KR100436567B1 - 다중필터를 이용한 경쟁여과면역분석법 및 이에 이용되는면역분석용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기존의 면역분석방법과 비교하여 분석민감도의 희생없이 분석과정에서 요구되는 구성성분의 수를 감소시켜 경제적인 장점과 시간의 절약을 제공하고자 하는 것으로, 신호발생원인 효소와 결합하여 신호발생 기능을 갖는 동시에 분석물질과 면역반응을 하여 포획기능을 갖는 한 종류의 항체를 사용한 항체-효소 접합체를 사용하여, 이를 분석물질이 포함된 액상의 시료내에서 분석물질과 면역반응을 수행시킨 후, 이를 상부의 여과용 멤브레인 필터에 통과시켜 면역결합체를 거르고 미반응 항체-효소접합체만을 통과시킨 후, 여과된 미반응 항체-효소 접합체를 분석물질이 고정화된 하부의 포획용 멤브레인 필터에서 면역반응시킴으로써 포획한 후, 상기의 면역결합체에 포함된 효소에 특이적인 기질을 첨가하여 얻은 효소-기질 반응을 통하여 분석물질의 유무 및 농도를 측정하는 경쟁여과면역분석법에 관한 것이다.

Description

다중필터를 이용한 경쟁여과면역분석법 및 이에 이용되는 면역분석용 키트{COMPETITIVE ENZYME-LINKED IMMUNOFILTRATION ASSAY USING MULTI-FILTERS AND A KIT FOR THE ABOVE ENZYME-LINKED COMPETITIVE IMMUNOFILTRATION ASSAY}

본 발명은 효소와 결합된 한 종류의 항체와 다중의 필터를 이용하여 분석 대상물질(이하 분석물질이라 함)을 분석하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 분석물질과 면역 반응 기능을 갖는 한 종류의 항체를 효소와 결합시킨 항체-효소 접합체를 분석물질을 포함하는 용액에 가하여 면역 반응 시킨 후 다중 필터에 통과시킴으로써 용액상에 형성된 항체-효소 접합체와 분석물질과의 면역결합체를 상단의 필터에서 제거하고 미반응 항체-효소 접합체만을 마지막 멤브레인 필터에서 포획한 후 효소-기질 반응에 의한 신호를 탐지하여 분석 물질의 유무 및 농도를 검사하는 방법에 관한 것이다.

분석물질, 특히 병원성 물질의 유무 및 농도의 파악을 위한 검사는 발병의 진원지 추적, 예방 등에 있어 중요하며 보다 경제적이고 빠르면서 민감한 검사 방법의 개발을 위해 많은 연구가 진행되었다.

일반적으로 많이 사용되는 병원성 물질 (미생물, 단백질 등)의 유무 및 농도를검사하기 위한 방법으로는 콜로니법, DNA 탐침(probe)법, 면역분석법 등이 많이 이용되고 있다.

첫째로, 콜로니법은 시료를 채취하여 검출하고자 하는 미생물만이 생존할 수 있게 성분을 조성한 선택배지에서 배양한 후, 미생물이 형성하는 콜로니의 수를 측정하는 방법으로, 이 방법은 매우 정확하지만 측정에 오랜 시간이 소요되며 각각의 미생물에 대한 배지의 선택에 어려움이 있다는 단점이 있다.

둘째로, DNA probe법은 미생물을 물리화학적으로 파괴한 후 세포 안의 DNA를 핵산 접합 반응에 의해 검출하는 방법으로, 콜로니법과 비교하여 검사 시간이 단축되고 경제적으로 매우 저렴한 편이지만, 적은 양의 미생물 검출 시에는 별도로 배양을 하여야 하고 신호 증폭을 위해 폴리머레이즈 연쇄반응(polymerase chain reaction) (PCR) 방법을 병행하여야 하고 고가의 PCR 장비가 사용되어야 한다는 단점이 있다. 더욱이, PCR을 수행할 경우 거짓-양성(false-positive)이 매우 빈번하여 검출의 오차 범위가 증가하고 분석의 신뢰도를 감소시킬 가능성을 가지고 있다.

셋째로, 면역분석법은 항원-항체 결합 반응을 이용한 것으로 예컨대, 검출하고자 하는 미생물의 표면 항원에 특이적으로 반응하는 항체를 이용한 효소 결합 면역 흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA) 이 널리 수행되어지는데, 이 방법은 짧은 시간에 매우 높은 민감도를 나타내므로 상기한 두 방법의 대체 방법으로 인식되고 있다. 이 방법은 항체 생산을 위한 시간과 경비에 대한 어려움이 단점으로 지적되고 있지만 일단 개발된 항체 생산 세포 (hybridoma) 는 지속적인 항체 생산을 가능하게 하므로 이 문제의 발생을 최소화할 수 있다.

본 발명은 분석물질을 보다 신속하고 민감하게 검출하는 분석법의 개발을 목적으로 하므로 상기한 방법 중 빠르면서도 민감도가 높은 면역 분석법을 사용하고자 한다.

기존의 면역분석방법으로는 분석하고자 하는 물질의 서로 다른 부위를 동시에 인지하는 두 종류의 항체(탐지항체와 포획항체)를 이용하는 샌드위치 면역분석법이 대표적인 방법이다. 이 방법에서는 항원-항체 면역결합체로부터 미반응 성분들의 분리를 용이하게 할 목적으로 고상 면역분석이 널리 이용된다. 이를 위해 한 항체 (포획항체)는 고체 상에 고정시켜 분석하고자 하는 물질을 포획하게 하고, 다른 항체 (탐지항체)는 신호 발생원(효소, 형광 물질 등)과 중합하여 분석하고자 하는 물질과 면역 반응 후 신호 발생 기능을 수행하도록 한다(샌드위치 면역결합체의 형성). 분석하고자 하는 물질이 존재하면 고체 표면에서의 항원-항체 반응에 의하여 샌드위치 면역결합체가 형성되고 이 결합체는 표지물질을 포함하고 있으므로분석하고자 하는 물질의 농도에 비례하여 신호가 발생하게 된다. 이와 같은 분석법은 항체 사용량에 대한 제한이 없으므로 낮은 농도의 분석 물질에 대한 탐지도 가능할 정도로 민감도를 향상시킬 수 있지만, 분석 단계가 복잡하고 서로 다른 두 항체 구성 성분들을 제조하고 관리하여야하는 번거로움이 발생한다. 또한 미생물 세포와 같은 거대한 크기의 분석물질에 대한 면역 분석 시 고체 표면에 고정화된 항체에 의해 세포를 포획할 경우 항원-항체 반응을 위한 반응물질 상호간의 공간 배열이 표면에 의해 간섭되는 입체적 효과(steric effect)가 발생하는 문제가 생긴다. 또한 비교적 큰 (약 5 ㎛) 세공의 멤브레인을 사용하기 때문에 분석 하고자 하는 물질이 단백질 같이 작은 크기의 것일 때에는 세공 표면적의 감소로 분석민감도가 감소되는 문제도 발생한다.

