DD299142A7 - Immunenzymometrischer assay (iema) zur immunchemischen bestimmung von glykogenisophosphorylase bb (gb-bb), verfahren zur herstellung und verwendung des iema - Google Patents

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DD299142A7 DD34237290A DD34237290A DD299142A7 DD 299142 A7 DD299142 A7 DD 299142A7 DD 34237290 A DD34237290 A DD 34237290A DD 34237290 A DD34237290 A DD 34237290A DD 299142 A7 DD299142 A7 DD 299142A7
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DD34237290A
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Franz Noll
Wilhelm Handschack
Clemens Loester
Ute Hofmann
Georg Rabitzsch
Ernst-Georg Krause
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Zentralinstitut Fuer Molekularbiologie,De
Zentralinstitut Fuer Herz-Kreislaufforschung,De
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Abstract

Die Erfindung betrifft einen immunenzymometrischen Assay (IEMA) zur quantitativen Bestimmung von Glykogenisophosphorylase BB * seine Herstellung und Verwendung. Die Erfindung ist in der medizinischen Diagnostik und in der Enzymtechnik anwendbar. Im Assay kommen nach dem Zwei-Seiten-Bindungsprinzip zwei monoklonale Antikoerper gegen GP-BB zur Anwendung, die keinerlei Kreuzreaktivitaet mit den Isoenzymen MM und LL der Glykogenisophosphorylase BB aufweisen. Zur Beschichtung der festen Phase wird der Antikoerper VID 12 eingesetzt, der monoklonale Antikoerper IIF 11 wird mit Meerrettich-Peroxidase (POD) markiert. Die diese Antikoerper produzierenden Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR in Berlin hinterlegt. Durch eine optimale Stabilisierung der beschichteten festen Phase und durch haltbare Positiv- und Negativkontrollen betraegt die Verwendbarkeit des Assays mindestens ein halbes Jahr. Der Test zeichnet sich durch leichte Handhabbarkeit aus, die GP-BB laeszt sich auch in Gegenwart der Isoenzyme MM und LL mit hoher Empfindlichkeit und Praezision in Koerperfluessigkeiten bestimmen. Die Testzeit betraegt zur Feindiagnostik 90 Minuten und zur Schnelldiagnostik 30 Minuten.{Assay, immunenzymometrischer; Glykogenisophosphorylase BB; Diagnostik, medizinische; Antikoerper, monoklonale; Isoenzyme MM, LL; Phase, feste; Peroxidase; Handhabbarkeit, leichte; Empfindlichkeit, hohe; Feindiagnostik; Schnelldiagnostik}

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen
Anwendungsgebiete der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen IEMA zur immunchemischen Bestimmung von GP-BB in Körperflüssigkeiten, vor allem im Blut, dessen Herstellung und Verwendung. Die Erfindung ist in der medizinischen Diagnostik und in der Enzymtechnik anwendbar.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Glykogenisophosphorylase b (EC 2.4.1.1.) kommt im menschlichen Organismus vorzugsweise im Skelett- und Herzmuskel sowie in der glatten Muskulatur, der Leber und in Leukozyten vor und kann in die Isoenzyme B,M,L unterteilt werden. Die natürlicherweise auftretenden Dimere der Glykogenphosphorylase haben entsprechend die Zusammensetzung BB1MM1LL und gewisse Mischformen. Für den Herzmuskel typisch ist das Isoenzym BB, obwohl auch MM in geringer Konzentration vorliegt. In Abhängigkeit yon der Stoffwechselsituation ist das Enzym aus einer strukturgebundenen Zellkomponente in ein zytosolisch gelöstes Protein überführbar. Bei entsprechender metabolischer Schädigung des Herzmuskels wird das Enzym aus den Myozyten freigesetzt und erscheint im Blut (Schulze, W., E.-G. Krause und A. Wollenberger: J. Mol. Cell. Cardiol. 2,241-251 [1971 j); G. Rabitzsch, E.-G. Krause und L. Will-Shahab: Gutachten zur Wertigkeit der Glykogenphosphorylase b in der serologischen Diagnostik des aktuellen Herzinfarktes, Zentralinst, f. Herz-Kreislauf-Forschung der AdW der DDR, 1079). Dieses Phänomen läßt sich für die Diagnostik ischämischer Herzkrankheiten ausnutzen.
