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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin Reagenzien, insbesondere zur
Verwendung in Enzymimmunoassay-Techniken mit enzymmarkierten Antikörpern oder
Antigenen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Enzymimmunoassay (EIA) ist eine Assay(=
Test)-Technik, die auf zwei Fakten basiert: (1) das Immunsystem
von Vertebraten kann eine nahezu unbegrenzte Vielzahl von Antikörpern produzieren,
jeder mit einer spezifischen Affinität für ein Antigen, und (2) die
hohe katalytische Energie und Spezifität von Enzymen, die oft sehr
einfach zu detektieren ist. In der EIA-Technik werden die Immunoreagenzien,
der Antikörper
und das entsprechende Antigen miteinander zur Reaktion gebracht,
und es wird diese Reaktion unter Verwendung von Enzymen, mit denen
eines der Immunoreagenzien markiert ist, detektiert. Verschiedene
Enzyme werden in dem Test verwendet und unter diesen sind (3-Galaktosidase,
Peroxidase, beispielsweise Horseradish-Peroxidase und alkalische
Phosphatase. Für
die Detektion der Enzymaktivität
wird ein chromogenisches Substrat und ein Chromogen verwendet, welches
während
der Reaktion eine Farbe entwickelt. Diese Technik ist sehr nützlich, sowohl
für diagnostische
Zwecke als auch bei grundlegender Forschungsarbeit. Die Enzymimmunoassays
haben verschiedene Vorteile. Es ist möglich, eine sehr hohe Sensitivität und Spezifität mit relativ
billigen Reagenzien und Ausrüstung
zu erreichen. Die Verfahren, um monoklonale Antikörper herzustellen,
haben die Möglichkeit
der Standardisierung des EIA mit sogar noch höherer Sensitivität und Spezifität erhöht und zu
neuen Assayformen beigetragen.
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Eine Modifikation des EIA und eines
der heutzutage sehr weit verbreitet verwendeten Enzymimmunoassay-Techniken
ist der ELISA (enzymgestützter
Immunosorbensassay), welcher sowohl für qualitative als auch für quantitative
Assays oder Tests verwendet werden kann. Im Prinzip wird ein Enzym
an ei nen gegen ein zu bestimmendes Antigen gerichteten Antikörper gekoppelt.
Das Assay oder der Test wird normalerweise in Schalen aus Polystyrol
oder Polypropylen ausgeführt,
an welchen das Antigen immobilisiert ist. Das Enzym wird chemisch
an den Antikörper
angekoppelt und mit einer Substrat-Lösung inkubiert, welche einen
passenden Puffer, ein chromogenisches Substrat, beispielsweise Wasserstoffperoxid
oder Ureaperoxid, und ein Chromogen enthält, welches seine Farbe verändert, wenn
das Peroxid oxidiert wird. Es gibt viele Variationen eines ELISA.
In vergleichbaren Assays oder Tests kann das Enzym mit dem Antigen
gekoppelt werden. Es ist sowohl möglich, dass die Anzahl der
"Schichten" von Antigen und Antikörper variieren kann als auch
verschiedene Enzyme zu verwenden. In ELISA-Techniken ist Horseradish
Peroxidase (HRP) ein normalerweise verwendetes Enzym. Für die Detektion
der Enzymaktivität
ist ein spezifisches Enzymsubstrat für das aktuelle Enzym notwendig.
Verschiedene Enzymsubstrate, wie etwa Ortho-Phenylendiamin (PD),
2,2'-Azino-bis-(3-Ethylbenz-Thiazolin-6-Schwefelsäure) (ABTS)
und 3,3'',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) sind weit verbreitet. TMB ist
ein nichtlebensgefährliches
normalerweise farbloses Substrat, welches ein intensiv blau-gefärbtes Oxidationsprodukt
in Anwesenheit von Peroxid und HRP bildet. TMB wird oftmals als
Substrat bevorzugt, da es derzeit das empfindlichste Substrat für HRP ist
und weniger toxisch ist als beispielsweise OPD.
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Wenn ein ELISA-Test ausgeführt wird,
ist es wichtig, das Hintergrundsignal zu reduzieren, um die bestmögliche Empfindlichkeit
zu erreichen. Es ist daher als wichtig angesehen worden, dass die
Substratkomponenten selbst farblos sein sollten oder nur sehr wenig
gefärbt
sein sollten, um sie als Substrat in einem ELISA-Test verwenden
zu können.
Derartige Eigenschaften werden die Blindextinktionswerte minimieren.