본 발명의 목적은 종래의 샌드위치 면역분석법이 복수개의 항체를 이용하는 것과 관련하여 항체성분의 제조 및 관리에 따른 번거로움을 해소하는 데 있다. 그리하여 하나의 항체를 사용하는 항체-효소 접합체를 이용하여 액상의 분석물질과 고체상 (membrane)에 고정되어있는 분석물질간의 항체에 대한 경쟁을 이용한 경쟁 여과 면역 분석법을 개발하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 하나의 항체-효소 접합체와 표면적이 넓은 비교적 작은 세공 크기의 다중 필터를 이용하여 액체 상에서 형성된 면역결합체를 상단의 필터에서 제거하고 미반응 항체-효소 복합체만을 마지막 멤브레인에서 포획함으로써 기존의 면역분석법과 비교하여 분석민감도의 희생 없이 분석과정에서 요구되는구성 성분의 수를 감소시키는 경제적인 장점과 분석시간을 절약하는 효과를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 면역반응을 액체 상에서 수행 후 그 반응 혼합물을 세공성 멤브레인에 통과시켜 여과하고, 분석물질이 고정화된 고체상의 멤브레인에 미반응 항체-효소 접합체를 포획함으로써 입체적 효과(steric effect)를 최소화하면서 분석물질을 검사할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.

도 1은 본 발명의 경쟁여과면역분석과정을 나타내는 도면.

도 2는 본 발명의 최적의 항체-효소 접합체의 농도를 나타내는 그래프.

도 3은 본 발명의 완충액의 최적 화학적 조성을 나타내는 그래프.

도 4는 본 발명의 최적 프리필터(prefilter)의 조건을 나타내는 그래프.

도 5는 본 발명의 경쟁여과면역분석법과 샌드위치면역분석법 및 단순여과면역분석법의 농도응답 곡선의 비교도.

본 발명은 신호발생원인 효소와 결합하여 신호발생 기능을 갖는 동시에 분석물질과 면역반응을 하여 포획기능을 갖는 한 종류의 항체를 사용한 항체-효소 접합체를 사용하여, 이를 분석물질이 포함된 액상의 시료내에서 분석물질과 면역반응을 수행시킨 후, 이를 상부의 여과용 멤브레인 필터에 통과시켜 면역결합체를 거르고 미반응 항체-효소접합체만을 통과시킨 후, 여과된 미반응 항체-효소 접합체를 분석물질이 고정화된 하부의 포획용 멤브레인 필터에서 면역반응시킴으로써 포획한 후, 상기의 면역결합체에 포함된 효소에 특이적인 기질을 첨가하여 얻은 효소-기질 반응을 통하여 분석물질의 유무 및 농도를 측정하는 경쟁여과면역분석법에 관한 것이다.

본 발명의 구성은 신호발생원으로 효소가 접합되어 탐지 기능과 분석물질과의 면역반응에 의한 포획기능을 모두 갖는 하나의 항체로 이루어진 항체-효소 접합체와 다음과 같이 상부로부터 포개어진 다중 멤브레인 필터를 포함하여 구성된다.

첫째로, 항원-항체 면역결합체를 제거하기 위해 분석물질이 통과할 수 없는세공크기를 갖는 니트로셀룰로오즈 멤브레인(NC membrane)을 설치하였다. 이와 같은 배치는 단지 미반응 항체-효소 접합체만을 통과시키기 위함이다.

둘째로, 면역반응에 참여하지 않은 미반응 항체-효소 접합체를 고체 표면에 포획하기 위하여 분석물질 분자가 고정화되어있는 니트로셀룰로오즈 멤브레인을 가장 하부에 배치한다. 이와 같이 세공 크기가 비교적 작은 멤브레인을 이용하여 고안된 분석법은 면역반응을 위해 넓은 표면적을 제공하여 분석민감도를 증가시킨다.

이때 상기의 멤브레인 필터에 더하여, 항원-항체 반응에 의해 부산물로 생성될 수 있는 면역 응집체와 그 외 잔존 가능한 불순물을 제거하기 위한 프리 필터의 기능을 갖는 유리 섬유 멤브레인(glass fiber membrane)을 가장 상부에 포함 할 수 있다. 이러한 프리필터는 여과 속도를 조절하여 궁극적으로 고체 상에서의 면역결합을 증진시키고 다음 단계의 여과 시 구멍이 막히는 것을 막아주는 역할을 한다.

이와 같은 구성성분을 이용한 분석과정은 다음과 같다. (도 1 참조)

첫 번째로, 항체-효소 접합체와 분석물질을 액체 상에서 일정시간 반응시켜 항원-항체간 면역 결합을 유도한다.

두 번째로, 이렇게 생성된 면역결합체와 미반응 항체-효소 접합체의 혼합물을 다중 멤브레인층의 상부에 가하고 그 하부에 진공펌프를 이용하여 여과시킨다. 시료가 다중의 멤브레인층을 거치며 여과될 때, 상기의 프리필터를 가장 상부에 사용하면 응집체나 불순물같이 입자가 큰 물질들이 첫 번째층에 존재하는 프리 필터용 유리 섬유 멤브레인 상에 걸러지므로 하부의 멤브레인의 세공이 막히는 문제점을 미리 해결할 수 있다. 이러한 프리 필터층을 통과한 분석물질를 포함하는 면역결합체는 두 번째 층에 존재하는 비교적 작은 세공크기의 니트로셀룰로오즈 멤브레인에 의하여 걸러져 제거되고 미반응 항체-효소 접합체만이 통과된다. 따라서 멤브레인의 세공크기는 면역결합체보다 작고 항체-효소 접합체보다 큰 범위에서 선택되므로 비교적 작은 세공크기( 예 ; 0.45㎛)의 멤브레인의 사용도 가능하다.

세 번째로, 첫 번째와 두 번째 멤브레인 층을 통과한 용액 내의 미반응 항체-효소 접합체는 분석물질 분자가 고정화된 니트로셀룰로오즈 멤브레인층에 도달되어 분석물질과의 항원-항체 반응에 의해 포획된다. 이는 종전 샌드위치 면역분석방법이 멤브레인 상에 신호물질과 결합한 탐지항체와는 별도의 포획기능을 갖는 별개의 항체를 고정화시킨 것과는 다른 것으로, 멤브레인 상에 분석물질을 고정화시켜 액상의 시료에서 미반응한 항체-효소 접합체와 그대로 반응하게 함으로써 한 종류의 항체로 반응의 수행을 가능하게 하고 또한 별도의 세척과정을 필요로 하지 않는다.

네 번째로, 멤브레인 상의 분석물질에 포획된 항체-효소 접합체에 비례하는 신호 발생을 위해 첫 번째 층과 두 번째 층의 멤브레인을 제거한 후 가장 하부의 멤브레인을 선택된 효소에 대한 기질용액에 담가 효소-기질 반응을 수행한다. 발생된 신호의 세기는, 액체 시료 내 분석물질이 존재하지 않을 경우 항체-효소 접합체는 모두 미반응 상태로 가장 하부 멤브레인 상에서 면역결합에 참여하므로 최대 신호가 발생하게 되고, 액체 시료 내의 분석물질의 농도가 증가할수록 액체 상에서의 항원-항체 반응이 증가하여 항체-효소 접합체가 상단의 필터에서 제거되므로 감소한다. 즉 이 신호의 세기는 시료 내의 분석물질의 농도에 반비례하게 된다.