Obwohl diese Tatsache schon lange bekannt war, gehört die Konzentrationsmessung der Glykogenphosphorylase b noch nicht zu den diagnostischen Routinemethoden.
Das bisher verwendete Bestimmungsverfahren beruht auf dem Nachweis der Enzymaktivität im menschlichen Serum (Krause, E.-G., H. Will, M. Böhm, A. Wollenberger: Clin. Chim. Acta 58,145-154 (1975]). DieserTest ist in seiner Durchführung für klinische Routine-Untersuchungen auf Grund seiner Kompliziertheit nicht einsetzbar. Außerdem ist eine Diskriminierung zwischen dem Isoenzym BB und MM nicht möglich, da nicht das Enzym selbst, sondern seine Aktivität gemessen wird. Eine Varbesserung der Bestimmungsmethode wurde durch die Einführung der spezifischen Immunhemmung entweder des Isoenzyms BB oder des Isoenzyms MM mittels entsprechender polyklonaler Antikörper des Kaninchens erreicht (Rabitzsch, G., H.Schulz, K.Onnen, A.Kössler und E.-G.Krause: Biomed. Biochim. Acta 46, S.584-588 [1987]; Rabitzsch, G., A.Kössler und E.-G. Krause: Zeitschr. Laboratoriumstechnik [1988)). Jedoch ist dieser Test nicht empfindlich genug, beruht auf nicht standardisierbaren Testbestandteilen, wie polygonale Antikörper, und ist als Routinetest ungeeignet. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen GP-BB, beschrieben im DD-WP 242750 und 274054 zur Verwendung für die quantitative Bestimmung von GP-BB in Körperflüssigkeiten ist inzwischen bekannt. Das im DD-WP 274098 beschriebene immunenzymometrische Verfahren zur Konzentrationsbestimmung des Enzyms, z. B. im Blut, erfolgt nach dem 2-Seiton-Bindungsprinzip. Hier werden 10 Antikcrperpaare vorgeschlagen. Mit diesen Antikörperkombinationen in dem beschriebenen Testverfahren gelingt eine präzise Qualifizierung von GP-BB auch in Gegenwart hoher Konzentration des Isoenzyms MM, da die Antikörper keine Kreuzrekation mit dem Isoenzym MM aufweisen. Nachteile dieses Verfahrens nach WP 274096 sind jedoch:
- Kreuzreaktion einiger dort beanspruchter Ak mit dem Isoenzym LL der Qlykogenphosphorylase. Diese Kreuzreaktion führt möglicherweise zur falschen Interpretation der erhaltenen Werte (Fehldiagnose z.B. Herzinfarkt - Leberschädigung)
- Reproduzierbarkeit nicht mit allen dort aufgeführten Ak-Paaren ausreichend wegen unterschiedlicher Stabilität der Ak
- mit der im DD-WP 274098 vorgeschlagenen Lösung ist eine problemlosu Behandlung des Patientenmaterials nicht möglich
- Stabilisierung der mit Ak beschichteten festen Phase nicht optimal gelöst
- Positivkontrolle (Standardwerte) und Negativkontrolle nicht optimal auf Grund fehlender Haltbarkeit und Vergleichbarkeit mit zu testonden Proben
- Produktivität der zur Gewinnung der für den IF.MA benötigten monoklonalen Antikörper erforderlichen Hybridome z.T. zu gering, um für die Routinediagnostik eingesetzt werden zu können
- Höhe der Blindwerte für die Auswertung zu hoch.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, einen optimalen Assay zur quantitativen Bestimmung von GP-BB zu entwickeln, der für das Isoenzym BB der Glykoganphosphorylase absolut spezifisch ist und eine präzise Bestimmung auch in Anwesenheit der Isoenzyme MM oder LL erlaubt, der eine feste Reproduzierbarkeit gewährleistet, eine leichte Herstellbarkeit und Handhabbarkeit des Testes und des Patientenmaterials sowie eine lange Verwendbarkeit des Tests einschließt und sowohl zur Fein- als auch zur Schnelldiagnostik einsehbar ist.