CN103823058B - 血清中抗原类蛋白的化学发光蛋白芯片方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明一种“血清中抗原类蛋白的化学发光蛋白芯片方法和试剂盒”，属于医学检测技术。其特征在于本发明结合化学发光技术、标准曲线以及蛋白质芯片技术来定量检测血清中的某种抗原类蛋白物质，化学发光技术本身的高特异性、灵敏性，以及标准曲线的采用实现定定量检测，蛋白质芯片技术实现了多个样品同时检测和分析，使得一套完整的样品检测耗时大为减少，具有可靠性、准确性和低成本的特点；适用于血清中普通抗原类蛋白水平的一般分析以及重大疾病抗原标志物的定量分析，以一项具有重大意义的医学辅助检测手段，本发明还基于该方法提供了配套的试剂盒。

Description

血清中抗原类蛋白的化学发光蛋白芯片方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及血清抗原检测技术，特别涉及血清中抗原类蛋白的化学发光蛋白芯片方法和试剂盒。

背景技术

肝细胞癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，我国是乙肝大国，肝癌发病率占全球总数的55%，近80%患者确诊时已属中晚期。术后复发转移率高，5年以上长期生存率仅为10%左右。肝癌的早期诊断成为提高患者长期生存率的最佳有效途径。

在肝癌早期诊断研究领域，血清肿瘤分子标志物一直受到普遍关注。目前基础研究已发现100多种标志物与肝癌相关，AFP仍是目前肝癌定性诊断的最佳标志物，对肝癌的确诊、预后推测、疗效判断及复发转移的监测具有良好的临床价值。

目前用于血清肿瘤分子标志物的检测方法包括：传统的放射免疫分析（RIA）、酶联免疫分析（ELISA）、化学发光免疫分析系统、荧光免疫分析系统及电化学发光免疫分析系统等。上述检测方法存在着血量大、检测时间长、费用高等问题。以ELISA为例，每次检测需要患者血清50ul,花费3个多小时。

在癌症类重大疾病的诊断过程中，提供快速、高效、准确的肿瘤标志物分析方法实现准确的早期诊断和及时的后续治疗具有重大意义。

发明内容

本发明基于本领域在检测血清中AFP抗原方面的技术需求及缺陷，提供了一种适合于定量定性检测生物样品中抗原类蛋白的方案，该方案不仅仅适合于检测血清中的AFP抗原，对检测抗原类蛋白物质具有通用性，具有省时、经济、准确且微型化的优点。本发明的技术方案如下：

血清中的抗原类蛋白的化学发光蛋白质芯片检测方法，其特征在于：

采用以下步骤：

（1）获取标准曲线：

所述标准曲线以目标抗原类蛋白的标准品的梯度浓度为横坐标，以梯度浓度的标准品经化学发光检测方法检测到的对应化学发光像素值为纵坐标；

（2）样品检测：

采用与上述化学发光检测方法相同的程序检测待测血清样品中的目标抗原类蛋白的荧光像素值，带入标准曲线的回归方程式中计算出相应的目标抗原类蛋白浓度，乘以血清样品的稀释倍数得出实际的浓度；

并且所述化学发光检测方法采用蛋白质芯片，所述蛋白质芯片至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；

所检测亚区内按斑点状设置有检测斑和对照斑，所述检测斑上固定有所述目标抗原类蛋白的特异性抗体，所述对照斑上固定有牛血清白蛋白作为阴性对照；

一个所述检测亚区内的所述检测斑至少为两个，且固定的特异性抗体浓度相同。

所述化学发光检测方法的步骤如下：

待测血清样本滴加在所述蛋白芯片的检测亚区上，孵育后形成抗原特异性抗体复合物；用PBST洗涤检测亚区，去除非特异结合物；

加入用PBS稀释的生物素标记的一抗,形成特异性抗体-抗原-一抗复合物；用PBST洗涤4次，去除非特异结合物；

加入用PBS稀释的HRP标记的链酶亲和素，形成特异性抗体-抗原-一抗-HRP标记的链酶亲和素复合物，用PBST洗涤未结合的链酶亲和素；

加入HRP底物发光液，化学成像仪进行扫描得到荧光像素值；

其中所述特异性抗体与所述一抗物种来源不同。

所述检测亚区内包括四个检测斑，四个对照斑；检测斑和对照斑各排成一列。

所述蛋白质芯片具有十个所述检测亚区。

所述样品检测步骤中，同时以正常血清、目标抗原类蛋白的标准品为对照检验所述标准曲线及所述蛋白质芯片的稳定性和有效性。

一种用于分析血清中抗原类蛋白的试剂盒，其特征在于：包括蛋白质芯片；所述蛋白质芯片至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；