Dies bedeutet, dass das Pipettieren des somit farblosen Substrats
in dem Enzymimmunoassayreaktionsgefäss, welches oft eine transparente
Röhre oder
eine transparente ELISA-Schale ist, mit dem Risiko einer derart
unrichtigen Dosierung verbunden ist, dass es schwierig sein kann,
gleich durch visuelle Untersuchung festzustellen, ob das Substrat
einem Gefäß (beispielsweise
einem Graben) hinzugefügt
wurde oder nicht. Als eine Konsequenz kann es passieren, dass das
Substrat nicht bei allen Gefässen
hinzugefügt
wird, oder dass die benötigte
Menge des Substrats einigen Gefässen
doppelt hinzugefügt
wird. In automatisierten Tests ist es nicht einfach zu erreichen,
Kontrollmessungen durchzuführen,
um sicherzustellen, dass das Substrat oder die richtige Menge des
Substrats hinzugefügt
wurde.
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Das Deutsche Patent Nr.
DE 195 27 160 C1 beschreibt
ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Konzentration eines
Enzyms durch Messen einer durch eine enzymatische Reaktion mit einem
farblosen Substrat erzeugten Farbe. Die enzymatische Reaktion wird
durch Hinzufügen
von 2 N NaOH gestoppt. Um das Hinzufügen der Stopplösung zu
kontrollieren, wird ein Farbstoff (Amaranth) in die im übrigen farblose Lösung aufgenommen.
Das Deutsche Patent bezieht sich auf den Einschluss eines Farbstoffes
in einer Stopplösung,
es adressiert jedoch nicht die Probleme der Speicherstabilität und des
Aufbaus von wasserbasierten Substratsystemen, wenn ein Farbstoff
in solchen Systemen für
denselben Zweck aufgenommen werden sollte.
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Das U.S. Patent Nr. 4,128,629 beschreibt
ein Verfahren zum Bestimmen kleiner Konzentrationen von Cortisol
durch Verwendung einer Immunoassay-Technik, insbesondere eines Radioimmunoassays
(RIA). In einem Beispiel wird die Möglichkeit des Aufnehmens eines
nicht-interferierenden roten Farbstoffes erwähnt, um das Vorhandensein des
in dem Assay verwendeten Tracers anzuzeigen. Die spezifischen Probleme,
die mit der Stabilisierung und der Speicherstabilität von Substratlösungen,
die Farbstoffe aufweisen, sind nicht erwähnt.
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Das U.S. Patent Nr. 5,318,894 beschreibt
ein Trockenphasentestgerät
und ein Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins einer peroxidasemäßig aktiven
Substanz. Das Testgerät
schließt
einen Testbausch ein, der eine passende Trägermatrix mit einer Indikatorreagenz
aufweist. Die Indikatorreagenzkomposition zur Imprägnierung
des Testbereiches des Testgerätes
schließt
einen Indikatorfarbstoff (z. B. TMB), ein Hydroperoxid und einen
Promotor ein. Um die Farbauflösung
und die Differenzierung zu verbessern, können in der Indikatorreagenz
ein oder mehrere inerte Hintergrundfarbstoffe aufgenommen werden.
Die Menge des in der Indikatorreagenz zur Imprägnierung vorhandenen organischen
Lösungsmittels
beträgt
bis zu 90 %. Das U.S. Patent Nr. 5,318,894 adressiert jedoch nicht
die Probleme in Bezug auf die Präparation
und die Speicherstabilität eines
wasserbasierten TMB- Substratlösungsmittelsystems.
Die Speicherstabilität
der flüssigen
Zusammensetzungen scheinen nicht relevant zu sein, da die flüssigen Zusammensetzungen
unmittelbar nach der Präparation
verwendet werden. Auch scheinen die in dem U.S. Patent Nr. 5,318,894
verwendeten Farbstoffe so ausgewählt
zu sein, dass sie von vornherein eine hohe Extinktion in dem gleichen
Bereich aufweisen, wie das reagierte TMB-Substrat.
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Beschreibung
der Erfindung
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Die vorliegenden Erfindung liefert
eine Lösung
für die
mit dem Hinzufügen
eines im übrigen
farblosen Substrates zu einem Reaktionsgefäß (z. B. manuelles Pipettieren
einer TMB-Substratkomposition in eine ELISA-Schale) verbundenen
Probleme durch Hinzunehmen eines Farbstoffes bei gebrauchsfertigen
Substraten. Auf diese Weise wurde es möglich, beispielsweise das Substrat
sowohl in der Pipette als auch in dem Reaktionsgefäß, wie etwa
einer ELISA-Schale,
während
des Pipettierens zu sehen. Der Farbstoff wird so ausgewählt, dass
er unter den Bedingungen, unter denen das Reaktionsprodukt der Reak-
tion zwischen dem Substrat und dem Enzym zu detektieren ist, im
wesentlichen keine Extinktion in dem Extinktionsbereich aufweist. Darüber hinaus
weisen die speziell ausgewählten
Farbstoffe im wesentlichen keinen Einfluss auf die Enzymsubstratreaktion
auf. Es ist daher zum ersten Mal möglich geworden, ein Substrat
zur Verfügung
zu stellen, welches das manuelle Pipettieren leichter und zuverlässiger macht,
und somit auch schneller, ohne dass ein Kompromiss bei der Speicherstabilität des Substrats
geschlossen werden muss.
