TW201812299A - 腫瘤標記物之測定方法及測定試藥 - Google Patents

腫瘤標記物之測定方法及測定試藥 Download PDF

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Abstract

本發明係揭示：在活體樣本中的腫瘤標記物測定時，能降低因自體抗體等影響而產生假低值、以及因HAMA等影響而產生假高值情形，可進行更正確測定的測定方法、及測定試藥。本發明腫瘤標記物之測定方法，係利用免疫分析從活體中分離出的樣本中之腫瘤標記物，包括有：將從活體中分離出的樣本、與含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液，予以混合之前處理步驟。本發明腫瘤標記物之免疫分析用試藥，係具備含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液。

Description

腫瘤標記物之測定方法及測定試藥
本發明係關於腫瘤標記物之測定方法及測定試藥。
所謂「腫瘤標記物」通常係正常細胞不會產生，但腫瘤細胞則會特異性產生的蛋白質總稱，特別係指可從受測者的血液等活體樣本檢測/測定者。在腫瘤診斷時，活體樣本中的腫瘤標記物測定值，係可使用於有無發生腫瘤的確認、以及患者治療後的腫瘤消失確認等。腫瘤標記物係存在有多種器官特異性，已知主要有如：PSA(攝護腺)、α-胎兒蛋白(AFP，主要為肝臟)、CA125(卵巣)、CA15-3(乳房)、CA19-9(消化器官)、癌胚抗原(CEA，主要為消化器官)等。
活體樣本中的腫瘤標記物大多係藉由使用特異性結合於腫瘤標記物的抗體之免疫分析系統進行測定。但是，在活體樣本中有存在與腫瘤標記物結合的抗體(所謂「自體抗體」等)，已知在測定此種樣本時，腫瘤標記物的測定值較實際低，即會有產生假低值的可能性(非專利文獻1、2)。另一方面，在患者治療時，有使用結合於腫瘤細胞上之抗原決定位的小鼠單株抗體，使為消滅癌細胞而接受治療的患者血清中，產生人抗鼠抗體(human antimouse antibody，HAMA)，但亦已知因該HAMA的影響，腫瘤標記物的測定值會較高於實際，即會有產生假高值的可能性(非專利文獻3)。又，雖原因尚未特定，但有報告指出：在血中存在有HAMA及人 抗動物抗體(HAAA：Human anti-animal antibody：以下與HAMA合稱為「HAMA等」)、依低親和性自體抗體形式觀察到的異嗜型抗體(Heterophile antibody：以下與抗體合稱為「自體抗體等」)，便成為出現假高值、假低值的要因(非專利文獻4)。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
非專利文獻1：俵木美幸等、JICLA Vol.37、No.1、pp.17-20(2012)
非專利文獻2：阿部正樹等、檢查與技術Vol.40、No.2、pp.162-163(2012)
非專利文獻3：F. J. Primus et al., Clin. Chem. 34/2, pp.261-264(1988)
非專利文獻4：Kricka, L. J., Clin. Chem. 45/7, pp.942-956(1999)
本發明目的在於提供：在活體樣本中的腫瘤標記物測定時，能降低因自體抗體等影響而產生假低值、以及因HAMA等影響而產生假高值情形，可進行更正確測定的測定方法及測定試藥。
本發明者等為達成上述目的經深入鑽研，結果發現在活體樣本中的腫瘤標記物測定時，於將上述活體樣本提供進行免疫反應前，藉由施行與含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液，進行混合之前處理步驟，便可不受自體抗體等、HAMA等的影響，能獲得更正確的腫瘤標記物測定值，遂完成本發明。
本發明的構成係如下。
(1)一種方法，係利用免疫分析測定從活體中分離出的樣本中之腫瘤標記物，包括有：將從活體中分離出的樣本、與含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液予以混合之前處理步驟。
