ES2894842T3 - Procedimiento para la recogida de antígeno microbiano - Google Patents

Procedimiento para la recogida de antígeno microbiano Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de detección de microorganismos que comprende un procedimiento para la recogida de antígenos de los microorganismos que comprende permitir que las muestras que contienen microorganismos pasen a través de un filtro de membrana con un diámetro de poro que no permite que los microorganismos pasen a través de este, en el que las muestras se suspenden en un líquido para la suspensión de muestra; capturar los microorganismos de las muestras en el filtro de membrana; permitir que un reactivo de destrucción microbiana capaz de destruir la membrana microbiana pase a través del filtro de membrana en el que se capturan los microorganismos para destruir los microorganismos capturados en el filtro de membrana; y recoger los antígenos en el filtrado, y ensayar los antígenos microbianos recogidos mediante una técnica de inmunoensayo, en la que el reactivo de destrucción microbiana es una solución alcalina, o una mezcla de un tensioactivo y una solución alcalina.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la recogida de antígeno microbiano
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento para la recogida de antígenos microbianos.
Antecedentes de la técnica
En el caso de las enfermedades infecciosas tales como la septicemia, la administración de agentes antibacterianos adecuados en una etapa temprana es fundamental para el tratamiento o el pronóstico de un paciente. De acuerdo con técnicas convencionales, las enfermedades infecciosas tales como la septicemia se han analizado de la manera que se describe a continuación.
La sangre extraída de un paciente (de 2 a 10 ml) se inocula en aproximadamente 30 a 100 ml de un medio líquido para cultivo bacteriano, y luego se lleva a cabo el cultivo de 30 °C a 37 °C. La observación se continúa durante de 1 a 7 días hasta que se detecta el crecimiento bacteriano, sobre la base de cambios en la turbidez del medio, la generación de gas en el medio causada por bacterias, los cambios en los niveles de pH y otros factores como indicadores. Una vez que se observa el crecimiento bacteriano, la solución de cultivo se recoge y se somete a tinción de Gram y subcultivo (cultivo secundario). Las especies bacterianas se clasifican aproximadamente sobre la base de los resultados de la tinción de Gram, y se determina si se detecta un solo tipo de bacteria o varios tipos de bacterias. Cuando las colonias de bacterias cultivadas mediante subcultivo son homogéneas, se plantea la hipótesis de que un solo tipo de bacteria está presente en la sangre, y las bacterias se someten luego a la prueba de identificación y a la prueba de sensibilidad. Por el contrario, cuando se observa una pluralidad de tipos de bacterias como un resultado de la tinción de Gram o crecen colonias de configuraciones aparentemente diferentes, se selecciona cada colonia y se continúa el cultivo hasta que las colonias de una sola configuración crecen selectivamente. Es decir, se necesitan varios días para completar un procedimiento desde el muestreo de las muestras hasta la identificación de las mismas. En el caso de un paciente con sospecha de septicemia, el diagnóstico precoz y la administración de un agente antibacteriano adecuado son fundamentales para el pronóstico del paciente. Como un procedimiento que permite una identificación más precisa de las especies bacterianas en un período de tiempo más corto, se emplea en consecuencia, una técnica inmunológica, tal como la inmunocromatográfica (documento WO 2007/069673). Cuando se identifican bacterias mediante una técnica inmunológica, se debe unir una inmunoglobulina que reconoce específicamente una proteína de la bacteria diana. La inmunoglobulina unida se marca de antemano con partículas de látex coloreadas o materiales de fluorescencia, de modo que se pueda detectar la presencia de bacterias. Por tanto, las bacterias pueden detectarse directamente a partir de hemocultivo sin cultivo puro. Sin embargo, las muestras que se usan para las pruebas bacterianas, tales como la sangre, la solución de cultivo, el esputo, las lágrimas o las heces, contienen varios tipos de proteínas. En consecuencia, para detectar una proteína diana con alta sensibilidad, es necesario eliminar los contaminantes al separar las bacterias mediante la centrifugación o el cultivo en un medio sólido. Además, el tratamiento térmico, la destrucción de la membrana celular con la ayuda de una solución, u otro tratamiento pueden ser necesarios en función del lugar donde esté presente una proteína de la bacteria diana, una configuración de proteína u otros factores.
El documento JP 2004/279113 divulga una cámara para suministrar líquido a filtrar, que se comunica con una salida de filtrado a través de una película de filtración, donde se filtra un líquido de humor a inspeccionar mediante un filtro equipado con un medio de presión negativa en la parte superior de la cámara para suministrar el líquido a filtrar, en el que el objeto retenido de un antígeno o un anticuerpo se captura en una película de permeabilidad, luego el interior del filtro se establece para estar bajo presión negativa por los medios de presión negativa, absorbiendo así la solución para la extracción del puerto de escape del filtrado para fluir hacia atrás en el filtro y fabricar el extracto de un antígeno o anticuerpo.
