KR20170130835A - 생체 분자 분석용 미소 입자 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 분자 분석용 미소 입자 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이러스 등과 같은 생체 분자를 정밀하게 분석하기 위한 미소 입자 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법에 관한 것이다.

Description

생체 분자 분석용 미소 입자 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법 {PARTICLE FOR BIOMOLECULES ANALYSIS AND METHOD FOR ANALYZING BIOMOLECULES USING THE SAME}

본 발명은 생체 분자 분석용 미소 입자 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이러스, 박테리아 등과 같은 생체 분자를 정밀하게 분석하기 위한 미소 입자 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법에 관한 것이다.

바이러스, 박테리아 등과 같은 생체 분자를 신속하고 정확하게 분석하는 것은 사회 전반의 의료 및 보건 측면에서 매우 중요하다.

종래 바이러스 등과 같은 생체 분자의 유무 및 그 양을 판단하는 방법으로는 주로 고압 액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography, HPLC), 액체 크로마토그래피 질량분석법(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS), 모세관 전기 영동(capillary electrophoresis), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 등과 같은 다양한 생체 분자 분석 장치 및 분석 방법이 개발되었다. 그러나, ELISA 등의 경우 신속한 분석을 제공하지만, 복잡한 실험 과정 및 정량화에 대한 상대적으로 낮은 감도의 단점을 보이며, HPLC와 LC-MS가 현재 고해상도의 가장 민감한 분석 기술이지만, 많은 시간이 소요되는 방법으로, 정교한 작동 및 전처리를 필요로 한다.

최근에는 바이러스 등과 같은 생체 분자를 분자생물학적 접근으로서 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 진단 연구가 활발히 되고 있다. 그러나 PCR의 경우에는 많은 시간이 소요되고, 여러 가지 바이러스 등을 동시에 검출하는 다중검출에서는 특이성, 민감도 등의 측면에서 여러 가지 문제점을 가지고 있다.

따라서, 우수한 진단 정확도 및 신뢰도를 위해 높은 감도를 가지면서 짧은 시간 내에 생체 분자를 검출할 수 있는 간편한 방법이 여전히 요구되고 있다.

본 발명은, 상기 종래 기술의 문제를 해결하기 위하여 안출된 것으로서,

다양한 생체 분자를 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 생체 분자 분석용 미소 입자 및 이를 이용한 생체 분자의 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 달성하기 위해 본 발명은,

자성물질 및 상기 자성물질 내부에 도핑된 금속물질을 포함하는 코어부;

상기 코어부 상에 형성된 실리카 코팅층; 및

상기 실리카 코팅층 상에 형성된, 표적 생체 분자와 결합하는 결합수단을 포함하는 생체 분자 분석용 미소 입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 생체 분자 분석용 미소 입자를 이용한 생체 분자 분석 방법으로서,

1) 표적 생체 분자와 결합하는 결합수단을 포함하는 미소 입자를 준비하는 단계;

2) 상기 미소 입자와 상기 표적 생체 분자를 혼합하는 단계;

3) 상기 생체 분자와 결합하거나, 결합하지 않는 미소 입자를 자성을 이용하여 분리하는 단계; 및

4) 상기 생체 분자와 결합한 미소 입자만을 취득하고, ICP-MS로 분석하여 상기 표적 생체 분자의 양을 측정하는 단계를 포함하는 생체 분자 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 생체 분자 분석용 미소 입자는 자성물질 내부에 금속물질을 포함하는 구조를 가지므로 보다 우수한 검출 민감도, 정확도를 가질 뿐만 아니라, 표적 생체 분자 분리의 정확성 및 분리 효율이 우수하고, 탁월한 검정곡선의 직선성 향상의 효과가 있으므로, 보다 정확한 생체 분자의 분석을 가능하게 할 수 있다.

또한, 본 발명의 미소 입자 코어부에 포함되는 금속물질의 양을 측정함으로써, 간단하고 신속하게 표적 생체 분자의 정량 분석이 가능하고, 금속물질 종류에 따른 다양한 종류의 생체 분자 분석이 가능하며, 비용상의 효율성 증대, 분석 공정상의 편리함 증대 효과가 있다.