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Es sollte klar sein, dass die Substrate
gemäß der vorliegenden
Erfindung genauso für
automatische Pipettierprozeduren verwendet werden können, bei
denen es wünschenswert
ist, das Hinzufügen
einer ausreichenden Menge von Substrat zu dem Reaktionsgefäss (entweder
manuell oder durch automatische Mittel) zu kontrollieren.
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Die vorliegenden Erfindung stellt
daher ganz allgemein die Verwendung eines Substrates in einen Enzymimmunoassay
zur Verfügung
(wobei der Enzymimmunoassay die Reaktion zwischen einem Enzym und einem
in dem Sub strat enthaltenen Enzymsubstrat einschließt); das
Substrat enthält
einen Farbstoff, welcher (a) für
das menschliche Auge sichtbar ist, wenn er der Umgebung zugeführt wird,
in der der Enzymimmunoassay ausgeführt wird (b) im wesentlichen
die Reaktion zwischen dem Enzymsubstrat und dem Enzym nicht stört (c) im
wesentlichen unter den für
das Messen verwendeten Bedingungen das Reaktionsprodukt der Reaktion zwischen
dem Enzymsubstrat und dem Enzym nicht stört.
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Die hier beschriebenen Substrate
können
in der Form eines Pulvers, einer Tablette oder einer flüssigen Formulierung
vorliegen, vorzugsweise liegen die Substrate in der Form einer flüssigen Formulierung
vor, z. B. einer gebrauchsfertigen Lösung oder in der Form einer
Tablette, welche leicht in einem passenden Medium, z. B. Wasser,
einem Puffer oder einer Mischung eines organischen Lösungsmittels
und Wasser, aufgelöst werden
kann, um eine Lösung
mit der gewünschten
Konzentration zur Verfügung
zu stellen.
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Die Substrate können für jeden dem Durchschnittsfachmann
bekannten Enzymimmunoassay (EIA) verwendet werden. Von den verschiedenen
verfügbaren
EIA-Techniken ist die ELISA-Technik insbesondere interessant, da
automatisierte Set-ups kommerziell erhältlich sind. Passende Enzymsubstrate
für den HRP-ELISA
sind Ortho-phenylendiamin (OPD), 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenz-thiazolin-6-Schwefelsäure) (ABTS),
Diaminobenzidin (DAB), und 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin, wie etwa
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), wobei 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
(TMB) aufgrund seiner nichtlebensgefährlichen Natur bevorzugt wird.
Es sei klargestellt, dass die vorliegende Erfindung sich auf jedes
beliebige der vorerwähnten
Enzymsubstrate bezieht. Wenn alkalische Phosphatase als Enzym in
den EIA-Substraten verwendet wird, kann das Enzymsubstrat 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat
(BICP), p-Nitrophenyl-Phosphat (p-NPP) und Echtrot (Fast Red) sein.
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Insbesondere stellt die Erfindung
die Verwendung eines speicherstabilen vorgefärbten 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
(TMB) Substrates zur Verfügung,
mit: (a) einer wasserbasierten TMB-Substrat-Komposition, welche
ein Peroxid und (b) einen darin löslichen Farbstoff aufweist.
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Wenn die Begriffe "vorgefärbtes Substrat"
und "Substrate" und ähnliche
Begriffe hier verwendet werden, dann ist beabsichtigt, dass sie
eine einen Farbstoff enthaltende Substratkomposition meinen.
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Es ist beabsichtigt, dass der Begriff
"sichtbar für
das menschliche Auge" meinen soll, dass das in Rede stehende Substrat
ausreichend gefärbt
ist, um in den typischerweise in Enzymimmunoassays verwendeten Mengen
durch den Techniker identifiziert werden zu können. Wenn das Substrat ein
TMB-Substrat ist,
bei dem das Reaktionsprodukt zwischen TMB, Peroxid und HRP bei etwa
450 nm (gelb) gemessen wird, dann ist es bevorzugt, dass das Substrat
(Farbstoff) eine sichtbare Farbe im Bereich von 500-600 nm, d.h.
in einem von den blauen und gelben Farben des TMB freien Bereich.
Es wird angenommen, dass die Extinktion bei einer Wellenlänge in diesem
Bereich (500-600
nm) mindestens 100 mabs, wie etwa mindestens 200 mabs, vorzugsweise
mindestens 400 mabs, betragen sollte.