El documento US 2013/309700 divulga un procedimiento rápido y sensible para separar y detectar microorganismos de una muestra que contiene microorganismos. El procedimiento se basa en técnicas de separación para separar y concentrar las células de la muestra, junto con técnicas químicas para amplificar la cantidad de señal detectable de un número reducido de células para proporcionar un procedimiento de detección de microorganismos rápido y sensible. Este procedimiento de detección utiliza un dispositivo de filtración, un dispositivo de centrifugación, un sistema, un dispositivo de hisopo, y un kit que comprende uno o más de los dispositivos y componentes para realizar un procedimiento de separación y detección de microorganismos en una muestra que contiene microorganismos. La muestra puede ser un producto químico, cosmético, de cuidado personal, farmacéutico o consumible en su estado de materia prima, en proceso y/o producto terminado que es necesario analizar para detectar cualquier microorganismo contaminante antes del envío al consumidor.
En consecuencia, era necesario un equipo especial, tal como una centrífuga o un bloque térmico, y un procedimiento que requería mucho tiempo, tal como el cultivo. En el caso de la centrifugación, además, las bacterias precipitadas pueden succionarse erróneamente al desechar el sobrenadante, el número de bacterias puede reducirse, y es posible que ocasionalmente no se haga un juicio preciso.
Sumario de la invención
Objetivos que debe lograr la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para recoger fácilmente antígenos poseídos por microorganismos sin el uso de equipo especial.
Medios para lograr los objetivos
Los presentes inventores han realizado estudios concentrados concernientes a un procedimiento para detectar fácilmente microorganismos, tales como bacterias patógenas. Los microorganismos pueden detectarse mediante la medición de los antígenos que poseen los microorganismos de interés. En consecuencia, los presentes inventores examinaron un procedimiento para recoger antígenos fácilmente.
Como resultado, descubrieron que los microorganismos podrían destruirse rápidamente y los antígenos podrían luego recogerse fácilmente al permitir que los microorganismos contenidos en las muestras, tales como la sangre o la solución de cultivo, pasen a través de un filtro de membrana para capturar los microorganismos en la membrana y tratar las bacterias capturadas sobre la membrana con una solución que contiene un tensioactivo o similar. Esto ha llevado a completar la presente invención.
Específicamente, la presente invención es como se describe a continuación.
[1] Un procedimiento de detección de microorganismos que comprende un procedimiento para la recogida de antígenos de los microorganismos que comprende: permitir que las muestras que contienen microorganismos pasen a través de un filtro de membrana con un diámetro de poro que no permite que los microorganismos pasen a través de este; en el que las muestras se suspenden en un líquido para la suspensión de muestra; capturar los microorganismos de las muestras sobre el filtro de membrana; permitir que un reactivo de destrucción microbiana capaz de destruir la membrana microbiana pase a través del filtro de membrana en el que se capturan los microorganismos para destruir los microorganismos capturados en el filtro de membrana; y recoger los antígenos en el filtrado, y ensayar los antígenos microbianos recogidos mediante la técnica de inmunoensayo, en la que el reactivo de destrucción microbiana es una solución alcalina o una mezcla de un tensioactivo y una solución alcalina.
[2] El procedimiento de detección de microorganismos de acuerdo con [1], en el que los microorganismos son bacterias.
[3] El procedimiento de detección de microorganismos de acuerdo con [1] o [2], en el que la solución alcalina tiene un pH de 11 o superior.
[4] El procedimiento de detección de microorganismos de acuerdo con cualquiera de [1] a [3], en el que la solución alcalina es una solución de hidróxido de sodio.
[5] El procedimiento de detección de microorganismos de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], en el que la técnica de inmunoensayo es inmunocromatográfica.
De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, las muestras, tales como la sangre o la solución de cultivo, que contienen microorganismos tales como bacterias se dejan pasar a través de un filtro de membrana, los microorganismos se capturan en el filtro de membrana y los microorganismos contenidos en las muestras pueden separarse fácilmente de los contaminantes. Además, se deja pasar un reactivo de destrucción microbiana que contiene un tensioactivo y/o una solución alcalina a través de un filtro de membrana, de modo que los microorganismos capturados en la membrana se destruyen, y los antígenos que poseen los microorganismos se exponen y se recogen fácilmente. De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, los antígenos de microorganismos pueden recogerse fácilmente sin el uso de equipo especial. Al ensayar los antígenos recogidos, puede detectarse la presencia o ausencia de microorganismos, y, por ejemplo, se pueden diagnosticar infecciones microbianas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una realización de un aparato de detección que puede usarse para ensayar los antígenos recogidos mediante el procedimiento de la presente invención.
Realizaciones para llevar a cabo la invención
A continuación, la presente invención se describe en detalle.
1. Recogida de antígenos microbianos
Los microorganismos de los que se pueden recoger antígenos mediante el procedimiento de la presente invención no están particularmente limitados. Ejemplos de tales microorganismos incluyen bacterias, algas, protistas, hongos tales como levaduras y mohos, y eucariotas tal como mohos lodosos. Entre tales microorganismos, se prefieren los microorganismos patógenos que causan enfermedades infecciosas en humanos o animales no humanos. Los ejemplos de los mismos incluyen Staphylococcus aureus que incluye Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MrSa ); Escherichia coli que incluye Escherichia coli enteropatógena; bacterias, tales como Salmonella, Pseudomonas, Vibrio cholerae, Bacillus dysenteriae, bacilos del ántrax, Bacillus tuberculosis, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, cadenas de cocos, Campylobacter, bacilos de Welch, Vibrio parahaemolyticus, Chlamydia trachomatis, Streptococcus haemolyticus, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, Leptospira, Treponema pallidum, y Borrelia; Candida albicans; Trichophyton; y Aspergillus.