도 1은 일례로서 본 발명에 따른 미소 입자를 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 생체 분자 분석용 미소 입자를 이용하여 생체 분자를 분석하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 세슘이 도핑된 코어부 상에 실리카 코팅층이 형성된 SEM 사진(a), 실리카 코팅층 상에 결합수단으로 아민기가 형성된 세슘 도핑된 미소 입자의 SEM 사진(b) 및 TEM 사진(c)이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 생체 분자라 함은 바이러스 또는 박테리아 등일 수 있다.

상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), 웨스트나일바이러스, SARS-코로나바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 등과 같이 RNA 게놈을 갖는 RNA 바이러스 또는 단순포진바이러스(HSV), 거대세포바이러스(CMV), 수두대상포진바이러스(VZV), B형 간염 바이러스(HBV) 등과 같은 DNA 게놈을 갖는 DNA 바이러스일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 박테리아는 그람-음성균(Gram negative) 또는 그람-양성균(Gram-positive)일 수 있으며, 보다 상세하게는 장티푸스균(salmonella typhimurium), 대장균(E coli) 등일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

미소 입자

본 발명의 미소 입자는,

자성물질 및 상기 자성물질 내부에 도핑된 금속물질을 포함하는 코어부; 상기 코어부 상에 형성된 실리카 코팅층을 포함하며, 상기 실리카 코팅층 상에, 표적 생체 분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합수단이 형성되어 있다.

또한, 상기 코어부는 필요에 따라 실리카 코어(silica core)입자를 포함할 수 있다. 상기 실리카 코어입자는 비드 형상의 입자일 수 있으며, 코어부에 포함되어 생성되는 미소 입자의 크기를 적절하게 조절하는 역할을 한다.

일례로서, 상기 코어부는 다중 비드 형상으로 구성될 수 있는데, 예를 들어, 하나의 생체 분자 분석용 미소 입자의 코어부는 하나 이상의 비드를 포함하는 형상일 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 하나의 생체 분자 분석용 미소 입자에서 코어부는 분산된 복수의 자기 비드 및 실리카 코어입자를 포함하여 전체가 다중의 비드 입자를 포함하는 형상을 가질 수도 있다.

상기에서 자기 비드라 함은, 금속물질이 내부에 도핑되어 있는 자성물질을 지칭할 수 있다.

상기 코어부는, 그 직경이 바람직하게는 100 내지 120 nm인 것이 구조적으로 바람직한 측면이 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 코어부는, 도 1에 도시된 바와 같이 금속물질을 포함하는 자성물질 및 실리카 코어입자를 1종 이상 포함할 수 있으며, 본 발명의 예시적인 실시예에서, 알칼리 공침법(alkaline co-precipitation)을 이용하여 제조할 수 있다. 특히 이때 같이 넣어 주는 실리카 코어입자는 미소 입자의 크기를 조절하는데 유용하게 사용될 수 있다.

상술한 바와 같이, 상기 미소 입자의 코어부는 자성물질(magnetic particle, MP) 및 금속물질을 포함하며, 상기 금속물질은 자성물질 내부에 도핑(doping)되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 금속물질이 자성물질 내부에 도핑되어 있을 경우 목표 물질을 포집하는 효율이 보다 우수해지는 효과가 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 미소 입자 코어부의 자성물질은 내부에 금속물질이 도핑된 구조인데, 이러한 구조상의 특성으로 인해 미소 입자 서로 간의 응집이 발생하지 않아, 자성으로 분리 시 표적 분자와 결합한 입자와 결합하지 않은 입자를 분리함에 있어 분리 정확성 및 분리 효율을 높여줄 수 있다.