(2)如(1)所記載的方法，其中，上述前處理液係含有酸化劑，前處理步驟中的酸化劑之最終濃度係超過0.05N且0.5N以下。
(3)如(1)所記載的方法，其中，上述前處理液係含有界面活性劑，該界面活性劑係陰離子性界面活性劑。
(4)如(3)所記載的方法，其中，上述前處理步驟係在加熱條件下實施。
(5)如(1)~(4)中任一項所記載的方法，其中，上述腫瘤標記物係PSA、α-胎兒蛋白、CA125、CA15-3、CA19-9或癌胚抗原。
(6)一種腫瘤標記物之免疫分析用試藥，係具備含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液。
根據本發明可提供：在活體樣本中的腫瘤標記物測定時，能降低因自體抗體等影響而產生假低值、以及因HAMA等影響而產生假高值情形，可進行更正確測定的測定方法、及測定試藥。
圖1係酸化前處理液之鹽酸濃度、與CA19-9呈假高值的血清檢體測定值相關圖。
圖2係酸化前處理液之鹽酸濃度、與CA19-9標準液測定值的相關圖。
圖3係酸化前處理液之鹽酸濃度、與CA19-9自體抗體模型檢體測定值的相關圖。
圖4係酸化前處理液之鹽酸濃度、與PSA自體抗體模型檢體測定值之相關圖。
本說明書中所記載的「%」濃度，在無特別聲明前提下，係表示重量/體積(w/v)濃度。
<腫瘤標記物之測定方法>
利用本發明方法所測定的腫瘤標記物，具體係從PSA(攝護腺)、α-胎兒蛋白(AFP，主要為肝臟)、CA125(卵巣)、CA15-3(乳房)、CA19-9(消化器官)、癌胚抗原(CEA，主要為消化器官)中所選擇源自人體的腫瘤標記物。
1.前處理步驟
本發明方法係利用使活體樣本與抗體進行反應的免疫反應，而測定活體樣本中所存在腫瘤標記物的方法，特徵在於包括有：在免疫反應(反應步驟)之前，施行將活體樣本與前處理液予以混合的前處理步驟。藉由前處理步驟，便可使腫瘤標記物呈現從自體抗體等之中游離的狀態，且能抑制HAMA等非特異反應。前處理液係可含有界面活性劑或酸化劑中之任一者、亦可雙方均含有。較佳前處理液係含有界面活性劑或酸化劑中任一者。
上述前處理步驟中進行混合的活體樣本與前處理液之體積比較佳係1：10~10：1、更佳係1：5~5：1、特佳係1：3~3： 1。本發明所使用的活體樣本係在能含有腫瘤標記物的樣本前提下，其餘並無特別的限定，可例如：血清、血漿、全血、尿、糞便、口腔黏膜、咽黏膜、腸黏膜及活組織樣本(例如：腸樣本、肝臟樣本)。較佳的活體樣本係血清或血漿。
上述前處理液中所含的界面活性劑係可使用例如：陰離子性界面活性劑、陽離子性界面活性劑、兩性離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑中之任一者，特別較佳係陰離子性界面活性劑。陰離子性界面活性劑較佳係可使用例如：十二烷基硫酸鈉(SDS)、N-月桂醯基肌胺酸、十二烷基硫酸鋰、十二烷基苯磺酸鈉、去氧膽酸(deoxycholic acid)等，特別較佳係可使用SDS。使用SDS時，則與活體樣本進行混合的混合液，在前處理時的濃度較佳係0.1~12.5%、更佳係0.25~10%、特佳係0.5~7.5%。藉由將SDS濃度設為0.1~10%(w/v)，便可達使腫瘤標記物所結合的自體抗體等、或HAMA等非特異物質充分游離，且不易發生SDS析出等情形的效果。
上述前處理液中所含的酸化劑係可適當使用鹽酸、硫酸、醋酸等。當有使用酸化劑時，前處理液的酸當量濃度係前處理時的濃度較佳設為超過0.05N且0.5N以下、更佳係0.1N以上且0.4N以下。藉由酸的當量濃度設為超過0.05N且0.5N以下，便可充分獲得前處理的效果，且可將對後段反應步驟的影響最小化。
當前處理有使用酸化劑時，為能再與活體樣本進行混合時不會發生沉澱情形，最好添加陽離子性界面活性劑。陽離子性界面活性劑較佳係同分子中具有碳數10個以上之單鏈烷基、與三級胺或四級銨鹽的陽離子性界面活性劑。此種界面活性劑例係可舉例如：氯化癸基三甲銨、氯化十二烷基三甲銨、氯化十四烷基三甲 銨、氯化十六烷基三甲銨(C16TAC)、溴化癸基三甲銨、溴化十二烷基三甲銨、溴化十四烷基三甲銨、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)、氯化月桂基吡啶鎓、氯化十四烷基吡啶鎓、氯化鯨蠟吡啶(cetylpyridinium chloride，CPC)等。陽離子界面活性劑的添加量，係與檢體混合時的濃度較佳設為0.01%以上且15%以下、更佳係0.05%~10%。