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Wenn ein Farbstoff in einem Substrat
aufgenommen werden soll, beispielsweise zusätzlich zu einem bereits etablierten
gebrauchsfertigen Substrat, wie etwa einer TMB-Substrat-Komposition,
dann muss der Farbstoff bestimmte Kriterien erfüllen.
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Es ist wichtig, dass der Farbstoff,
im wesentlichen nicht mit der Reaktion zwischen dem Enzymsubstrat und
dem Enzym interferiert. Daher sollte in dem Fall, in dem eine Horseradish-Peroxidase
ELISA (HRP-ELISA) ausgeführt
wird, der Farbstoff im wesentlichen nicht mit der Reaktion zwischen
dem Peroxid, der Horseradish-Peroxidase und dem TMB sowie im wesentlichen
nicht mit dem Reaktionsprodukt interferieren. Es ist klar, dass
für bestimmte
Applikationen eine kleine Interferenz akzeptabel sein kann, im allgemeinen
wird jedoch eine Interferenz mit der Reaktion eine schwerwiegende
Verschlechterung der Empfindlichkeit des Assays zur Folge haben.
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Als ein weiteres Kriterium muss der
Farbstoff vollständig
lösbar
unter den Bedingungen sein, unter denen das Reaktionsprodukt der
Reaktion Enzymsubstrat/Enzym gemessen wird. Es wird angenommen,
dass Farbstoffe mit einer Löslichkeit
in dem Substrat von mindestens 5 μg/ml,
vorzugsweise von min destens 10 μg/ml,
für den
hier beschriebenen Zweck geeignet sind. (Wenn das Substrat in der
Form eines Pulvers oder einer Tablette vorliegt, bezieht sich die
Löslichkeit
des Farbstoffs auf die finale (gebrauchsfertige) Konzentration.)
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Ein weiteres, jedoch nicht weniger
wichtiges Kriterium (welches den Geist der vorliegenden Erfindung darstellt)
ist, dass das Substrat (einschließlich des Farbstoffs) sichtbar
sein sollte, wenn es dem Reaktionsgefäß zugeführt wird, in dem der Enzymimmunoassay
ausgeführt
wird, beispielsweise in die ELISA-Schale pipettiert wird. Im Zusammenhang
mit dieser wichtigen Eigenschaft des Farbstoffs sollte es jedoch
im wesentlichen nicht unter den für die Messung des Reaktionsproduktes
aus der Reaktion zwischen dem Enzymsubstrat und dem Enzym verwendeten
Bedingungen interferieren. Dies sollte auch dann der Fall sein,
wenn weitere Reagenzien (Stopp-Lösungen)
dem Reaktionsgefäss
zugeführt
werden, bevor die Messung des Reaktionsprodukts ausgeführt wird.
In dem Fall, in dem der Enzymimmunoassay auf einem HRP/TMB-System
basiert, sollte der Farbstoff keinen Einfluss auf die Detektion
des Reaktionsprodukts haben, insbesondere nicht nach dem Hinzufügen einer
Stopp-Lösung
(z. B. Schwefelsäure).
Der Farbstoff selbst sollte daher keine oder nur eine geringe Extinktion
bei der Messwellenlänge
haben, oft im Bereich von 400-500 nm oder 600-660 nm, insbesondere
bei etwa 450 nm und etwa 640 nm. Für ein normales TMB-Substrat
(ohne Farbstoff) liegen die normalen Blindextinktionswerte bei 5-20
Milli-Extinktionseinheiten (mabs; gemessen für ein Volumen von 100 μl in einer
ELISA-Schale (Durchmesser 6,7 mm). [Dieses Verhältnis von Volumen zu Durchmesser
liegt im allgemeinen bei den mabs-Werten vor, die in der Beschreibung
und in den Ansprüchen
genannt sind (es sei denn, es ist dort etwas anderes festgehalten)]).
Der Farbstoff kann einen kleinen Anstieg verursachen, das Gesamtniveau
der Blindextinktion sollte jedoch vorzugsweise unterhalb von 100
mabs, vorzugsweise unterhalb von 75 mabs, wie etwa unterhalb von
50 mabs liegen, zumindest bei etwa 450 nm und etwa 640 nm, jedoch
vorzugsweise auch in den Gesamtbereichen von 400-500 nm und 600-660
nm. Daher können
Farbstoffe, welche sich von farbig zu farblos verändern, oder
Farben, die keine Extinktion bei der Messwellenlänge unter den Testbedingungen
aufweisen, verwendet werden.
