KR102561659B1 - 미생물 항원의 회수법 - Google Patents

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Abstract

특별한 기기를 사용하지 않고, 용이하게 미생물이 가지는 항원을 회수하는 방법의 제공. 미생물을 포함하는 검체가 미생물을 통과시키지 않는 공경(孔徑)을 가지는 여과막으로 지나가게 하고, 상기 검체 중의 미생물을 여과막 상에 포착하고, 미생물을 포착한 여과막으로 미생물의 막을 파괴할 수 있는 미생물 파괴 시약이 지나가게 함으로써 포착된 미생물을 여과막 상에서 파괴하고, 여과액 중에 항원을 회수하는 것을 포함하는, 미생물의 항원을 회수하는 방법.

Description

미생물 항원의 회수법
본 발명은, 미생물에 포함되는 항원을 회수하는 방법에 관한 것이다.
패혈증 등의 감염증의 경우, 조기에 적절한 항균약을 투여하는 것이 환자의 치유나 예후에 큰 영향을 준다. 종래 기술에서는, 패혈증 등의 감염증에 대한 검사는 하기와 같이 행해지고 있다.
세균배양용 액체 배지 약 30mL∼100mL에 채취한 혈액 2∼10 mL를 접종하고, 30∼37 ℃에서 배양한다. 배지의 탁도(濁度)의 변화, 세균에 의한 배지 중의 가스 발생, pH의 변화 등을 지표로 하여, 세균의 증식이 확인될 때까지 1∼7 일간 관찰을 행한다. 균의 발육이 확인된 후, 배양액을 채취하고, 그람염색과 서브컬쳐(2차 배양)를 실시한다. 그람염색에 의해 대략적인 균종의 분류, 및 관찰되는 균이 단일인가, 복수인가를 확인한다. 서브컬쳐로 증식한 균의 콜로니가 균일한 경우에는, 혈액 중에 존재한 균의 종류를 단일로 가정하고, 동정(同定) 검사, 감수성 검사에 제공된다. 한편, 그람염색에서 복수의 균종이 관찰되거나, 명백하게 상이한 형상의 콜로니가 증식한 경우에는, 각각의 콜로니로부터 균을 채취하고, 단일 형상의 콜로니만이 발육하게 될 때까지 배양을 반복한다. 이와 같이 검체의 채취로부터 동정까지 시일이 걸린다. 패혈증이 의심되는 환자의 경우, 조기 진단과 적절한 항균약 치료가 예후에 큰 영향을 주게 된다. 이에, 보다 단시간에 정확하게 균의 종류를 동정 방법으로서, 면역크로마토그래피와 같은 면역학적 방법이 사용된다(특허문헌 1을 참조). 면역학적 방법을 사용하여 세균을 동정하는 경우, 목적으로 하는 세균의 단백질을, 특이적으로 인식하는 이뮤노글로불린을 결합시킨다. 결합한 이뮤노글로불린에 사전에, 착색 라텍스 입자나 형광 물질을 표지해 두는 것에 의해, 세균의 존재를 인식할 수 있다. 이 때문에, 순배양을 행하지 않고, 혈액 배양으로부터 직접, 균을 검출하는 것이 가능하다. 그러나, 혈액, 배양액, 객담(喀痰), 콧물, 분변 등 세균 검사에 사용되는 검체 중에는, 다양한 단백질이 포함된다. 이 때문에, 양호한 감도로 원하는 단백질을 찾아 내기 위해서는, 협잡물(挾雜物)을 제거할 필요가 있고, 원심분리 조작이나 고형 배지 상에서 배양하고 균을 분리함으로써 협잡물의 제거가 행해진다. 또한, 목적으로 하는 세균의 단백질이 존재하는 장소나 단백질의 형상 등에 따라서는, 열처리나, 용액에 의한 세포막의 파괴 등의 조작이 필요하다.
이 때문에, 원심분리기나 히트 블록 등의 특별한 기기가 필요하거나, 분리 배양과 같이 시간이 걸리는 조작이 필요했다. 또한, 원심분리 조작의 경우, 상청액을 폐기할 때, 침전한 균을 실수로 흡인할 경우가 있어, 균수가 적어져, 정확한 판정에 영향을 끼치는 경우도 있었다.
국제공개 제2007/069673호
본 발명은, 특별한 기기를 사용하지 않고, 용이하게 미생물이 가지는 항원을 회수하는 방법을 제공한다.
본 발명자는, 병원성 세균 등의 미생물을 용이하게 검출하는 방법에 대하여 예의 검토를 행하였다. 미생물은, 그 미생물이 가지는 항원을 측정함으로써 검출이 가능하게 되며, 본 발명자는, 항원을 간단하게 회수하는 방법에 대하여 검토를 행하였다.