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, zunächst zwei stabile Hybridome zu finden, die Antikörper mit solchen konstanten Eigenschaftenohne Kreuzreaktion mit dem Isoenzym MM und LL- in großer Menge produzieren, daß sie auch zur Schnelldiagnostik geeignet sind und der damit hergestellte Testkit in seinem Variationskoeffizienten internationalen Anforderungen entspricht. Außerdem ist die mit einem Antikörper beladene feste Phase optimal zu stabilisieren. Gleichermaßen sind haltbare Positiv- und Negativkontrollen herzustellen, so daß die Verwendbarkeit dos Assays mindestens ein halbes Jahr beträgt. Der Testablauf und die Lösungen für die Stabilisierung, für die Blockierung freier Proteinbindungsstellen auf der mit Antikörpern besetzten festen Phase, für die Verdünnung des Antikörper-Enzym-Konjugates sind so zu gestalten, daß der Test so kurz als möglich ist und mit einem sehr niedrigen Blindwert verbunden ist.
Die Aufgabe wird gelöst, indem zur immunchemischen Bestimmung von GP-BB ein Assay eingesetzt wird, der besteht aus einer mit einem monoklonalen Antikörper gegen GP-BB beschichteten und stabilisierten festen Phase, einem zweiten monoklonalen Antikörper gegen GP-BB, der mit einem Enzym markiert ist (Antikörper-Enzym-Konjugat), einer Lösung zum Aufnehmen des Antikörper-Enzym-Konjugates, den Positivkontrollen (Standardproben), der Negativkontrolle, einem Chromogen, einem Enzymsubitrat, einem Substratpuffer zum Aufnehmen von Enzymsubstrat und Chromogen sowie Säure zum Abstoppen der Farbreaktion.
Erfindungsgernäß wird als monoklonaler Antikörper, mit dem die feste Phase beschichtet wird, der Antikörper-IVD 12 (produziert durch die Hybridomzellinie ZIM-0326) dusgewählt. Die Stabilisierung der beschichteten festen Phase erfolgt erfindungsgemäß mit einer Pufferlösung, die 2-7 Masseantoile in % Zucker, 0,3-0,8 Masseanteile in % Schutzprotein, 0,01-0,03 Masseanteile in % einer bakteriziden Substanz und 0,02-0,1 Volumenanteile in % Detergens enthält. Vorzugsweise werden als Zucker 5 Masseanteile in % Saccharose, als Schutzprotein 0,5 Masseanteile in % Rindersurumalbumin, als bakteriozide Substanz 0,02 Masseanteile in % Merthiolat und als Detergens 0,05 Volumenanteile in % Tween 20 eingesetzt.
Der zweite, mit Peroxidase (POD) markierte monoklonale Antikörper ist erfindungsgemäß der Antikörper-HF 11 (produziert lurch die Hybridomzellinie ZIM-0329). Beide Hybridomzellinien sind in der Hinterlegungsstelle im Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie'der Wissenschaften der DDR unter den o.g. Registriernummern hinterlegt. Es handelt sich hier um zwei stabile
Hybridome, die Antikörper mit konstanten Eigenschaften und in guten Ausbeuten produzieren. Überraschenderweise gehen nur die von diesen beiden Hybridomen produzierten monoklonalen Antikörper keine Kreuzreaktionen mit dem Isoenzym LL der Glykogenphosphorylase ein. Die Lösung zum Aufnehmen (Verdünnen) des Antikörper-IIF 11-POD-Konjugates ist eine Pufferlösung, die 5-15, vorzugsweise 10, Volumenanteile in % normales Kälberserum, 0,02-0,1 Volumenanteile in % Detergens, vorzugsweise 0,05 Volumenanteile Tween 20, und 2-7, vorzugsweise 4, mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) enthält.