在含有酸化劑的前處理液中，除添加上述陽離子性界面活性劑之外，尚亦可含有非離子性界面活性劑等其他界面活性劑。藉由其他界面活性劑的添加，便可更高感度地檢測腫瘤標記物。
在前處理液中亦可更進一步使用還原劑。還原劑係可任意使用2-(二乙胺基)乙硫醇鹽酸鹽(DEAET)、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、硫甘油、亞硫酸鈉、硼氫化物等現有還原劑，就從在溶液中的安定性理由，較佳係使用DEAET、TCEP。還原劑的濃度，就與活體樣本混合的混合液最終濃度較佳係0.5~100mM、更佳係1.0~50mM、特佳係2.0~20mM。
在前處理液中，視需要亦可含有脲、硫脲等其他的蛋白質改質劑。改質劑的濃度，較佳係處理時濃度達0.1M以上、更佳係0.5M以上且未滿4M。又，在前處理液中，為增強處理效果，亦可添加單醣類、雙醣、檸檬酸及檸檬酸鹽類中之任一者、或該等的組合。又，在前處理液中亦可含有EDTA等螯合劑。
前處理步驟最好在將活體樣本與前處理液進行混合後，更進一步施行加熱。特別係當前處理液有使用界面活性劑時，為能提高其效果，最好施行加熱。加熱溫度較佳係設為35~95℃、更佳係50~90℃、特佳係70~85℃。又，加熱時間較佳係設為1分 鐘以上、更佳係3分鐘以上、特佳係5分鐘以上。加熱時間的上限並無特別存在，通常設為60分鐘以下、較佳係30分鐘以下的加熱時間。
2.反應步驟
經本發明方法的前處理步驟施行處理過的活體樣本混合液，將提供給接著進行的反應步驟。在反應步驟中，使活體樣本混合液與緩衝液進行混合，便使混合液中的抗原對測定對象腫瘤標記物的抗體進行反應。
上述緩衝液係可舉例如以MES緩衝液、磷酸緩衝液、Tris緩衝液、碳酸緩衝液為基質者，特別較佳係可使用以磷酸緩衝液為基質者。當前處理液係使用含有界面活性劑者的情況，較佳係使用例如：BSA、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)葡聚糖硫酸鈉的水溶性高分子，在與經前處理後的混合液進行混合時，含有最終濃度0.01~10.0%、較佳係0.05~5.0%左右的緩衝液。又，當前處理液係使用含有酸化劑者的情況，最好使用含有鹼劑、或具有能緩和前處理液酸影響之緩衝能力的緩衝液。前處理步驟的混合液與緩衝液之混合，依體積比計，較佳係1：10~10：1、更佳係1：5~5：1、特佳係1：3~3：1。
本發明方法所使用腫瘤標記物的抗體係將腫瘤標記物的胺基酸排列中之至少其中一部分、或醣鏈辨識為抗原決定位的抗體。腫瘤標記物的抗體並無特別的限定，可任意使用已知辨識抗原決定位的抗體，較佳的腫瘤標記物之抗體係辨識腫瘤標記物特異性抗原決定位的抗體。
腫瘤標記物的抗體係可任意使用多株抗體或單株抗體。腫瘤標記物的抗體亦可為免疫球蛋白(例如：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY)的任一同型(isotype)。腫瘤標記物的抗體尚亦可為全長抗體(full length antibody)。所謂「全長抗體」係指具備分別含有可變區與恆定區的重鏈及輕鏈之抗體(例如含有2個Fab部分與Fc部分的抗體)。腫瘤標記物的抗體尚亦可為由此種全長抗體所衍生的抗體片段。抗體片段係全長抗體的其中一部分，例如恆定區缺失抗體(例如：F(ab')2、Fab'、Fab、Fv)。腫瘤標記物的抗體尚亦可為單鏈抗體等修飾抗體。
腫瘤標記物的抗體係可使用習知的公知方法製作。例如腫瘤標記物的抗體係可將上述抗原決定位使用為抗原進行製作。又，因為如上述辨識抗原決定位的腫瘤標記物之多數抗體已有市售，因而亦可使用此種市售物。