所检测亚区内按斑点状设置有检测斑和对照斑，所述检测斑上固定有所述目标抗原类蛋白的特异性抗体，所述对照斑上固定有牛血清白蛋白作为阴性对照；

一个所述检测亚区内的所述检测斑至少为两个，且固定的特异性抗体浓度相同。

所述检测亚区内包括四个检测斑，四个对照斑；检测斑和对照斑各排成一列。

所述蛋白质芯片具有十个所述检测亚区。

所述蛋白质芯片具有多个所述检测亚区，所述检测亚区之间的分界采用凸起作为物理隔断。避免样品之间的相互污染。

所述的试剂盒还包括目标抗原类蛋白的标准品，和/或以所述目标抗原类蛋白的标准品制作的标准曲线或直线回归方程说明书。

上述任一试剂盒，还包括用于化学发光检测的通用试剂；所述通用试剂包括生物素标记的一抗，所述一抗与所述蛋白芯片斑上的所述特异性抗体的物种来源不同。

本发明基于解决如何快速、低成本、可靠地定量检测肝癌血清样本中的标志物蛋白AFP这个技术问题，研发出了一种适合于检测血清中大多数抗原类蛋白物质的检测方法。

特别声明以下两点：

1.只要基于现有技术能够获得该抗原类蛋白物质的特异性抗体，那么本发明的方法就可以检测该抗原类蛋白在血清中的水平。

2.为了符合中国专利法的规定，本发明的方法要求保护的范围排除以本发明的检测方法检测疾病标志物以实现该疾病的诊断目的的检测，即本发明的方法权利要求中所述的目标抗原类蛋白物质不包括那些能明确指示血清样品所属主体的健康状况或疾病程度的标志性抗原蛋白物。

第2条声明不适用于本发明的产品权利要求。

本发明的方法结合了化学发光检测方法、标准曲线以及蛋白质芯片技术的应用，为本发明检测血清中抗原类蛋白物质保证了高灵敏性，准确性、高效性和低成本。

以下以检测AFP为例，说明本发明的方法原理：

采用购买的AFP抗原标准品，制成梯度浓度，采用化学发光检测方法测定每个梯度对应的荧光像素值，以梯度浓度为横坐标，荧光像素值为纵坐标制定标准曲线并得到直线回归方程。

化学发光检测方法：将AFP单克隆抗体按斑点状有序的固定在醛基玻片上（蛋白质芯片），利用抗体和抗原（血清中的蛋白标志物）特异性结合的特点，加入血清或者血浆标本进行孵育，然后加入生物素标记的AFP多克隆抗体，最后加入链酶亲和素HRP,通过HRP底物发光液获得信号结果化学发光成像仪对HRP底物的发光信号进行扫描量化。将获得的信号值带入直线回归方程中的得到样品中目标抗原AFP的浓度。如图2所示，在本发明的方法中，通过多克隆抗体上标记的生物素，加入链酶亲和素HRP后，链酶亲和素结合到生物素上，然后加入HRP的底物发光液，通过链酶亲和素HRP上的HRP与HRP底物发光液反应获得检测信号，该检测信号通过上述反应过程如图2所示是一种扩大的检测信号，这使得本发明的检测灵敏度大大提高。

蛋白质芯片的使用有三方面的优势：

一、允许为样品设置正常血清和标准品两种对照，保证待测血清样品与正常血清对照以及标准品血清对照的检测同时同质地真正平行地进行；正常血清对照的设置在于即时地检验蛋白质芯片的有效性以免出现假阳性，标准品对照的设置是为了验证本此次操作的可靠性，如果检测结果带入直线回归方程算出的浓度与标准品的浓度在误差允许范围内基本相符，说明本次操作是可信的。这整体上提高了本方法的可靠性。

二、允许同时检测多个样品。多个重复的样品，或者不同时间点取的样品以获得动态值，或者各个不同的样品，总之，实现高通量检测。整体上降低检测成本和提高检测效率。

三、采用本发明的蛋白质芯片需要的血样及抗体量都大为减少，需血清量10ul,而ELISA方法检测需血清50ul；蛋白芯片板抗体点样，5ul可以点样20张芯片，检测200份血清,抗体需要量远远低于ELISA方法，大大降低了检测费用。

实验结果证明，本发明的方法不仅可以进行定性检测，还可通过发光强度对AFP进行定量检测。与ELISA方法进行对比，敏感性和特异性均优于ELISA方法，从时间上比较，ELISA检测至少需要3小时，本发明仅需要1.5小时。

综上，本发明提供的检测方法一种可行、可靠、经济，且简单、省时的方法。其成功开发将为检测血清中抗原类蛋白物质的大规模检测提供了经济、可靠的检测方法。本发明根据该方法提供了试剂盒，本领域技术人员在本发明的方法的指导下，可是采用该试剂盒毫无疑义地实现本发明的检测目的。

附图说明

图1蛋白质芯片点样示意图；

图2抗体夹心法蛋白质芯片流程图；

图3AFP标准品检测结果图；

检测物分别为1.80ng/ml，2.40ng/ml，3.20ng/ml，4.10ng/ml，5.5ng/ml

血清样本6.小鼠腹水AFP，7.小鼠腹水AFP，8.空白对照，9.健康血清，10.肝癌血清；

图4.蛋白质芯片检测AFP标准曲线图；

图5.AFP抗原，肝癌血清和正常血清检测结果图,

其中(a-e)肝癌血清1：4稀释;(f)AFP抗原5ng/ml;(f)AFP抗原5ng/ml;(g)AFP抗原2.5ng/ml;(h)AFP抗原1.25ng/ml;(i,j)正常血清1：4稀释。

