CN117169509A - 一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒，包括R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液，和R3RF反应缓冲液，所述R1磁珠包被物工作液中含类风湿因子抗原磁珠复合物；所述类风湿因子抗原磁珠复合物中，类风湿因子抗原和磁珠的质量比为(12‑16)μg：1mg。本申请还公开了一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的制备方法和一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的非诊断性检测方法。能够更有效捕获样品中的抗心磷脂抗体，令类风湿因子试剂盒灵敏度更高，可以定量检测到较低浓度的目标分子。检测速度更快，更加简便。

Description

一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒及其制备方法和检测 方法

技术领域

本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种类风湿因子及其亚型测定试剂盒及其制备方法和非诊断性检测方法。

背景技术

类风湿因子属于免疫球蛋白M(IgM)类抗体，由B淋巴细胞产生。它通常结合到其他抗体IgG上，形成免疫复合物，引发炎症反应。根据它结合IgG的部位和活性，可以将类风湿因子分为不同的亚型，如IgM、IgA、IgG等。类风湿因子通过自身免疫反应，错误攻击自身细胞和组织，产生免疫复合物。这些免疫复合物沉积在关节、血管壁和其他身体组织中，并引发炎症反应，并且这种炎症反应可以导致关节肿胀、疼痛、僵硬和功能损害。常见的类风湿因子导致的病症有类风湿性关节炎(RA)、雷诺氏现象、系统性红斑狼疮或干燥综合征等自身免疫性疾病。

目前，类风湿因子及其亚型的检测方法主要为酶联免疫或荧光免疫层析作为反应的原理。其中，酶联免疫吸附法的重复性好，但是灵敏度和特异性较差，并且操作步骤多，检测时长耗时多；荧光免疫层析法的灵敏度与好，但是设备成本高，并且应用的试纸开发复杂，不适合大规模生产。另一方面，现有技术也有通过化学发光免疫分析法来对类风湿因子进行检测的技术方案，解决了灵敏度低和特异性低的问题，但是同样面临着检测范围窄，以及无法定量的新问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种类风湿因子及其亚型测定试剂盒，能定量分析人血清中的类风湿因子及其亚型，信噪比大，具有灵敏度高、特异性强的特点。

本发明的目的之二在于提供一种类风湿因子及其亚型测定试剂盒的制备方法，制备工艺稳定性高，简单易操作，生产成本低，制备出的产品均一性好。

本发明的目的之三在于提供一种类风湿因子及其亚型测定试剂盒的非诊断性检测方法，具有灵敏度高、特异性强和检测范围宽的优势，并且检测方法耗时短。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒，包括R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液，所述R1磁珠包被物工作液中含类风湿因子抗原磁珠复合物；所述类风湿因子抗原磁珠复合物中，类风湿因子抗原和磁珠的质量比为(12-16)μg：1mg。

进一步地，所述类风湿因子包括类风湿因子IgA、类风湿因子IgG和类风湿因子IgM中的任一种或其亚型。

进一步地，所述R1磁珠包被物工作液中含类风湿因子抗原磁珠复合物的浓度为0.1-0.4mg/ml；所述R2碱性磷酸酶标记物工作液含有羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记物，浓度为0.5-2.0μg/mL。

进一步地，所述类风湿因子及其亚型的测定试剂盒还包括校准品、校准品复融液、化学发光底物液和R3 RF反应缓冲液；

所述R3 RF反应缓冲液为PBS溶液、Hepes溶液和Tris溶液中的至少一种，且所述R3RF反应缓冲液中包括以质量百分比计：0.8-1.5％BSA、0.08-0.15％Tween 20、0.3-0.8％Proclin 300，所述RF反应缓冲液的浓度为0.03-0.08M，pH值为7.2-7.4。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

S1、对类风湿因子抗原进行水浴和冰浴，将磁珠与类风湿因子抗原在磁珠结合缓冲液中依次进行包被结合，在磁珠封闭缓冲液中进行封闭，清洗后得到类风湿因子抗原磁珠复合物，加入磁珠包被物稀释液，稀释得到R1磁珠包被物工作液；