腫瘤標記物的抗體係可固相化為固相。本說明書中，亦將經固相化為固相的抗體簡稱為「固相化抗體」。固相係可例如能收容或搭載液相的固相(例如：培養盤、透膜、試驗管等支撐體；以及孔培養盤、微通道、玻璃毛細管、奈米柱、整體管柱(monolithic column)等容器)、以及可懸浮或分散於液相中的固相(例如：粒子等固相載體)。固相的材料係可例如：玻璃、塑膠、金屬及碳。固相的材料尚亦可使用非磁性材料或磁性材料，就從操作簡便性等觀點，較佳係磁性材料。固相較佳係固相載體、更佳係磁性固相載體、特佳係磁性粒子。抗體的固相化方法係可利用習知的公知方法。此種方法係可例如：物理性吸附法、共價鍵法、利用親和性物質(例如生物素、鏈親和素)的方法及離子鍵法。就特定實施形態而言， 腫瘤標記物的抗體係經固相化為固相的抗體、較佳係經固相化為磁性固相的抗體、更佳係經固相化為磁性粒子的抗體。
反應步驟係可在使前處理步驟的混合液與緩衝液進行混合後，才接觸經固相化的抗體，又亦可預先在緩衝液中加入例如在粒子經固相化的抗體而形成粒子液，然後再使上述混合液與粒子液進行混合。反應步驟係可僅利用如免疫凝聚法、競爭法之類的一次反應步驟實施，亦可設計二次反應步驟。另外，設計二次反應步驟的情況，亦可在一次反應步驟與二次反應步驟之間，設計為除去未反應成分用的洗淨步驟。
腫瘤標記物的抗體係可利用標幟物質施行標幟化。本說明書中，經歷用標幟物質施行標幟化的抗體，亦簡稱「標幟化抗體」。標幟物質係可舉例如：酵素(例如：過氧化酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶)、親和性物質(例如：鏈親和素、生物素)、螢光物質或蛋白質(例如：螢光黃、螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate，FITC)、玫瑰紅、綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質)、發光或吸光物質(例如：螢光素、水母素(aequorin)、阿地溴銨(aclidinium)、釕)、放射性物質(例如：3H、14C、32P、35S、125I)。又，當本發明方法有設計二次反應的情況，二次反應中所使用的抗體亦可利用此種標幟物質施行標幟化。
就特定的實施形態而言，本發明方法在二次反應中所使用的抗體，係包括有辨識不同於腫瘤標記物抗體之抗原決定位的腫瘤標記物其他抗體。辨識此種其他抗體的抗原決定位詳細內容，係同上述相關腫瘤標記物的抗體所詳述抗原決定位(但，併用的情況，抗原決定位種類不同)。利用腫瘤標記物的抗體辨識的抗原決 定位、與利用腫瘤標記物其他抗體辨識的抗原決定位之組合，並無特別的限定。此種其他抗體的使用較佳係例如利用三明治法的情況。
3.檢測步驟
當一級抗體或二級抗體有使用標幟的情況，利用適於所使用標幟的方法(例如使用酵素標幟的情況，便添加酵素基質)，便可進行檢測。例如當將鹼性磷酸酶(ALP)使用為標幟抗體時，便可設為將3-(2'-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷氧醯)苯基-1,2-二氧烷‧2鈉鹽(AMPPD)，使用為酵素基質的化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)系統。
本發明方法係使用腫瘤標記物的抗體之免疫分析。此種免疫分析係可例如：直接競爭法、間接競爭法及三明治法。又，此種免疫分析係可舉例如：化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)、化學發光免疫分析(CLIA)、免疫比濁法(TIA)、酵素免疫分析法(EIA)(例如：直接競爭型ELISA、間接競爭型ELISA及三明治ELISA)、放射免疫分析(RIA)、乳膠凝聚反應法、螢光免疫分析(FIA)、及免疫層析試紙分析法。該等免疫分析自體已為周知，此處雖無詳述的必要，但分別簡單說明。