본 발명에서는 효소-기질 반응의 탐지기로써 신호 변화의 민감도의 향상을 위해 특별히 고안된 반도체 센서인 light addressable potentiometric sensor (LAPS, Molecular Devices, USA)를 이용한 포텐시아메트리(potentiometriy) 방법을 선택하였다. ELISA 리더나 스펙트로메타를 이용하여 측정할 경우 신호 발생원인 효소로 일반적으로 ELISA에서 사용하는 효소를 사용하여 마지막 멤브레인 필터에 기질 용액을 여과시키면서 통과한 기질용액의 발색정도를 측정할 수 있으며, 상기의 LAPS를 사용하는 경우에는 우레아제나 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 같이 기질의 pH를 변화시킬 수 있는 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 우레아제는 특이적 기질인 요소의 존재 하에서 효소-기질 반응하여 프로톤(proton)을 소모하여 계의 pH를 상승시키고, 이것은 수용액에 노출된 LAPS의 포텐셜 변화를 초래하여 신호로써 측정된다. 이와 같은 효소-기질 반응은 한 분자에 의해 반복적으로 수행되므로 신호 증폭 효과를 제공할 뿐 아니라 구입된 LAPS 장치에 특별히 고안된 극히 작은 부피 (<1㎕) 내에서 일어나므로 비교적 민감한 신호가 발생하게 된다.

본 발명에 의하여 분석 가능한 물질에는 단백질뿐만 아니라 비교적 크기가 큰 미생물이나 세포 등이 모두 가능하고 이들을 한 필터에서 동시에 분석하는 것도 가능하다. 미생물, 세포 단백질 등의 다수의 분석물질을 한 필터에서 동시에 분석함에 있어서, 기존의 샌드위치 방법이나 단순 여과방법에 의하는 경우에는 가장 크기가 큰 면역 결합체를 통과시키기 위해 세공이 큰 필터(예 ; 세공크기 약5㎛)를 사용하여야 하므로 반응할 수 있는 표면적이 상대적으로 좁아서 크기가 작은 분석물질은 분석 민감도에서 손해를 보았지만, 본 발명에 의하는 경우에는 미반응 항체-효소 접합체가 통과 할 수 있다면 매우 작은 세공 크기의 필터(예 ; 세공크기 약0.45㎛)를 사용하는 것도 가능하므로 반응할 수 있는 표면적이 상대적으로 넓어서 분석물질의 크기의 제약 없이 다수의 분자를 분석민감도의 희생없이 한 필터에서 동시에 분석 가능하다. 또한, 본 발명이 세공크기가 작은 멤브레인 필터를 사용하여 상대적으로 표면적이 넓어짐으로 인해 크기가 작은 단백질 같은 물질의 분석에 있어서 분석물질이 세공을 통과할 때 항체-효소 접합체와의 접촉 기회가 많아져서 면역반응이 보다 완벽하게 일어날 수 있어서 분석민감도가 향상된다. 또한 항체 대신에 세포 표면의 수용체를 특이적으로 인지하는 리간드를 이용하여, 항체-효소 접합체 대신에 리간드-효소 접합체를 제조하고 이를 사용하여 하기의 실시예과 동일한 방법으로 면역분석을 수행할 수 있다.

재 료

본 발명의 실시예 및 비교예에서 사용된 재료는 다음과 같다. 분석물질 모델로 미생물(Salmonella균)을 사용하였으며 이 때 사용된Salmonella균 (Salmonella typhi,유기 용매로 처리되고 건조된 상태)과 그에 대한 감응물질로써 S.typhi특이하게 반응하는 단일클론 항체는 정제되지 않은 복수액 (ascites) 상태로 국립보건원으로부터 공급받았다. N-숙신이미딜-3-[2-피리딜이티오]프로피오네이트( N-succinimidyl-3- [2-pyridyldithio]propionate ; SPDP), 술포숙신이미딜 4-[N-말레이미도-메틸] 사이클로핵산-1-카르복실산 (Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimido-methyl] cyclohexane-1 -carboxylate ; SMCC), 디티오테리톨(dithiotheritol ; DDT), 그리고 N-하이드록시숙신이미딜 (N-Hydroxysuccinimidyl ; NHS)-LC-LC-바이오틴(biotin)은 Pierce 사(미국)로부터 구입하였다. 카제인 ( Casein ; 나트륨염(sodium salt) 형태, 우유로부터 추출) 그리고 소의 혈청 알부민 (BSA ; bovine serum albumin, heat shock 공정에 의한 정제, fraction V)과 트윈(Tween)-20 (Tw), 트리톤(Triton) X-100 (Tx)은 Sigma 사(미국)으로부터 공급되었다. 니트로셀룰로오즈 멤브레인 중 세공크기 0.45 ㎛ 인 것은 Sigma 사(미국), 세공크기가 5 ㎛인 것은 Whatman 사(미국), 그리고 세공크기 12 ㎛ 인 것은 Schleicher & Schuell 사(독일)로부터 공급되었다. 유리 섬유 멤브레인으로 사용되는 Gelman으로 표기된 것은 Gelman Sciences 사(미국), Fisher-F6과 Fisher-F8로 표기된 것은 Fisher Scientific 사(미국), 그리고 Millipore라고 표기된 것은 Millipore 사(아일랜드)에서 각각 구입하였다. 스트렙타비딘 (SA)은 Calbiochem 사(미국)에서 그리고 우레아제는 Boehringer Mannheim 사(독일)에서 각각 구입하였다. 그 밖의 명시되지 않은 모든 시약들은 분석용 급을 사용하였다.

이하에서는 본 발명의 보다 상세한 이해를 돕기 위해 실시예와 비교예를 들어 본 발명을 기존의 면역분석 방법과 비교하여 상술한다. 그러나 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

a. 항체-효소 접합체의 제조 ; 항체-우레아제 접합체의 제조

단백질 G에 의해 정제된 Slmonella균 특이항체를 150 mM NaCl이 포함된 100 mM 포스페이트(phosphate) 완충용액 (반응용액, pH 7.0)으로 투석된 후 디메틸 황산화물 (dimethyl sulfoxide ; DMSO)에 용해된 15배 몰 과잉농도의 SMCC와 4℃에서 4시간 동안 반응시킴으로써 활성화시켰다. 과량의 SMCC는 세파덱스 G-15 젤 크로마토그래피에 의해 제거하고, 이것을 아래와 같이 활성화된 우레아제와 바로 접합반응 시켰다.

우레아제 반응기의 활성화를 위해, 먼저 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid ; EDTA)이 함유된 반응용액에 용해시키고, 그 분자 상에 설프하이드릴 반응기를 생성시키기 위해 DDT (최종 100 mM)를 우레아제 용액에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 과량의 시약은 세파덱스 G-15 칼럼을 이용하여 제거하였다.

