JP2012149896A

JP2012149896A - ブドウ球菌の抗原抽出方法

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Publication number: JP2012149896A
Application number: JP2011006659A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Hanaki; 秀明花木; Hidehito Matsui; 秀仁松井
Original assignee: KOOJIN BIO KK
Current assignee: KOOJIN BIO KK
Priority date: 2011-01-17
Filing date: 2011-01-17
Publication date: 2012-08-09

Abstract

【課題】アルカリ水溶液抽出よりも層効率よく、かつ各毒素も検出可能な多剤耐性ブドウ球菌の抗原を抽出する方法を提供すること。また、抽出して得られたタンパクを抗原として免疫反応で検出する方法を提供すること。
【解決手段】ブドウ球菌の抗原を酸性条件下で抽出する。抽出は界面活性剤の存在下に行うことが好ましい。抽出条件はｐＨ３以下、温度が室温から沸点条件下で、１５秒から６０分行うことが好ましい。
本発明により、ブドウ球菌の毒素、もしくはβ−ラクタム薬耐性を司るタンパク（ＰＢＰ２’）を迅速簡便に効率よく抽出することができる。また、毒素を検出することができる。本発明により、抽出された毒素やＰＢＰ２’を含むタンパクは抗原として抗原抗体反応を利用した免疫測定に利用できる。
【選択図】なし

Description

本発明は、ブドウ球菌の抗原抽出法に関する。

ブドウ球菌は基本的に化膿をおこす化膿菌であるが、同時に多くの毒素を産生する強毒菌でもある。これらの毒素であるｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎはＳＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」（デンカ生研株式会社）で、ｔｏｘｉｃｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍｅｔｏｘｉｎ−１（ＴＳＳＴ−１）はＴＳＴ−ＲＰＬＡ「生研」（同）で、ｅｘｏｆｏｌｉａｔｉｖｅｔｏｘｉｎはＥＸＴ−ＲＰＬＡ「生研」（同）で、液体培養での培養液上清が用いられて測定されているが、寒天培地に生育したコロニーからの検出はおこなわれていない。液体培養は寒天培地を使った菌株の単離培養後に実施されるため、液体培養法では２０時間程度の遅れが生じる。

近年、抗菌薬に対して抵抗性を有するブドウ球菌が問題となってきている。抗菌薬耐性ブドウ球菌のうち、β−ラクタム薬耐性に関与する遺伝子はｍｅｃ遺伝子であり、そのタンパクはｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＢＰ）２’である。このｍｅｃ遺伝子、もしくはＰＢＰ２’が検出されればｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ耐性株（ＭＲ株）として扱われ、検出されない株はｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ感性株（ＭＳ株）として扱われる。このＰＢＰ２’を保有するブドウ球菌はβ−ラクタム薬に耐性を有する。

現状の臨床現場で、この耐性を確認する方法は、従来法の抗菌薬感受性試験か、遺伝子そのものを核酸増幅法で検出する方法、さらにＰＢＰ２’自体を抗原抗体反応で検出するスライドラテックス凝集反応のＰＢＰ２’検出用キットＭＲＳＡ−ＬＡ「生研」（デンカ生研株式会社）による方法がある。これらの検出は寒天培地を使った菌株の単離培養時のコロニーを用いて行うことができる。特に、このＰＢＰ２’の検出法に関する重要性は特許文献１に詳細に述べられていると同時に、ＰＢＰ２’をアルカリ条件下で安定に感度良く抽出（アルカリ抽出法）でき、それを抗原としてスライドラテックス凝集法で検出できる事が記載されている。

特開平１０−７８３８２号公報

ブドウ球菌が抗菌薬耐性か否かを判定することは、医療現場において極めて重要である。前記特許文献１においては、多剤耐性ブドウ球菌の抗原をアルカリ水溶液で抽出し、免疫測定法により検出又は定量している。この方法は優れた方法ではあるものの、さらに一層効率よく抽出する方法が望まれている。また、この方法では、各毒素を検出することはできない。
従って、本発明の目的は、アルカリ水溶液抽出よりも効率よく、かつ各毒素も検出可能な多剤耐性ブドウ球菌の抗原を抽出する方法を提供することである。また、抽出して得られたタンパクを抗原として免疫反応で検出する方法を提供することである。