그 결과, 혈액이나 배양액 등의 검체에 포함되는 미생물을, 여과막을 거치게 함으로써, 막 상에 포착하고, 이어서, 막 상에 포착된 세균에 계면활성제 등을 포함하는 용액을 흐르게 하는 처리를 함으로써, 신속하게 미생물을 파괴하고, 항원을 용이하게 회수할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
[1] 미생물을 포함하는 검체가 미생물을 통과시키지 않는 공경을 가지는 여과막으로 지나가게 하고, 상기 검체중의 미생물을 여과막 상에 포착하고, 미생물을 포착한 여과막으로 미생물의 막을 파괴할 수 있는 미생물 파괴 시약이 지나가게 함으로써 포착한 미생물을 여과막 상에서 파괴하고, 여과액 중에 항원을 회수하는 것을 포함하는, 미생물의 항원을 회수하는 방법.
[2] 미생물이 세균인 것을 특징으로 하는 [1]의 미생물의 항원을 회수하는 방법.
[3] 미생물 파괴 시약이 계면활성제, 알카리성 용액, 또는 계면활성제와 알카리성 용액의 혼합물인 것을 특징으로 하는 [1]의 미생물의 항원을 회수하는 방법.
[4] 알카리성 용액의 pH가, 11 이상인 것을 특징으로 하는, [3]의 미생물의 항원을 회수하는 방법.
[5] 알카리성 용액이 수산화 나트륨 용액인, [3]의 미생물의 항원을 회수하는 방법.
[6] [1]∼[5]의 어느 하나의 방법으로 회수한 미생물의 항원을 면역학적 측정법으로 측정하는 것을 포함하는, 미생물의 검출 방법.
[7] 면역학적 측정법이 면역크로마토그래피인, [6]의 미생물의 검출 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본특허출원번호 2015-092218호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명의 방법에 의하여, 세균 등의 미생물을 포함하는 혈액, 배양액 등의 검체가 여과막으로 지나가게 함으로써, 여과막 상에서 미생물을 포착하고, 검체 중에 포함되는 미생물과 협잡물을 용이하게 분리할 수 있다. 또한 계면활성제나 알카리성 용액을 포함하는 미생물 파괴 시약이 여과막으로 지나가게 함으로써, 막 상에 포착한 미생물을 파괴하고, 미생물이 가지는 항원을 노출시키고, 용이하게 회수할 수 있도록 한다. 본 발명의 방법은, 특별한 기기를 필요로 하지 않으며, 용이하게 미생물의 항원을 회수를 가능하게 한다. 회수한 항원을 측정함으로써, 미생물의 존재를 검출할 수 있고, 미생물 감염증의 진단 등을 행할 수 있다.
도 1은 본 발명의 방법으로 회수한 항원의 측정에 사용할 수 있는 검출 장치의 일례를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 미생물의 항원의 회수
본 발명의 방법에 의해 항원을 회수할 수 있는 미생물은 전혀 한정되지 않고, 세균, 조류(藻類), 원생 생물, 효모나 곰팡이 등의 진균, 점균 등의 진핵 생물이 포함된다. 이들 중에서도 인간이나 비인간 동물의 감염증을 야기하는 병원체 미생물이 바람직하다. 예를 들면, 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)을 포함하는 황색포도상구균, 병원대장균을 포함하는 대장균, 살모넬라균, 녹농균, 콜레라균, 적리균, 탄저균, 결핵균, 보튤리누스균(botulinus bacillus), 파상풍균, 연쇄 구균, 캄필로박터, 웰치균, 장염 비브리오균, 클라미디아·트라코마티스(chlamydia trachomatis), 용련균, 백일해균, 헬리코박터·필로리, 렙토스피라증(leptospira), 트레포네마·팔리둠, 보렐리아 등의 세균, 칸디다(candida), 백선균, 아스페르길루스(aspergillus) 등이 있다.