두 종류의 활성화된 반응물질 즉, 항체와 우레아제 (단량체 기준)를 그 몰 비가 1:50이 되도록 혼합하고 4℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 후 반응 혼합액에 10배 몰 과잉농도 (우레아제 기준)의 시스테인(cystein)을 첨가하고 4℃에서 4시간 이상 반응시킴으로써 반응이 종결하였고, 그 반응 혼합액을 보관용액 (2 mM DDT, 그리고 1 mM EDTA가 포함된 10 mM 포스페이트 완충용액, pH 7.0) 내에서 투석시켰다. 비환원 SDS-PAGE (7% gel, β-mercaptoethanol 배제)을 수행하여 접합체의 합성여부를 확인한 후, 그 생성물을 미반응 물질들로부터 분리시키기 위해 바이오젤(Biogel) A5M 젤 칼럼 (15×500 mm)을 이용하여 크기 배제 (size exclusion) 크로마토그래피를 수행하였다 (유속 1 mL/h 보관용액). 유출액 내의 총 단백질 농도는 브래드폴드 방법에 의해 측정하였고 우레아제의 유출 위치 및 항체와의 접합여부는 각각 액상에서의 효소 활성과 고정화된 세포를 이용한 고체상의 면역분석에의해 결정하였다. (자세한 사항은 아래 참조). 최종 정제된 접합체를 10% 소의 혈청 알부민 (BSA, 최종 1%) 용액과 혼합한 후 4℃에서 보관하였다.

b. 효소활성측정 및 중합여부결정

효소활성측정을 위해 칼럼으로부터 유출된 각 시료를 마이크로웰(microwell)에 5 μL씩 넣고 10 mM 아세테이트 완충용액 (pH 5.1)으로 20배 희석한 후 100 μL의 발색기질 (16.6 mM 요소와 0.2 mM EDTA가 포함된 0.1 mM 브로모크레졸 퓨리에이즈플 (bromocresol pureaseple) 용액, pH 4.8을 각 마이크로웰에 가하여 37℃에서 15분간 반응시켰고 발생된 신호를 흡광도 570nm (A570)에서 측정하였다.

다음으로 중합여부결정을 위해, 먼저 마이크로웰에 0.5% (v/v) 글루타르알데하이드 용액을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰고, 탈이온수로 5번 세척한 후 10 ㎍/mL 세포용액을 각 마이크로웰에 100 μL씩 첨가하였고, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 후 마이크로웰을 탈이온수로 3번 세척한 뒤 잔여 표면 처리를 위해 100 mM 트리스(Tris)-HCl 완충용액 (pH 7.6)에 용해된 0.5% 카제인 용액을 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 탈이온수로 3번 세척함으로써 세포를 고정화시켰다. 이와 같은 준비된 마이크로웰 내에 각 시료를 10배로 희석하여 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 탈이온수로 3번 세척하였다. 위에서와 같이, 우레아제 발색기질을 첨가하여 37℃에서 15분간 반응기킴으로써 신호를 발생시켰다.

c. LAPS 장치용 니트로셀룰로오즈 멤브레인 스틱의 제작 ;

미생물을 고정화시킨 니트로셀룰로오즈 멤브레인 스틱의 제작

분석물질인 S.typhi는 10 mM PBS 완충용액을 사용하여 10⁷cell/mL이 되도록 서스펜션(suspension)하여 사용하였다. 미생물세포의 포획을 위해 먼저 LAPS 장치 제조사로부터 공급받은 플라스틱 스틱 상의 기존 멤브레인을 제거한 후 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오즈 멤브레인으로 대체하여 사용하였다. 0.5% (v/v) 글루타르알데히드 용액으로 처리하고 세척 후 건조시킨 니트로셀룰로오즈 멤브레인을 양면 테이프 위에 접착하였다. LAPS 장치 내 9개의 센서부위 중 8개와 위치가 일치하는 부위 (직경 1.5 mm)에 S.typhi (10⁷cell/mL)를 5μL/spot 씩 가하여 스파팅(spotting) 한 후 ??-박스(wet-box)에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 잔여표면을 0.1 M Tris-HCl 완충용액 (pH 7.6)에 용해된 2% (w/v) BSA 용액으로 상온에서 1시간 동안 처리하고, 0.1% 트리톤 X-100이 함유된 0.1 M 트리스-HCl 완충용액 (pH 7.6)에 3번 세척한 후 공기 중에서 건조시킴으로써 멤브레인 스틱을 제작하였다.

d. 여과용 멤브레인의 제작

ⓐ 프리 필터용 유리 섬유 멤브레인의 제작

LAPS용 플라스틱 스틱에 접착된 니트로셀룰로오즈 멤브레인위에 덧 댈 유리 섬유 멤브레인 (3×3 ㎝)은 0.1% 트리톤 X-100이 함유된 0.1 M 트리스-HCl 완충용액 (pH 7.6)에 3번 세척한 후 공기중에서 건조시킴으로써 제작하였다.

ⓑ 면역결합체 제거용 니트로셀룰로오즈 멤브레인 제작

경쟁반응을 수행하는 시스템에서 분석물질과 항체-우레아제 접합체를 반응시킨 면역결합체가 신호발생과정에 참여하는 것을 막기 위하여 이를 여과 분리하여야한다. 이를 위해 미생물세포 크기보다 작은 세공크기의 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오즈 멤브레인을 선택하였다. 이것을 0.5% 카제인이 함유된 0.1% 트리스-HCI 완충용액 (pH 7.6) 내에 상온에서 1시간 동안 담가 표면처리를 수행한 후 0.1% 트리톤 X-100이 포함된 0.1 M 트리스-HCI 완충용액 (pH 7.6)에 3번 세척하였고 공기 중에서 건조시킴으로써 멤브레인 스틱을 제작하였다.

e. 면역분석법의 조작예

각각 다른 조건으로 제작한 LAPS 용 멤브레인 스틱을 시험하기 위해 분석물질인 S.typhi를 PBS 완충용액으로 희석하여 준비된 표준시료에 대한 응답을 구하였다. 항체-우레아제 접합체를 0.5% 카제인과 0.1% 트읜(Tween) 20이 함유된 0.1 M 트리스-HCl 완충용액 (pH 7.6)으로 희석시켰다. 이와 같이 준비된 분석물질과 항체-효소 접합체를 각각 100 ㎕와 25 ㎕을 혼합한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. LAPS 장치 중 필터 유니트(filter unit)에 분석물질이 고정화시킨 니트로셀룰로오즈 멤브레인 스틱과 면역결합체 제거용 니트로셀룰로오즈 멤브레인 그리고 프리필터용 유리 섬유 멤브레인을 아래로부터 순서대로 위치시킨 후 그 상부에 미생물세포와 항체-효소 접합체 간 면역결합체가 함유된 반응혼합물 (100 μL)을 분주하였다. Syrunge pump (모델 : KDS210, kd-Scientific 사, 미국)를 이용하여 멤브레인 하부에 진공을 걸어 약 10분간 여과시킨 후 0.05% 트읜 20이 함유된 10 mM PBS 완충용액 1 mL를 추가하여 5분간 세척하였다. LAPS 필터유니트 내의 스틱에 부착된 니트로셀룰로오즈 멤브레인으로부터 그 상부의 여과용 두 멤브레인을 제거하였고, 그 멤브레인 스틱을 LAPS 장치의 0.1 M 요소 (30 mL) 기질용액이 포함된리더 체임버 (reader chamber) 내에 위치시켰다. 신호발생원인 우레아제로부터의 신호는 효소반응에 의해 야기되는 pH 상승을 LAPS에 의해 감지하여 측정하였다.

< 본 면역분석법의 변수 최적화 및 최적 조건 >

본 발명에서는 항원-항체 반응과 면역결합체의 분리에 효과적인 여과방식을 이용하여 시료 내 포함된 불순물 입자들을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 또한 면역 구성성분의 수를 감소시킬 수 있는 경쟁여과면역분석법을 구성하였고, 그 측정민감도에 대한 변수 최적화 그리고 최적조건 하에서 성능평가를 수행하였다.

분석시스템의 성능을 향상시키기 위해 여러 변수에 대한 실험을 수행하였다.