Las muestras a analizar en cuanto a la presencia de microorganismos en ellas mediante el procedimiento de la presente invención no se limitan. Los ejemplos de las mismas incluyen muestras biológicas, tales como un hisopado de garganta, un hisopado nasal, un aspirado nasal, una suspensión de heces, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina, saliva, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, pus, extracto de órgano, y diversos extractos de tejido; un extracto alimenticio; un sobrenadante de cultivo; agua del grifo; aguas residuales; agua de lago; agua de río; agua de mar; un extracto de suelo; y un extracto de lodo. Desde el punto de vista de la detección de microorganismos patógenos, las muestras biológicas se prefieren particularmente. Por ejemplo, puede usarse preferentemente un hisopado de garganta, un hisopado nasal, un aspirado nasal, un lavado nasal, un lavado alveolar, un hisopado rectal o una suspensión de heces. Pueden usarse muestras derivadas de humanos o de animales no humanos. Además, una solución de cultivo en la que se cultivaron las muestras mencionadas anteriormente está dentro del ámbito de las muestras. Si bien una muestra puede usarse sin ningún procedimiento, una muestra que contiene una cantidad en exceso de microorganismos, tales como una solución de cultivo, una muestra muy viscosa, o similar, se usa adecuadamente en forma de suspensión de las mismas, por ejemplo, solución salina fisiológica o tampón. Un líquido en el que se suspenderá la muestra se denomina "líquido para la suspensión de muestra", y un líquido que comprende la muestra suspendida en el líquido para la suspensión de muestra se denomina "suspensión de muestra". Cuando una muestra contiene sangre tal como sangre completa, se prefiere que los eritrocitos sanguíneos se destruyan de antemano con el uso de un tensioactivo o similar y se hemolicen completamente. Para lograr la reacción hemolítica, una muestra puede tratarse con el uso de, por ejemplo, un tensioactivo, varios solventes, o una solución hipotónica.
De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, se deja que la muestra pase a través de un filtro de membrana, para capturar los microorganismos en el filtro de membrana. Cuando se capturan los microorganismos, no se permite que los microorganismos pasen a través de un filtro de membrana, y permanecen en el filtro de membrana después de que la muestra ha pasado a través de este. En este caso, se usa un filtro de membrana que tiene un diámetro de poro que no permite el paso de los microorganismos a través de este.
Cuando los microorganismos a detectar son bacterias, un filtro de membrana con un diámetro de poro de 1,5 pm o menos, preferentemente 1,2 pm o menos, con mayor preferencia 0,8 pm o menos, y más preferentemente 0,45 pm o menos, por ejemplo, puede usarse un filtro de membrana con un diámetro de poro que sea de 0,1 a 1,2 pm, y preferentemente 0,22 pm, 0,45 pm, 0,8 pm o 1,2 pm. Cuando se van a detectar hongos o levaduras de gran tamaño, puede usarse un filtro de membrana con un diámetro de poro superior a 0,5 pm, tal como un filtro de membrana con un diámetro de poro de 0,8 pm. Ejemplos de filtros de membrana que pueden usarse incluyen filtros de membrana con los diámetros de poro como se describió anteriormente y compuestos de ésteres de celulosa mixtos (ECM), fluoruro de polivinilideno (FPVD), politetrafluoroetileno (PTFE), PTFE hidrofílico, polietersulfona (PES), polietersulfona hidrofílica, polipropileno hidrófilo (PGH), nailon (NYL), acetato de celulosa (AC), polisulfona (PSF), un copolímero acrílico, poliamida, nailon 66, poliéster, policarbonato, nitrocelulosa y una mezcla de nitrocelulosa y éster de celulosa. En combinación con un filtro de membrana de este tipo, puede usarse un prefiltro de fibra de vidrio, tales como fibra de vidrio de borosilicato (FB) o fibra de vidrio multicapa (FxV). Ejemplos de tales combinaciones incluyen un filtro de membrana de nailon y un prefiltro de fibra de vidrio multicapa (FxV), un filtro de membrana de polietersulfona (PES) y un prefiltro de fibra de vidrio multicapa (FxV), un filtro de membrana de acetato de celulosa (AC) y un prefiltro de fibra de vidrio de borosilicato (FB), y un filtro de membrana de nailon (NYL) y un prefiltro de fibra de vidrio de borosilicato (FB).
Después de que los microorganismos se capturan en un filtro de membrana, los microorganismos capturados se destruyen para exponer los antígenos microbianos. Los microorganismos se destruyen preferentemente por medio de la destrucción de la membrana celular microbiana. Los antígenos expuestos como resultado de la destrucción de microorganismos se pueden recoger fácilmente. Los ejemplos de antígenos microbianos incluyen sustancias que pueden producir anticuerpos, tales como proteínas, lípidos y polisacáridos. Esto indica que los antígenos recogidos se detectan con el uso de reacciones antígeno-anticuerpo. Los ejemplos específicos de tales sustancias incluyen constituyentes de los microorganismos, toxinas producidas por los microorganismos y antígenos bacterianos de las bacterias. Un ejemplo más específico es la proteína de unión a penicilina 2' (PUP2') de MRSA.