具体实施方式

实施例1.蛋白质芯片制备及使用流程

实验所用试剂：鼠源单克隆抗体AFP（深圳菲鹏公司）；醛基芯片（上海百傲公司）；生物素标记的兔源一抗（美国abcam公司）；HRP标记的链酶亲和素（美国abcam公司）；HRP底物发光液（美国millipore公司），化学成像仪(军事医学科学院研发)。

本发明的优选实施例中，将鼠源单克隆抗体AFP（深圳菲鹏公司）、依次点在芯片上，点样四次，点样浓度2mg/ml，点成检测斑。

10%牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照，同样点样四次，点成对照斑。芯片为醛基芯片（上海百傲公司），每张芯片包含10个检测方格，每个方格检测一份血清，一次检测10份血清。

蛋白芯片操作流程

用制备好的蛋白质芯片检测健康对照组、非肝癌乙肝对照组和肝癌实验组动态血清标本中的肿瘤标志物。

用血清样本10ul,（或者2.5ul稀释4倍）,滴加在芯片上，利用抗原抗体相结合的特性，使血清中的抗原与芯片上相对应的（鼠源）抗体特异性结合，形成抗原抗体（鼠源）复合物。

用PBST洗涤4次，去除非特异结合物后，用PBS稀释生物素标记的兔源一抗（美国abcam公司）,再加入稀释好的兔源一抗。兔源抗体与抗原结合，形成（鼠源）抗体-抗原-（兔源）生物素标记抗体复合物。

用PBST洗涤4次，去除非特异结合物，用PBS稀释HRP标记的链酶亲和素（美国abcam公司）。形成抗体-抗原-抗体-HRP标记的链酶亲和素复合物。

用PBST洗涤未结合的链酶亲和素。加入HRP底物发光液（美国millipore公司），化学成像仪(军事医学科学院研发)进行扫描。

固相载体上的发光像素与标本中受检抗原的量成正向相关,此时测定复合物中的像素值，即可确定待测抗原含量。芯片点样抗体和检测用的抗体分别取自不同种属的动物。这种点夹心法具有很高的特异性。如图示2抗体夹心法蛋白芯片流程图。

实施例2.本发明检测方法的建立

步骤1：制定标准曲线

采用购买的AFP抗原（美国abcam公司），设置成不同的浓度梯度，80ng/ml,40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.625ng/ml。

采用实施例1中的操作流程和蛋白质芯片检测AFP标准品各个浓度梯度，扫描结果

如图3。

表1.标准曲线检测数据结果

检测结果绘制成标准曲线图，以标准物的浓度为横坐标，像素值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线；根据样品的像素值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度，标准曲线及回归方程见图4。

步骤2：样品检测

样品：

30份肝癌血清、30份正常健康人血清，AFP标准品5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml

检测流程同实施例1.

将样品的像素值代入图4的回归方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

每张芯片10个检测亚区，包括3个不同浓度的AFP抗原标准品，1-2个健康血清样本，其余为肝癌血清样本，部分样品检测结果扫描结果见图5。

检测的数据结果见表2：计算公式抗原浓度X=（像素值Y-54.3）/4.75×稀释倍数。目前的AFP检测水平以20ng/ml为分界线，正常人低于20ng/ml。本芯片的检测结果，正常人低于1ng/ml，肝癌血清高于150ng/ml，标准品的检测浓度显示本发明的方法可靠性好。

表2.血清检测像素扫描数据及AFP含量计算

Claims (4)

1.一种用于分析血清中AFP抗原蛋白的试剂盒，其特征在于：包括蛋白质芯片；所述蛋白质芯片至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；

所述检测亚区内按斑点状设置有检测斑和对照斑，所述检测亚区内包括四个检测斑，四个对照斑；检测斑和对照斑各排成一列，所述检测斑上固定有所述AFP抗原蛋白的特异性抗体，所述对照斑上固定有牛血清白蛋白作为阴性对照；所述检测斑上固定的所述特异性抗体的量及方法如下:特异性抗体点样浓度为2mg/ml，5μl点成用于检测200份血清的检测斑，每个检测斑上固定的特异性抗体浓度相同；

还包括用于化学发光检测的通用试剂；所述通用试剂包括生物素标记的一抗，所述一抗与所述蛋白芯片斑上的所述特异性抗体的物种来源不同，所述蛋白芯片为醛基芯片；

所述检测斑上固定的特异性抗体为AFP鼠源抗体；所述一抗为生物素标记的兔源一抗。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质芯片具有十个所述检测亚区。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质芯片具有多个所述检测亚区，所述检测亚区之间的分界采用凸起作为物理隔断。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：还包括AFP抗原蛋白的标准品，和/或以所述AFP抗原蛋白的标准品制作的标准曲线或直线回归方程说明书。