CN108037279A - 一种提高elisa试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液及其使用方法 - Google Patents

一种提高elisa试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液及其使用方法，属于生物技术领域。本发明的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液包含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X‑100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠，其余为0.01M的磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液的pH值为7.2～7.4。本发明通过在洗涤液中添加洗涤能力较强的SDS和Triton‑X100，同时提高洗涤液的离子强度，有效控制了分子之间的非特异性相互作用，进而实现ELISA实验结果的低背景和高信噪比，提高检测的敏感性和准确性，且通用性较好，具有极强的推广应用潜力。

Description

一种提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液及其使 用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种能有效控制ELISA试剂盒操作过程中蛋白质之间的非特异性结合，降低背景，提高信噪比的通用型酶标板洗涤液。
背景技术
ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)又称酶联免疫吸附实验，是指将已知抗原或抗体包被与酶联板上，用于测试待检样品中是否有能与之特异性结合的抗体或抗原。由于ELISA方法具有方便、快速、敏感等特征，在科学研究和临床检验中被广泛应用。最初的ELISA方法主要包括直接法和间接法，随着研究的需要，人们根据抗原-抗体反应基本原理，又相继衍生出了夹心法、阻断法等，并开发出了相应的商品化试剂盒。此外，为了减少ELISA的操作程序，人们在传统两步法ELISA 的基础上，通过体系优化，又开发了“一步法”ELISA检测试剂盒。
尽管ELISA及衍生方法繁多，且操作步骤各异。但ELISA的核心是抗原-抗体反应，即是蛋白分子之间的相互作用(包括修饰后的有机化合物小分子甚至金属离子与抗体相互作用)，除了抗原-抗体特异性结合外，分子之间还存在非特异性相互作用。而非特异性结合将使背景增加，进而影响检测的准确性。酶标板洗涤旨在减少非特异性结合，降低背景，提高信噪比，使检测结果更准确。
对于酶标板洗涤液，最经典且广泛使用的是PBST(即在PBS中加入0.05％～0.5％的吐温20或吐温80)。但是，在研究中发现，用PBST 洗涤酶标板，对于很多ELISA实验特别是检测血清中的抗原或抗体，背景高，阴性样品的OD值甚至高达0.2～0.5(检测血清稀释倍数越小，背景越高)，难以和待检样品中低浓度检测靶标区分，降低了检测的敏感性和准确性。此外，在研究和检测中发现，一些商品化临床ELISA检测试剂盒或研究用ELISA检测试剂，也存在背景高，其cut off值(判定阈值)甚至高达0.3～0.4。因此，急需一种能降低背景信号信噪比的通用型酶标板洗涤液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液，控制ELISA实验过程中抗原和抗体分子之间的非特异性结合，可降低未结合抗体所引起的背景信号，增加分析的信噪比，从而提高ELISA检测的敏感性和准确性。
为实现上述目的，本发明的技术方案提供一种提高TLISA试剂盒信噪比的通用通用型酶标板洗涤液，所述洗涤液包含0.15～0.35M的NaCl、 0.05～0.1％vol的曲拉通X-100(Triton-X100)、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠(SDS)，其余为0.01M的磷酸缓冲液(PB)，其中磷酸缓冲液的pH值为7.2～7.4。
优选地，所述0.01M磷酸缓冲液按以下步骤制备：取Na2HPO4· 12H2O 3.58g，KCl0.4g，KH2PO4 0.54g定溶于1000mL水中，用1M HCl和1M NaOH调节pH值到7.2～7.4(优选pH值为7.4)，即制得1L 0.01M的磷酸缓冲液。
优选地，所述洗涤液中NaCl的含量为0.25M。
优选地，所述洗涤液中曲拉通X-100的含量为0.08％vol。
优选地，所述洗涤液中十二烷基肌氨酸钠的含量为4g/L。
本发明还涉及一种提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液的使用方法，所述方法包括以下步骤：
(1)抗原或抗体与包被酶标板反应完成后，向包被酶标板每孔中加入150μL洗涤液，甩干；
(2)向包被酶标板每孔中加入300μL洗涤液，于150～200r/min的摇床上洗涤3～5min，甩干；
(3)重复步骤(2)两次，即完成酶标板的洗涤，根据ELISA试剂盒设计要求，进行后续操作。
优选地，所述步骤(2)中于180r/min的摇床上洗涤3min。
本发明具有如下优点：
1、本发明提供的一种提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液基于抗原-抗体分子亲和力通常高于非特异性结合分子之间亲和力这一特征，在洗涤液中添加洗涤能力较强的SDS和Triton-X100，同时提高洗涤液的离子强度，有效控制了分子之间的非特异性相互作用，进而实现ELISA实验结果的低背景和高信噪比，提高检测的敏感性和准确性。