Los microorganismos capturados se destruyen al tratar los microorganismos con un reactivo de destrucción microbiana que contiene un tensioactivo y/o un reactivo de destrucción microbiana, que es una solución alcalina. Un reactivo de destrucción microbiana es capaz de destruir una membrana microbiana. El tensioactivo a usar no se limita, y preferentemente se usa un tensioactivo que sea capaz de solubilizar una membrana microbiana. Ejemplos de tensioactivos que pueden usarse incluyen: polioxietileno p-t-octilfenil éter (tensioactivos basados en Triton), tales como Triton X-100 (Triton: marca registrada) (polioxietileno (10) octilfenil éter), Triton X-114 (polioxietileno (8) octilfenil éter), Triton X-405 (polioxietilen (40) isooctilfenil éter) y NP-40 (Nonidet P-40) (polioxietileno (9) octilfenil éter); éster de ácido graso de polioxietileno sorbitán (tensioactivos basados en Tween), tales como Tween 20 (Tween: marca registrada), Tween 40, Tween 60, Tween 80, Tween 65 y Tween 85; polioxietileno alquiléter (tensioactivos basados en Briji), tal como Briji 35 (Briji: marca registrada) (polioxietileno (23) lauril éter); tensioactivos no iónicos, tales como dodecil-P-D-maltosa y octil-P-D-glucósido; tensioactivos aniónicos, tales como dodecilsulfato de sodio (SDS); tensioactivos catiónicos, tales como cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, sal de didecildimetilamonio y cloruro de dodeciltrimetilamonio; y tensioactivos anfóteros, tales como CHAPS (3-(3-colamidapropil)dimetilamonio-1-propanosulfonato) y cloruro de alquil poliaminoetil glicina. Se prefiere el uso de tensioactivos no iónicos, tales como tensioactivos basados en éter (por ejemplo, polioxietileno alquiléter, polioxietileno alquil alil éter y polioxietileno polioxipropilenglicol) y tensioactivos basados en éster (por ejemplo, éster de ácido graso de alcohol superior), y tensioactivos basados en éster éter (por ejemplo, éster de ácido graso de polioxietileno sorbitán), tensioactivos aniónicos y tensioactivos anfóteros, y se prefiere particularmente el uso de tensioactivos no iónicos. Puede usarse un tensioactivo a una concentración de 0,2 a 5 % (p/p) y preferentemente de 0,5 a 2 % (p/p).
Una solución alcalina no solo destruye las membranas microbianas, sino que también desnaturaliza la proteína A en la membrana. Por tanto, se pueden suprimir las reacciones inespecíficas a los anticuerpos. Puede usarse una solución alcalina con un nivel de pH de 11 o más, preferentemente de 12 o más, y con mayor preferencia de 13 o más. Por ejemplo, se usa preferentemente una solución de hidróxido de sodio de 0,1 M a 1,0 M o hipoclorito de sodio.
Puede mezclarse un tensioactivo con una solución alcalina y usarse en forma de mezcla. Por ejemplo, puede usarse hidróxido de sodio de 0,1 a 0,5 M que contiene un tensioactivo, tal como Triton X-100 del 1 % al 2 %.
Los microorganismos pueden tratarse con un reactivo de destrucción microbiana mediante la aplicación de una mezcla de un tensioactivo y una solución alcalina o una solución alcalina al filtro de membrana en el que se han capturado los microorganismos. Específicamente, el reactivo de destrucción microbiana puede ponerse en contacto con los microorganismos capturados. A continuación, se puede dejar reposar el filtro de membrana de 1 a 20 minutos, y preferentemente de 2 a 10 minutos, mientras la solución se retiene en este. Por tanto, los microorganismos pueden destruirse por completo. Cuando se usa un filtro de membrana con un diámetro de 20 a 40 mm, por ejemplo, se aplica de 1 a varios ml de la muestra o suspensión de muestra al filtro de membrana, y los microorganismos de la muestra o suspensión de la muestra se capturan en el filtro de membrana. Posteriormente, se aplican de varios a varios cientos de ml del reactivo de destrucción microbiana al filtro de membrana, para destruir los microorganismos capturados en el filtro de membrana y recoger un filtrado que contiene antígenos microbianos. Cuando el reactivo de destrucción microbiana es una solución alcalina, se añaden de varios a varios cientos de ml de un tampón con un pH alrededor de neutro, preferentemente de 1/10 a 2/3 del volumen del reactivo de destrucción microbiana usado para neutralizar el reactivo o reducir la concentración de tensioactivo. Una solución que se añadirá al filtrado recogido se denomina solución de ajuste del filtrado, y se puede seleccionar un reactivo adecuado en función de las condiciones para un procedimiento de ensayo de antígenos en el filtrado recogido. Como solución de ajuste de filtrado, puede usarse un tampón de neutro a ácido, tal como un tampón Tris-HCl. El filtrado recogido contiene antígenos microbianos. Los antígenos contenidos en el filtrado recogido pueden ensayarse mediante diversas técnicas. Puede aplicarse una solución de ajuste del filtrado al filtro de membrana a través del cual ha pasado el reactivo de destrucción microbiana. Por tanto, los antígenos microbianos se pueden recoger mientras se neutraliza el reactivo de destrucción microbiana o se reduce la concentración de tensioactivo.