直接競爭法係將待測定標靶抗原(本發明為腫瘤標記物)的抗體，施行固相化為固相(相關固相及固相化，如上述)，經施行防止非特異吸附的阻斷處理(利用血清白蛋白等蛋白質溶液處理固相)後，使該抗體、與含有上述標靶抗原(target antigen)的受檢樣本(本發明係如上述，經施行前處理步驟的活體樣本)、以及一定量經標幟的抗原(標幟係如上述)進行反應，經洗淨後，在將結合於固 相的標幟施行定量之方法。因為受檢樣本中的抗原與標幟抗原係競爭性結合於抗體，受檢樣本中的抗原量越多，則固相所結合的標幟量越少。製作各種已知濃度的抗原標準液，分別固定化為固相，再測定標幟量(配合標幟性質的吸光度、發光強度、螢光強度等，以下亦同)，製作橫軸為抗原濃度、縱軸為標幟量的檢量線。針對未知的受檢樣本測定標幟量，藉由所測得標幟量擬合於檢量線，便可測定未知受檢樣本中的抗原量。直接競爭法自體在此領域中已屬周知，例如US 20150166678 A1所記載。
間接競爭法係將標靶抗原(本發明中為腫瘤標記物)施行固相化為固相(相關固相及固相化，係同上述)。接著，經施行固相的阻斷處理後，再將含標靶抗原的受檢樣本(本發明中，如上述係經施行前處理步驟過的活體樣本)、以及一定量的抗靶抗原抗體予以混合，再與上述固相化抗原進行反應。經洗淨後，再將結合於固相上的上述抗靶抗原抗體施行定量。此係藉由使經標幟過的二級抗體(secondary antibody)(標幟係如上述)，對上述抗靶抗原抗體進行反應，經洗淨後，再測定標幟量便可實施。製作各種已知濃度的抗原標準液，分別施行固定化為固相，再測定標幟量，便製成檢量線。相關未知的受檢樣本，測定標幟量，藉由將所測得標幟量擬合於檢量線，便可測定未知受檢樣本中的抗原量。另外，亦可未使用標幟二級抗體，而是使用經標幟過的一級抗體(primary antibody)。間接競爭法自體在此領域中已屬周知，例如上述US 20150166678 A1所記載。
三明治法係將抗靶抗原抗體固相化成固相(相關固相及固相化，係如上述)，經阻斷處理後，使含有標靶抗原的受檢樣 本(本發明係如上述，經施行前處理步驟過的活體樣本)進行反應，經洗淨後，再使對標靶抗原標幟的二級抗體(標幟係如上述)進行反應，經洗淨後，再將固相上所結合的標幟進行定量之方法。製作各種已知濃度的抗原標準液，分別測定經固定化為固相的標幟量，而製成檢量線。相關未知的受檢樣本，測定標幟量，藉由將所測得標幟量擬合於檢量線，便可測定未知受檢樣本中的抗原量。三明治法自體在此領域中已屬周知，例如US 20150309016 A1所記載。
上述各種免疫分析中，化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)、化學發光免疫分析(CLIA)、酵素免疫分析法(EIA)、放射免疫分析(RIA)、螢光免疫分析(FIA)係屬於根據施行上述直接競爭法、間接競爭法、三明治法等之時所使用的標幟種類，進行分類之免疫分析。化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)係標幟使用酵素(例如上述鹼性磷酸酶)、而基質係使用生成化學發光性化合物的基質(例如上述的AMPPD)之免疫分析。酵素免疫分析法(EIA)係標幟使用酵素(例如上述的過氧化酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶等)之免疫分析。各酵素的基質係使用利用吸光度測定等便可定量的化合物。例如過氧化酶的情況，便使用1,2-苯二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)等；當鹼性磷酸酶的情況，便使用p-硝化苯基磷酸鹽(pNPP)等；當β-半乳糖苷酶的情況，便使用MG：4-甲基繖形基半乳糖苷(4-methyl umbelliferyl galactoside)、NG：硝化苯基半乳糖苷等；當螢光素酶的情況，便使用螢光素(luciferin)等。放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)係標幟使用放射性物質的方法，而放射性物質係如上述，可例如：3H、14C、32P、35S、125I等放射性元素。螢光免疫分析(FIA)係標幟使用螢光物質或螢光蛋白質 (fluorescent protein)的方法，而螢光物質或螢光蛋白質係如上述，可例如：螢光黃、螢光異硫氰酸鹽、玫瑰紅、綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質等。使用該等標幟的免疫分析自體在此領域中已屬周知，例如US 8039223 B、US 20150309016 A1所記載