2、本发明的一种提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液与现有技术中广泛使用的酶标板洗涤液PBST相比，可以有效降低背景信号，明显提高信噪比；与现有高背景商品化或科研用ELISA试剂盒提供的洗涤液相比，具有更高的信噪比，提高检测的敏感性和准确性；与背景信号控制良好的商品化或科研用ELISA试剂盒提供的洗涤液相比，不影响检测效果，适用于绝大多数ELISA实验，具有极强的通用性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液按以下步骤制备：
1、0.01M PB(pH值7.4)配置：
称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL 双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL。
2、酶标板洗涤液配置：
根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤液所需各原料的量：
0.25M的NaCl；
0.08％vol的曲拉通X-100(Triton-X100)；
4g/L的十二烷基肌氨酸钠(SDS)；
用上述制备的0.01M PB溶解。
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液的使用方法按以下步骤进行：
(1)抗原或抗体与包被酶标板反应完成后，向包被酶标板每孔中加入150μL洗涤液，甩干；
(2)向包被酶标板每孔中加入300μL洗涤液，于180r/min的摇床上洗涤3min，甩干；
(3)重复步骤(2)两次，即完成酶标板的洗涤，根据ELISA试剂盒设计要求，进行后续操作。
实施例2
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液按以下步骤制备：
1、0.01M PB(pH值7.4)配置：
称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL 双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL。
2、酶标板洗涤液配置：
根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤液所需各原料的量：
0.15M的NaCl；
0.06％vol的曲拉通X-100(Triton-X100)；
6g/L的十二烷基肌氨酸钠(SDS)；
用上述制备的0.01M PB溶解。
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液的使用方法按以下步骤进行：
(1)抗原或抗体与包被酶标板反应完成后，向包被酶标板每孔中加入150μL洗涤液，甩干；
(2)向包被酶标板每孔中加入300μL洗涤液，于160r/min的摇床上洗涤4min，甩干；
(3)重复步骤(2)两次，即完成酶标板的洗涤，根据ELISA试剂盒设计要求，进行后续操作。
实施例3
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液按以下步骤制备：
1、0.01M PB(pH值7.3)配置：
称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL 双蒸水溶解，调节pH值为7.3，定溶至1000mL。
2、酶标板洗涤液配置：
根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤液所需各原料的量：
0.20M的NaCl；
0.09％vol的曲拉通X-100(Triton-X100)；
3g/L的十二烷基肌氨酸钠(SDS)；
用上述制备的0.01M PB溶解。
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液的使用方法按以下步骤进行：
(1)抗原或抗体与包被酶标板反应完成后，向包被酶标板每孔中加入150μL洗涤液，甩干；
(2)向包被酶标板每孔中加入300μL洗涤液，于190r/min的摇床上洗涤4min，甩干；
(3)重复步骤(2)两次，即完成酶标板的洗涤，根据ELISA试剂盒设计要求，进行后续操作。
实施例4
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液按以下步骤制备：
1、0.01M PB(pH值7.2)配置：
称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL 双蒸水溶解，调节pH值为7.2，定溶至1000mL。
2、酶标板洗涤液配置：
根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤液所需各原料的量：
0.30M的NaCl；
0.05％vol的曲拉通X-100(Triton-X100)；
5g/L的十二烷基肌氨酸钠(SDS)；
用上述制备的0.01M PB溶解。
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液的使用方法按以下步骤进行：
(1)抗原或抗体与包被酶标板反应完成后，向包被酶标板每孔中加入150μL洗涤液，甩干；
(2)向包被酶标板每孔中加入300μL洗涤液，于200r/min的摇床上洗涤3min，甩干；
(3)重复步骤(2)两次，即完成酶标板的洗涤，根据ELISA试剂盒设计要求，进行后续操作。
实施例5
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液按以下步骤制备：
1、0.01M PB(pH值7.4)配置：
称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL 双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL。
2、酶标板洗涤液配置：
根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤液所需各原料的量：
0.35M的NaCl；
0.1％vol的曲拉通X-100(Triton-X100)；