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Da der Farbstoff vorzugsweise in
einer gebrauchsfertigen Substratkomposition vorhanden ist, sollte
jeder (negative) Effekt auf die Aktivität und die Langzeitstabilität des Substrats,
wenn es bei 4°C,
oder sogar bei 25°C,
gelagert wird, minimal sein. Die Langzeitstabilität des einen
Farbstoff aufweisenden Substrats sollte so gut sein, wie die des
normalen farblosen Substrats, d.h. oft mindestens 12 Monate (wie
etwa 12-18 Monate oder mehr) betragen, wenn es bei 4°C in der
Dunkelheit gelagert wird, mit weniger als 25% Abnahme in der Aktivität, verglichen
mit der ursprünglichen
Aktivität
des Substrat. Vorzugsweise liegt die Abnahme der Aktivität sogar
darunter, wie etwa bei 20%, oder sogar bei weniger als 10%, oder
weniger als 5%.
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Wenn der Begriff "TMB-Substrat-Komposition"
hier verwendet wird, ist beabsichtigt, dass er eine (im übrigen im
wesentlichen farblose) Zusammensetzung meint, welche selbstständig verwendet
werden kann. Wenn hier verwendet, kann daher eine Substratzusammensetzung
ein bereits etabliertes Substrat sein; dies sollte jedoch nicht
so verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung auf die Aufnahme
von Farbstoffen in derzeit kommerziell erhältlichen TMB-Substratzusammensetzungen
beschränkt
ist.
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TMB-Substratzusammensetzungen werden
typischerweise eine Anzahl von Additiven enthalten, um die Stabilität und die
Kompatibilität
mit HRP-ELISA oder HRP-EIA zu erhöhen. Darüber hinaus werden TMB-Substratzusammensetzungen
weiterhin das notwendige Peroxid aufweisen, so dass die TMB-Substratkomposition
ein "vollständiges"
Substratsystem konstituiert. Ein Peroxid als ein Teil der TMB-Substratzusammensetzung
wird typischerweise ausgewählt
aus Wasserstoffperoxid und Urea-Wasserstoffperoxid,
vorzugsweise Wasserstoffperoxid.
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Aus dem Obigen sollte klar sein,
dass der Farbstoff nicht ein Substrat oder ein Inhibitor für Horseradish-Peroxidase
(HRP) in dem Fall sein sollte, in dem das Substrat in einem HRP-ELISA
oder einem HRP-EIA verwendet wird.
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Um lebensgefährliche Bedingungen für die mit
den Substraten arbeitenden Technikern zu vermeiden, ist es insbesondere
bevorzugt, dass die Substrate gemäß der vorliegenden Erfindung
ein TMB-Substrat aufweisen, welches ein wasserbasiertes Lösungsmittelsystem
oder ein Lösungsmittelsystem
mit weniger als 5% (v/v) organischer Lösungsmittel aufweist. In dem
Fall, in dem ein wasserbasiertes Lösungsmittelsystem angewendet
wird (aber auch in bestimmten Fällen,
in dem ein organisches Lösungsmittelsystem
verwendet wird), kann es notwendig oder wünschenswert sein, eine oder
mehrere löslichkeitserhöhende Mittel
einzusetzen, um die (permanente) Auflösung des Farbstoffs zu erleichtern.
Ein Beispiel eines geeigneten löslichkeitserhöhenden Mittels
ist Polyvinylalkohol, welcher bereits Konstituent der TMB-Substratzusammensetzung
sein kann. Es ist klar, dass der relativ niedrige Gehalt organischer
Lösungsmittel
eine weitere Herausforderung in Richtung auf eine Lösung entsprechend
dem mit der vorliegenden Erfindung gelösten Problem war.
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Beispiele kommerziell erhältlicher
TMB-Substratkompositionen sind: "TMB Eins Substrat" (ex Kem-En-Tec
A/S, Denmark), "TMB PLUS Substrat" (ex-Kem-En-Tec A/S, Denmark), "TMB Microwell
Peroxidase Substrat" (ex Kirkegaard & Perry Labortories), "K-Blue" (ex
Elisa Technologies) und "TMB Peroxidase Substrat" (ex MOSS Inc.).
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Für
Substrate für
andere Enzymimmunoassays gelten mutatis mutandis ähnliche
Prinzipien.
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Im vorliegenden Kontext ist beabsichtigt,
dass der Begriff "Farbstoff" seine normale Bedeutung aufweisen soll,
nämlich
als eine "lösliches"
Färbemittel.
Farbstoffe, die passende Eigenschaften mit Bezug auf mindestens
einen der oben erwähnten
Parameter aufweisen, sind beispielsweise Phloxin B, Eosin B und
Chinaldin Rot, Naphthol Gelb, basisches Fuchsin, m-Cresol Purpur,
Thymol Blau, Xylenol Blau, Nil Blau A, Thymolphtalein, wobei Phloxin
B der geeignetste sein dürfte.