El líquido para la suspensión de muestra, un reactivo de destrucción microbiana y una solución de ajuste del filtrado, en total, se denominan reactivos de extracción de antígeno microbiano.
2. Ensayo de antígenos recogidos
Los antígenos recogidos se pueden ensayar mediante cualquier técnica. De acuerdo con la invención, se realiza una técnica de inmunoensayo en base a las reacciones antígeno-anticuerpo con el uso de un anticuerpo específico del antígeno diana. Los ejemplos de técnicas de inmunoensayo incluyen inmunotinción tales como la técnica de anticuerpos de fluorescencia, la técnica de anticuerpos enzimáticos, la técnica de anticuerpos marcados con metales pesados y la técnica de anticuerpos marcados con radioisótopos; un procedimiento que implica la separación mediante electroforesis en combinación con la detección con la ayuda de una fluorescencia, enzima o radioisótopo, tal como la electroforesis bidimensional de fluorescencia y transferencia Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), transferencia puntual, inmunoensayo turbidimétrico con aglutinación de látex (LA:TI) e inmunocromatografía. Se prefiere la inmunocromatografía o el ELISA.
La inmunocromatografía se lleva a cabo con el uso de un aparato de detección inmunocromatográfica. Un aparato de detección inmunocromatográfica también se denomina pieza de prueba inmunocromatográfica. El aparato de detección es una pieza de prueba inmunocromatográfica compuesta por piezas de prueba. Por ejemplo, las piezas de prueba están dispuestas como se muestra en la Figura 1. El aparato de detección comprende: un sitio de suministro de muestra 1 que suministra una muestra sobre un soporte de fase sólida en forma de hoja; un sitio del reactivo marcado 2 que retiene un reactivo marcado que tiene marcado un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno en un soporte de fase sólida de una manera extendible sobre el mismo; y un sitio del reactivo de captura 3 en el que se ha inmovilizado un reactivo de captura capaz de unirse específicamente a un complejo de reactivo marcado con antígeno y capturarlo. Se compone de tal manera que la muestra pasa sucesivamente a través del sitio del reactivo marcado 2 y el sitio del reactivo de captura 3 en ese orden, una vez que se suministra una muestra al sitio de suministro de muestra 1.
El aparato de detección inmunocromatográfica de acuerdo con la presente invención puede comprender además un reactivo de control en un sitio de control, y, además, puede comprender un sitio de absorción. Un reactivo de control no se limita. Por ejemplo, puede usarse una sustancia a la que se une un anticuerpo en el reactivo marcado. Se puede fijar un reactivo de control en un sitio corriente abajo del sitio del reactivo de captura, que corresponde al "sitio de control 4" en la Figura 1. Un sitio de absorción tiene una propiedad de absorción de líquido, de modo que absorbe una muestra que ha pasado por el sitio del reactivo de captura, para regular el flujo de las muestras. El sitio de absorción puede ubicarse en la posición más baja del aparato de detección, que corresponde al "sitio de absorción 6" en la Figura 1. Un sitio de absorción puede estar hecho, por ejemplo, de papel, y puede usarse en forma de almohadilla absorbente.
En el aparato de detección inmunocromatográfica de la presente invención, puede usarse un extremo de un soporte de fase sólida como un sitio de suministro de muestra, o un sitio de suministro de muestra puede estar hecho de un material distinto del soporte de fase sólida. En el caso de este último, el sitio de suministro de muestra se proporciona en contacto con el soporte de fase sólida, de modo que una solución pueda extenderse y moverse por el flujo capilar. Es decir, el sitio de suministro de muestra absorbe una vez la muestra o una mezcla de la muestra y un reactivo marcado y luego suministra la muestra o mezcla absorbida al soporte de fase sólida. Ejemplos de materiales distintos del soporte de fase sólida incluyen, pero no se limitan particularmente a, materiales compuestos de polímeros naturales o sintéticos, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, nailon, polietersulfona, alcohol polivinílico, poliéster, fibra de vidrio, poliolefina, celulosa y poliestireno, y una mezcla de cualquiera de los mismos.
En el aparato de detección inmunocromatográfica de la presente invención, un reactivo marcado es un conjugado de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno y una sustancia marcada adecuada unidos entre sí. Los ejemplos de sustancias marcadas incluyen coloides metálicos tal como coloides de oro, coloides no metálicos tales como coloides de selenio y sustancias insolubles tales como partículas de resina coloreadas (portadores insolubles). En general, se deja que un reactivo marcado se impregne en un material distinto del soporte de fase sólida, el resultante se seca, y luego se proporciona en una posición conectada al soporte de fase sólida. Alternativamente, se puede aplicar directamente un reactivo marcador al soporte de fase sólida y secarlo. Cuando la muestra llega al sitio del reactivo marcado que contiene un reactivo marcado, el reactivo marcado se disuelve en la muestra y la solución resultante se puede esparcir sobre el soporte de fase sólida. Por tanto, el reactivo marcado se retiene en un sitio del reactivo marcado de manera extendible.
