JP2007524098A - 結合対の特異的な結合反応の媒体として使用するための水溶液 - Google Patents
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Abstract
Description
a)pHを制御するためのバッファー;
b)一般式I:R1-[[CR2R3]p-O]q-R4(式中、R1は水素またはヒドロキシ基であり、R2はそれぞれのユニットで独立して水素またはヒドロキシ基であり、R3は水素、メチル基、エチル基であり、R4は水素またはアルキル基であり、pは2から10の整数であり、qは1から100の整数であり、但し、この化合物は少なくとも2つのヒドロキシ基を有する)で規定される化合物;
ポリオール;
糖;
からなる群から選択される化合物A;及び
c)非イオン性界面活性剤:
を含む溶液により解決される。
本発明の好ましい実施形態においては、水溶液にはさらに、非特異的な抗体結合を免疫学的にブロックするのに有効な量のタンパク質が含まれる。このタンパク質は、好ましくは、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、カゼイン、ウシ胎仔血清からなる群から選択される。さらに好ましくは、タンパク質は、0.1から2%(w/v)の範囲、さらに好ましくは0.5から1.5%(w/v)の範囲の濃度で水溶液中に存在している。これらのタンパク質は、イムノアッセイで用いられる抗体の何れにも認識されないものとする。この認識されないタンパク質は、試料中に存在しうるような分子または化合物による非特異的な抗体結合の免疫学的なブロックを可能にする。
a)置換基R1およびR2を有する置換フェニル残基(R1-Ph-R2)(式中、R1はC1〜C9のアルキル基であり、R2は-O-[CH2-CH2-O]a-H基である。式中、「a」は5から40の整数であり、式中、R2は、R1に対してパラ、メタ、またはオルト位に位置する)、
b)
からなる群から選択される一般式の化合物を含む。
a)本発明の水溶液を含有する容器;
b)その上に固定化した、検体を捕捉するための相補的な結合要素を含むキャリヤ;及び
c)所望により、相補的な結合要素と結合した検体を免疫学的に認識する試薬(ここで、該試薬(抗体)は検出手段と共役している);及び
d)所望により、前記検出手段と反応して検出可能な反応生成物を生成する試薬:
を含むキットを提供するものである。
a)pHを制御するためのバッファー;
b)一般式I:R1-[[CR2R3]p-O]q-R4(式中、R1は水素またはヒドロキシ基であり、R2はそれぞれのユニットで独立して水素またはヒドロキシ基であり、R3は水素、メチル基、エチル基であり、R4は水素またはアルキル基であり、pは2から10の整数であり、qは1から100の整数であり、但し、この化合物は少なくとも2つのヒドロキシ基を有する)で規定される化合物;
ポリオール;
糖;
からなる群から選択される化合物A;及び
を含むことを特徴とする。
100μlの希釈した捕捉抗体C2(PBSバッファーにおける最終濃度1μg/ml)を、マイクロタイタープレート(C8 StarWellモジュール、NUNC)の各ウェルに添加し、プレートをプレートシーラーでカバーした。捕捉抗体は、CRP(C反応性タンパク質)に対するものである。次いで、プレートを室温で5時間インキュベートした。プレートシーラーを取り除き、各ウェルあたり300μlの洗浄バッファー(10mMリン酸、350mM NaCl、0.05% Tween、pH7.4)でプレートを4回洗浄した。次いで、各ウェルに200μlのブロッキング溶液(PBSバッファー pH7.4、1% BSA)を添加した。プレートシーラーでカバーした後、プレートを4℃で一晩インキュベートした。検体CRP(C反応性タンパク質)をウサギ血清中で希釈(0〜5ng/ml)し、室温で30分間インキュベートした。ビオチン標識検出抗体C6(CRPに対するもの)を異なる試料バッファー、および参考例バッファー中で希釈した(表1を参照)。各調合液の最終的な濃度は、4μg/mlであった。CRP含有ウサギ血清標準を、検出抗体を含有する試料バッファーを用いて1:2に希釈した。調合液を、室温で30分間インキュベートした。プレートシーラーを取り除き、300μlの洗浄バッファーでプレートを4回洗浄した。洗浄バッファーの残存物は、テーピングしてプレートを乾燥させることにより完全に取り除いた。ウェルに、100μlのCRP調合液を添加した。