S2、将碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶在碱性磷酸酶结合缓冲液中孵育结合后进行超滤纯化，得到羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记物，然后加入碱性磷酸酶标记物稀释液进行稀释，稀释得到R2碱性磷酸酶标记物工作液；

S3、将所述R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液、R3 RF反应缓冲液、化学发光底物液、校准品和校准品复融液进行组装，得到类风湿因子及其亚型的测定试剂盒。

进一步地，步骤S1中，所述类风湿因子抗原水浴时间为15-45分钟，水浴温度为62-65℃；所述冰浴时间为5-15分钟。

进一步地，步骤S1中，所述磁珠结合缓冲液为0.05-0.2M MES缓冲液，pH为5.0-6.0；磁珠与类风湿因子抗原的包被时间为1-6h，

所述磁珠封闭缓冲液中BSA的质量浓度为1-3％，封闭时间为0.5-2h；所述磁珠包被物稀释液成分与R3 RF反应缓冲液相同。

进一步地，步骤S2中，所述碱性磷酸酶结合缓冲液为0.05-0.15M TSE缓冲液，pH为6.5-7.3，所述结合时间为30-120min；所述超滤次数为4-8次；所述羊抗人IgG抗体和碱性磷酸酶结合的质量比为1：(1-4)；

所述碱性磷酸酶标记物稀释液为TES溶液、MES溶液和Tris溶液中的一种，且所述碱性磷酸酶标记物稀释液中包括以质量百分比计：0.8-1.5％BSA、0.08-0.15％Tween 20、0.3-0.8％Proclin 300，所述碱性磷酸酶标记物稀释液浓度为0.03-0.08M。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的非诊断性检测方法，检测方法包括以下步骤：

步骤1、将待测样品稀释后与R1磁珠包被物工作液、R3 RF反应缓冲液进行孵育结合，第一次洗涤后加入R2碱性磷酸酶标记物工作液进行标记结合，磁分离并进行第二次洗涤，得到类风湿因子免疫复合物；

步骤2、将所述类风湿因子免疫复合物加入化学发光底物液中反应，检测RLU发光值；

步骤3、将RLU发光值与校准品构建的发光值标准曲线进行匹配，得到待测样本中的类风湿因子的含量。

进一步地，所述待测样品的稀释倍数为10-60倍；

所述稀释后样品、R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液、R3RF反应缓冲液和化学发光底物也的加入体积比为(20-100)：(20-70)：(20-100)：(20-70)：(20-300)；

所述步骤1中，孵育结合时间为5-20min，第一次洗涤次数为1-5次；标记结合时间为1-15min，第二次洗涤次数为1-5次。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明的一种类风湿因子及其亚型测定试剂盒，通过类风湿因子磁珠包被物特异性捕获待测样品液中的目的抗体，形成双抗原夹心结构，更好的放大信号；通过磁分离能减少对目的抗体结构的破坏；其中R1磁珠包被物工作液中抗原的含量能够更有效捕获样品中的类风湿因子，令类风湿因子试剂盒灵敏度更高，可以检测到较低浓度的目标分子。

2.本发明的一种非诊断和治疗目的类风湿因子及其亚型测定试剂盒的检测方法，将磁珠分离提取技术和双抗原夹心法结合，实现从待测样品液中快速、高效地分离出类风湿因子并进行标记，利用化学发光分析系统对类风湿因子定量检测，在30分钟左右即可获得均一性和准确度高的结果，大幅提高了样品的处理效率，同时稀释倍数在10-60，降低了使用成本的同时扩大了可报告区间，可报告区间为1-15500U/mL。

3.本发明的一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒制备方法，制备方法简单，制备出的产品精密度高，能够实现批次间和样品间的高度可重复性，产品的批间差变异系数低。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1类风湿因子IgA试剂盒磁珠包被物的制备