우선 경쟁 부착반응에서 주요변수 중 하나는 항체-효소 접합체 농도로서 과·소량 여부에 따라 경쟁 반응의 경향이 상이하게 전개될 수 있다. 과량의 항체가 사용될 경우 이에 대한 두 분석물질 간 경쟁 반응이 약화되므로 분석민감도가 낮아지고, 반면에 소량이 사용되면 경쟁반응은 강화되지만 고체 상에 포획되어 형성되는 면역결합체의 양이 감소되므로 신호세기가 감소된다. 이러한 이유로 경쟁반응과 신호발생에 균형을 맞출 수 있는 적절한 농도의 선택이 중요하다.

두 번째 변수로는 항원-항체 반응 시 노출된 화학적 조성이 중요한데 이는 다양한 아미노산으로 구성된 단백질 분자들이 화학조건 (예: pH, 비반응성 단백질 존재 여부)에 따라 비특정 부착 등 분석특성을 변화시키기 때문이다.

세 번째 변수로써 프리필터의 종류인데 이는 제조회사에 따라 다른 세공특성을 지닐 뿐만 아니라 그 두께마저 서로 상이하기 때문에 이를 이용하여 분석성능과 재현성을 조절할 수 있기 때문이다.

a. 항체-효소 접합체 농도

경쟁부착반응에서 신호생성원인 탐지항체(항체-효소 접합체)를 과량으로 사용할 경우 액상에 존재하는 분석물질과 고체 상에 고정화된 분석물질 간 항체에 대한 부착경쟁이 최소화되므로 측정민감도가 현저히 저하된다. 반면에, 항체를 매우 적게 사용하면 부착반응에 대한 경쟁은 강화되지만 항체-효소 접합체와 고정화된 분석물질 간의 반응에 의하여 형성되는 신호발생에 필요한 면역결합체의 절대량이 감소된다. 이와 같은 고체 상에서의 반응을 최대로 유도하기 위해 미반응 항체-효소 접합체를 포획하는 고정화된 분석물질을 과량으로 사용하였다.

측정민감도에 대한 최적 항체-효소 접합체의 농도를 결정하기 위해 경쟁여과면역분석시스템을 구성하고 (도면 1 참조) 신호 발생원 농도를 변화시키며 분석물질의 존재(10⁵cells/ml)시에 발생된 신호를 LAPS 장치를 이용하여 측정한 후 이 값을 잡음 (즉, 분석물질 부재 하에서의 신호)에 대한 비율 (signal-to-noise (S/N) ratio)로 계산하여 도식화하였다. 즉, 분석물질이 존재할 때와 존재하지 않을 때의 신호의 변화가 클수록 S/N ratio 값이 커지게 되고, 이는 민감도가 높다는 것을 의미한다. 이 결과는 도 2에 도시되어 있다.

S/N ratio는, 예컨대 효소로 우레아제를 사용할 경우에 항체-우레아제 접합체의 농도가 1 ㎍/mL 일 경우 가장 높게 나타난 반면에 상기의 중합체 농도보다 높거나 낮은 영역에서는 감소하는 것으로 나타났다. 이 결과는 중합체의 농도가 낮아질수록 경쟁이 강화되어 측정민감도가 증가될 것이라고 예측한 부착경쟁 이론과는상반되는 것이다. 실제로, 항체-효소 접합체의 양이 적어지게 되면 신호발생을 위해 고체 상에 포획된 미반응 항체-효소 접합체의 절대량이 감소하므로 결국 발생된 신호는 분석물질 부재 시에 측정되는 잡음 값에 접근하게 된다. 반면에, 최적농도보다 높은 항체-효소 중합체를 사용하는 경우 부착경쟁의 약화에 따른 민감도 감소뿐만 아니라 분석물질과의 면역반응에 참여하지 못한 미반응 중합체의 증가에 따른 비특이적 반응이 증가하게 된다. 따라서 시험된 분석법의 분석민감도를 나타내는 S/N 비율에 대한 최적 항체-우레아제 접합체의 농도는 1 ㎍/mL인 것으로 결정되었다.

b. 항원-항체 반응을 위한 화학적 환경

분석불질과 항체간의 면역반응은 이와 같은 면역반응성분들이 노출된 용액의 산성도와 이온농도와 같은 화학적 환경을 최적화 함으로써 증진될 수 있다. 이러한 화학적 조건들은 아미노산으로 구성된 단백질 분자들의 전하상태를 조절하므로 반응성분들간의 상호작용을 증가시킬 수 있다. 멤브레인을 이용한 여과방식의 분석법에서 상기한 인자들은 원치 않는 비특이 부착을 최소화하기 위해 비반응성 단백질 (예를 들어, 소의 혈청 알부민 또는 카제인) 로 표면 처리된 멤브레인 세공을 이용하여 반응성분들의 이동성을 변화시킬 수 있다. 더욱이, 적절한 완충용액 이온은 그 용액의 농도와 산성도가 일정하더라도 면역반응을 강화시킬 수 있는 것으로 나타났다.

면역반응용액의 최적 화학적 조성을 결정하고자 용액의 산성도와 이온농도는 생리적 조건으로 고정시켰고 완충용액 이온과 비반응성 단백질 그리고 계면활성제의 종류를 변수로 선택하였다. 10 mM PBS·트읜 20, 100 mM 트리스·트읜 20, BSA/트리스·트읜 20, BSA/트리스·트리톤 X-100을 사용하여 분석물질이 없을 때(0 cells/ml)와 분석물질이 존재할 때(10⁵cells/ml)의 신호의 크기와 S/N ratio를 측정하여 도 3에 도시하였다. 측정민감도의 지표로 사용된 S/N ratio는 비반응성 단백질 (예컨대, 소의 혈청 알부민(BSA)) 의 존재하에서 현저히 향상된 반면 이온과 계면활성제의 종류에 대해서는 크게 변화되지 않는 것으로 나타났다. 이 결과로부터, 분석물질 운반용액에 첨가된 소의 혈청 알부민이 면역반응 성분들을 비특이적 부착으로부터 보호함으로써 면역반응을 더욱 강화시키는 것으로 생각된다. 또한, 상기의 비반응성 단백질은 단독으로 혹은 트읜 20 그리고 트리톤 X-100 과 같이 비교적 순한 계면활성제와 혼합하여 사용할 수 있다. 이와 같은 성분들은 고체표면상의 흡착 자리를 막아줄 뿐만 아니라 액체-고체 계면에서의 항원-항체 반응이 적절히 유도되도록 면역반응성분들과 상호 작용하는 것으로 판단된다. 참고로, 다른 구성성분들로 이루어진 분석시스템들을 이용한 분석 시 각각 다른 최적 비반응성 물질들을 요구하게 된다. 면역분석에서 가장 일반적으로 사용되는 비반응성 단백질로써 카제인(casein), 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin), 젤라틴(gelatin), 그리고 오브알부민(ovalbumin) 등이 있다.

c. 프리 필터용 유리 섬유 멤브레인

분석물질과 항체-효소 접합체간 면역결합체를 고체상에 포획된 항체-효소 접합체로부터 분리하기 위해, 위에서 설명한 바와 같이 최종 신호 발생 장소인 LAPS스틱 상부에 단순 표면 처리를 위한 니트로셀룰로오즈 멤브레인 (세공크기 0.45 ㎛)을 사용하여 여과하였다. 이와 같은 여과 과정을 통과한 미반응 항체가 분석물질을 고정화 되어있는 멤브레인 표면에서 면역반응시키기 위해서는 항원-항체 평형반응이 유도될 수 있도록 여과속도를 조절하여야한다. 그러나 분석물질인 미생물세포인 경우 크기가 매우 크고 그 외 다른 불순물 입자들에 의해 멤브레인의 세공이 막힐 경우 분석시간이 지체되고 멤브레인이 파손될 우려가 있다. 이와 같은 문제점들을 해결하기 위해 여과분석시스템 가장 상부에 유리 섬유 멤브레인을 위치시킴으로써 입자들의 예비여과(pre-filtration)에 사용하였다.