본 발명의 방법에 의해 미생물의 존재를 분석하기 위한 검체도 한정되지 않으며, 예를 들면, 인두(咽頭)를 닦은 액, 비강(鼻腔)을 닦은 액, 비강 흡인액, 변(便) 현탁액, 혈장, 혈청, 오줌, 타액, 양수, 수액, 고름, 장기 추출액, 각종 조직 추출액 등의 생체 시료, 식품 추출액, 배양 상청액, 상수, 하수, 호수, 하천물, 바닷물, 토양 추출액, 진흙 추출액 등이 있다. 이 중에서도, 병원성 미생물의 검출의 관점에서, 특히 생체 시료가 바람직하고, 인두를 닦은 액, 비강을 닦은 액, 비강 흡인액, 비강 세정액, 폐포 세정액, 직장을 닦은 액 또는 변 현탁액 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 검체는 인간 유래라도, 비인간 동물 유래라도 된다. 또한, 상기 검체 중에 포함되는 미생물을 배양한 배양액도 포함된다. 검체는 그대로 사용해도 된지만, 배양액 등 미생물이 지나치게 많은 검체나, 검체의 점성이 높은 등의 경우에는, 이 검체를 적절하게 생리 식염수나 완층액에 부유시켜 사용한다. 검체를 부유시키는 액을 검체 부유용액이라 하고, 검체를 검체 부유용액에 부유시킨 액을 검체 부유액이라고 한다. 검체가, 전혈 등의 혈액을 포함하는 검체라면, 사전에 계면활성제 등을 사용하여 적혈구를 파괴하고, 완전히 용혈시켜 놓은 것이 바람직하다. 적혈구를 용혈시키기 위해서는, 계면활성제, 각종 용매, 저장액(hypotonic solution) 등을 사용하여 검체를 처리하면 된다.
본 발명의 방법에 있어서는, 상기한 검체가 여과막으로 지나가게 함으로써, 미생물을 여과막 상에 포착한다. 여기서, 포착이란 미생물을 여과막을 통과시키지 않고, 검체를 지나가게 한 후의 여과막 상에 잔존하는 것을 일컫는다. 이 때, 미생물을 통과시키지 않는 크기의 공경을 가지는 여과막을 사용한다.
검출하고자 하는 미생물이 세균인 경우, 공경 1.5㎛ 이하, 바람직하게는 1.2㎛ 이하, 보다 바람직하게는 0.8㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 공경 0.45㎛ 이하의 여과막, 예를 들면, 공경 0.1∼1.2 ㎛, 바람직하게는 0.22㎛, 0.45㎛, 0.8㎛ 또는 1.2㎛의 여과막을 사용하면 된다. 또한, 사이즈가 큰 곰팡이, 효모를 검출하고자 할 경우에는, 공경이 0.5㎛보다 큰, 예를 들면, 0.8㎛의 여과막을 사용하면 된다. 여과막으로서는, 예를 들면, 상기한 공경을 가지는, 셀룰로오스 혼합 에스테르(MCE: Mixed cellulose esters), 폴리비니리덴플루오리드(PVDF), 폴리테트라플루오로에틸렌(tetrafluoroethylene)(PTFE), 친수성 PTFE, 폴리에테르술폰(PES), 친수성 폴리에테르술폰(hydrophilic polyethersulfone), 친수성 폴리프로필렌(GHP), 나일론(NYL), 셀룰로오스아세테이트(CA: cellulose acetate), 폴리술폰(PSF), 아크릴계 공중합체(acrylic copolymer), 폴리아미드, 나일론 6,6, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 니트로셀룰로오스, 니트로셀룰로오스와 셀룰로오스에스테르의 혼합물 등으로 만들어진 여과막을 사용할 수 있다. 또한, 이 여과막에 프리 필터로서, 붕규산 유리 섬유(GF)나 다층 유리 섬유(GxF) 등의 유리섬유제 프리 필터를 조합하여 사용할 수도 있다. 예를 들면, 나일론제 여과막과 다층 유리 섬유(GxF)제 프리 필터의 조합, 폴리에테르술폰(PES)제 여과막과 다층 유리 섬유(GxF)제 프리 필터의 조합, 셀룰로오스아세테이트(CA)제 여과막과 붕규산 유리 섬유(GF)제 프리 필터의 조합, 나일론(NYL)제 여과막과 붕규산 유리 섬유(GF)제 프리 필터의 조합시켜 등이 있다.
여과막 상에 미생물을 포착한 후, 포착한 미생물을 파괴하여, 미생물의 항원을 노출시킨다. 미생물의 파괴는 바람직하게는 미생물의 세포막 파괴를 일컫는다. 미생물의 파괴에 의해 노출한 항원은, 용이하게 회수할 수 있다. 여기서, 미생물의 항원은, 단백질, 지질, 다당류 등의 항체를 제작할 수 있는 물질을 예로 들 수 있다. 이는, 회수한 항원을 항원 항체 반응을 사용하여 검출하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 상기한 미생물의 구성 성분, 상기한 미생물이 생산하는 독소, 상기한 세균의 세균 항원 등을 예로 들 수 있다. 예를 들면, MRSA의 PBP2'(Penicillin Binding Protein 2')가 있다.