본원발명의 미소 입자는 금속물질을 포함하므로, 분광분석기로서 예를 들어, 유도결합플라즈마 질량분석기(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS) 등에 의해 그 존부 및 존재량이 확인될 수 있다. 따라서, 본 발명의 미소 입자에 포함되는 결합수단이 표적 생체 분자와 결합하는 경우, ICP-MS를 이용한 간단한 분석만으로 상기 생체 분자의 존재량을 용이하게 분석할 수 있다.

즉, 본 발명은, 생체 분자의 존재량 분석에 광학적인 측정 방법을 이용함으로써 형광물질, 발광 물질 등의 광학 발현 물질 등이 필수적으로 요구되고 이를 분석하기 위한 기기가 필요한 종래 기술의 번거로움을 해결하는 효과를 제공할 수 있다.

다시 말해, 본 발명의 미소 입자는 자성물질 내부에 금속물질을 포함하므로 표적 생체 분자 분석의 정확성, 분리의 효율성을 가질 뿐 아니라, 복잡한 공정 없이 ICP-MS 만으로 그 존부 및 존재량을 확인할 수 있어 간편성을 제공한다. 특히, ICP-MS는 검출 민감도가 매우 높은 장치이므로, 금속물질을 포함하는 입자의 존재량을 측정할 때 ICP-MS를 이용하는 경우, 검출 속도 및 민감도를 모두 향상시킬 수 있다.

여기서, 상기 금속물질로는 다양한 금속이 적용될 수 있고, 각 금속이 보유하는 고유한 동위원소질량이 검출에 활용될 수 있다. 특히 이 동위원소 측정 방법은 제조된 미소 입자와 ICP-MS가 결합하여 다중측정기술 및 독창적이고 우수한 정량성과 측정의 신뢰성을 부여할 수 있다.

상기 금속물질로는 주기율표상의 모든 금속이 이용될 수 있으며, 이러한 금속의 산화물을 이용하는 것도 가능하다.

상기 금속물질의 구체적인 예로서, 란타넘, 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 프로메튬, 사마륨, 유로퓸, 가돌리늄, 터븀, 디스프로슘, 홀뮴, 어븀, 툴륨, 이터븀, 루테튬, 티타늄, 알루미늄, 구리, 망간, 셀레늄, 아연, 안티몬, 비소, 붕소, 나트륨, 칼슘, 크롬, 리튬, 마그네슘, 수은, 이트륨, 몰리브덴, 비스무트, 금, 백금, 은, 스트론튬, 주석, 우라늄, 란타노이드, 세슘, 납, 카드뮴 또는 이들의 산화물로부터 선택되는 1종 이상을 들 수 있다.

상기 금속물질로 세슘, 유로퓸, 가돌리늄 및 란타넘으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하는 것이 측정간섭을 제거하는 측면에서 보다 바람직할 수 있다.

상기 금속물질의 종류는 분석하고자 하는 생체 분자의 종류에 따라 적절하게 변경하여 사용하는 것이 가능하다. 상기 금속물질의 종류가 달라지는 경우, 결합수단을 통해 결합할 수 있는 표적 생체 분자가 상이해지므로, 이를 통해 목표하는 생체 분자를 검출하는 것이 가능하다.

즉, 본원발명의 미소 입자 제조 시에 동일한 제조 방법을 사용하되, 금속물질의 종류만을 변경하면 제조 공정의 변경 없이 다양한 생체 분자를 검출 가능하므로, 본원발명의 미소 입자는 다중 검출(multiplex detection)에 적용하기에 매우 유리하다는 효과를 제공한다.

상기 금속물질의 직경은 바람직하게는 10 내지 30 nm일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 미소 입자에 포함된 금속물질은 자성물질 내부에 도핑되어 있는 것을 특징으로 하는데, 상기 자성물질이란 수 내지 수십 나노미터 직경의 비드 형상으로 이루어질 수 있으며, 외부 자력에 의해 유동하는 성질을 갖는 물질을 의미할 수 있다. 상기 자성물질은 바람직하게는 70 nm 이하의 직경을 가질 수 있으며, 철, 코발트, 니켈 및 이들의 산화물이 사용될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 자성물질은, 미소 입자와 상보적으로 결합된 생체 분자의 결합체의 분리를 위한 것일 수 있다. 즉, 자성물질이 가지고 있는 자성을 이용함으로써, 미소 입자와 상보적으로 결합된 생체 분자의 결합체를 농축시켜 이를 분리, 검출하여 생체 분자를 분석할 수 있다. 여기서, 농축의 의미는 주변의 다른 물질들을 제외하고 표적 물질만을 포집, 분리한다는 의미이다.