Die Negativkontrolle besteht in GP-BB-freiem EDTA-Plasma (Nullplasma).
Die Positivkontrollan enthalten unterschiedliche Standardkonzentrationen an GP-BB, aufgenommen in Nullplasma und lyophilisiert. Sie können aus 2-8 Standardproben mit bekanntem Gehalt an GP-BB bestehen.
Die Pufferlösung der Stabilisierungsregelung und der Lösung zum Aufnehmen des Antikörper-HF 11-POD-Konjugates ist PBS (phosphate buffered saline: 0,02M Na-Phosphate pH 7,3 und 0,154M NaCI).
Die feste Phase ist entweder eine Mikrotestplatte, ein Mikioteststreifen, ein Teststäbchen oder eine Testkugel.
Das zu bestimmende Blut ist vorzugsweise Plasma und enthält 3-7 mM EDTA.
bestehend aus Chromogen, Enzymsubstrat und Substratpuffer, Negativkontrolle und Positivkontrollen sowie Säure zum Stoppen der Farbreaktion herstellt.
Erfindungsgemäß wird die feste Phase, die eine Mikrotestplatte, ein Mikroteststreifen, ein Telefonstäbchen oder eine Testkugei sein kann, mit dem monoklonalen Antikörper VID12 (ZIM-0326) beschichtet, indem sie mit dem in Lösung befindlichen Antikörper in Kontakt gebracht wird und die Adsorption des mAk an die feste Phase innerhalb von 12 Stunden in einer feuchten Kammer bei 40C (z. B. im Kühlschrank) oder durch Antrocknen bei 37°C innerhalb von weniger als 16 Stunden erfolgt. Als Lösung zum Aufnehmen des monoklonalen Antikörpers ist PBS gut geeignet. Anschließend wird erfindungsgemäß die beschichtete feste Phase durch mehrstündige Inkubation, vorzugsweise 2 Stundon bei Raumtemperatur, mit einer Pufferlösung stabilisiert, die enthält 2-7 Masseanteile in % Zucker, vorzugsweise 5 Masseanteile in % Saccharose, 0,3-0,8 Masseanteile in % Schutzprotein, vorz ;weise 0,5 Masseanteile in % Rinderserumalbumin, 0,01-0,03 Masseanteile in % einer bakteriziden Substanz, vorzugsweise 0,02 Masseanteile in % Merthiolat, und 0,02-0,1 Volumenanteile in % eines Dotergens, vorzugsweise 0,05 Volumenanteile in %Tween 20. Schließlich wird zur Aufbewahrung der mit dem Antikörper beschichteten und stabilisierten festen Phase diese sorgfältig getrocknet und in Folie zusammen mit einem Trockenmittel (z.B. Filterpapier) luftdicht eingeschweißt.
Der erfindungsgemäß zweite Antikörper UF11 (produziert durch die Hybridomzellinie ZIM-0329) wird nach bekanntem Verfahren mit Meerrettich-Peroxidase (POD) markiert. Das entstandene Antikörper-HF 11-POD-Konjugat wird für seine Verwendung im Test in einer Pufferlösung aufgenommen, die folgende Bestandteile enthält: 5-15, vorzugsweise 10, Volumenanteile in % normales Kälberserum; 0,02-0,1 Velumenanteile in % Detergens, vorzugsweise 0,05 Volumenanteile in %Tween 20 und 2-7, vorzugswiese 4, mM Ethyi^ndiamintetraacetat (EDTA).
Als Pufferlösung zur Stabilisierung der beschichteten festen Phaso und zum Aufnohmen des Antikörper-HF 11-POD-Konjugats ist PBS (phosphate buffered saline) gut geeignet.
Als Negativkontrolle wird GP-BB-freies EDTA-Plasma (Nullplasma) bereitet und lyophilisiert. Die Positivkontroilen (= Standardwerte) enthalten GP-BB in definierter Konzentration, aufgenommen in Nullplasma, und werden zwecks besserer Lagerfähigkeit lyophilisiert.