포착한 미생물의 파괴는, 미생물을 계면활성제를 포함하거나, 또는 알카리성 용액인 미생물 파괴 시약으로 처리함으로써 행한다. 미생물 파괴 시약은 미생물의 막을 파괴할 수 있다. 사용하는 계면활성제는 한정되지 않지만, 미생물의 막을 가용화할 수 있는 계면활성제를 바람직하게 사용할 수 있다. 이러한 계면활성제로서, Triton X-100(Triton은 등록상표)(폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐에테르), Triton X-114(폴리옥시에틸렌(8)옥틸페닐에테르), Triton X-405(폴리옥시에틸렌(40)이소옥틸페닐에테르), NP-40(Nonidet P-40)(폴리옥시에틸렌(9)옥틸페닐에테르) 등의 폴리옥시에틸렌p-tert-옥틸페닐에테르(Triton계 계면활성제); Tween 20(Tween은 등록상표), Tween 40, Tween 60, Tween 80, Tween 65, Tween 85 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(Tween계 계면활성제); Briji 35(Briji는 등록상표)(폴리옥시에틸렌(23)라우릴에테르) 등의 폴리옥시에틸렌알킬에테르(Briji계 계면활성제); Dodecyl-β-D-maltose; Octyl-β-D-glucoside 등의 비이온성 계면활성제나 도데실 황산 탄산 나트륨(SDS) 등의 음이온성 계면활성제나 염화벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 디데실디메틸암모늄염, 도데실트리메틸암모늄클로리드 등의 양이온성 계면활성제나 CHAPS(3-(3-cholamidepropyl)dimethylammonio-1-propanesulphonate), 염화 알킬폴리아미노에틸글리신 등의 양성 계면활성제을 사용할 수 있다. 바람직하게는 에테르형 계면활성제(폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬알릴에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜 등), 에스테르형 계면활성제(고급 알코올 지방산에스테르 등), 에스테르에테르형 계면활성제(폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르 등) 등의 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양성 계면활성제이며, 특히 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 사용한다. 계면활성제는, 0.2∼5 %(w/w), 바람직하게는 0.5∼2 %(w/w)의 농도로 사용하면 된다.
알카리성 용액은 미생물의 막을 파괴할 뿐만 아니라, 막 중의 프로테인 A를 변성시킴으로써, 항체에 대한 비특이 반응을 억제할 수 있다. 알카리성 용액으로서는, pH 11 이상, 바람직하게는 12 이상, 더욱 바람직하게는 13 이상의 용액을 사용하면 되고, 0.1M∼1.0M의 수산화 나트륨 용액, 차아염소산 나트륨 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
계면활성제와 알카리성 용액은 혼합하여 사용할 수도 있고, 예를 들면, 1∼2 %의 Triton X-100 등의 계면활성제를 포함하는 0.1∼0.5 M의 수산화 나트륨을 사용할 수 있다.
미생물 파괴 시약에 의한 처리는, 미생물을 포착한 여과막으로 계면활성제 또는 알카리성 용액이 지나가게 하면 된다. 즉, 포착된 미생물에 미생물 파괴 시약이 접촉하도록, 미생물 파괴 시약을 흐르게 하면 된다. 그 후, 여과막 내에 액이 잔존한 상태에서, 1∼20 분간, 바람직하게는 2∼10 분 정치(靜置)해도 된다. 정치함으로써 미생물을 확실하게 파괴할 수 있다. 예를 들면, 여과막으로서, 직경 20∼40 mm의 여과막을 사용한 경우, 검체 또는 검체 부유액이 1∼수 mL 여과막으로 지나게 하고, 검체 또는 검체 부유액 중의 미생물을 여과막 상에 포착한다. 이어서, 미생물 파괴 시약이 수 mL∼수백 mL 여과막으로 지나가게 하고, 여과막 상에 포착된 미생물을 파괴하고, 또한 미생물의 항원을 포함하는 여과액을 회수한다. 미생물 파괴 시약이 알카리성 용액일 경우, 중화하기 위하여, 혹은 계면활성제 농도를 낮게 하기 위하여 중성 부근의 완층액을 수 mL∼수백 mL, 바람직하게는 사용한 미생물 파괴 시약에 1/10∼2/3 용량 첨가한다. 회수한 여과액에 첨가하는 액을 여과액 조정액이라고 하고, 회수한 여과액 중의 항원을 측정하는 방법의 조건에 적합하도록 맞춘 시약을 사용하면 된다. 여과액 조정액으로서는, 트리스 염산 완층액 등의 중성으로부터 산성의 완층액을 사용하면 된다. 회수한 여과액에는, 미생물의 항원이 포함된다. 회수한 여과액 중의 항원을 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 여과액 조정액은, 미생물 파괴 시약이 지나간 여과막으로 지나가게 하면 된다. 여과액 조정액이 여과막으로 지나가게 함으로써, 미생물 파괴 시약을 중화하고, 혹은 계면활성제 농도를 낮게 하면서, 미생물의 항원을 회수할 수 있다.
검체를 부유시키기 위한 검체 부유용액, 미생물 파괴 시약, 여과액 조정액을 포함하여 미생물 항원 추출 시약 세트라고 한다.