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Eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Substrat mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
(TMB), Phloxin B, Wasserstoffperoxid, eines oder mehrere Additive,
einschließlich
eines beliebigen Löslichkeitserhöhenden Mittels,
und eines wasserbasierten Lösungsmittelsystems.
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auch auf die Verwendung der hier beschriebenen Substrate in einem
Enzymimmunoassay, wie etwa einem ELISA.
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Darüber hinaus bezieht sich die
vorliegenden Erfindung auch auf die Verwendung eines Farbstoffes für die Vorbereitung
eines Substrats für
einen Enzymimmunoassay, wie etwa einen ELISA, wobei der Farbstoff in
dem Substrat in einer solchen Konzentration vorhanden ist, dass
der Farbstoff für
das menschliche Auge sichtbar ist. Besonders interessante Farbstoffe
für diesen
Zweck sind Phloxin B, Eosin B und Chinaldin Rot.
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Beispiele
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Allgemeine Prozedur für einen
ELISA-Assay unter Verwendung von TMB-Substraten
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In allen folgenden Beispielen wird
die folgende ELISA-Prozedur verwendet. Der Assay ist ein dreilagiger
Sandwich-ELISA. Für
alle drei Lagen wurde Kaninchen-Anti-Human-IgG, Humanserumproteinkalibrator, und
Kaninchen-Anti-Human-IgG-HRP
von Dako A/S, Dänemark,
verwendet. Die Platte ist mit dem ersten Antikörper beschichtet, an welchem
das Antigen als zweite Schicht gekoppelt ist. Diese Schicht ist
normalerweise die zu analysierende Probe; da es jedoch unser Ziel
ist, das Substrat zu analysieren, ist die "Probe" in allen Tests
das gleiche Antigen. An dieses Antigen ist ein zweites Antikörperenzymkonjugat
gekoppelt. Das Assay wird im Folgenden im Detail beschrieben.
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Das Assay wird in Polystyrol MAXISorp-Platten
(flachen Gefässen/Gräben mit
Boden) von Nalge NUNC International ausgeführt.
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Erste Schicht: Kaninchen-Anti-Human
IgG (DAKO A 0423); wird 1:1000 verdünnt in 0.1 M KHP2O4, pH 7.2, 100 μl wird zu jedem Gefäß hinzugefügt und über Nacht
bei 4°C
inkubiert. Der Antikörper
wird dekantiert und die Gefässe
werden einmal mit Waschpuffer (0.1 M KHP2O4; 0.5 M NaCl; 0.1 % Tween 20; pH 7.2) gewaschen.
200 μl Blockierlösung (0.1
M KHP2O4; 0.5 %
Tween 20, pH 7.2) wird hinzugefügt
und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blockierlösung wird
dekantiert und die Wände
werden zweimal mit Waschpuffer gewaschen.
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Zweite Schicht: Human-Serum-Protein-Kalibrator
(DAKO X 0908) wird auf 4 ng/ml in 0.1 M KHP2O4, pH 7.2, verdünnt, 100 μl wird zu jedem Gefäß hinzugefügt und über Nacht
bei Raumtemperatur inkubiert. Die verdünnte Antigen-Lösung wird dekantiert und die
Gefäße werden
dreimal mit Waschpuffer gewaschen.
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Dritte Schicht: Kaninchen-Anti-Human-IgG-HrP
(DAKO P 214) wird 1:1000 in 0.1 M KHP2O4, pH 7.2, verdünnt, 100 μl wird hinzugefügt und zwei
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Antikörperenzymkonjugat wird dekantiert
und die Gefässe
werden dreimal in Waschpuffer gewaschen.
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Die Platte ist dann fertig für die Hinzufügung des
zu testenden TMB-Substrats. Für
jedes zu testende Substrat wird eine Säule ( = acht Gefäße) verwendet.
Dies bedeutet, dass jedes Substrat in einer achtfachen Bestimmung
analysiert wird. 100 μl
Substrat wird hinzugefügt
und für
dreizehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird
durch Hinzufügen
von 100 μl
0.2 M Schwefelsäure
gestoppt und die Platte wird in einen ELISA (BIO-TEK Instruments
EL 312e) bei 450 nm mit 630 nm als Referenzwellenlänge eingelesen.
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Beim Ausführen eines Tests wird ein stabiles
TMB-Substrat, ein TMB-Microwell-Peroxidase-Substrat von
Kirkegaard & Perry
Laboratories, als Standard in einer Säule in jeder Schale aufgenommen.
Die Aktivität des
getesteten Substrats ist der Mittelwert der acht Bestimmungen und
wird mit diesem Standard verglichen.