免疫比濁法(TIA)係利用由待測定標靶抗原(本發明為腫瘤標記物)、與該抗原的抗體之抗原抗體反應，所生成的抗原抗體複合物會增加濁度之現象的免疫分析。在抗靶抗原抗體溶液中添加各種已知濃度的抗原，分別測定濁度而製成檢量線。針對未知的受檢樣本，同樣地測定濁度，藉由將所測得濁度擬合於檢量線，便可測定未知受檢樣本中的抗原量。免疫比濁法自體已屬周知，例如US 20140186238 A1所記載。乳膠凝聚法係類似免疫比濁法，只是取代免疫比濁法中的抗體溶液，改為使用表面經固定化有抗靶抗原抗體的乳膠粒子浮游液之方法。免疫比濁法及乳膠凝聚法自體在此領域中已屬周知，例如US 820,398 B所記載。
免疫層析試紙分析法係在例如：濾紙、纖維素透膜、玻璃纖維、不織布等由多孔性材料所形成的基體(亦稱「間質」或「試條」(strip))上，施行上述三明治法、競爭法的方法。例如當利用三明治法施行免疫層析試紙分析法時，在上述基體上設計將抗靶抗原抗體固定化的檢測區，在基體中添加含有標靶抗原的受檢樣本(本發明中，如上述，經施行前處理步驟過的活體樣本)，從上游側流入展開液，使標靶抗原移動至檢測區，而於檢測區固定化。將經固定化的標靶抗原，利用經標幟的二級抗體形成三明治，藉由檢測檢測區中之經固定化的標幟，而檢測受檢樣本中的標靶抗原。藉由在較檢測區更靠上游側形成含有標幟二級抗體的標幟區，便可將標 靶抗原與標幟二級抗體的結合體固定化於檢測區。當標幟係酵素的情況，在較檢測區更靠上游側亦設計含有酵素基質的基質區。競爭法的情況，例如將標靶抗原固定化於檢測區，便可使受檢樣本中的標靶抗原、與檢測區中固定化的標靶抗原進行競爭。在較檢測區更靠上游側設計標幟抗體區，使受檢樣本中的標靶抗原與標幟抗體進行反應，而將未反應的標幟抗體固定化於檢測區，並檢測(或定量)標幟，便可檢測(或定量)受檢樣本中的標靶抗原。免疫層析試紙分析法自體在此領域中已屬周知，例如US 6210898 B所記載。
<腫瘤標記物之測定試藥>
本發明腫瘤標記物之測定試藥，係能實現上述腫瘤標記物之測定方法的測定試藥。本發明之測定試藥係除通常免疫分析時所使用構成之外，特徵在所含有構成成分係含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液。
本發明的試藥係依相互隔離的形態或組成物形態含有各構成成分。具體而言，各構成成分係可依分別收容於不同容器(例如：試管、培養盤)的形態提供，亦可其中一部分構成成分係依組成物形態(例如同一溶液中)提供。或者，本發明的試藥亦可依裝置形態提供。具體而言，構成成分全部可依收容於裝置中的形態提供。或者，構成成分其中一部分依收容於裝置中的形態提供，而其餘部分則依未收容於裝置中的形態(例如：收容於不同容器的形態)提供。此情況，未被收容於裝置中的構成成分亦可藉由在進行標的物質測定時注入於裝置中而使用。
較佳實施形態，本發明的試藥亦可具有配合待採用免 疫分析種類的構成。例如採用三明治法的情況，本發明試藥的必要構成成分係含有：i)前處理液、ii)腫瘤標記物的抗體、iii)緩衝液，以及任意構成成分的iv)腫瘤標記物的其他抗體、v)標幟物質、vi)稀釋液及視需要的vii)與標幟物質產生反應的基質。ii)與iii)的構成成分亦可含於同一溶液中。iv)的構成成分亦可利用v)標幟物質進行標幟化。較佳腫瘤標記物的抗體亦可被固相化為磁性粒子。
[實施例] <實施例1 酸化前處理迴避自體抗體干擾>
(1)檢體製備
取代含有自體抗體等的檢體，改為將LUMIPULSE PRESTOCA19-9、AFP、CA15-3、CA125、CEA的高濃度標準液，經檢體稀釋液(組成：含有Tris緩衝液與BSA)稀釋5倍，且依最終濃度成為100μg/mL方式，添加各試藥的固相化抗體(源自小鼠)之相同游離抗體者，使用為自體抗體模型檢體。所使用各標準液的濃度係如表1所示。此外，將取代固相化抗體添加，改為添加小鼠IgG：100μg/mL者，使用為對照檢體(control specimen)。