本発明者らは、鋭意研究の結果、酸性水溶液を抽出液として使用すること、さらに特定の界面活性剤を含有する酸性水溶液を抽出液として使用することで一層効率よく上記本発明の目的を達成できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下のとおりである。
１．ブドウ球菌の抗原を酸性条件下で抽出することから成る、ブドウ球菌抗原の抽出方法。
２．ブドウ球菌の抗原を界面活性剤含有の酸性条件下で抽出することから成る、ブドウ球菌抗原の抽出方法。
３．酸性条件がｐＨ３以下である前記１又は２記載の抽出方法。
４．抽出液を室温から沸点条件下で１５秒から６０分で抽出する前記１、２又は３の抽出方法。
５.前記１から４のいずれか１項で得られたタンパクを抗原として免疫反応で検出する方法。

本発明により、ブドウ球菌の毒素、もしくはβ−ラクタム薬耐性を司るタンパク（ＰＢＰ２’）を迅速簡便にアルカリ抽出法よりも効率よく抽出する方法を提供することができる。また、毒素を検出することができる。

本発明の方法においては、具体的には、ブドウ球菌の抗原をアレニウス酸、ブレンステッド酸、ルイス酸、無機酸等の化学的特徴を有する酸性の水溶液で抽出する。これらの酸を例示すれば、無機酸である塩酸、硝酸、過塩素酸、硫酸、ホウ酸、リン酸、フッ化水素酸等、さらに有機酸としてカルボキシル基、スルホ基、ヒドロキシル基、チオール基、エノール基を有す有機化合物等である。好ましくは塩酸、リン酸、硫酸、硝酸である。
抗原の抽出に使用する水溶液はｐＨ５．０以下で実施可能であるが、好ましくはｐＨ３．０以下が望ましい。さらにこの水溶液と菌液の混合物のｐＨが３．０以下であることが望ましい。また用いる酸の濃度は０．０1Ｍから１．０Ｍが好ましい。

抽出液は界面活性剤を含有していることが好ましい。界面活性剤としては、Ｂｒｉｊ５８，Ｂｒｉｊ３５，Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｗｅｅｎ４０，Ｔｗｅｅｎ６０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００，ＴｒｉｔｏｎＸ１１４，ＮＰ−４０，ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドなどの非イオン系界面活性剤、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムなどの陽イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム，デオキシコール酸ナトリウム，コール酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤、ＣＨＡＰＳ，ＣＨＡＰＳＯなどの両イオン性界面活性剤が例示できるが、界面活性作用を有す化合物であればいずれでも構わない。好ましい界面活性剤は、Ｂｒｉｊ５８，ＴｒｉｔｏｎＸ１００，Ｔｗｅｅｎ２０である。界面活性剤の濃度は、例えば０．００１〜５％、好ましくは０．０１〜０．５％である。
抗原の抽出温度は室温から１００℃が好ましく、抽出時間は１分から６０分が好ましい。

本発明による抽出の対象となる試料は、抗菌薬耐性ブドウ球菌抗原の存在の有無を判定する必要がある試料であれば特に制限はないが、本発明の目的に鑑みると、好ましくは寒天培地等の個体培地に生育したコロニーである。

本発明を実施するには、例えば、検体中に含まれる菌を寒天培地で培養し、得られた菌体を酸性条件下好ましくは界面活性剤含有の酸性条件下に懸濁して抗原を抽出する。
上記の方法で抽出された抗原、細胞壁合成酵素のＰＢＰ２’や毒素であるＴＳＳＴ−１やエンテロトキシンをそれぞれの抗体を用いて、既存の免疫測定方法であるラテックス凝集法、酵素免疫測定方法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロット法、Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法、イムノクロマト法等で検出や測定することが出来る。
免疫測定時には測定に適したｐＨに調整するために、適切なｐＨ緩衝液やアルカリ溶液を用いて中性近辺にｐＨを調整することが好ましい。

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、これらの実施例に限定されるものではない。

実施例１．ＥＬＩＳＡ法によるＰＢＰ２’の検出
（１）試験菌液の調整方法
血液寒天培地を用いて、ＭＲＳＡ７０，ＭＲＳＡ９２−１１９１、ＭＳＳＡＦＤＡ２０９Ｐ，ＭＳＳＡ臨床分離株Ｎｏ．６を３５℃で一晩培養した。得られた菌体を滅菌精製水に懸濁し、５７８ｎｍにおける濁度を２．０に調整した。ＭＳＳＡとＭＲＳＡの確認はＰＣＲ法によるｍｅｃ遺伝子の検出で行った。
（２）既存方法であるアルカリ加熱処理による抗原抽出
調製した菌懸濁液１００μＬと０．２ＭＮａＯＨ１００μＬを混合し、１００℃で３分間加熱処理を行った。室温にて１〜２分間放冷後、２．５％ＢＳＡを含む０．５ＭＫＨ_２ＰＯ_４５０μＬを加えて中和した。