Die Verwendung des immunenzymometrischen Assays (IEMA) für die quantitative Bestimmung von GP-BB in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise Blut, erfolgt, wie aus dem Stand der Technik bekannt, indem man die Reaktionsflächen einer mit einem monoklonalen Antikörper gegen GP-BB beschichteten und stabilisierten festen Phase mit den zu bestimmenden Proben, einer Negativkontrolle und Positivkontrollen in Kontakt bringt, alle Kontrollen und Proben mit einem zweiten, in Lösung befindlichen monoklonalen Antikörper gegen GP-BB, der mit einem Enzym markiert ist (Antikörper-Enzym-Konjugat) inkubiert, danach mit einer Substratlösung aus Chromogen, Enzymsubstrat und Substratpuffer inkubiert, die Reaktion durch Zugabe von Säuren stoppt und schließlich die Enzymaktivität photometrisch, fluorometrisch oder luminometrisch bestimmt. Erfind.mgsgemäß wird der oben beschriebene IEMA mit den zwei ausgewählten monoklonalen Antikörpern und der speziellen Stabiliiierungslösung und der speziellen Lösung zum Aufnehmen des Antikörper-POD-Konjugats eingesetzt. Die zu bestimmenden Blutproben werden als Plasma eingesetzt, das 3-7 mM EDTA enthält. Erfindungsgemäß e.ifolgt die Inkubation mit dem Antikörper-POD-Konjugat in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur innerhalb von 90 Minuten zur Feindiagnostik oder auch nur innerhalb von 30 Minuten zur Schnelldiagnostik.
Der beschriebene immunenzymometrische Test beinhaltet bekannte Verfahrensmerkmale wie das Zwei-Seiten-Bindungsprinzip, die Enzymmarkierung monoklonal Antikörper und die Messung der Enzymaktivität. Die erreichte untere Nachweisgrenze von 0,5ng/ml Probe und der Testbereich von 0,5ng/ml bis ca. 100ng/ml entsprechen dem Stand der Technik. Die Vorteile dieses Tests gegenüber dem Stand der Technik bestehen in der Auswahl von zwei monoklonalen Antikörpern, die keinerlei Kreuzaktivität mit den !soenzymen MM und LL der Giykogenphosphorylase aufweisen, in der hervorragenden Reproduzierbarkeit der Testwerte auf Grund der besonderen Stabilität des ausgewählten Antikörperpaares, in der verbesserten Patientenprobenvorbereitung mit erleichterter Handhabung, in der guten Lagerbarkeit dor Testbestandteile durch die erfindungsgemäße Stabilisierung, in der hohen Produktivität der die ausgewählten mAk produzierenden Hybridomzellinien und schließlich in der geringer Höhe des Blindwertes. Die Verwendbarkeit des Assays beträgt mindestens eh halbes Jahr. Dieses Testverfahren ist durch leichte Handhabbarkeit, gegeben durch ein optimales Test-Herstellungsverfahren, geeignet, die Glykogenisophosphorylase BB auch in Gegenwart der Isoenzyme MM und LL mit hoher Empfindlichkeit und Präzision in Körperflüssigkeiten bestimmen zu können. In seinem Varianzkoeffizienten entspricht der Assay internationalen Anforderungen (s. Abb. 1 - Standardkurve)
Die Erfindung soll an Ausführungsbeispielen noch näher erläutert werden, ohne sie einzuschränken.