2. 회수한 항원의 측정
회수한 항원의 측정은 어떠한 방법으로도 행할 수 있지만, 바람직하게는 측정하고자 하는 항원에 특이적인 항체를 사용하고, 항원 항체 반응을 사용한 면역학적 측정법에 의해 측정한다. 면역학적 측정법으로서, 면역 염색법(형광 항체법, 효소 항체법, 중금속 표지 항체법, 방사성 동위 원소 표지 항체법을 포함함), 전기영동법에 의한 분리와 형광, 효소, 방사성 동위 원소 등에 의한 검출 방법을 조합한 방법(웨스턴블롯법, 형광 2차원 전기영동법을 포함함), 효소 면역 측정 흡착법 (ELISA), 도트·블로팅법, 라텍스 응집법(LA: Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay), 면역크로마토그래피 등을 예로 들 수 있다. 바람직하게는, 면역크로마토그래피 또는 ELISA법에 의해 측정한다.
면역크로마토그래피는 면역크로마토그래피 검출 장치를 사용하여 행한다. 면역크로마토그래피용 검출 장치를 면역크로마토그래피용 시험편이라고도 한다. 상기 검출 장치는, 시험편으로 이루어지는 면역크로마토그래피 시험편이며, 예를 들면, 도 1에 나타낸 바와 같이 배치되어 구성된다. 시트형의 고상(固相) 지지체 상에 검체를 공급하는 검체 공급 부위(1), 및 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 표지하는 표지 시약을 고상 지지체 상에서 전개 가능하게 유지한 표지 시약 부위(2), 항원과 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화한 포착 시약 부위(3)를 포함한다. 검체 공급 부위(1)에 검체를 공급하면, 검체는 표지 시약 부위(2), 포착 시약 부위(3)의 순서로 통과하도록 구성되어 있다.
본 발명의 면역크로마토그래피 검출 장치는 또한 대조 부위에 대조용 시약을 포함하고 있어도 되고, 또한 흡수 부위를 포함하고 있어도 된다. 대조용 시약은 한정되지 않지만, 예를 들면, 표지 시약 중의 항체가 결합하는 물질을 사용할 수 있다. 대조용 시약은, 포착 시약 부위의 하류에 고정화하면 되며, 도 1에 있어서는 대조 부위(4)가 해당한다. 흡수 부위는, 포착 시약 부위를 통과한 검체를 흡수함으로써, 검체의 흐름을 제어하는 액체 흡수성을 가지는 부위이며, 검출 장치의 최하류에 설치하면 되며, 도 1에 있어서는 흡수 부위(6)가 해당한다. 흡수 부위는, 예를 들면, 종이로 만든 것을 흡수 패드(absorbent pad)로서 사용하면 된다.
본 발명의 면역크로마토그래피 검출 장치에 있어서, 검체 공급 부위는 고상 지지체의 일단을 그대로 사용해도 되지만, 고상 지지체와는 다른 부재에 의해 구성할 수도 있다. 후자에서의 검체 공급 부위는 일단 검체 혹은 검체와 표지 시약의 혼합물을 흡수하고, 이어서, 흡수한 검체 또는 혼합물을 고상 지지체에 공급하도록, 고상 지지체와 모세류(毛細流)에 의해 용액이 전개 이동 가능하도록 접촉하여 배치된다. 고상 지지체와는 다른 부재란, 예를 들면, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 폴리스티렌 등의 천연, 합성 폴리머, 혹은 이들의 혼합물로 이루어지는 부재가 있으며, 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 면역크로마토그래피 검출 장치에 있어서, 표지 시약이란 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 적절한 표지 물질을 결합시킨 콘쥬게이트(conjugate)이며, 표지 물질로서, 금 콜로이드 등의 금속 콜로이드, 셀레늄 콜로이드 등의 비금속 콜로이드, 착색 수지 입자 등의 불용성의 물질(불용성 담체)을 예로 들 수 있다. 일반적으로 표지 시약은 고상 지지체와는 다른 부재에 함침시켜서 건조하고, 이것을 고상 지지체와 연속적으로 연결하는 위치에 둔다. 또는, 표지 시약은 고상 지지체 상에 직접 도포하고, 건조해도 상관없다. 검체가 표지 시약을 포함하는 표지 시약 부위에 도달하면 표지 시약은 검체 중에 용해되어, 고상 지지체를 전개할 수 있다. 즉, 표지 시약은 표지 시약 부위에 전개 가능하게 유지되어 있다.