1.1包被抗原用量优化

按每mg磁珠添加12、14、16ug抗原进行包被，试验结果如下表1：

表1抗原包被用量优化表

试验结果显示，以每mg磁珠包被14μg抗原的检测结果最为理想，信噪比最高，因此在本实施例进行磁珠包被时，使用14μg(抗原)：mg(磁珠)比例进行包被。

1.2抗原水浴时间优化

将抗原置于浮子放入65℃水浴锅中(温度需严格控制在62-65℃之间)，水浴加热15min、30min、60min。置于冰中，冰浴10min。优化结果如下表2

表2抗原水浴时间优化

试验结果显示，抗原水浴加热30min检测结果最为理想，信噪比最高，因此在抗原水浴时间为30min。

1.3抗原冰浴时间优化

将抗原置于浮子放入65℃水浴锅中(温度需严格控制在62-64℃之间)，水浴加热30min。置于冰中，冰浴5、10、15min。优化结果如下表3：

表3抗原冰浴时间优化表

试验结果显示，抗原冰浴10min检测结果最为理想，信噪比最高，因此在抗原冰浴时间为10min。

1.4结合缓冲液pH优化

分别用pH为5.0、5.5和6.0的0.1M MES，进行包被。试验结果如表4：

表4磁珠和抗体结合缓冲液pH优化表

从上表4可知，结合缓冲液为pH5.5时信噪比最高。因此本实施例的结合缓冲液的pH为5.5。

1.5封闭液中BSA浓度优化

调整封闭液中BSA的量，使BSA浓度为1％、2％、3％，进行磁珠封闭，按每mg磁珠加封闭液0.1mL进行磁珠封闭。试验结果如下表5：

表5封闭液中BSA含量优化表

从上表5可知，封闭液中BSA含量为2％时，封闭效果最好，信噪比最高。因此本实施例选用封闭液中BSA含量为2％。

1.6抗原包被时间优化

分别设置磁珠包被时间为1h、3h、6h，进行磁珠包被。试验结果如下表6：

表6类风湿因子抗原IgA包被时间优化表

从上表6可知，类风湿因子抗原IgA的包被时间为3h时，信噪比最高。因此本实施例选择类风湿因子抗原IgA包被时间为3h。

1.7磁珠封闭时间优化

分别设置磁珠封闭时间为0.5h、1h、2h，进行磁珠封闭。试验结果如下表7：

表7磁珠和抗原封闭时间优化表

从上表可知，封闭时间为0.5h时，信噪比最高。因此本实施例选择封闭时间为0.5h。

1.8磁珠包被物稀释液优化

分别以0.05M Hepes(PH7.2-7.4)体系、0.05M PBS(PH7.2-7.4)体系和0.05M Tris(PH7.2-7.4)体系(均含1％BSA、0.1％Tween 20、0.5％Proclin 300)稀释磁珠包被物，测试样本信噪比。其余试剂稀释液保持不变，使用0.05M Tris(PH7.2-7.4)。试验结果如下表8：