Aiisfuhrungsbelsplele
1. Immunenzymoinetrischer Assay (IEMA) zur quantitativen Bestimmung von Glykogenisophosphorylase BB (GP-BB):
Als feste Phase werden die Näpfe von 96er-Mikrotestplatten (MTP) verwendet, die mit dem monoklonalen Antikörper VID12 vorbeschichtet sind. Nach Entfernen der MTP aus der luftdichten Verpackung und Auflösen der Lycphilisate der Negativkontrolle und der Positivkontrollen (6 Standardwerte) in Wasser werden Näpfe mit je 50 μΙ der zu messenden Proben (z. B. EDTA-Plasma), mindestens zwei Näpfe mit je 50 μΙ der Negativkontrolle (Nullplasma) sowie jeweils zwei Näpfe mit 50 μΙ der gleichen Konzentration der Positivkontrollen (insgesamt 6) gefüllt. Jedem Napf werden dann 50 μΙ des in einer Pufferlösung (PBS mit 10% Volumenanteile normales Kälberserum, 0,05% Volumenanteile Tween 20,4mM an EDTA) vorverdünnten Antikörper-HF 11-POD-Konjugates zugegeben. Die sich anschließende Inkubation von 90min erfolgt bei Zimmertemperatur in einer feuchten Kammer auf einem Schüttler. Danach wird gründlich mit Wasser gewaschen und die Substratlösung (Phosphat [0,2M Na2HPO4]-Zitrat (O,O7M]-Puffer, pH 5,0 mit 0,40mg o-Phenylendiamin pro ml sowie 0,02% Volumenanteile an H2O2) (200pl/Napf) zugegeben.
Nach einer Inkubation von 15min bei Zimmertemperatur im Dunkeln werden jedem pro Napf 50 μΙ 2,5 N HjSQ» zugeführt. Die Intensität der entstandenen Färbung wird schließlich photometrisch bei der Wellenlänge von 492 nm gemessen.
Aus der gemessenen Extinktion wird an Hand der mittels der Standardwerte (Positivkontrollen) erstellten Eichkurve der GP-BB-Gehalt einer Probe ermittelt (siehe Standardkurve Abb. 1).
Herstellung eines IEMA zur quantitativen Bestimmung von GP-BB
Die Näpfe einer Mikrotestplatte als feste Phase werden mit je 100 μΙ Antikörper-VID 12-Lösung (5 μg Antikörper pro ml PBS) gefüllt. Die Beschichtung mit dem Antikörper erfolgt durch Adsorption an die Wände der MTP-Näpfe über 12 Stunden bei 40C.
Danach wird die Lösung entfernt und 20GpI einer Stabilisierungslösung (5% Masseanteile Saccharose, 0,5% Mt, .seanteile Rinderserumalbumin, 0,02% Masseanteile Merthiolat und 0,05% Volumenanteile an Tween 20) werden zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation wird die Lösung gründlich entfernt, die MTP erst bei 370C, dann bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Die völlig trockenen, mit dem Antikörper beschichteten MTP werden dann in Folie unter Zusatz eines Filterpapierstreifens luftdicht verpackt und so bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Die Herstellung der Negativkontrollen (Nuilplasma EDTA-Plasma frei von GP-BB) erfolgt durch spezifische Entfernung der in physiologischen Konzentrationen im Blut vorkommenden GP-BB und abschließender Lyophilisation zu 150ul pro Ampulle, Die Positivkontrollen (sechs: 160, 80,40,20,10,5ng/ml) werden durch Γ ibstitution von Nullplasma mit aus menschlichem Herzmuskel präparierter GP-BB in definierten Konzentrationen hergestellt. Von jeder Positivkontrolle werden 150μΙ pro Ampulle lyophilisiert.
Das Antikörper-HF 11-POD-Konjugat wird nach üblichen Verfahren entweder über SPDP- oder Porjodat-Kopplung hergestellt.
Die Stammlösung in Testbesteck enthält ca, 200μο Antikörper-HF 11 -POD-Konjugat pro ml, 10% Volumenanteile normales Kälberserum, 0,05% Volumenanteile Tween 20 und 4mM EDTA in PBS.
Zur Herstellung der Arbeitsverdünnung der Antikörper-ilF 11-POD-Konjugat-Stammlösung wird ein Puffer folgender Zusammensetzung verwendet:
PBS mit 10% Volumenanteilan normales Kälberserum, 0,05% Volumenanteile Tween 20 und 4 mM EDTA.
Dem Testbesteck werden zusätzlich in jeweils getrennten Ampullen o-Phenylendiamin, H2O2 und 2,5 N H2SO4 zugegeben.
Verwendung des IEMA zur quantitativen Bestimmung von GP-BB im Blut
Vom Patienten wird Blut entnommen, dem sofort EDTA bis zur Konzentration vor. 4mM zugesetzt wird, damit eine Gerinnung verhindert wird.