（３）既存方法であるアルカリ室温処理による抗原抽出
（１）で調製した菌懸濁液１００μＬと０．４ＭＮａＯＨ１００μＬを混合し、室温で３分間放置した。その後、２．５％ＢＳＡを含む１ＭＫＨ_２ＰＯ_４５０μＬを加えて中和した。
（４）本発明である酸加熱処理による抗原抽出
（１）で調製した菌懸濁液１００μＬと０．０２％Ｂｒｉｊ５８を含む０．２ＭＨＣｌ１００μＬを混合し（ｐＨ１．１）、１００℃で３分間加熱処理を行った。室温にて１〜２分間放冷後、２．５％ＢＳＡを含む１ＭＫ_２ＨＰＯ_４５０μＬを加えて中和した。
（５）本発明である酸室温処理による抗原抽出
（１）で調製した菌懸濁液１００μＬと０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む０．２ＭＨＣｌ１００μＬを混合し（ｐＨ１．１）、室温で３分間放置した。その後、２．５％ＢＳＡを含む１ＭＫ_２ＨＰＯ_４５０μＬを加えて中和した。

（６）上記抽出法で得られたＰＢＰ２’抗原を用いたＥＬＩＳＡ法による測定
１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）で０．５μｇ／ｍＬに調製した、抗ＰＢＰ２’モノクローナル抗体１Ｇ１２を５０μＬずつ９６穴プレートに添加し、室温にて２時間穏やかに振盪（６００ｒ／ｍｉｎ）した。１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）で洗浄後、０．５％ブロックエース含有１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）を１００μＬずつ添加し、室温にて２時間穏やかに振盪することでブロッキングを行った。
続いて、０．２ＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄後、（２）〜（５）で調製した抗原抽出液を０．２ＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，１％ＢＳＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で８倍希釈した溶液を５０μＬずつ添加し、４℃で一晩反応させた。
翌日、同様に洗浄後、２５ｎｇ／ｍＬに調製したビオチン化抗ＰＢＰ２’モノクローナル抗体１０Ｇ２を５０μＬずつ添加し、室温にて１．５時間穏やかに振盪した。洗浄後、１万倍希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを５０μＬずつ添加し、室温にて１時間穏やかに振盪した。
洗浄後、テトラメチルベンジジン発色液を５０μＬずつ添加し、室温にて１０分間発色させたのち、１Ｍリン酸を５０μＬずつ添加することで発色を停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を表１に示す。

表１の結果より、従来法（特許文献１）のアルカリ処理よりも、本発明の酸性処理において、より高濃度にＰＢＰ２’が抽出されていることが確認された。まず、ＭＳＳＡの２株の吸光度を平均した値を用いてアルカリ加熱処理条件でのＭＲＳＡ７０の吸光度を割った場合は５．９２倍になり、ＭＲＳＡ９２−１１９１では６．０５倍になる。同様にアルカリ室温処理では８．８９倍と１５．４６倍になる。酸加熱処理では１８．１５倍と１９．９７倍に、さらに酸室温処理では７．８２倍と１６．５２倍にある。
つまり、室温処理では従来法であるアルカリ法でも本発明の酸法でも同等の抽出量であったが、酸加熱処理ではアルカリ加熱処理に比べて３倍以上の抽出量が確認された。これらの結果からＭＲＳＡのＰＢＰ２’抽出量は、アルカリ法と酸法が室温処理では同等であったが、加熱処理ではアルカリ処理法よりも酸加熱処理の方が３倍程度優れている結果であり、本法の酸処理法の優位性が証明されていた。

実施例２．イムノクロマトによるＰＢＰ２’の検出
（１）イムノクロマト測定検体の調製
血液寒天培地を用いて、ＭＲＳＡ７０，ＭＲＳＡ臨床分離株Ｎｏ．５９４、ＭＳＳＡＦＤＡ２０９Ｐ，ＭＳＳＡ臨床分離株Ｎｏ．８を３５℃で一晩培養した。得られた菌体を実施例１と同様の方法で処理し、得られた抗原抽出液及びその希釈液を測定検体とした。
（２）イムノクロマトによる測定
公知の方法（ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＶａｃｃｉｎｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｄｅｃ．Ａｃｃｅｐｔ，Ｍａｔｓｕｉｅｔａｌ．）にて作製されたＰＢＰ２’検出イムノクロマトを用いて、（１）で調製した測定検体１５０μＬを試験した。結果の判定は、室温で１０分放置後に目視にて行った。テストライン上に赤いラインが確認された場合を陽性（＋）、赤いラインが確認されなかった場合を陰性（−）とした。結果を表２に示す。