プレートをプレートシーラーでカバーし、穏やかに振盪しながら室温で4時間インキュベートした。その後、プレートを再度洗浄した。各ウェルに、100μlの希釈NeutrAvidin(商標)-ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(PBSバッファーにおける最終濃度0.05μg/ml)を添加した。プレートを、穏やかに振盪しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを再度洗浄した。等体積のImmunoPure(登録商標)TMB Substratの2種の溶液を混合し、ただちに100μlを各ウェルに添加した。所望の色が呈されるまで、プレートを室温でインキュベートした。色は、透明から明るい青色に変化した。最終ステップでは、各ウェルに150μlの2 M H2SO4を添加することにより反応を停止させ、450nmにおいてELISAプレートリーダー(Molecular devices)で吸光度を読み取った。マトリックス効果に対する異なるバッファーの影響を、図1にプロットした。表1は、試験の結果を示す。表1では、非特異的結合、低親和性結合、およびマトリックス効果の低減を、「結果」欄に「+」として示している。「+」の数は、参考例バッファー(「-」)との比較において、非特異的結合、低親和性結合、およびマトリックス効果が低減された量を示している。図1は、CRP濃度(ng/ml)に対してプロットした、450nmにおける吸光度としてのCRPに結合した検出抗体C6の量を示している。試料バッファーIが、最も良好な感度を示している。参考バッファーの低い感度は、強いマトリックス効果に起因している。
次のアッセイにおいては、250μlの希釈した捕捉抗体P3(ポリクローナルウサギ抗プロテアーゼ、自己調製物、PBSバッファーにおける最終濃度1g/ml)を、マイクロタイタープレート(C8 StarWellモジュール、NUNC)の各ウェルに添加し、プレートをプレートシーラーでカバーした。プレートを室温で4時間インキュベートした。その後、プレートシーラーを取り除き、各ウェルあたり300μlの洗浄バッファー(10mMリン酸、350mM NaCl、0.05% Tween(登録商標)、pH7.4)でプレートを4回洗浄した。次いで、各ウェルに200μlのブロッキング溶液(PBSバッファーpH7.4、1% BSA)を添加した。プレートをプレートシーラーで再度カバーし、4℃で一晩インキュベートした。ビオチン標識ポリクローナル検出抗体P2(ポリクローナルウサギ抗プロテアーゼ、自己調製物)を、参考例バッファーII、または試料バッファーI(表1を参照)中でそれぞれ希釈し(各調合液の最終濃度は10μg/ml)、ウェルに添加した(各ウェルあたり250μl;5倍の複製)。プレートを室温で2時間インキュベートした。プレートシーラーを取り除き、300μlの洗浄バッファーでプレートを4回洗浄した。洗浄バッファーの残存物は、テーピングしてプレートを乾燥させることにより完全に取り除いた。各ウェルに、250μlの希釈NeutrAvidin(商標)-ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(PBSバッファーにおける最終濃度0.5μg/ml)を添加した。プレートを、穏やかに振盪しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを再度洗浄した。等体積のImmunoPure(登録商標)TMB Substratの2種の溶液を混合し、ただちに100μlを各ウェルに添加した。所望の色が呈されるまで、プレートを室温でインキュベートした。色は、透明から明るい青色に変化した。最終ステップでは、各ウェルに150μlの2 M H2SO4を添加することにより反応を停止させ、450nmにおいてELISAプレートリーダー(Molecular devices)で吸光度を読み取った。捕捉抗体P3に非特異的に結合するポリクローナル検出抗体P2の非特異的な結合により生じる高いバックグラウンドシグナルに対する2種の異なるバッファーの影響を、図2にプロットする。図2は、本発明による試料バッファーIを用いたことによる、バックグラウンドシグナルの減少を示している。この実験においては、検体は用いていない。さらに、抗体としてはポリクローナル血清を用いた。ポリクローナル血清は、ターゲットタンパク質に対応する多くの異なる抗体を含む。多くの抗体が、低い、またはより低い親和性で結合する一方、いくつかの抗体は中程度の親和性で結合し、1種またはごく少ない抗体だけが高い親和性で結合する。図2に示すように、本発明によるバッファーの使用は、個々の抗体の低親和性結合を防止し、中程度の親和性結合を少なくとも低減する。結果として、このようなアッセイにおいて検体が一度添加されると、本発明による水溶液の性質によって、シグナル対ノイズ比率が改善される。