Nach Abzentrifugieren der Blutzellen entsteht EDTA-Plasma, das direkt in den IEMA eingesetzt wird.
In die Näpfe einer mit dem Antikörper VID12 beschichteten MTP werden 50 μΙ der Plasmaproben (in jeweils zwei Doppelbestimmungen!) eingefüllt. Gleichzeitig werden zwei Näpfe mit je 50μ! Nullplasma (Negativkontrolle) und zwölf weitere mit je 50 μΙ der sechs Positivkontrollen beschichtet, nachdem die Lyophilisate mit dem entsprechenden Volumen an H2O2 aufgelöst worden waren.
Den Proben, Negativ- und Positivkontrollen werden dann nach Herstellung der entsprechenden Arbeitsverdünnung des Antikörper-HF 11-POD-Konjugates jeweils 50μΙ davon zugesetzt. Es schließt sich eine Inkubation von 60min bei Zimmertemperatur in piner feuchten Kammer auf einem Schüttler an. Danach wird mit Wasser gründlich gewaschen und die Näpfe vollständig geleert und die Substratlösung (200μΙ/Νβρ0 zugegeben. Nach einer Inkubation von 15min bei Zimmertemperatur im Dunkeln werden pro Napf 50 μΙ 2,5 N H2SO4ZUr Abstoppung der Farbreaktion zugefügt. Die Intensität der entstandenen Färbung wird in einem Photometer bei der Wellenlänge = 492 nm gemessen.
An den Mittelwerten der gemessenen Extinktionen der Doppelbestimmungen wird mittels der im gleichen Test ermittelten Eichkurve (sechs Standardwerte als Positivkontrolle) der GP-BB-Gehalt des bestimmten Patientenplasmas ermittelt (siehe Standardkurve mit Probe Abb. 2).

Claims (7)

1. Immunenzymometrischer Assay (IEMA) zur immunchemischen Bestimmung von Glykogenisophosphoryiase BB (GP-BB) im Blut, bestehend aus
- einer mit einem monoklonalen Antikörper gegen GP-BB beschichteten und stabilisierten festen Phase
- einem zweiten monoklonalen Antikörper gegen GP-BB, der mit einem Enzym markiert ist (Antikörper-Enzym-Konjugat)
- einer Lösung zum Aufnehmen des Antikörper-Enzym-Konjugats
- Positivkontrollen (Standardproben)
- Negativkontrolle
- einem Chromogen
- einem Enzymsubstrat
- einem Substratpufter zum Aufnehmen von Enzymsubstrat und Chromogen
- Säure zum Stoppen der Farbreaktion,
gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung von GP-BB im Blut
- der monoklonal Antikörper, mit dem die feste Phase beschichtet ist, der Antikörper VID12 (produziert durch die Hybridomzellinie ZIM-0326) ist, und die Stabilisierung der beschichteten festen Phase mit einer Pufferlösung erfolgt ist, die
2-7 Massenanteile in % Zucker
0,3-0,8 Massenanteile in % Schutzprotein
0,01-0,03 Massenanteile in % bakteriozide Substanz
0,02-0,1 Volumenanteile in % Detergens enthält,
- der zweite, mit Peroxidase (POD) markierte monoklonal Antikörper HF11 (produziert durch die HybridomzeMinie ZIM-0329) ist,
- die Lösung zum Aufnehmendes Antikörper-IIFH-POD-Konjugats eine Pufferlösung ist, die 5-15 Volumenanteile in % normales Kälberserum
0,02-0,1 Volumenanteile in % Detergens und
2-7 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) enthält,
2. IEMA nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Pufferlösung zur Stabilisierung der beschichteten lösten Phase als Zucker 5 Massenanteile in % Saccharose, als Schutzprotein 0,5 Massenanteile in % Rinderserumalbumin, als bakteriozide Substanz 0,02 Massenanteile in % Merthiolat und als Detergens 0,05 Volumenanteile in % Tween 20 enthält.