본 발명의 면역크로마토그래피 검출 장치에 있어서, 포착 시약이란 항원에 특이적으로 결합하는 항체이며, 포착 시약 부위는 항원과 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있고, 표지 시약-항원-포착 시약 복합체가 형성된다. 복합체의 존재는, 포착 시약 부위(2)에서의 표지 물질이 형성한 라인의 색의 짙은 정도로서 육안으로 혹은 액량기에 의해 검출할 수 있다. 일반적으로 포착 시약은 고상 지지체에 직접 도포하고 건조시키는 방법으로 작성되지만, 이것으로 한정되지 않고, 고상 지지체와는 다른 부재에 함침시켜서 건조한 것을 고상 지지체 상에 두는 방법으로 작성해도 상관없다. 또한, 포착 시약의 고상 지지체로의 고정화는, 흡착에 의한 방법으로 한정되지 않고, 아미노기, 카르복실기등의 관능기를 사용하여 화학적으로 결합시키는 방법 등, 공지의 방법으로 하면 된다.
포착 시약으로서 사용하는 항체와 표지 시약으로서 사용하는 항체는 동일해도 되지만, 항원 중에 해당 물질과 결합하는 부위가 하나밖에 존재하지 않는 경우에는, 표지 시약-항원-포착 시약 복합체가 형성되지 않는다. 따라서, 이 경우 포착 시약과 표지 시약은 각각 항원의 다른 부위에 결합할 필요가 있다.
고상 지지체는 모세관 현상에 의해 시료 검체가 흡수되고 유동할 수 있는 것이면, 어떤 것이라도 된다. 예를 들면, 지지체는 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 폴리스티렌 등의 천연, 합성 폴리머, 혹은 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 고상 지지체는 바람직하게는 직사각형의 스트립 형상을 가진다.
이하, 구체적으로, 면역크로마토그래피를 사용한 혈액 배양 양성 검체로부터의 PBP2' 직접 검출법에 대하여 설명한다.
혈액 배양으로부터 분리되는 균주 가운데, 4할 정도가 포도상구균이다. 포도상구균의 경우, 메티실린 내성 황색 포도상구균(MRSA) 등의 항생 물질에 내성을 가지는 주가 수 많이 출현하고 있다. 패혈증의 신속 및 적정한 치료를 위해서는, 내성의 유무를 신속하게 진단할 필요가 있다. 포도상구균의 약제 내성에 관한 단백질로서 PBP2'(Penicillin Binding Protein 2')이 알려져 있다.
이에, 본 발명에서는 혈액 배양으로 포도상구균이 양성이 된 검체를 직접 시험하는 것에 의해, 분리 배양을 거치지 않고 보다 단시간에 PBP2'를 검출하는 방법을 제시한다.
패혈증의 의혹이 있는 환자로부터 혈액을 채취하고, 박트얼라트(BacT/Alert) 등의 혈액 배양 장치에서의 배양을 개시한다. 장치의 경고가 울리고, 균의 증식이 확인된 검체를 1ml 채취하고, 0.1M 수산화 나트륨과 1.5% Triton X-100의 혼합액 1ml을 가하여, 혈구를 신속하게 파괴한다. 처리한 검체가 전량, 균체보다 체눈(pore size)이 작은 여과막으로 지나가게 한다. 여과막 상에 목적으로 하는 균체가 포착된다. 목적으로 하는 단백질인 PBP2'는, 세균의 세포막 상에 존재하므로, 양호한 감도로 검출하기 위하여, 균체를 파괴할 필요가 있다. 필터로 0.2M 수산화 나트륨과 1.0% Triton X-100의 혼합액 1ml가 지나가게 하고, 5분 정치함으로써, 균체를 파괴하여, PBP2'를 노출시킨다. 0.6M 트리스 염산염을 포함하는 중화액이 필터로 지나가게 하고, PBP2'을 포함하는 여과액을, PBP2'을 특이적으로 포착하는 항체를 고정화한 멤브레인과, 항체를 감작(減作)한 라텍스 입자로 이루어지는 면역크로마토그래피법을 원리로 한 테스트 스트립에 적하(適下)함으로써, 단시간에 PBP2'를 검출할 수 있다.
[실시예]
이하에 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명은 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 PBP2' 측정용 면역크로마토그래피용 시험편의 제작
(1) 항체 감작 라텍스 입자의 조제 및 건조화
항PBP2' 단클론 항체를 통상적인 방법에 의해 펩신으로 처리하여 F(ab')2를 얻었다. 이것을 입자 직경 0.4㎛의 라텍스 입자에 감작하고 결합시키고, 폴리스티렌 부직포에 분무했다. 이어서 감압 장치 내에서 1시간 감압 건조하여, 건조 라텍스 항체 패드로 만들었다. 사용 시에는 4mm 간격으로 재단하여, 표지 시약 부위(2)로서 사용했다.