4g/L的十二烷基肌氨酸钠(SDS)；
用上述制备的0.01M PB溶解。
本实施例的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液的使用方法按以下步骤进行：
(1)抗原或抗体与包被酶标板反应完成后，向包被酶标板每孔中加入150μL洗涤液，甩干；
(2)向包被酶标板每孔中加入300μL洗涤液，于150r/min的摇床上洗涤5min，甩干；
(3)重复步骤(2)两次，即完成酶标板的洗涤，根据ELISA试剂盒设计要求，进行后续操作。
验证试验1
使用本发明的酶标板洗涤液检测带His标签重组鸡干扰素α在工程细胞中的表达水平
具体操作如下：
(1)将表达鸡干扰素α(带His标签)的工程细胞株接种于24孔板，采用无血清培养基培养；同时以正常CHO细胞为阴性对照；
(2)待细胞长满孔的60％以上时，取上清直接包被ELISA板，每孔100μL；
(3)4℃过夜包被的ELISA板弃掉包被液，加入含0.5％BSA的PBS 液体120μL室温下封闭30min；
(4)弃掉封闭液，每孔加HRP标记的鼠抗His单克隆抗体(用含 0.5％BSA的PBS稀释500倍)100μL，37℃孵育40min；
(5)酶标板洗涤：试验组使用本发明实施例1中的酶标板洗涤液和洗涤方法；对照组采用传统洗涤液(在pH值为7.4的0.01M PBS中加入体积比为0.1％吐温20)，洗涤方法同实施例1；
(6)显色：每孔中加入单组份TMB显色液100μL，37℃避光反应 15min；
(7)终止：每孔中加入终止液(1N的硫酸)50μL；
(8)OD值测定：在测量波长450nm、参比波长620nm下读取OD。
(9)结果：试验组(使用本发明洗涤液)的测量孔和阴性对照孔 OD均值分别为(1.116±0.05)和(0.056±0.005)，信噪比(P/N)为19.93；而对照组(传统洗涤液(PBST))的OD均值分别为(1.257±0.096)和 (0.245±0.04)，信噪比(P/N)为5.13。
验证试验2
使用本发明的酶标板洗涤液检测猴B病毒血清抗体
具体操作如下：
(1)将CHO细胞重组表达的猴B病毒gD蛋白用碳酸盐缓冲液 (CBS，pH值为9.6)稀释为1μg/mL，包被于ELISA板，每孔100μL；
(2)4℃过夜的ELISA板弃掉包被液，加入含0.5％BSA的PBS液体120μL室温下封闭30min；
(3)弃掉封闭液，每孔加5倍稀释的猴B病毒阳性血清(阳性血清由10份已知B病毒阳性血清等量混合而成)和阴性血清(阴性血清由 10份已知B病毒阴性血清等量混合而成)100μL，血清稀释液为含0.5％ BSA的PBS；37℃孵育40min；
(4)酶标板洗涤：试验组使用本发明实施例1中的酶标板洗涤液和洗涤方法；对照组采用传统洗涤液(在pH值为7.4的0.01M PBS中加入体积比为0.1％吐温20)，洗涤方法同实施例1；
(5)每孔加HRP标记的兔抗猴IgG二抗(用含0.5％BSA的PBS 稀释20000倍)100μL，37℃孵育40min；
(6)酶标板洗涤：同步骤(4)；
(7)显色：每孔中加入单组份TMB显色液100μL，37℃避光反应 15min；
(8)终止：每孔中加入终止液(1N的硫酸)50μL；
(9)OD值测定：在测量波长450nm、参比波长620nm下读取OD。
(10)结果：试验组(使用本发明洗涤液)的测量孔和阴性对照孔 OD均值分别为(2.250±0.04)和(0.052±0.013)，信噪比(P/N)为43.27；而对照组(传统洗涤液(PBST))的OD均值分别为(2.406±0.062)和 (0.216±0.022)，信噪比(P/N)为11.39。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液，其特征在于：所述洗涤液包含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠，其余为0.01M的磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液的pH值为7.2～7.4。
2.根据权利要求1所述的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液，其特征在于：所述0.01M磷酸缓冲液按以下步骤制备：取Na2HPO4·12H2O 3.58g，KCl 0.4g，KH2PO40.54g定溶于1000mL水中，用1M HCl和1M NaOH调节pH值到7.2～7.4，即制得1L 0.01M的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液，其特征在于：所述洗涤液中NaCl的含量为0.25M。
4.根据权利要求1所述的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液，其特征在于：所述洗涤液中曲拉通X-100的含量为0.08％vol。
5.根据权利要求1所述的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液，其特征在于：所述洗涤液中十二烷基肌氨酸钠的含量为4g/L。
6.一种提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液的使用方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)抗原或抗体与包被酶标板反应完成后，向包被酶标板每孔中加入150μL所述洗涤液，甩干；
(2)向包被酶标板每孔中加入300μL所述洗涤液，于150～200r/min的摇床上洗涤3～5min，甩干；
(3)重复步骤(2)两次，即完成酶标板的洗涤。
7.根据权利要求6所述的提高ELISA试剂盒信噪比的通用型酶标板洗涤液的使用方法，其特征在于：所述步骤(2)中于180r/min的摇床上洗涤3min。
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