3. IEMA nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Pufferlösung zum Aufnehmen des Antikörper-HF 11-POD-Konjugats 10 Volumenanteile in % normales Kälberserum, als Detergens 0,05 Volumenanteüe in %Twccn 20 und 4rnM EDTA enthält.
4. Verfahren zur Herstellung eines immunenzymometrischen Assays (IEMA) zur Bestimmung von Glykoganisophosphorylase BB (GP-BB) im Blut, indem man eine feste Phase mit einem monoklonalen Antikörper gegen GP-BB beschichtet und danach stabilisiert, einen zweiten monoklonalen Antikörper gegen GP-BB mit einem Enzym markiert (Antikörper-Enzym-Konjugat), eine Lösung zum Aufnehmen des Antikörper-Enzym-Konjugats bereitet, eine Substratlösung, bestehend aus Chromogen, Enzymsubstrat und Substratpuffer, Negativkontrolle und Positivkontrollen sowie Säure zum Stoppen der Farbreaktion herstellt, gekennzeichnet dadurch, daß man die feste Phase mit dem monokionalen Antikörper VID12 (produziert durch die Hybridomzellinie ZIM-0326) beschichtet, die beschichtete Phase durch mehrstündige Inkubation mit einer Pufferlösung stabilisiert, die
2-7 Massenanteile in % Zucker
0,3-0,8 MassenanteÜG in % Schutzprotein
0,01-0,03 massenaniöiie in % bakteriozide Substanz
0,02-0,1 Volumenanteile in % Detergens enthält,
den monoklonalen Antikörper IIF11 (produziert durch die Hybridomzßliinie ZIM-0329) mit Peroxidase (POD) markiert, eine Pufferlösung zum Aufnehmen des Antikörper-IIF11-POD-Konjugats herstellt, die 5-15 Volumenanteile in % normales Kälberserum
0,02-0,1 Volumenanteile in % Detergens und
2-7mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) enthält, als Negativkontrolle GP-BB-freies EDTA-Plasma (Null-Plasma) bereitet und Positivkontrollen herstellt, die jeweils in Null-Plasma aufgenommen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man die beschichtete feste Phase zur Stabilisierung 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einer Pufferlösung inkubiert, die als Zucker 5 Massenanteile in % Saccharose, als Schutzprotein 0,5 Massenanteile in % Rinderserumalbumin, als bakteriozide Substanz 0,02 Massenanteile in % Merthiolat und als Detergens 0,05 Volumanameile in % Tween 20 enthält, und danach die beschichtete und stabilisierte feste Phase vollständig trocknet.
6. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man die Pufferlösung zum Aufnehmen desAntikörper-IIF11-POD-Konjugatsmit
10 Volumenanteilen in % normalem Kälberserum,
0,05 Volumenanteilen in % Tween 20 als Detergent und
4mM EDTA herstellt.
7. Verwendung eines immunenzymometrischen Assays (IEMA) zur immunchen .ischen Bestimmung von Glykogenisophosphorylase BB (GP-BB) im Blut, indem man die Reaktionsflächen einer mit einem monoklonalen Antikörper gegen GP-BB beschichteten und stabilisisrten festen Phase mit den zu bestimmenden Blutproben, einer Negativkontrolle und Positivkontrollon in Kontakt bringt, alle Kontrollen und Proben mit einem zweiten, in Lösung befindlichen monoklonalon Antikörper gegen GP-BB, der mit einem Enzym markiert ist (Antikörper-Enzym-Konjugat) inkubiert, danach mit einer Substratlösung aus Chromogen, Enzymsubstrat und Substratpuffer inkubiert, die Reaktion durch Zugabe von Säuren stoppt und schließlich die Enzymaktivität photometrisch, fluorometrisch oder luminometrisch bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß der IEMA gemäß Anspruch 1 eingesetzt wird, die zu bestimmenden Blutproben als EDTA-Plasma eingesetzt werden und die Inkubation mit dem Antikörper-Enzym-Konjugat in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur innerhalb von 90 Minuten zur Feindiagnostik oder innerhalb von 30 Minuten zur Schnelldiagnostik errolgt.
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