針對各自體抗體模型檢體及對照檢體，將檢體50μL與酸化前處理液(2.5M 脲、0.42M 鹽酸、0.08M 檸檬酸水合物、 2.5% 麥芽糖、10.0% CTAB、4.9% TrionX-100(商品名))50μL混合，在1000rpm振盪條件下，依37℃加熱6分鐘。接著，添加緩衝液(500mM Bicine、50mM MOPS、200mM NaCl、20mM EDTA3Na、10.0% BSA、0.10% ProClin(註冊商標)、NaOH(~pH9.2))100μL，而成為酸化前處理樣品。針對同檢體，另外將各50μL、和由酸化前處理液50μL與緩衝液100μL預先混合的溶液進行混合，而成為未處理樣品。針對自體抗體模型檢體與對照檢體，使用LUMIPULSE PRESTOCA19-9、AFP、CA15-3、CA125、CEA(富士麗比歐公司)，如尋常般的測定各腫瘤標記物。
測定結果如表2所示。CA19-9、AFP、CA15-3、CA125、CEA任一腫瘤標記物均係未處理的情況，藉由固相化抗體的添加便使反應受抑制，測定值(計數值)明顯低於對照檢體。另一方面，針對經酸化前處理過的檢體，迴避因固相化抗體造成的抑制反應，可獲得與對照檢體同等級的測定值。由該等結果暗示：在腫瘤標記物的測定系統中，因自體抗體等所生成的假低值係利用檢體的酸化前處理便可迴避。
<實施例2 酸化前處理抑制HAMA之效果>
(1)檢體前處理
針對CA19-9測定時因HAMA影響而呈現假高值的檢體1例，將20μL與各濃度鹽酸(0.025N、0.05N、0.1N、0.2N、0.4N、0.6N、0.8N、1.0N、1.2N、1.4N、1.6N、1.8N、2.0N)20μL混合，依37℃進行10分鐘培養。在各檢體溶液中添加與鹽酸等莫耳的氫氧化鈉溶液40μL而中和，並添加緩衝液(24mM 磷酸二氫鉀、76mM 磷酸氫二鉀、1.0% BSA、1.0% PVP、0.05% 酪蛋白鈉、0.05% Tween20(商品名)、0.05% 氯化鈉、20mM EDTA2Na、0.1% ProClin(註冊商標)300、pH7.0)80μL，而成為測定樣品。同時，將LUMIPULSE CA19-9的500IU/mL、0IU/mL標準液，分別利用PBS稀釋3倍，並施行與檢體同樣的酸化處理、中和、添加緩衝劑，而成為對照樣品。
針對各測定用樣品，使用LUMIPULSE PRESTO CA19-9(富士麗比歐公司)，如尋常進行測定。
前處理時的鹽酸濃度、與測定樣品的計數值(表示反應強度)之關係係如圖1所示，對照樣品的計數值係如圖2所示。因為對照樣品的計數值幾乎沒有因鹽酸處理而出現變動，因而得知CA19-9自體並未受到前處理的影響。另一方面，相關因HAMA而產生假高值的檢體，特別係利用0.1N以上鹽酸施行前處理，將導致計數值明顯降低。藉此得知在CA19-9測定時，利用酸化前處理便可迴避HAMA的影響。
<實施例3 酸化前處理迴避自體抗體干擾的最佳濃度>
針對酸化前處理時所使用的酸化劑，就迴避自體抗體干擾的有效最佳濃度進行研究。分別將LUMIPULSE CA19-9、PSA的高濃度標準液(CA19-9：500IU/mL、PSA：100ng/mL)，利用陰性人血清稀釋1/10，再依成為100μg/mL的方式，添加與LUMIPULSE CA19-9、PSA的固相化抗體相同之游離抗體後，在室溫中靜置2小時而製備得自體抗體模型檢體。另外，取代固相化抗體，改為製備經添加小鼠IgG計100μg/mL的對照檢體。將檢體各50μL與酸化前處理液(2.5M 脲、鹽酸、2.5% 麥芽糖、10.0% CTAB、4.9% TritonX-100)50μL混合。酸化前處理劑係分別製備含有鹽酸2N、1N、0.8N、0.6N、0.4N、0.2N、0.1N、0.05N、0.025N、0N者，針對各濃度施行同樣的研究。經與酸化前處理液混合過的檢體，在1000rpm振盪條件下，依37℃加熱6分鐘。接著，添加與上述鹽酸等量的氫氧化鈉溶液100μL而中和。在經中和後的溶液中添加與實施例2同樣的緩衝液200μL，而成為酸化前處理樣品。針對各酸化前處理樣品，使用LUMIPULSE PRESTO CA19-9、PSA(富士麗比歐公司)，如尋常進行測定。