従来法であるアルカリ処理の加熱と室温処理の結果は同じだったので加熱処理の結果のみを記す。表２の結果より、アルカリ処理に比べて本発明の酸加熱処理は、ＰＢＰ２’産生量が多いＭＲＳＡ７０において１０倍の検出感度を示し、かつＰＢＰ２’産生量の少ないＭＲＳＡ臨床分離Ｎｏ．５９４は３０倍の検出感度を示した。結果として、何れの株に於いても酸加熱処理はアルカリ処理よりも優れていた。また、２株のＭＳＳＡに対しては両方法において陰性であり、高い特異性を示した。

実施例３．ラテックス凝集キットによる各種毒素の検出
（１）ラテックス凝集キット測定検体の調製
血液寒天培地を用いて、ＭＲＳＡ５０（ＴＳＳＴ−１産生株），ＭＲＳＡ臨床分離株Ｎｏ．６７０（エンテロトキシンＡ産生株）を３５℃で一晩培養した。得られた菌体を１μＬの定量白金耳で２白金耳採取し、２００μＬの滅菌精製水に懸濁した。
（２）中性条件下でのラテックス凝集キット測定検体の抽出調製
５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）５０μＬと菌懸濁液５０μＬを混合し、１００℃で３分間加熱処理を行った。室温にて１〜２分間放冷後、５０μＬの５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）を加え、遠心分離（３０００ｘｇ，５分）を行い、得られた上清を測定検体とした。

（３）アルカリ条件下でのラテックス凝集キット測定検体の調製
（１）で調製した菌懸濁液５０μＬと０．２ＭＮａＯＨ５０μＬを混合し、１００℃で３分間加熱処理を行った。室温にて１〜２分間放冷後、０．５ＭＫＨ_２ＰＯ_４５０μＬを加えて中和し、遠心分離（３０００ｘｇ，５分）で得られた上清を測定検体とした。
（４）酸性条件下でのラテックス凝集キット測定検体の調製
（１）で調製した菌懸濁液５０μＬと０．０２％Ｂｒｉｊ５８を含む０．２ＭＨＣｌ５０μＬを混合し、１００℃で３分間加熱処理を行った。室温にて１〜２分間放冷後、１ＭＫ_２ＨＰＯ_４５０μＬを加えて中和し、遠心分離（３０００ｘｇ，５分）で得られた上清を測定検体とした。
（４）ラテックス凝集キットによる毒素の検出
ＭＲＳＡ５０（ＴＳＳＴ−１産生株）を用いて（２）〜（４）で調製した測定検体からのＴＳＳＴ−１検出をＴＳＴ−ＲＰＬＡ「生研」（デンカ生研）を用いて行った。また、ＭＲＳＡ臨床分離株Ｎｏ．６７０（エンテロトキシンＡ産生株）を用いて（２）〜（４）で調製した測定検体からのエンテロトキシンＡ検出をＳＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」（デンカ生研）を用いて行った。操作方法は、各添付文書に従って行った。結果を表３に示す。

表３より、ＴＳＳＴ−１は、中性条件下は２倍希釈まで、アルカリ条件下では検出されず、酸性条件下では８倍希釈まで検出された。エンテロトキシンＡでは、中性条件下は４倍希釈、アルカリ条件下では検出されず、酸性条件下は１６倍希釈まで検出された。従来法であるアルカリ条件（特許文献１）では各毒素を検出することはできないが、本発明の酸性条件下では中性条件下よりもさらに４倍高い検出感度であった。

本発明により、抽出された毒素やＰＢＰ２’を含むタンパクは抗原として抗原抗体反応を利用した免疫測定に利用できる。

Claims

ブドウ球菌の抗原を酸性条件下で抽出することから成る、ブドウ球菌抗原の抽出方法。
ブドウ球菌の抗原を界面活性剤含有の酸性条件下で抽出することから成る、ブドウ球菌抗原の抽出方法。
酸性条件がｐＨ３以下である請求項１又は２記載の抽出方法。
抽出液を室温から沸点条件下で１５秒から６０分で抽出する請求項１、２又は３の抽出方法。
請求項１から４のいずれか１項で得られたタンパクを抗原として免疫反応で検出する方法。