유리 섬유 멤브레인의 예비여과 성능은 세공크기와 멤브레인 두께에 차이가 있을 것으로 예측되어 제조회사와 생산공정이 다른 멤브레인들을 사용하여 분석물질의 농도 변화에 따른 신호의 변화정도를 시험하여 도 4에 도시하였다. 세 다른 제조회사에서 만든 두께가 비슷한 멤브레인 (Gelman, Millipore, 그리고 Fisher-G6)을 선택하여 면역여과분석에 사용한 결과 한 회사의 제품 (Gelman)은 양호한 농도응답을 제공한 반면에 다른 두 회사제품 (Millipore와 Fisher-G6)은 현저히 낮은 분석재현성을 나타내었다. 더욱이, 두께가 상대적으로 두꺼운 멤브레인의 경우 (Fisher-G8) 신호를 생성하는 최종 신호발생장소인 세 번째 층인 LAPS 스틱위에 장착된 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오즈 멤브레인에 손상을 야기하여 신호를 측정할 수 없었다. 또한, 이것은 항체-우레아제 접합체와 분석물질과의 결합체의 제거를 목적으로 사용하는 두 번째 층의 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오즈 멤브레인에 손상을 야기시켜 미생물세포와 중합체간의 제거가 불완전해지므로 위양성 결과를 초래하였다.

< 비교예 >

본 발명에서 개발된 경쟁여과면역분석법의 성능 향상치를 측정하기 위해 기존의 면역분석법과 비교 분석하였다. 기존의 면역 분석법 중, 하나는 샌드위치형 여과면역분석법으로 상이한 두 기능을 갖는 두 종류의 항체를 이용하여 분석물질의 검출을 수행하는 것이고, 다른 하나는 여과과정 중 크기에 의해 야기되는 걸림 현상을 이용한 단순 여과면역분석법이다.

a. 샌드위치형 여과면역분석법

항체-스트렙타비딘 접합체의 제조 ;

Salmonella균 특이항체는 150 mM NaCl이 포함된 100 mM 포스페이트 완충용액 (반응용액, pH 7.0)으로 투석시킨 후 디메틸 황산화물에 용해된 20배 몰 과잉농도의 SMCC와 4℃에서 4시간 동안 반응시킴으로서 활성화 시켰다. 과량의 SMCC를 세파덱스(Sephadex) G-15 젤 크로마토그래피에 의해 제거하고, 이것을 아래와 같이 활성화된 스트렙타비딘과 바로 접합반응(conjugation) 시켰다.

스트렙타비딘(SA)의 활성화를 위해 스트렙타비딘을 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산이 함유된 반응용액에 용해시키고 몰농도가 2배 더 높은 SPDP와 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기의 스트렙타비딘 분자 상에 설프하이드릴(sulfhydryl) 반응기를 생성시키기 위해 DDT (최종 100 mM)를 반응 혼합액에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 다시 반응시켰다. 과량의 시약들을 세파덱스 G-15 칼럼을 이용하여 제거하였다.

두 종류의 활성화된 반응물질, 즉 항체와 스트렙타비딘을 그 몰 비가 1:3이되도록 혼합하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 합성된 항체-스트렙타비딘 접합체의 정제는 다이아미노바이오틴-아가로즈 (diaminobiotin-agarose) 젤 층(1×2㎝)과 세파덱스 G-100 젤 층 (1×10 ㎝)의 이중으로 구성된 칼럼을 이용하여 수행하였다. 반응 혼합물 1 mL를 칼럼 내에 주입하고 시료가 젤 내로 모두 스며든 뒤 PBS로 세척하였다 (유속 1 mL/h). 유출부피가 10 mL에 도달했을 때 50 mM 아세테이트 완충용액 (pH 3.5)으로 교체하고 그 용액이 5 mL 유출된 후 다시 PBS를 운반용액으로 사용하였다. 각 유출액 내 단백질을 브래드폴드 (Bradfold) 분석방법에 의해 측정하였고, 접합체의 합성 및 정제를 비환원 조건하에서 SDS-PAGE (7% gel, β-mercaptoethanol 배제) 분석에 의해 확인하였다.

LAPS 장치용 니트로셀룰로오즈 멤브레인 스틱의 제작 ;

BSA-바이오틴을 고정화시킨 니트로셀룰로오즈 멤브레인 스틱의 제작

BSA-바이오틴 중합체를 준비하기 위하여 BSA는 150 mM NaCl이 포함된 100 mM 포스페이트 완충용액 (pH 7.0)에 용해하여 준비하고 디메틸 황산화물에 용해된 NHS-LC-LC-바이오틴을 40배 몰로 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그리고 미반응된 과량의 NHS-LC-LC-바이오틴을 투석과 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 제거하였다. 미생물세포의 포획을 위해 먼저 LAPS 장치 제조사로부터 공급받은 플라스틱 스틱 상의 기존 멤브레인을 제거한 후 니트로셀룰로오즈 멤브레인 (세공크기는 0.45 ㎛, 혹은 12 ㎛ )으로 대체하여 사용하였다. 0.5% (v/v) 글루타르알데히드 용액으로 처리하고 세척 후 건조시킨 니트로셀룰로오즈 멤브레인을 양면 테이프 위에 접착하였다. LAPS 장치 내 9개의 센서부위 중 8개와 위치가 일치하는부위 (직경 1.5 mm)에 BSA-바이오틴 결합체(1mg/mL)를 5μL/spot 씩 가하여 스파팅(spotting) 한 후 ??-박스에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 잔여표면을 0.1 M Tris-HCl 완충용액 (pH 7.6)에 용해된 2% (w/v) BSA 용액으로 상온에서 1시간 동안 처리하고, 0.1% 트리톤 X-100이 함유된 0.1 M 트리스-HCl 완충용액 (pH 7.6)에 3번 세척한 후 공기 중에서 건조시킴으로써 멤브레인 스틱을 제작하였다.