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Der Blindextinktionswert des Substrats
wird durch Hinzufügen
von 100 μl
Substrat zu einer Säule
einer unbeschichteten ELISA-Platte bestimmt, wobei 100 μl 0.2 M Schwefelsäure hinzugefügt werden
und die Platte bei 450 nm mit 630 nm als Referenzwellenlänge gelesen
wird. Der Blindextinktionswert ist der Mittelwert der acht Bestimmungen.
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Beispiel 1 – Hinzufügen von
Farbstoff zu den TMB-Substraten
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Phloxin B (Sigma) ist ein Farbstoff,
welcher Rot bis Purpur bei dem pH des Substrats ist und sich durch Hinzufügen von
Schwefelsäure
zu farblos hin verändert.
Phloxin B wurde zu 5 verschiedenen gebrauchsfertigen Substraten
hinzugefügt:
TMB Eins Substrat; Kem-En-Tec A/S, TMB PLUS Substrat; Kem-En-Tec A/S, TMB Microwell
Peroxidase-Substrat; Kirkegaard % Perry Laborstories (TMB 1), K-Blau;
Elisa Technologies; (TMB 2) und TMB Peroxidase-Substrat; MOSS Inc. (TMB 3). Die Konzentration
des Farbstoffs war 15 μg
pro ml Substrat. Die vorgefärbten
Substrate wurden visuell auf Niederschlag des Farbstoffs geprüft und von
"+++" (schwerer Niederschlag) bis "–" (kein Niederschlag) eingestuft.
Darüber
hinaus wurde der Blindwert der Substrate bei 450 nm mit 630 nm als
Referenzwellenlänge
in einer ELISA-Schale gelesen, siehe die obige allgemeine Prozedur.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt. Tabelle
1
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Für
zwei der Substrate, TMB Plus und TMB 2, verursachte das Hinzufügen des
Farbstoffs einen schweren Niederschlag, wenn der Farbstoff zu den
Gebrauchsfertigen Substraten hinzugefügt wurde. Es entstand kein
Niederschlag in drei der verbleibenden gefärbten Substrate. Eines von
diesen (TMB Eins) wird als ein ELISA verwendbar sein, da der Blindwert
niedriger ist als die gewünschten
50-75 mabs. Für
die anderen beiden Substrate (TMB 1 und TMB 3) verursachte das Hinzufügen des
Farbstoffs einen Anstieg in dem Blindwert zu einem Niveau, welches
höher lag
als oder sehr nahe bei 75 mabs.
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Beispiel 2 – Verbessern
der Löslichkeit
des Farbstoffs
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Um die Löslichkeit zu verbessern, wurde
Polyvinylalkohol hinzugefügt,
welches eine der Komponenten ist, die bereits in einigen der Substratzusammensetzungen
vorhanden sind. Polyvinylalkohol (PVA) ist in den beiden Kem-En-Tec-Substrat-Kompositionen
(TMB Eins und TMB Plus) vorhanden und die Menge wurde durch Hinzufügen von
0.100 mg/ml bzw. 0.152 mg/ml erhöht
auf eine Endkonzentration von 0.200 mg PVA/ml. Zu den anderen drei
getesteten Substraten wurde 0.200 mg PVA/ml bis zu einer Konzentration
von mindestens 0.200 mg/ml hinzugefügt. Anschließend wurde
Phloxin B in der gleichen Konzentration wie in Beispiel 1, d.h. 15 μg/ml, hinzugefügt.
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Die vorgefärbten Substrate wurden erneut
visuell auf einen Niederschlag des Farbstoffs untersucht und es
wurde der Blindwert der Substrate bei 450/630 nm in einer ELISA-Schale
(siehe die obigen allgemeine Prozedur) gelesen. Die Ergebnisse sind
in der Tabelle 2 dargestellt. Tabelle
2
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TMB Eins und TMB Plus wiesen beide
eine gute Sichtbarkeit nach dem Pipettieren in der ELISA-Schale
auf, und zeigten akzeptable Blindwerte ausreichend unterhalb von
50 mabs.
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Beispiel 3 – Bestimmung
der optimalen Konzentration des Farbstoffs
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Wie in Beispiel 2 wurde zu den TMB-Standard
und TMB-Plus-Substraten zusätzlich
Polyvinylalkohol hinzugefügt,
und es wurde Phloxin B in der Tabelle 3 dargestellten Konzentrationen
hinzugefügt. Tabelle
3
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Die optimale Konzentration des Farbstoffs
ist eine Kombination aus einer Löslichkeit
in der Substratformulierung, dem Anstieg des Blindwerts, wobei die
Farbe stark genug sein muss, um in der ELISA-Schale sichtbar zu
sein. Mit einer Konzentration von 2 μg/ml sind die Substrate nahezu
farblos. Eine Konzentration von 10 μg/ml liefert eine gute Sichtbarkeit
und einen akzeptablen Blindwert. Die hohe Konzentration von 50 μg/ml führt zu einem
Niederschlag des Farbstoffs in dem TMB Eins Substrat. In der TMB
Plus Substrat Zusammensetzung liegt der Blindwert unterhalb von
50 mabs. Da die Sichtbarkeit sowohl bei 10 als auch bei 50 μg/ml gut
ist, ist es bevorzugt, nur die notwendige Menge des Farbstoffs hinzuzufügen, so
dass eine Konzentration von 10 μg/ml
ausreichend zu sein scheint.