(2) PBP2' 측정용 면역크로마토그래피용 시험편의 제작
라텍스 감작에 사용한 항PBP2' 단클론 항체와는 인식 부위를 달리하는 제2 항PBP2' 단클론 항체를 통상적인 방법에 의해 펩신으로 처리하여 F(ab')2를 얻었다. 이것을 0.075% CHAPS를 포함하는 시트르산 완층액(pH 6)으로 희석하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(고상 지지체(5))에 도포하고, 충분히 건조했다(포착 시약 부위(3)). 대조용 시약으로서 Anti-Mouse IgGs를 동일하게 니트로셀룰로오스 멤브레인에 도포하고, 충분히 건조했다(대조 부위(4)).
소수성 시트(7) 상에 포착 시약 부위(3) 및 대조 부위(4)를 포함하는 고상 지지체(5)를 배치하고, 표지 시약 부위(2), 검체 공급 부위(1)로서 유리계 섬유, 흡수 부위(6)로서 여과지를 사용하여 임의의 장소에 배치하고, PBP2' 측정용 면역크로마토그래피용 시험편을 제작했다.
면역크로마토그래피용 시험편의 구조를 도 1에 나타낸다.
실시예 2 PBP2' 추출 시약의 제작
검체 부유용액으로서, 0.1M 수산화 나트륨과 1.0% Triton X-100을 혼합한 수용액을 조제했다.
R1 시약(미생물 파괴 시약)으로서, 0.2M 수산화 나트륨과 1.5% Tx-100을 혼합한 수용액을 조제했다.
R2 시약(여과액 조정액)으로서, 0.6M 트리스 염산염 수용액(pH 6.0±0.5)을 조제했다.
상기한 검체 부유용액, R1 시약 및 R2 시약을 합쳐서 PBP2' 추출 시약이라고한다.
실시예 3
여과막의 사이즈 검토
혈액 한천 배지에서 배양한 MRSA를 생리식염수에 부유시키고, 1.0×108개로 조정한 것을 검체로 했다.
1) 검체 1: 검체 부유액 1이 되도록 혼합하여, 전량 2mL로 했다.
2) 전량 2mL를 여과막(재질: 셀룰로오스아세테이트, 공경: 0.45㎛, 직경: 25mm)으로 여과했다.
3) 2)의 여과막에 R1 시약을 1000μL 여과하고, 여과막 내에 액을 잔존시켜 5분 정치했다.
4) 3)의 여과막에 R2 시약을 400μL 여과하고, 여과액을 회수했다.
5) 실시예 1에서 제작한 PBP2' 시험편에서의 검체 공급 부위에 적하하고, 10분 후에 판정했다. 판정 결과를 표1에 나타내었다. 「++」는 비교적 강한 양성을 나타내고, 「+++」은 강한 양성을 나타낸다.
[표 1]
Figure 112017109015660-pct00001
PVDF: 폴리비닐리덴플루오라이드
acrylic copolymer: 아크릴 공중합체
표 1의 결과는, 공경 0.22∼1.2 ㎛의 여과막을 사용한 경우, 모두 본 발명의 방법으로 MRSA의 PBP2'를 검출할 수 있는 것을 나타낸다. 특히, 공경 0.22∼0.45 ㎛의 여과막을 사용한 경우가 양호했다.
실시예 4
여과막의 재질 검토
혈액 한천 배지에서 배양한 MRSA를 생리식염수에 부유시키고, 1.0×108개로 조정한 것을 검체로 했다.
1) 검체 1: 검체 부유액 1이 되도록 혼합하여, 전량 2mL로 했다.
2) 전량 2mL을 여과막(재질: 셀룰로오스아세테이트, 공경: 0.45㎛, 직경: 25mm)으로 여과했다.
3) 2)의 여과막에 R1 시약을 1000μL 여과하고, 여과막 내에 액을 잔존시켜 5분 정치했다.
4) 3)의 여과막에 R2 시약을 400μL 여과하고, 여과액을 회수했다.
5) 실시예 1에서 제작한 PBP2' 시험편에서의 검체 공급 부위에 적하하고, 10분 후에 판정했다. 판정 결과를 표 2에 나타내었다. 「++」는 비교적 강한 양성을 나타내고, 「+++」은 강한 양성을 나타낸다.
[표 2]
Figure 112017109015660-pct00002
PVDF: 폴리비닐리덴플루오라이드
MCE: 셀룰로오스 혼합 에스테르
PES: 폴리에테르술폰
hydrophilic polyethersulfone: 친수성 폴리에테르술폰
GHP: 친수성 폴리프로필렌
NYL: 나일론
CA: 셀룰로오스아세테이트
GxF: 다층 유리 섬유제 프리 필터
GF: 붕규산 유리 섬유제 프리 필터
PTFE: 폴리테트라플루오로에틸렌
표 2의 결과는, 1∼13의 어떤 여과막을 사용한 경우라도 본 발명의 방법으로 MRSA의 PBP2'을 검출할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 5
계면활성제의 검토
혈액 한천 배지에서 배양한 MRSA를 생리식염수에 부유시키고, 1.0×108개로 조정한 것을 검체로 했다.