조작예 ;

이 시스템에서는 포획기능을 부여하는 항체-SA 접합체와 탐지기능을 제공하는 항체-우레아제 접합체를 사용하여 면역분석을 수행하였다. 검출하한 농도를 결정하기 위한 LAPS용 스틱의 제작은 니트로셀룰로오즈 멤브레인 (세공크기 0.45 ㎛)을 접착하여 만든 스틱 위에 BSA-바이오틴 결합체 (농도: 1 ㎍/mL, 5 μL/spot)를 부동화 하였다. 분석물질인S. typhi를 10 mM PBS (pH 7.4) 완충용액을 사용하여 0 cells/mL, 10³cells/mL, 10⁴cells/mL, 10⁵cells/mL의 표준농도로 희석하였다. 액상 면역반응을 위해 2% BSA와 0.1% 트리톤 X-10 이 함유된 0.1 M 트리스-HCI 완충용액 (pH 7.6)으로 희석된 항체-스트렙타비딘 접합체 (농도: 0.5 ㎍/mL, 부피: 25 μL/batch)와 항체-우레아제 접합체 (농도: 1 ㎍/mL, 부피: 25 μL/batch)를 표준농도로 희석된 분석물질 (부피:100 μL/batch)과 혼합하였다. 1시간 반응 후 시료에서 일정량 (100 μL)을 취해, 필터 유니트에 장착된 LAPS용 스틱에 가하였다. 여과 (속도: 10 μL/분)를 마친 후, 0.05% 트읜 20이 첨가된 10 mM PBS (pH 6.5) 완충용액을 사용하여 세척하였다. LAPS용 스틱을 필터 유니트에서 빼 내어, 0.1 mM요소 (부피: 30 mL)가 함유된 LAPS 리더 체임버에 삽입한 후, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 센서를 작동시켜 수치화 된 신호를 발생시켰다. 면역반응을 포함하여 총 분석 시간은 1시간 30분이 소요되었다.

b. 단순 여과면역분석법

본 시스템의 기본원리는 세공보다 큰 물질의 크기로 이한 걸림 현상을 이용하여 분석물질을 포획 및 검출하는 것이다. 검출하한농도를 결정하기 위해 LAPS용 스틱은 2% BSA가 함유된 0.1 M 트리스-HCl 완충용액 (pH 7.6)으로 니트로셀룰로오즈 멤브레인 (세공크기 0.45 ㎛)을 접착하여 만든 스틱을 표면처리 하여 제작하였다. 분석물질인 S.typhi를 10 mM PBS (pH 7.4) 완충용액을 사용하여 0 cells/mL, 10³cells/mL, 10⁴cells/mL, 10⁵cells/mL의 표준농도로 희석하여 수행하였다. 액상 면역반응을 위해 2% BSA와 0.1% 트리톤 X-100 이 함유된 0.1 M 트리스Tris-HCl 완충용액 (pH 7.6)으로 희석시킨 항체-우레아제 접합체 (농도: 1 ㎍/mL, 부피: 25 μL/batch)를 여러 농도로 희석시킨 분석물질 (부피: 100 μL/batch)과 혼합하였다. 1 시간 반응 후 시료의 여과 및 신호발생 과정은 위에서 언급한 샌드위치형 면역여과분석법과 동일하다.

c. 본 발명 : 경쟁 여과면역분석법

상기한 두 면역분석법과 비교되는 경쟁여과면역분석법은 액상의 항원과 고체표면에 고정화되어 있는 항원간의 항체에 대한 부착경쟁을 기본 원리로 한다. 검출하한 농도를 측정하기 위한 실험에 사용할 LAPS용 스틱의 제작은 니트로셀룰로오즈멤브레인 (세공크기 0.45 ㎛)을 접착하여 만든 스틱 위에 분석물질인S.typhi(농도: 10⁷cells/mL, 5 μL/spot)를 화학적인 방법 (예컨대, 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde))을 사용하여 일정하게 고정화하였다. 분석물질인S.typhi를 10 mM PBS (pH 7.4) 완충용액을 사용하여 0 cells/mL, 10³cells/mL, 10⁴cells/mL, 10⁵cells/mL의 표준농도로 희석하여 수행하였다. 액상 면역반응을 위해 2% BSA와 0.1% 트리톤 X-100 이 함유된 0.1 M 트리스-HCl 완충용액 (pH 7.6)으로 희석시킨 항체-우레아제 접합체 (농도 1 ㎍/mL, 부피: 25 μL/batch)를 여러 농도로 희석시킨 분석물질 (부피: 100 μL/batch)과 혼합하였다. 1 시간 반응 후 상기의 시료에서 일정량 (100 μL)을 취해, 필터 유니트에 장착된 LAPS용 스틱에 가하였다. LAPS용 스틱 위에는 도 1에서 설명한 대로 두 가지 멤브레인을 추가하여 필터 단위를 구성하였다. 여과 (속도: 10 μL/분)를 마친 후, 0.05% 트윈 20이 첨가된 10 mM PBS (pH 6.5) 완충용액을 사용하여 세척하였다. LAPS용 스틱을 필터 유니트에서 빼냄과 동시에 스틱 위에 덧댄 두 멤브레인 층을 제거한 후 위에서 설명된 바와 같이 신호를 측정하였다.

d. 결과 및 고찰

상기한 세 면역분석법으로부터 발생된 신호수치를 사용하여 각 농도응답곡선을 작성한 후 각 면역분석법의 분석성능을 상호 비교하여 도 5에 도시하였다.

상기의 실시예에서 결정된 최적조건 하에서 경쟁면역분석시스템의 측정민감도를 평가하고자 기존의 두 다른 미생물 면역검출방법으로부터 구한 성능과 농도응답곡선 상에서 비교하였다.

첫번째 비교 시스템으로, 서로 다른 두 가지 기능을 가진 접합체 (포획항체-스트렙타비딘 접합체 그리고 탐지항체-우레아제 접합체)를 이용하여 검출하는 샌드위치 여과면역분석법 (sandwich format)을 사용하였다. 이 경우, 상기한 두 접합체를 분석물질인 미생물세포와 반응시켜 면역결합체를 형성시킨 후 바이오틴이 고정화된 니트로셀룰로오즈 멤브레인을 단지 통과시킴으로써 고체표면에서 스트렙타비딘-바이오틴 반응에 의한 포획반응을 수행한다.

두 번째 비교 시스템으로, 탐지항체-우레아제 접합체만 사용하여 검출하도록 고안된 단순여과면역분석법 (filtration format)을 선택하였다. 면역반응성분인 항체-효소 접합체를 분석물질과 반응시켜 형성된 면역결합체는 니트로셀룰로오즈 멤브레인 상에서 여과된다.

이와 같은 두 비교 시스템에서는 경쟁면역분석에서와는 달리 분석물질이 멤브레인 표면상에 포획되거나 여과된 면역결합체로부터 신호를 발생시키므로 그 신호세기는 분석물질 농도와 정비례한다.

도 5에 도시된 농도응답곡선으로부터, 본 발명을 통하여 새로 개발된 경쟁 면역여과분석시스템의 분석민감도를 대표하는 인자인 측정하한농도는 약 10³cells/mL로써 단순 여과시스템(측정하한농도 ; 10³∼10⁴cells/ml)의 경우보다 약간 낮게( 즉, 높은 분석민감도) 나타났고, 샌드위치 시스템(측정하한농도 ; 10⁴∼10⁵cells/ml)과 비교할 때 10 ∼ 100 배정도 낮은 측정하한농도 즉, 높은 민감도를 나타내었다. 이러한 샌드위치 시스템에 대한 결과는 본 발명에서 사용된 항체는 한 종류의 단일클론 항체로써 분석물질과 샌드위치를 형성하여야하는 서로 다른 기능을 갖는 두 종류의 항체-효소 접합체들 간의 분석물질 분자상의 인지부위에 대한 부착경쟁이 야기되어 발생한 것으로 추측된다.