즉, 본 발명의 미소 입자는 생체 분자와 반응 후 코어부에 포함된 자성물질을 이용해 외부자력으로 분리할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석용 미소 입자는, 상기 코어부를 코팅하는 실리카 코팅층을 포함한다. 실리카 코팅층은 역 마이크로에멀젼(reverse microemulsion) 방법으로 형성될 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

또한 실리카 코팅층은, 금속물질이 도핑된 자성물질을 복수개 커버하도록 형성될 수 있다. 즉, 본 발명에서 하나의 미소 입자는 다수개의 금속물질 및 다수개의 자성물질을 포함할 수 있으며, 이때 상기 코어부에 포함되는 금속물질로서, 금속 원소 약 1.0X 10³ 내지 5.0X 10⁴개를 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1.70 X 10⁴ 내지 5.0 X 10⁴ 개를 포함할 수 있다. 금속 원소의 개수가 상기한 범위 이내일 경우, 분리 및 검출 민감도가 보다 우수하며, 금속성과 자성이 적절하게 유지될 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 미소 입자가 복수 개의 자기 비드를 포함하는 미소 입자인 경우, ICP-MS에 의한 검출 민감도가 대폭 향상될 수 있어 보다 정확한 분석이 가능하므로 바람직할 수 있다. 또한, 단일비드를 ??하는 미소 입자에 비해 보다 무거운 중량을 가지므로, 자성을 통한 분리 시에 분리 속도가 빨라지는 장점이 있다.

만약 미소 입자의 사이즈나 중량이 지나치게 작을 경우, 자성물질(magnet)에 의한 이동이 발생하지 않으므로 분리가 어려울 수 있다. 반면, 지나치게 많은 자기 비드를 포함하여 미소 입자의 중량이 지나치게 커질 경우, high background 문제가 발생할 수 있다.

상기 실리카 코팅층은 투명한 물질로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 실리카 코팅층은 실리카로 이루어질 수 있다. 금속물질이 도핑된 자성물질이 실리카 코팅층에 의해 커버되어 있으므로, 미소 입자 내 금속물질 및 자성물질이 다양한 외부 요인들로부터 보호될 수 있고, 따라서 자성물질의 자성 유지능이 우수할 수 있다. 예를 들어, 자성물질 표면에 이물질 등이 부착되어 자성이 감소하는 경우, 본 발명의 미소 입자를 이용하여 생체 분자 분석 시 측정 민감도 감소 등의 문제가 발생할 수 있는데, 상기 실리카 코팅층을 이용하여 이를 방지할 수 있으므로 바람직하다.

앞서 언급한 바와 같이, 미소 입자에는 금속물질이 도핑된 자성물질이 한 개 이상 포함될 수 있으므로, 상기 자성물질을 각각 별도로 취급하는 것은 공정상 매우 번거로울 수 있다. 따라서, 미소 입자에 포함될 수 있는 다양한 종류의 자성물질을 일정한 조성을 가지는 실리카 코팅층으로 코팅하면, 미소 입자의 표면이 일정해지므로 미소 입자를 취급하기 용이해질 수 있다.

또한, 앞서 언급한 바와 같이, 본원발명의 미소 입자는 금속물질이 도핑된 자성물질 및 실리카 코어입자를 하나 이상 포함할 수 있으므로, 상기 자성물질 및 실리카 코어입자를 실리카 코팅층으로 코팅하여 취급의 용이성을 부여하는 것도 가능하다.