表8磁珠包被物稀释液优化表

从上表8可知，磁珠包被物用Tris体系稀释时，信噪比最好。因此选择Tris体系稀释磁珠包被物。

实施例2类风湿因子IgG试剂盒磁珠包被物的制备

2.1包被抗原用量优化

按每mg磁珠添加12、14、16ug抗原进行包被，试验结果如下表9：

表9抗原包被用量优化表

试验结果显示，以每mg磁珠包被14μg抗原的检测结果最为理想，信噪比最高，因此在本实施例进行磁珠包被时，使用14μg(抗原)：mg(磁珠)比例进行包被。

2.2抗原水浴时间优化

将抗原置于浮子放入65℃水浴锅中(温度需严格控制在62-65℃之间)，水浴加热15min、30min、60min。置于冰中，冰浴10min。优化结果如下表10：

表10抗原水浴时间优化

试验结果显示，抗原水浴加热30min检测结果最为理想，信噪比最高，因此在抗原水浴时间为30min。

2.3抗原冰浴时间优化

将抗原置于浮子放入65℃水浴锅中(温度需严格控制在62-64℃之间)，水浴加热30min。置于冰中，冰浴5、10、15min。优化结果如下表11：

表11抗原冰浴时间优化表

试验结果显示，抗原冰浴10min检测结果最为理想，信噪比最高，因此在抗原冰浴时间为10min。

2.4结合缓冲液pH优化

分别用pH为5.0、5.5和6.0的0.1M MES，进行包被。试验结果如表12：

表12磁珠和抗体结合缓冲液pH优化表

从上表12可知，结合缓冲液为pH5.5时信噪比最高。因此本实施例的结合缓冲液的pH为5.5。

2.5封闭液中BSA浓度优化

调整封闭液中BSA的量，使BSA浓度为1％、2％、3％，进行磁珠封闭，按每mg磁珠加封闭液0.1mL进行磁珠封闭。试验结果如下表13：

表13封闭液中BSA含量优化表

从上表13可知，封闭液中BSA含量为2％时，封闭效果最好，信噪比最高。因此本实施例选用封闭液中BSA含量为2％。

2.6抗原包被时间优化

分别设置磁珠包被时间为1h、3h、6h，进行磁珠包被。试验结果如下表14：

表14类风湿因子抗原IgG包被时间优化表

从上表14可知，类风湿因子抗原IgG的包被时间为3h时，信噪比最高。因此本实施例选择类风湿因子抗原IgG包被时间为3h。

2.7磁珠封闭时间优化

分别设置磁珠封闭时间为0.5h、1h、2h，进行磁珠封闭。试验结果如下表15：

表15磁珠和抗原封闭时间优化表

从上表15可知，封闭时间为0.5h时，信噪比最高。因此本实施例选择封闭时间为0.5h。

磁珠包被物稀释液采用0.05M Tris(PH7.2-7.4)体系(含1％BSA、0.1％Tween 20、0.5％Proclin 300)稀释磁珠包被物。

实施例3类风湿因子IgM试剂盒磁珠包被物的制备

3.1包被抗原用量优化

按每mg磁珠添加12、14、16ug抗原进行包被，试验结果如下表16：

表16抗原包被用量优化表

试验结果显示，以每mg磁珠包被14μg抗原的检测结果最为理想，信噪比最高，因此在本实施例进行磁珠包被时，使用14μg(抗原)：mg(磁珠)比例进行包被。

3.2抗原水浴时间优化

将抗原置于浮子放入65℃水浴锅中(温度需严格控制在62-65℃之间)，水浴加热15min、30min、60min。置于冰中，冰浴10min。优化结果如下表17：

表17抗原水浴时间优化

试验结果显示，抗原水浴加热30min检测结果最为理想，信噪比最高，因此在抗原水浴时间为30min。

3.3抗原冰浴时间优化

将抗原置于浮子放入65℃水浴锅中(温度需严格控制在62-64℃之间)，水浴加热30min。置于冰中，冰浴5、10、15min。优化结果如下表18：

表18抗原冰浴时间优化表

试验结果显示，抗原冰浴10min检测结果最为理想，信噪比最高，因此在抗原冰浴时间为10min。

3.4结合缓冲液pH优化

分别用pH为5.0、5.5和6.0的0.1M MES，进行包被。试验结果如表19：

表19磁珠和抗体结合缓冲液pH优化表

从上表19可知，结合缓冲液为pH5.5时信噪比最高。因此本实施例的结合缓冲液的pH为5.5。

3.5封闭液中BSA浓度优化

调整封闭液中BSA的量，使BSA浓度为1％、2％、3％，进行磁珠封闭，按每mg磁珠加封闭液0.1mL进行磁珠封闭。试验结果如下表20：

表20封闭液中BSA含量优化表

从上表20可知，封闭液中BSA含量为2％时，封闭效果最好，信噪比最高。因此本实施例选用封闭液中BSA含量为2％。