En el aparato de detección inmunocromatográfica de la presente invención, un reactivo de captura es un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno, un sitio del reactivo de captura puede unirse específicamente y capturar un complejo de un antígeno y un reactivo marcado, y se forma así un complejo de un reactivo marcado - un antígeno - un reactivo de captura. La presencia de un complejo puede detectarse visualmente sobre la base de la densidad de color de la línea formada por la sustancia marcada en el sitio 2 del reactivo de captura o puede detectarse con el uso de un aparato de medición. En general, un reactivo de captura se prepara al aplicar directamente el mismo al soporte de fase sólida y al secar sobre el soporte. Alternativamente, se puede preparar un reactivo de captura al permitir que el mismo se impregne en un material distinto del soporte de fase sólida, al secar el resultante, y al proporcionar el mismo sobre el soporte de fase sólida. Se puede inmovilizar un reactivo de captura sobre el soporte de fase sólida mediante adsorción u otros medios sin limitación. Por ejemplo, se puede emplear una técnica convencional, tal como un procedimiento de unión química con el uso de un grupo funcional, tal como un grupo amino o un grupo carboxilo.
El anticuerpo que se usará como reactivo de captura puede ser el mismo que el anticuerpo que se usará como reactivo marcado. Sin embargo, cuando un antígeno comprende solo un sitio que se une a la sustancia de interés, no se forma un complejo de un reactivo marcado- un antígeno- un reactivo de captura. En tal caso, en consecuencia, es necesario que el reactivo de captura se una a un sitio del antígeno que sea diferente de un sitio al que se une el reactivo marcado.
Un soporte de fase sólida puede estar hecho de cualquier sustancia, con la condición de que absorba una muestra y permita que la misma fluya por capilaridad. Por ejemplo, un soporte está compuesto por una sustancia seleccionada del grupo que consiste en polímeros naturales o sintéticos, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, nailon, polietersulfona, alcohol polivinílico, poliéster, fibra de vidrio, poliolefina, celulosa y poliestireno, y una mezcla de cualquiera de los mismos. Un soporte de fase sólida tiene preferentemente la forma de una tira.
A continuación, se describe en detalle un procedimiento para detectar PBP2' directamente a partir de una muestra positiva de hemocultivo mediante inmunocromatográfica.
Aproximadamente el 40 % de las cepas bacterianas separadas mediante hemocultivo son estafilococos. En el caso de los estafilococos, se han desarrollado muchas células resistentes a los antibióticos, tales como el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA). Para lograr un tratamiento rápido y adecuado de la septicemia, es necesario que se determine la presencia o ausencia de resistencias. La proteína de unión a penicilina 2' (PBP2') se conoce como una proteína asociada con la resistencia a fármacos de los estafilococos.
La presente invención proporciona un procedimiento para detectar PBP2' dentro de un período de tiempo más corto sin cultivo, que comprende analizar directamente muestras que resultaron positivas para estafilococos como resultado del hemocultivo.
Se obtiene una muestra de sangre de un paciente con sospecha de septicemia y el cultivo se inicia con el uso de un aparato de hemocultivo tal como BacT/Alert. Cuando se observa crecimiento bacteriano en la muestra alertada por el aparato, se toma una muestra de 1 ml de la misma, se añade 1 ml de una mezcla de hidróxido de sodio 0,1 M y Triton X-100 al 1,5 %, y las células sanguíneas se destruyen rápidamente. Se deja pasar la cantidad total de las muestras tratadas a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro menor que el de las células bacterianas. Por tanto, las bacterias diana se capturan en el filtro de membrana. La proteína diana (PBP2') está presente en una membrana celular bacteriana. En consecuencia, para detectar la proteína diana con alta sensibilidad, es necesario destruir las células. Se deja pasar una mezcla (1 ml) de hidróxido de sodio 0,2 M y Triton X-100 al 1,0 % a través del filtro, y se deja reposar el filtro durante 5 minutos, para destruir las células y exponer PBP2'. Se deja pasar una solución neutralizante que contiene Tris-HCl 0,6 M a través del filtro y se aplica gota a gota un filtrado que contiene PBP2' a una tira de prueba inmunocromatográfica que comprende una membrana en la que se inmovilizan anticuerpos que capturan específicamente PBP2' y partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos. Por lo tanto, PBP2' puede detectarse en un corto período de tiempo.
Ejemplos
A continuación, la presente invención se describe con mayor detalle con referencia a los ejemplos, aunque el ámbito técnico de la presente invención no se limita a estos ejemplos.
Ejemplo 1: Preparación de tira de prueba inmunocromatográfica para la detección de PBP2'
(1) Preparación y secado de partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos
Los anticuerpos monoclonales anti-PBP2' se trataron con pepsina de acuerdo con una técnica convencional para obtener F(ab')2. El F(ab')2 obtenido se sensibilizó y se unió a partículas de látex con un diámetro de partícula de 0,4 |jm y el resultante se pulverizó sobre una tela de poliestireno no tejida. Posteriormente, el resultante se secó a presión reducida en un dispositivo reductor de presión durante 1 hora para obtener una almohadilla de anticuerpo de látex seco. En el momento de su uso, la almohadilla se cortó a intervalos de 4 mm y se usó como un sitio del reactivo marcado 2.