한 종류의 항체-효소 접합체를 사용하는 분석시스템 중 단순 여과면역분석법의 경우 상대적으로 높은 민감도를 나타내지만, 크기의 차이를 이용한 여과방법을 이용한 시스템이므로 시료 내의 다른 입자 (예: 황사, 먼지, 다른 미생물 등)에 의해 멤브레인 세공의 막힘으로 인한 여과속도 조절의 어려움 또는 미반응된 항체-효소 접합체의 걸림 현상에 의한 비특이적 신호등이 발생될 수 있다. 더욱이, 단순히 멤브레인 상에 여과된 면역결합체는 분석공정 중 우연하게 유실될 수 있으므로 분석재현성이 현저히 감소될 수 있다.

반면에, 경쟁 여과면역분석 시스템의 경우 10³cells/mL 정도의 높은 민감도를 보일 뿐 아니라 신호를 발생하는 항체-우레아제 중합체가 고정화 모체인 멤브레인 표면에 항원-항체 반응에 의해 부착되기 때문에 단순 여과시스템에서와는 달리 신호가 손실될 우려가 최소화된다. 또한, 분석시스템을 구성하는 구성성분의 수가 한 종류 (예 ; 항체-우레아제 접합체) 로 줄어들어 항체의 제조와 관리에 있어서 기존 샌드위치 여과면역분석시스템과 비교하여 간편하다. 또한 멤브레인에 항체를 고정화시켜 분석물질을 포획하여 신호를 얻어야하는 기존의 샌드위치여과면역분석법에서는 미반응 물질을 제거하기위한 세척과정이 필요하지만, 본 발명에서는 분석물질이 멤브레인에 고정되어 미반응 항체-효소 접합체를 포획하므로 세척과정이 필요없기 때문에 보다 간편하고 신속하게 분석을 수행할 수 있다. 또한 기존의 샌드위치여과면역분석법에 의하여 크기가 다른 여러 물질( 예 ; 미생물과 단백질)을 동시에 분석하고자 할 때에는 크기가 큰 분석물질의 면역결합체가 통과할 수 있을만큼 큰 세공크기(>5㎛)의 멤브레인이 사용되어 단백질같이 크기가 작은 물질은 분석민감도에서 손해를 보았다. 그러나 본 발명에서는 미반응 항체-효소 복합체를 통과시켜 신호를 얻으므로 분석물질의 종류에 항체-효소 복합체가 통과 할 수 있는 크기만 되면 세공크기가 매우 작아도 분석이 가능하므로 크기가 작은 물질의 분석민감도의 희생 없이 크기가 다른 여러 가지 물질을 동시에 분석할 수 있다.

고체표면에 고정화된 항체를 이용한 고상 면역분석 시 분석물질의 크기가 매우 큰 경우 (예를 들어, 미생물 세포) 그 크기에 기인하여 항원-항체 반응이 방해를 받을 수 있다. 특히, 세포는 용액 내에서 침전효과에 의해 면역결합체 형성에 필요한 적절한 물질전달공정의 조절이 어려우며 또한 고체표면에 의해 공간적 배열이 방해받을 수 있다. 또한 고체표면에서의 항원-항체 반응은 액체상의 성분이 고정화된 항원 층으로의 확산을 전제하므로 상당한 반응시간이 요구되지만, 멤브레인으 고정화모체로 사용하는 여과방식의 분석시스템을 이용하면 그 물질전달에 소요되는 분석시간이 현저히 단축된다.

본 발명에서 개발된 경쟁여과면역분석법은 기존의 면역분석법과 비교하여 포획기능과 신호발생기능을 동시에 갖는 하나의 항체-효소 접합체를 사용한 항원-항체 반응과 다중의 여과필터와 분석물질이 고정화된 필터를 통과시키는 여과반응을 결합하여 분석민감도의 희생 없이 분석과정에서 요구되는 구성성분 수를 감소시켰고 따라서 경제적인 장점과 분석시간을 절약하는 효과를 제공하였다.

Claims (8)

1. (1) 분석물질과의 면역반응에 의한 포획기능과 신호발생원인 효소와의 결합에 의한 탐지기능을 모두 갖는 한 종류의 항체와 상기의 신호발생원인 효소가 접합된 항체-효소 접합체를 분석물질이 포함된 액상의 시료에 가하여 면역반응 시키고,

   (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 분석물질과 항체-효소 접합체 간의 면역결합체 및 미반응 항체-효소 접합체를 포함하는 혼합액을 예비여과 기능의 프리필터와 면역결합체 제거를 위한 여과용 멤브레인 필터에 차례로 통과시켜 면역결합체와 기타 면역응집물을 제거시킨 후,

   (3) 상기 (2) 단계에서 여과된 미반응 항체-효소 접합체를 분석물질을 고정화시킨 포획용 멤브레인에서 면역반응 시킴으로써 포획한 후,

   (4) 상기 (3) 단계에서 만들어진 면역결합체에 포함된 효소에 특이적인 기질을 가하여 얻은 효소-기질반응을 통해 분석물질의 유무 및 농도를 측정하는 단계를 포함하는 경쟁여과면역분석방법.
2. (1) 분석물질과의 면역반응에 의한 포획기능과 신호발생원인 효소와의 결합에 의한 탐지기능을 모두 갖는 한 종류의 리간드와 상기의 신호발생원인 효소가 접합된 리간드-효소 접합체를 분석물질이 포함된 액상의 시료에 가하여 면역반응 시키고,

   (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 분석물질과 리간드-효소 접합체 간의 면역결합체 및 미반응 리간드-효소 접합체를 포함하는 혼합액을 예비여과 기능의 프리필터와 면역결합체 제거를 위한 여과용 멤브레인 필터에 차례로 통과시켜 면역결합체와 기타 면역응집물을 제거시킨 후,

   (3) 상기 (2) 단계에서 여과된 미반응 리간드-효소 접합체를 분석물질을 고정화시킨 포획용 멤브레인에서 면역반응 시킴으로써 포획한 후,

   (4) 상기 (3) 단계에서 만들어진 면역결합체에 포함된 효소에 특이적인 기질을 가하여 얻은 효소-기질반응을 통해 분석물질의 유무 및 농도를 측정하는 단계를 포함하는 경쟁여과면역분석방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 효소가 우레아제인 것을 특징으로 하는 경쟁여과면역분석방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 분석물질이 세균, 단백질, 세포 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 경쟁여과면역분석방법.
5. 제 4 항에 있어서, 세균, 단백질 및 세포 중 둘 이상을 하나의 필터상에서 분석하는 것을 특징으로 하는 경쟁여과면역분석방법.
6. 분석물질과의 면역반응에 의한 포획기능과 신호발생원인 효소와의 결합에 의한 탐지기능을 모두 갖는 한 종류의 항체 또는 리간드와 상기의 신호발생원인 효소가 접합된 항체-효소 접합체 또는 리간드-효소 접합체 ;

   예비여과 기능의 프리필터, 여과용 멤브레인 필터 및 분석물질이 고정화된 포획용 멤브레인을 포함하여 구성되는 다중 필터 및 ;

   상기의 효소에 특이적인 기질을 포함하여 구성되는 면역분석용 키트.
7. 제 6 항에 있어서, 다중 필터가 카제인, 소의 혈청 알부민, 젤라틴 또는 오브알부민 중에서 선택된 비반응성 단백질 또는 상기의 비반응성 단백질과 계면활성제와의 혼합액으로 표면처리된 세공을 포함하는 멤브레인을 포함하여 구성되는 면역분석용 키트.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 예비여과 기능의 프리필터가 유리 섬유 멤브레인인 면역분석용 키트.