3.6抗原包被时间优化

分别设置磁珠包被时间为1h、3h、6h，进行磁珠包被。试验结果如下表21：

表21类风湿因子抗原IgM包被时间优化表

从上表21可知，类风湿因子抗原IgM的包被时间为3h时，信噪比最高。因此本实施例选择类风湿因子抗原IgM包被时间为3h。

1.7磁珠封闭时间优化

分别设置磁珠封闭时间为0.5h、1h、2h，进行磁珠封闭。试验结果如下表22：

表22磁珠和抗原封闭时间优化表

从上表22可知，封闭时间为0.5h时，信噪比最高。因此本实施例选择封闭时间为0.5h。

磁珠包被物稀释液采用0.05M Tris(PH7.2-7.4)体系(含1％BSA、0.1％Tween20、0.5％Proclin 300)稀释磁珠包被物。

实施例4碱性磷酸酶标记工艺

实施例中采用以下方法制备R2碱性磷酸酶标记物工作液：

活化羊抗人IgG抗体和碱性磷酸酶，将碱性磷酸酶与羊抗人IgG抗体在碱性磷酸酶标记缓冲液中进行标记，所述羊抗人IgG抗体和碱性磷酸酶的质量比为1：2，标记时间为30min；所述标记缓冲液为0.1M TES缓冲液，pH为7.3。随后超滤纯化，超滤次数为6次。使用碱性磷酸酶标记物稀释液进行稀释，稀释液体系为含有1％BSA、0.1％Tween 20、0.5％Proclin 300的0.05M Tris缓冲液，稀释缓冲液pH为7.2-7.4，完成R2碱性磷酸酶标记物工作液的制备，浓度为1.0μg/mL。

实施例5R3 RF反应缓冲液体系

分别以0.05M Hepes(PH7.2-7.4)体系、0.05M PBS(PH 7.2-7.4)体系和0.05MTris(PH7.2-7.4)(均含1％BSA、0.1％Tween 20、0.5％Proclin 300)作为RF反应缓冲液，测试样本信噪比。其余试剂稀释液保持不变，使用0.05M Tris(PH7.2-7.4)，作为RF IgA反应缓冲液。试验结果如下表23。

表23RF IgA反应缓冲液体系筛选

从上表23可知，RF IgA试剂盒中的R3 RF反应缓冲液用Tris体系时，信噪比最好。因此本实施例选择Tris体系作为RF IgA、RF IgG、RF IgM及其亚型试剂盒的RF反应缓冲液。

实施例6类风湿因子及其亚型试剂盒的检测方法

1.试剂盒的检测方法(以类风湿因子IgA抗体测定试剂盒为例)

将待测的样品先进行稀释，与R1磁珠包被物工作液混合，使待测样品中的类风湿因子与R1磁珠包被物工作液中的抗原孵育结合(第一次反应)，形成类风湿因子磁珠结合物。进行第一次洗涤，洗涤未结合的物质。

随后向反应体系中加入R2碱性磷酸酶标记物工作液(第二次反应)，形成免疫复合物，随后经过磁性分离，第二次洗涤未结合的物质，向免疫复合物中加入发光底物液在波长470nm检测发光值(RLU)，通过与标准曲线比对，从而确定待测样品中类风湿因子的含量。

2.试剂盒工作浓度优化

设置磁珠工作液浓度为0.1、0.2、0.3mg/mL，碱性磷酸酶标记物浓度为0.5、1、2μg/mL，使用方阵滴定法(棋盘滴定法)进行优化，试验结果如下表24，其中R1为磁珠包被物工作液(mg/mL)；R2羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记物工作液浓度(μg/mL)。

表24试剂盒工作浓度优化表(以类风湿因子IgA抗体测定试剂盒为例)

从上表24可知，磁珠包被物工作浓度为0.1mg/mL、碱性磷酸酶标记物工作浓度为1μg/mL时，信噪比最高。最终选择磁珠包被物工作浓度为0.1mg/mL、碱性磷酸酶标记物工作浓度为1μg/mL。

3.加样量优化

(1)R1磁珠包被物工作液加样量优化

用高、中、低三个浓度的血清样本分别以20、30、40、50、60、70μL的R1磁珠包被物工作液试剂加样量进行试验，保持R2反应缓冲液加样量为50μL，R2碱性磷酸酶标记物溶液加样量为50μL，样本加样量为30μL。试验结果如下：

表25 R1磁珠包被物工作液加样量优化

从上表25可知，以50μL磁珠包被物工作液的信噪比最好。因此确定本实施例R1磁珠包被物工作液加样量为50μL。

(2)R3 RF反应缓冲液加样量优化

用高、中、低三个浓度的血清样本分别以20、30、40、50、60、70μL的R反应缓冲液加样量进行试验，保持R1磁珠包被物工作液加样量为50μL，R2碱性磷酸酶标记物工作液加样量为50μL，样本加样量为30μL。试验结果如下表26

