 필름
31: 미생물 포집용 여과막
41: 진공이나 흡착성 막을 이용한 수용액 흡수 흐름
4-2: Staphylococcus aureus균의 고속 검출
실시예 2에 기재된 방법으로 배양된 Staphylococcus aureus를 0.1% BSA (PBS-0.05% Tween 20 완충용액으로 녹인 것) 용액에 현탁시킨 용액 10 μL (0, 105, 106 cfu)와 실시예 4-1의 방법으로 제조된 MNP-anti-Staphylococcus aureus (Abcam) 접합체 용액 30 μL와 0.1% BSA (PBS-0.05% Tween 20 완충용액으로 녹인 것)용액 160ul을 각각 혼합하여 30분 동안 약하게 흔들어 주었다. 30분 후, 상기 용액을 상온에서 자석을 이용하여 Staphylococcus aureus 와 반응한 자기나노입자 복합체를 5분 동안 자석으로 분리한 후 상등액을 제거하였다. 0.1% BSA (PBS-0.05% Tween 20 완충용액으로 녹인 것)용액 200 μL를 첨가하여 혼합하였다.
포획용 여과막은 Pore 크기가 1.2 ㎛인 nitrocelluolose(NC) 막(Millipore)에 1% BSA 용액(증류수에 녹인 것)을 도포한 후, 건조시킨 것을 사용하였다. 가지가 있는 100 mL 삼각 플라스크에 장착한 필터 위에 상기 NC 막을 올려놓고, NC 막 위에 실시예 1에서 제작된 PDMS 필름을 덮었다. 플라스크의 가지를 통해 진공을 걸어주면서, PDMS 필름 구멍으로 상기 MNP-항체 접합체와 Staphylococcus aureus의 혼합용액을 통과시켜 Staphylococcus aureus의 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, Staphylococcus aureus의 농도가 증가할수록 여과용 멤브레인에 남아있는 MNP의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 이로써 미생물을 농도별로 측정할 수 있는 것을 확인하였으며 이는 자기력을 이용하여 여러 가지 불순물들이 섞여 있는 현탁 용액으로부터 목적물을 얻어낼 수 있는 분리기술의 장점을 확인할 수 있었다 (A: 균이 없는 경우, B: 105 cfu, C: 106 cfu).
실시예 5 스크린 프린팅용 페이스트를 이용한 미생물 응집용 필름의 제조
다양한 크기(0.15, 0.3, 0.5, 0.75 mm)의 3개 구멍을 가진 필름이 제조되도록 메쉬를 제작한 후, 폴리술폰 멤브레인(Pall life sciences, 0.45 μm pore)의 공극이 작은 면에, 실버 페이스트를 스크린 프린팅 하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 필름과 여과막이 일체형으로 구성된 일체형 응집용 필름-포획용 여과막을 얻었다. 또한, 본 기술을 이용할 경우 약 0.1 mm 크기의 작은 구멍을 가진 응집용 필름을 얻을 수 있었다.
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 나노입자를 이용한 미생물 고속검출방법 및 장치는 검출대상 미생물의 경제적이고 간단한 검출에 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 이용함으로써, 복잡하고 시간이 오래 걸리는 탐지기능물질의 2차 반응을 거치지 않고 나노입자를 바로 확인 할 수 있도록 하여 경제적이고 간단하게 미생물의 유무 및 농도를 측정하는데 효과가 있다. 또한, 기존 면역여과법으로는 미생물을 105 cfu까지 측정할 수 있었으나 본 발명은 102 cfu까지 측정할 수 있어 적은 양의 미생물을 측정하는데 효과가 있다.

Claims (15)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법:
    (a) 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 나노입자-항체 접합체 및 검출 대상 미생물이 함유된 시료를 혼합하여 반응시키는 단계;
    (b) 상기 반응액을 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜, 미생물과 반응하지 않은 나노입자-항체 접합체를 투과시키고, 나노입자-항체-미생물 복합체를 선택적으로 분리시키는 단계; 및
    (c) 상기 포획용 여과막에 포획된 나노입자-항체-미생물 복합체의 유무 또는 농도를 측정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 양자점 (quantum dot) 나노입자 또는 자기 나노입자인 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 금속은 금, 은 및 구리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 자기 나노입자이며,
    상기 (a) 단계는 시료를 혼합하여 반응시키는 단계 이후에,
    상기 반응액 중 자기나노입자-항체-미생물 복합체를 자석으로 분리한 다음,
    분리된 복합체를 완충용액에 재현탁시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 양자점 나노입자이며,
    2종 이상의 미생물을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 0.1 내지 5 ㎜의 직경을 가지는 다수의 구멍을 가지는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 PDMS (polydimethylsiloxane), 접착성이 있는 고분자 및 알루미늄, 고무 및 라텍스, 및 스크린 프린팅용 페이스트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 상기 포획용 여과막에 스크린 프린팅용 페이스트를 스크린 프린팅 기법으로 도포하여 제조한 필름인 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 포획용 여과막의 세공크기가 100 nm 내지 10 μm인 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 포획용 여과막은 니트로셀룰로스, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리에스터, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리술폰 및 폴리에탄술폰으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 선택적으로 분리하는 단계는, 진공, 원심분리 또는 흡수법을 이용하는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 측정은, CCD 카메라 또는 흡광도를 이용하는 것을 특징으로 하는 미생물의 고속 검출방법.
  13. 검출 대상 미생물에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 나노입자를 포함하는 시료반응부;
    상기 시료반응부로부터 반응액을 수용하여 검출 대상 미생물을 응집하는 미생물 응집용 필름;
    상기 미생물 응집용 필름을 통과하여 응집된 미생물들을 포획하여 선택적으로 분리하는 미생물 포획용 여과막; 및
    상기 미생물의 유무 또는 농도를 확인하기 위한 검출부
    를 포함하는 미생물의 검출장치.
  14. 제13항에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 양자점 나노입자 또는 자기 나노입자인 것을 특징으로 하는 미생물의 검출장치.
  15. 제13항에 있어서, 상기 미생물 응집용 필름은 상기 포획용 여과막에 스크린 프린팅용 페이스트를 스크린 프린팅 기법으로 도포하여 제조한 필름인 것을 특징으로 하는 미생물의 검출장치.
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