1) 검체 1: 검체 부유액 1이 되도록 혼합하고, 전량 2mL로 했다.
2) 전량 2mL을 여과막(재질: 셀룰로오스아세테이트, 공경: 0.45㎛, 직경: 25mm)으로 여과했다.
3) 2)의 여과막에 R1 시약을 1000μL 여과하고, 여과막 내에 액을 잔존시키고 5분 정치했다.
4) 3)의 여과막에 R2 시약을 400μL 여과하고, 여과액을 회수했다.
5) 실시예 1에서 제작한 PBP2' 시험편에서의 검체 공급 부위에 적하하고, 10분 후에 판정했다. 판정 결과를 표 3에 나타내었다. 「++」는 비교적 강한 양성을 나타내고, 「+++」는 강한 양성을 나타낸다.
[표 3]
Figure 112017109015660-pct00003
에멀겐 106: 폴리옥시에틸렌(5)라우릴에테르
에멀겐 A500: 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르
표 3의 결과는, 어떤 계면활성제를 사용한 경우라도 본 발명의 방법으로 MRSA의 PBP2'을 검출할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 6
종래 기술과의 비교 실험
본 발명의 여과막법과 종래 기술인 원심분리법의 재현성에 대하여 비교했다.
검체는 MRSA 균주를 혈액 배지(말 탈섬유혈(defibrinated horse blood) 1: 액체 배지 4)로 희석했다.
1. 원심분리법
1) 검체 1: 검체 부유액 3이 되도록 혼합하고, 전량 2mL로 했다.
2) 7000g, 5min, 실온에서 원심분리했다.
3) 상청액을 버리고, R1 시약을 200μL 가하였다.
4) R2 시약을 100μL 첨가하고, 혼합했다.
5) 실시예 1에서 제작한 PBP2' 시험편에서의 검체 공급 부위에 적하하고, 10분 후에 판정했다.
2. 여과막법
1) 검체 1: 검체 부유액 1이 되도록 혼합하고, 전량 2mL로 했다.
2) 전량 2mL을 여과막(재질: 셀룰로오스아세테이트, 공경: 0.45㎛, 직경: 25mm)으로 여과했다.
3) 2)의 여과막에 R1 시약을 1000μL 여과하고, 여과막 내에 액을 잔존시키고 5분 정치했다.
4) 3)의 여과막에 R2 시약을 400μL 여과하고, 여과액을 회수했다.
5) 실시예 1에서 제작한 PBP2' 시험편에서의 검체 공급 부위에 적하하고, 10분 후에 판정했다.
원심분리법과 여과막법을 A, B, C의 3명에 3회 실시하도록 하고 판정 결과의 재현성을 비교했다. 판정 결과를 표4에 나타내었다. 「-」는 음성, 「+」는 양성, 「++」는 비교적 강한 양성, 「+++」는 강한 양성을 나타낸다.
[표 4]
Figure 112017109015660-pct00004
표 4의 결과는, 본 발명의 여과막법은 종래 기술의 원심분리법보다 재현성이 양호한 것을 나타낸다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에서 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해, 병원성 미생물의 감염증이나 병원성 미생물의 존재를 검출할 수 있다.
1: 검체 공급 부위
2: 표지 시약 부위
3: 포착 시약(캡쳐 항체) 부위
4: 대조(컨트롤) 부위
5: 고상 지지체(니트로셀룰로오스막)
6: 흡수 부위(흡수 패드)
7: 톱 라미네이트 또는 하우징

Claims (7)

  1. 미생물을 포함하는 검체가 미생물을 통과시키지 않는 공경(孔徑)을 가지는 여과막으로 지나가게 하고, 상기 검체 중의 미생물을 여과막 상에 포착하고, 미생물을 포착한 여과막으로 미생물의 막을 파괴할 수 있는 미생물 파괴 시약인 계면활성제와 알카리성 용액의 혼합물을 지나가게 함으로써 포착된 미생물을 여과막 상에서 파괴하고, 여과액 중에 항원을 회수하고, 여과액 중에 회수한 미생물의 항원을 면역학적 측정법으로 측정하는 것을 포함하며, 상기 미생물이 메티실린 내성 황색포도상구균인, 미생물의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    알카리성 용액의 pH가 11 이상인, 미생물의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    알카리성 용액이 수산화 나트륨 용액인, 미생물의 검출 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역학적 측정법이 면역크로마토그래피(immunochromatography)인, 미생물의 검출 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
KR1020177031921A 2015-04-28 2016-04-28 미생물 항원의 회수법 KR102561659B1 (ko)

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