表26R3 RF反应缓冲液加样量优化

从上表26可知，以50μL R3 RF反应缓冲液的信噪比最好。因此确定本实施例RF反应缓冲液加样量为50μL。

(3)R2碱性磷酸酶工作液加样量优化

用高、中、低三个浓度的血清样本分别以20、30、40、50、60、100μL的R2碱性磷酸酶标记物工作液加样量进行试验，保持磁珠工作液加样量为50μL，RF反应缓冲液加样量为50μL，样本加样量为30μL。试验结果如下：

表27R2碱性磷酸酶工作液加样量优化表

从上表27可知，以100μL R2碱性磷酸酶标记物工作液的信噪比最好。因此确定实施例中R2碱性磷酸酶工作液加样量为100μL。

(4)样本加样量优化

用高、中、低三个浓度的血清样本分别以20、30、40、50、60、70μL的样本加样量进行试验，保持磁珠工作液、RF反应缓冲液及碱性磷酸酶标定物溶液加样量不变。试验结果如下表28：

表28样本加样量优化表

从上表28可知，以30μL加样量的信噪比最好。因此确定实施例样本加样量为30μL。

(5)样本稀释比例优化

将高、中、低三个浓度的血清样本分别以10、20、40、60倍数稀释进行试验。试验结果如下表29：

表29样本稀释比例优化

从上表29可知，样本稀释40倍的信噪比最好。因此确定本实施例样本稀释倍数为40倍。

4.反应条件优化

(1)第一步反应时间优化

设置不同第一步反应时间，保持第二步反应时间不变为5min进行试验，结果如下表30：

表30第一步反应时间优化

从上表30可知，反应时间为10min时，信噪比最好。最终确定实施例第一步反应时间为10min。

(2)第二步反应时间优化

设置不同第二步反应时间，保持第一步反应时间不变为10min进行试验，结果如下表31：

表31第二步反应时间优化

从上表31可知，反应时间为5min时，信噪比最好。最终确定本实施例第二步反应时间为5min。

(3)第一步反应洗涤次数优化

双抗夹心法理论上一般采用两步两清洗反应模式，因此通过测试第一步反应不同洗涤次数的信噪比、CV，选取合适的洗涤次数。试验结果如下表32：

表32第一步反应洗涤次数优化

从上表32可知，第一步反应后洗涤3次的信噪比S/N更高，CV更好。因此本实施例中第一步反应后洗涤次数为3次。

(4)第二步反应洗涤次数优化

一般采用两步两清洗反应模式，因此通过测试第一步反应不同洗涤次数的信噪比、CV，选取合适的洗涤次数。试验结果如下表33：

表33第二步反应洗涤次数优化表

从上表33可知，第二步反应后3次洗涤的信噪比S/N更高，CV更好。因此确定本实施例中第二步反应后洗涤次数为3次。

根据上述实验结果优化，本实施例的一种类风湿因子及其亚型试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)第一步反应：在25-30℃的环境温度下，将血液样本用样本稀释液稀释40倍得样本溶液，进行第一步反应。第一步反应检测体系中，稀释后样本加样量30μL、R1磁珠包被物工作液加样量为50μL，R3 RF反应缓冲液加样量为50μL。第一步反应时间为10min，磁分离收集磁珠后进行第一次洗涤，洗涤次数为3次。

(2)第二步反应：在25-30℃的环境温度下，向上述体系中加入R2碱性磷酸酶工作液进行孵育，加样量为100μL，第二步反应时间为5min，磁分离收集磁珠后进行第二次洗涤，洗涤次数为3次。

(3)将所述酶标免疫复合物加入100μL化学发光底物液中反应5min，在波长470nm下检测得到样本发光值；所述化学发光底物为AMPPD。

(4)将校准品采用冻干稀释液稀释后，采用校准品复溶液复溶，然后加入化学发光底物液中反应并检测发光值，根据校准品的浓度以及发光值绘制标准曲线，将所述样本发光值代入所述标准曲线得到待测样本中的类风湿因子的含量。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒，包括R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液，其特征在于，所述R1磁珠包被物工作液中含类风湿因子抗原磁珠复合物；所述类风湿因子抗原磁珠复合物中，类风湿因子抗原和磁珠的质量比为(12-16)μg：1mg。