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Beispiel 4 – Ein gefärbtes TMB-Substrat
gegen ein "normales" TMB-Substrat
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Die Aktivität von TMB Eins Substrat und
TMB Plus Substrat wurde bezüglich
der Aktivität
verglichen, wenn zusätzliches
PVA und ein Farbstoff zu der Formulierung hinzugefügt wurde.
Zusätzliches
PVA wurde in Beispiel 2 hinzugefügt.
Der Farbstoff Phloxin B wurde in einer Konzentration von 10 μg/ml verwendet. Tabelle
4
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Diese Ergebnisse zeigen, dass das
Hinzufügen
eines Farbstoffs zu den beiden TMB-Formulierungen einen sehr kleinen
Einfluss auf den Blindextinktionswert hat, und dass die Aktivität für beide
Substrate die gleiche ist.
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Beispiel 5 – Test verschiedener
Farbstoffe
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Drei verschiedene Farbstoffe, Phloxin
B, Eosin B und Chinaldin Rot, alle von Sigma Chemical Co., wurden
auf ihre Leistungsfähigkeit
getestet, wenn sie in die Formulierung des TMB Plus Substrats in
einer Konzentration von 10 μg/ml
zusammen mit Polyvinylalkohol (0.152 mg/ml – Gesamtmenge 0.200 mg/ml)
aufgenommen wurden. Die Leistungsfähigkeit wurde wie in der allgemeinen
Prozedur beschrieben getestet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle
5 dargestellt. Tabelle
5
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Keiner der Farbstoffe schlug sich
in einer Konzentration von 10 μg/ml
nieder. Der Blindwert ist gut für alle
ausgewählten
Farbstoffe, jedoch wird die Aktivität leicht durch Eosin B und
Chinaldin Rot beeinflusst. Die Abnahme in der Aktivität für Eosin
B liegt bei etwa 8 % und könnte
akzeptabel sein, jedoch liegt die Abnahme für Chinaldin Rot bei etwa 25%,
was für
manche praktische Ver wendungen unakzeptabel sein kann. In bestimmten
Fällen
kann es jedoch sein, dass es kein prohibitiver Effekt für die Verwendung
des Substrats ist, so dass es daher als innerhalb des Schutzbereichs
der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet werden sollte.
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Beispiel 6 – Langzeitstabilität der vorgefärbten Substrate
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Um die Langzeitstabilität der vorgefärbten Substrate
TMB Standard und TMB Plus zu prüfen,
wurden kleine Flaschen (Nalgene Bernstein 15 ml Flaschen), die frisch
produziertes Substrat enthielten, bei 4°C und 20°C in der Dunkelheit platziert.
Von Zeit zu Zeit wurden Flaschen des Substrats in dem in der allgemeinen Prozedur
beschriebenen Assay analysiert. Die Aktivität des Substrats wurde auf 100
% an dem Tag der Herstellung gesetzt. Die Ergebnisse der Stabilitätstests
sind in den unten stehenden Tabellen dargestellt. Tabelle
6
Tabelle
7
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Wie aus den Tabellen zu ersehen ist,
weisen beide Substrate eine sehr gute Langzeitstabilität auf, sehr ähnlich zu
den ungefärbten
kommerziellen Substraten. Nach nahezu einem Jahr bei 4°C war bei
dem TMB Standard Substrat kein Verlust von Aktivität vorhanden
und es war kein Anstieg in der Blindextinktion vorhanden. Bei 20°C war ein
Verlust in der Aktivität
von etwa 25 vorhanden, was im allgemeinen für ein Substrat nach einer Speicherung
bei einer Umgebungstemperatur für
solch einen langen Zeitraum erwartet wird. Für das TMB Plus Substrat war
kein Anstieg in der Blindextinktion vorhanden, und es war eine leichte
Abnahme in der Aktivität
bei 4°C
(nahe nicht signifikant) vorhanden. Nach etwa einem Jahr bei 20°C war etwas
Verlust in der Aktivität
vorhanden. Es wurde erwartet, einen höheren Verlust bei 20°C für dieses
Substrat aufgrund des höheren
Aktivitätsniveaus
zu beobachten.