(2) Preparación de tira de prueba inmunocromatográfica para la detección de PBP2'
Los segundos anticuerpos monoclonales anti-PBP2' que reconocen el sitio que es diferente del sitio reconocido por los anticuerpos monoclonales anti-PBP2' usados para la sensibilización del látex se trataron con pepsina de acuerdo con una técnica convencional para obtener F(ab')2. El F(ab')2 obtenido se diluyó en un tampón de citrato (pH 6) que contiene CHAPS al 0,075 %, y el resultante se aplicó sobre una membrana de nitrocelulosa (es decir, un soporte de fase sólida 5), seguido de un secado completo (es decir, un sitio del reactivo de captura 3). Como reactivo de control, se aplicó IgG anti-ratón a una membrana de nitrocelulosa de la misma manera, y el resultante se secó completamente (es decir, un sitio de control 4).
Sobre una lámina hidrofóbica 7, se proporcionó un soporte de fase sólida 5 que comprendía el sitio del reactivo de captura 3 y el sitio de control 4, y se proporcionaron el sitio del reactivo marcado 2, fibra de vidrio como sitio de suministro de muestra 1 y un papel de filtro como sitio de absorción 6 en posiciones arbitrarias. Por tanto, se preparó una tira de prueba inmunocromatográfica para la detección de PBP2'.
La Figura 1 muestra la estructura de la tira de prueba inmunocromatográfica.
Ejemplo 2: Preparación del reactivo de extracción de PBP2'
Como una suspensión de muestra, se preparó una solución acuosa que contiene hidróxido de sodio 0,1 M y Triton X-100 al 1,0 %.
Como reactivo R1 (es decir, un reactivo de destrucción microbiana), se preparó una solución acuosa de hidróxido de sodio 0,2 M y Tx-100 al 1,5 %.
Como reactivo R2 (es decir, una solución de ajuste de filtrado), se preparó una solución acuosa de Tris-HCl 0,6 M (pH 6,0 ± 0,5).
La suspensión de muestra, el reactivo R1, y el reactivo R2 se denominan colectivamente "reactivo de extracción de PBP2'".
Ejemplo 3: Examen del tamaño del filtro de membrana
Una suspensión celular que contiene MRSA cultivada en el medio de agar sangre a una densidad ajustada a 1,0 x 108 células en solución salina fisiológica se designó como una muestra.
1) Muestra 1: Se preparó una suspensión de muestra 1 y la cantidad total de la misma se ajustó a 2 ml.
2) La cantidad total (2 ml) se filtró a través de un filtro de membrana hecho de acetato de celulosa con un diámetro de poro de 0,45 pm y un diámetro de 25 mm.
3) Se filtró el reactivo R1 (1.000 pl) a través del filtro de membrana de 2), se retuvo la solución en el filtro de membrana y se dejó reposar en ese estado durante 5 minutos.
4) Se filtró el reactivo R2 (400 pl) a través del filtro de membrana de 3) y se obtuvo el filtrado.
5) El resultante se añadió gota a gota al sitio de suministro de muestra sobre la PBP2' preparada en el Ejemplo 1, y la evaluación se realizó 10 minutos más tarde. Los resultados de la evaluación se muestran en la Tabla 1. El símbolo "++" indica un positivo relativamente fuerte y el símbolo"+++" indica un positivo fuerte.
Tabla 1
Figure imgf000008_0001
Los resultados mostrados en la Tabla 1 demuestran que la PBP2' de MRSA puede detectarse mediante el procedimiento de la presente invención con el uso de un filtro de membrana con un diámetro de poro de 0,22 a 1,2 pm. Se logran resultados particularmente satisfactorios con el uso de un filtro de membrana con un diámetro de poro de 0,22 a 0,45 pm.
Ejemplo 4: Examen del material del filtro de membrana
Una suspensión celular que contiene MRSA cultivada en el medio de agar sangre a una densidad ajustada a 1,0 x 108 células en solución salina fisiológica se designaron como una muestra.
1) Muestra 1: Se preparó una suspensión de muestra 1 y la cantidad total de la misma se ajustó a 2 ml.
2) La cantidad total (2 ml) se filtró a través de un filtro de membrana hecho de acetato de celulosa con un diámetro de poro de 0,45 pm y un diámetro de 25 mm.
3) Se filtró el reactivo R1 (1.000 pl) a través del filtro de membrana de 2), se retuvo la solución en el filtro de membrana y se dejó reposar en ese estado durante 5 minutos.
4) Se filtró el reactivo R2 (400 pl) a través del filtro de membrana de 3) y se obtuvo el filtrado.
5) El resultante se añadió gota a gota al sitio de suministro de muestra sobre la PBP2' preparada en el Ejemplo 1, y la evaluación se realizó 10 minutos más tarde. Los resultados de la evaluación se muestran en la Tabla 2. El símbolo "++" indica un positivo relativamente fuerte y el símbolo"+++" indica un positivo fuerte.
Tabla 2
Figure imgf000009_0001
Los resultados mostrados en la Tabla 2 demuestran que la PBP2' de MRSA puede detectarse mediante el procedimiento de la presente invención con el uso de cualquiera de las membranas del filtro 1 a 13.
Ejemplo 5: Examen de tensioactivo
Una suspensión celular que contiene MRSA cultivada en el medio de agar sangre a una densidad ajustada a 1,0 x 108 células en solución salina fisiológica se designó como una muestra.
1) Muestra 1: Se preparó una suspensión de muestra 1 y la cantidad total de la misma se ajustó a 2 ml.