2.如权利要求1所述一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒，其特征在于，所述类风湿因子包括类风湿因子IgA、类风湿因子IgG和类风湿因子IgM中的任一种或其亚型。

3.如权利要求1所述的一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒，其特征在于，所述R1磁珠包被物工作液中含类风湿因子抗原磁珠复合物的浓度为0.1-0.4mg/ml；所述R2碱性磷酸酶标记物工作液含有羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记物，浓度为0.5-2.0μg/mL。

4.如权利要求3所述一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒，其特征在于，所述类风湿因子及其亚型的测定试剂盒还包括校准品、校准品复融液、化学发光底物液和R3 RF反应缓冲液；

所述R3 RF反应缓冲液为PBS溶液、Hepes溶液和Tris溶液中的至少一种，且所述R3 RF反应缓冲液中包括以质量百分比计：0.8-1.5％BSA、0.08-0.15％Tween 20、0.3-0.8％Proclin 300，所述R3 RF反应缓冲液的浓度为0.03-0.08M，pH值为7.2-7.4。

5.权利要求1-4任一项所述的一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、对类风湿因子抗原进行水浴和冰浴，将磁珠与类风湿因子抗原在磁珠结合缓冲液中依次进行包被结合，在磁珠封闭缓冲液中进行封闭，清洗后得到类风湿因子抗原磁珠复合物，加入磁珠包被物稀释液，稀释得到R1磁珠包被物工作液；

S2、将碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶在碱性磷酸酶结合缓冲液中进行孵育结合后进行超滤纯化，得到羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记物，然后加入碱性磷酸酶标记物稀释液进行稀释，稀释得到R2碱性磷酸酶标记物工作液；

S3、将所述R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液、R3 RF反应缓冲液、化学发光底物液、校准品和校准品复融液进行组装，得到类风湿因子及其亚型的测定试剂盒。

6.如权利要求5所述一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述类风湿因子抗原水浴时间为15-45分钟，水浴温度为62-65℃；所述冰浴时间为5-15分钟。

7.如权利要求5所述一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述磁珠结合缓冲液为0.05-0.2M MES缓冲液，pH为5.0-6.0；磁珠与类风湿因子抗原的包被时间为1-6h，

所述磁珠封闭缓冲液中BSA的质量浓度为1-3％，封闭时间为0.5-2h；所述磁珠包被物稀释液成分与R3 RF反应缓冲液相同。

8.如权利要求6所述一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述碱性磷酸酶结合缓冲液为0.05-0.15M TSE缓冲液，pH为6.5-7.3，所述结合时间为30-120min；所述超滤次数为4-8次；所述羊抗人IgG抗体和碱性磷酸酶结合的质量比为1：(1-4)；

所述碱性磷酸酶标记物稀释液为TES溶液、MES溶液和Tris溶液中的一种，且所述碱性磷酸酶标记物稀释液中包括以质量百分比计：0.8-1.5％BSA、0.08-0.15％Tween 20、0.3-0.8％Proclin 300，所述碱性磷酸酶标记物稀释液浓度为0.03-0.08M。

9.权利要求1-4任一项所述的一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于，检测方法包括以下步骤：

步骤1、将待测样品稀释后与R1磁珠包被物工作液、R3 RF反应缓冲液进行孵育结合，第一次洗涤后加入R2碱性磷酸酶标记物工作液进行标记结合，磁分离并进行第二次洗涤，得到类风湿因子免疫复合物；

步骤2、将所述类风湿因子免疫复合物加入化学发光底物液中反应，检测RLU发光值；

步骤3、将RLU发光值与校准品构建的发光值标准曲线进行匹配，得到待测样本中的类风湿因子的含量。

10.如权利要求9所述的一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于，所述待测样品的稀释倍数为10-60倍；

所述稀释后的待测样品、R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液、R3 RF反应缓冲液和化学发光底物也的加入体积比为(20-100)：(20-70)：(20-100)：(20-70)：(20-300)；

所述步骤1中，孵育结合时间为5-20min，第一次洗涤次数为1-5次；标记结合时间为1-15min，第二次洗涤次数为1-5次。