Claims (27)
- 第1の結合要素がこれと相補的な第2の結合要素を認識する結合対の特異的な結合反応の媒体として使用するための水溶液であって、
a)pHを制御するためのバッファー;
b)一般式I:R1-[[CR2R3]p-O]q-R4(式中、R1は水素またはヒドロキシ基であり、R2はそれぞれのユニットで独立して水素またはヒドロキシ基であり、R3は水素、メチル基、エチル基であり、R4は水素またはアルキル基であり、pは2から10の整数であり、qは1から100の整数であり、但し、この化合物は少なくとも2つのヒドロキシ基を有する)で規定される化合物;
ポリオール;
糖;
からなる群から選択される化合物A;及び
c)非イオン性界面活性剤:
を含む溶液。 - 非特異的な抗体結合を免疫学的にブロックするのに有効な量のタンパク質をさらに含む、請求項1に記載の水溶液。
- タンパク質が、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、カゼイン、ウシ胎仔血清からなる群から選択される、請求項2に記載の水溶液。
- タンパク質の濃度が、0.1から2%(w/v)の範囲、好ましくは0.5から1.5%(w/v)の範囲である、請求項2または3に記載の水溶液。
- 溶液がNaCl、KCl、NH4Clからなる群から選択される塩を含む、請求項1から請求項4のいずれかに記載の水溶液。
- 溶液が100mMから1.5M、好ましくは200mMから1M、より好ましくは200mMから800mM、さらに好ましくは200mMから600mM、最も好ましくは250mMから500mMのイオン強度を有する、請求項1から5のいずれかに記載の水溶液。
- バッファーが、Tris(トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、Pipes(ピペラジン-1,4-ビス-2-エタンスルホン酸)、Mes(4-モルホリノエタンスルホン酸)、Hepes(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン-エタンスルホン酸)、リン酸バッファーからなる群から選択される、請求項1から6のいずれかに記載の水溶液。
- 化合物Aが、ポリアルキレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、単糖類、二糖類、三糖類、サッカロース、マンノース、トレハロース、ポリオール、グリセロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1から7のいずれかに記載の水溶液。
- 化合物Aの濃度が、0.5から25%(v/v)の範囲、好ましくは2.0から20%(v/v)の範囲、より好ましくは2から15%(v/v)の範囲、さらに好ましくは2.0から10%(v/v)の範囲、さらにより好ましくは2.0から7.0%(v/v)の範囲、最も好ましくは5%(v/v)前後である、請求項1から8のいずれかに記載の水溶液。
- 非イオン性界面活性剤が、
a)置換基R1およびR2を有する置換フェニル残基(R1-Ph-R2)(式中、R1はC1〜C9のアルキル基であり、R2は-O-[CH2-CH2-O]a-H基であり、式中、「a」は5から40の整数であり、式中、R2は、R1に対してパラ、メタ、またはオルト位に位置する)、
b)
(式中、n、x、yおよびzは共に5から40の整数であり、Rは脂肪酸残基である)