2) La cantidad total (2 ml) se filtró a través de un filtro de membrana hecho de acetato de celulosa con un diámetro de poro de 0,45 pm y un diámetro de 25 mm.
3) Se filtró el reactivo R1 (1.000 pl) a través del filtro de membrana de 2), se retuvo la solución en el filtro de membrana y se dejó reposar en ese estado durante 5 minutos.
4) Se filtró el reactivo R2 (400 pl) a través del filtro de membrana de 3) y se obtuvo el filtrado.
5) El resultante se añadió gota a gota al sitio de suministro de muestra en la pieza de prueba de PBP2' preparada en el Ejemplo 1, y la evaluación se realizó 10 minutos más tarde. Los resultados de la evaluación se muestran en la Tabla 3. El símbolo "++" indica una positividad relativamente fuerte y el símbolo "+++" indica una positividad fuerte.
Tabla 3
Figure imgf000009_0002
Los resultados mostrados en la Tabla 3 demuestran que la PBP2' de MRSA puede detectarse mediante el procedimiento de la presente invención con el uso de cualquier tensioactivo.
Ejemplo 6: Experimento para comparar con la técnica convencional
La técnica de filtro de membrana de acuerdo con la presente invención se comparó con una técnica convencional de centrifugación en términos de reproducibilidad.
La muestra se preparó por dilución de las células de MRSA en un medio sanguíneo (sangre de caballo desfibrinada: medio líquido (1: 4)).
1. Centrifugación
1) Muestra 1: Se preparó una suspensión de muestra 3 y la cantidad total de la misma se ajustó a 2 ml.
2) Se llevó a cabo una centrifugación a 7.000 g y temperatura ambiente durante 5 minutos.
3) Se desechó el sobrenadante y se añadieron 200 pl de reactivo R1.
4) Esto se mezcló con el reactivo R2 (100 pl).
5) El resultante se añadió gota a gota al sitio de suministro de muestra en la pieza de prueba de PBP2' preparada en el Ejemplo 1, y la evaluación se realizó 10 minutos más tarde.
2. Técnica de filtro de membrana
1) Muestra 1: Se preparó una suspensión de muestra 1 y la cantidad total de la misma se ajustó a 2 ml.
2) La cantidad total (2 ml) se filtró a través de un filtro de membrana hecho de acetato de celulosa con un diámetro de poro de 0,45 pm y un diámetro de 25 mm.
3) Se filtró el reactivo R1 (1.000 pl) a través del filtro de membrana de 2), se retuvo la solución en el filtro de membrana y se dejó reposar en ese estado durante 5 minutos.
4) Se filtró el reactivo R2 (400 pl) a través del filtro de membrana de 3) y se recogió el filtrado.
5) El resultante se añadió gota a gota al sitio de suministro de muestra en la pieza de prueba de PBP2' preparada en el Ejemplo 1, y la evaluación se realizó 10 minutos más tarde.
La técnica de centrifugación y la técnica de filtro de membrana se realizaron 3 veces por los analistas A, B y C, y se comparó la reproducibilidad de los resultados de la evaluación. Los resultados de la evaluación se muestran en la Tabla 4. El símbolo "-" indica un negativo, el símbolo "+" indica un positivo, el símbolo "++" indica un positivo relativamente fuerte y el símbolo "+++" indica un positivo fuerte.
Tabla 4
Figure imgf000010_0001
Los resultados mostrados en la Tabla 4 demuestran que la reproducibilidad lograda por la técnica de filtro de membrana de la presente invención es superior a la lograda por una técnica de centrifugación convencional.
Aplicabilidad Industrial
De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, se pueden detectar enfermedades infecciosas provocadas por microorganismos patógenos y la presencia de microorganismos patógenos.
Descripción de referencias numéricas
1: Sitio de suministro de muestra
2: Sitio del reactivo marcado
3: Sitio del reactivo de captura (anticuerpo de captura)
4: Sitio del control
5: Soporte de fase sólida (membrana de nitrocelulosa)
6: Sitio de absorción (almohadilla absorbente)
7: Laminado superior o carcasa

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un procedimiento de detección de microorganismos que comprende un procedimiento para la recogida de antígenos de los microorganismos que comprende permitir que las muestras que contienen microorganismos pasen a través de un filtro de membrana con un diámetro de poro que no permite que los microorganismos pasen a través de este, en el que las muestras se suspenden en un líquido para la suspensión de muestra; capturar los microorganismos de las muestras en el filtro de membrana; permitir que un reactivo de destrucción microbiana capaz de destruir la membrana microbiana pase a través del filtro de membrana en el que se capturan los microorganismos para destruir los microorganismos capturados en el filtro de membrana; y recoger los antígenos en el filtrado, y ensayar los antígenos microbianos recogidos mediante una técnica de inmunoensayo, en la que el reactivo de destrucción microbiana es una solución alcalina, o una mezcla de un tensioactivo y una solución alcalina.
  2. 2 El procedimiento de detección de microorganismos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los microorganismos son bacterias.
  3. 3. El procedimiento de detección de microorganismos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la solución alcalina tiene un pH de 11 o superior.
  4. 4. El procedimiento de detección de microorganismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la solución alcalina es una solución de hidróxido de sodio.
    5 El procedimiento de detección de microorganismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la técnica de inmunoensayo es inmunocromatografía.
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