CA19-9、PSA的自體抗體模型檢體、及對照檢體的酸化前處理樣品之測定結果，分別如圖3、4所示。就CA19-9的自體抗體模型檢體，將前處理的鹽酸濃度設為0.5N~0.9N時，發現與對照檢體間的測定計數值差異有減少傾向。另一方面，PSA的自體抗體模型檢體在將前處理的鹽酸濃度設為0.2N以上時，發現與對照檢體間的測定計數值差異有減少傾向。由該等結果暗示：利用檢體的酸化前處理，便可降低腫瘤標記物因自體抗體等而發生假陰性情形。另外，因為該等研究係針對取代自體抗體，改為使用與 CA19-9、PSA間之親和性較強抗體的模型檢體而實施，因而實際含自體抗體的檢體，即便將酸化前處理劑的酸濃度設為更低濃度，仍可降低假低值發生的可能性。
<實施例4 SDS前處理之抑制HAMA的效果>
(1)檢體之SDS前處理
針對CA19-9測定時因HAMA影響而出現假高值的檢體5例，各50μL與SDS前處理液(10% SDS、1.5% C14APS、0.225% TritonX-100(商品名)、3.75% EDTA2Na、37.5mM L-色胺酸、150mM 咪唑、10mM TCEP)100μL混合，在1000rpm振盪條件下，依80℃加熱5分鐘。同時，針對相同檢體，取代前處理液，改為將添加PBS 100μL者使用為未處理樣品。又，針對LUMIPULSE CA19-9標準液亦同樣地製備SDS前處理樣品、未處理樣品。
(2)CA19-9之測定
使用市售CA19-9測定試藥的LUMIPULSE PRESTO CA19-9(富士麗比歐公司)、與自動分析機LUMIPULSE PRESTOII(富士麗比歐公司)，施行各檢體測定。測定試藥中，除取代普通磁性粒子液，改為使用由磁性粒子液與20%BSA溶液依體積比5：1混合者之外，其餘均依照與尋常方法同樣使用。
(3)結果
SDS前處理樣品與未處理樣品的CA19-9計數值比較，如表3所示。所有檢體的計數值均明顯降低。另一方面，因為標準液的計 數值並未有大幅變動，所以暗示利用前處理並不會對CA19-9分子自體造成負面影響，僅會迴避HAMA呈假高值情形。
<實施例5 SDS前處理迴避自體抗體干擾>
依照與實施例1同樣的方法，製備CA19-9的自體抗體模型檢體及對照檢體，依照與實施例4同樣的方法施行檢體前處理、CA19-9測定。CA19-9測定結果係如表4所示。未處理的情況，若自體抗體模型檢體則藉由固相化抗體的添加會抑制反應，計數值明顯低於對照檢體。另一方面，針對經施行SDS前處理的檢體，能迴避因固相化抗體造成的抑制反應情形，可獲得與對照檢體同等級的測定值。此現象暗示於腫瘤標記物的測定系統，利用檢體的SDS前處理，便可迴避因自體抗體等所造成的假低值情形。

Claims (6)

  1. 一種方法，係利用免疫分析測定從活體中分離出的樣本中之腫瘤標記物，包括有：將從活體中分離出的樣本、與含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液予以混合之前處理步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中，上述前處理液係含有酸化劑，前處理步驟中的酸化劑之最終濃度係超過0.05N且0.5N以下。
  3. 如請求項1之方法，其中，上述前處理液係含有界面活性劑，該界面活性劑係陰離子性界面活性劑。
  4. 如請求項3之方法，其中，上述前處理步驟係在加熱條件下實施。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中，上述腫瘤標記物係PSA、α-胎兒蛋白、CA125、CA15-3、CA19-9或癌胚抗原。
  6. 一種腫瘤標記物之免疫分析用試藥，係具備含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液。
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