からなる群から選択される一般式の化合物である、請求項1から9のいずれかに記載の水溶液。 - 非イオン性界面活性剤が、ドデシルポリ(エチレングリコールエーテル)m(式中、mは5から40の整数である);1-O-n-オクチル-β-D-グルコピラノシド(n-オクチルグルコシド);アルキルフェノールポリ(エチレングリコールエーテル)m(式中、mは5から40の整数であり、m=11(Nonidet P40(登録商標))であることが好ましい);1-O-n-ドデシル-β-D-グルコピラノシル(1-4)アルファ-D-グルコピラノシド;ドデシルポリ-(エチレングリコールエーテル)m(式中、mは5から40の整数であり、m=23(Brij35(登録商標))であることが好ましい);好ましくはポリ(オキシエチレン)(20)-ソルビタンモノオレエート(Tween(登録商標)80)、ポリ(オキシエチレン)(20)-ソルビタンモノラウレート(Tween(登録商標)20)、ポリ(オキシエチレン)(20)-ソルビタンモノパルミテート(Tween(登録商標)40)、ポリ(オキシエチレン)(20)-ソルビタンモノステアレートから選択されるポリ(オキシエチレン)(20)-ソルビタンモノ脂肪酸エステル;オクチルフェノールポリ(エチレングリコールエーテル)m(式中、mは5から40の整数であり、好ましくはm=10(Triton(登録商標) X-100)である)からなる群から選択される、請求項1から9のいずれかに記載の水溶液。
- 非イオン性界面活性剤の濃度が、0.1から1.0%(v/v)の範囲、好ましくは0.15から1.0%(v/v)の範囲、より好ましくは0.2から1.0%(v/v)の範囲、さらに好ましくは0.2から0.8%(v/v)の範囲、さらにより好ましくは0.25から0.6%(v/v)の範囲、最も好ましくは約0.25%(v/v)である、請求項1から11のいずれかに記載の水溶液。
- 非イオン性界面活性剤の化合物Aに対する比率が、1:15から1:25、好ましくは1:20前後である、請求項1から12のいずれかに記載の水溶液。
- 溶液がジチオスレイトールを含まない、請求項1から13のいずれかに記載の水溶液。
- pHが5.6から9.6の範囲、好ましくは6.0から9.0の範囲、より好ましくは6.5から8.0の範囲、最も好ましくは6.8から7.4の範囲に調整されている、請求項1から14のいずれかに記載の水溶液。
- 非特異結合、交差反応性、およびマトリックスのかく乱効果を低減する能力を有する、請求項1から15のいずれかに記載の水溶液。
- KD値が10-7Mを超えない低親和性結合を防止する能力を有する、請求項1から16のいずれかに記載の水溶液。
- KD値が10-7Mを超えない低親和性結合を防止し、KD値が10-7Mと10-8Mの間の範囲の中程度の親和性結合を少なくとも90%減少させる能力を有する、請求項1から17のいずれかに記載の水溶液。
- KD値が10-7Mを超えない低親和性結合を防止し、KD値が10-7と10-9の間の範囲の中程度の親和性結合を少なくとも90%減少させる能力を有する、請求項1から18のいずれかに記載の水溶液。
- 抗体の結合活性(親和性)、好ましくは固定化抗体の結合活性(親和性)を増大させる能力を有する、請求項1から19のいずれかに記載の水溶液。
- 好ましくは2から10倍の濃縮物、より好ましくは3から5倍の濃縮物である、請求項1から20のいずれか一項に記載の水溶液の濃縮物。
- 第1の結合要素が、これと相補的な第2の結合要素を特異的に認識して結合する結合対の結合反応のための媒体としての、請求項1から20のいずれか一項に記載の水溶液の使用。
- 抗体-抗原結合反応のための媒体としての、請求項1から20のいずれか一項に記載の水溶液の使用。
- レセプター-リガンド結合反応の媒体としての、請求項1から20のいずれか一項の水溶液の使用。
- 試料および試薬、好ましくはリガンド、レセプター、抗原、抗体の希釈バッファーとしての、または洗浄バッファーとしての、請求項1から20のいずれか一項に記載の水溶液の使用。
- 第1の結合要素がこれと相補的な第2の結合要素を認識する結合対の特異的な結合反応の間における、非特異的結合および/または交差反応性および/またはマトリックスのかく乱効果を低減するための方法であって、特異的な結合反応の媒体として請求項1から20の水溶液の使用を含む方法。
- 少なくとも1種の被験検体のイムノアッセイによる検出のためのキットであって、被験検体が、第1の結合要素がこれと相補的な結合要素と特異的に結合する結合対の第1の結合要素であり、
a)請求項1から20のいずれか一項に記載のバッファーを含有する容器;
b)その上に固定化した、検体を捕捉するための相補的な結合要素を含むキャリヤ;
c)所望により、相補的な結合要素と結合した検体を免疫学的に認識する試薬であって、検出手段と共役している試薬;及び
d)所望により、前記検出手段と反応して検出可能な反応生成物を生成する試薬:
を含むキット。
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