상기 자성물질 및/또는 실리카 코어입자에 실리카 코팅층을 코팅하는 방법으로는 역 마이크로에멀젼(reverse microemulsion) 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상술한 코어부가 포함된 물, 도큐세이트 나튜륨염 및 헵탄을 혼합하여 용액을 형성하고 이를 섞어주는 공정을 포함하여 실리카 코팅층을 형성할 수 있다.

본 발명의 미소 입자의 실리카 코팅층 상에는 표적 생체 분자와 결합하는 적어도 하나의 결합수단을 포함한다. 상기 결합수단은 실리카 코팅층과 화학적 결합으로 연결되어 있을 수 있다. 실리카 코팅층 상에 결합수단이 형성되어 있는 형상은, 하나의 비드 형상에서 돌기부가 돌출된 형태일 수 있다.

미소 입자에 포함되는 코어부 등을 일정한 조성을 갖는 실리카 코팅층으로 코팅하면, 실리카 코팅층 상에 결합수단을 형성하는 공정은 통일이 가능하므로, 미소 입자 제조 공정의 단순화 측면에서도 유리할 수 있다.

상기 결합수단으로는 구체적으로 알데하이드기, 에테르기, 에스터기, 케톤기, 설파이드기, 티올기, 아릴기, 아민기, 카르복실기, 및 히드록시기 등으로부터 적어도 하나의 작용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는 일반적인 생체 분자와 결합 구조를 형성할 수 있는 작용기인 아민기(-NH₂), 카르복실기(-COOH) 및 히드록시기(-OH)로부터 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 이 경우 COOH, NH₂ 작용기를 갖는 생체 분자와 아마이드 결합 또는 에스테르 결합 등을 통하여 결합할 수 있다. 즉, 상기 결합수단으로, 표적 생체 분자와 비특이적으로 결합하는 상이한 2개 이상의 결합 수단을 포함할 수도 있다.

또한, 상기 결합수단으로 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 것을 사용할 수도 있으며, 특별히 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 표적 생체 분자를 항원으로 인식하는, 항원에 대한 항체 또는 유전자의 상보적 결합 등을 들 수 있다.

상기 결합수단은 표적 생체 분자와 직접 결합할 수도 있으며, 상기 결합수단과 결합하는 다른 결합수단을 이용하여 간접적으로 결합할 수도 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일례로서, 상기 결합수단은, 상기 알데하이드기, 에테르기, 에스터기, 케톤기, 설파이드기, 티올기, 아릴기, 아민기, 카르복실기 및 히드록시기로부터 선택되는 1종 이상의 작용기와 결합된, 표적 생체 분자를 항원으로 인식하는 항체일 수 있다.

본 발명의 일시예로서, 미소 입자의 평균직경은 바람직하게는 100 내지 300 nm이며, 보다 바람직하게는 160 내지 240 nm일 수 있다. 미소 입자의 평균직경이 100 nm 미만인 경우 목표물(표적 생체 분자와 결합한 미소 입자)을 모으는 효율에 문제가 있으며, 300 nm를 초과하는 경우 입자 분산의 문제가 발생할 수 있으므로 바람직하지 않다.

또한, 본 발명은

본 발명의 생체 분자 분석용 미소 입자를 이용한 생체 분자 분석 방법으로서,

1) 표적 생체 분자와 결합하는 결합수단을 포함하는 미소 입자를 준비하는 단계;

2) 상기 미소 입자와 상기 표적 생체 분자를 혼합하는 단계;

3) 상기 생체 분자와 결합하거나, 결합하지 않는 미소 입자를 자성을 이용하여 분리하는 단계;

4) 상기 표적 생체 분자와 결합한 미소 입자만을 취득하고, ICP-MS로 분석하여 상기 표적 생체 분자의 양을 측정하는 단계를 포함하는 생체 분자 분석 방법을 제공한다.

일 실시예에 따른, 본 발명의 생체 분자 분석용 미소 입자를 이용한 생체 분자 분석 방법을 개략적으로 설명하면,

먼저, 분석 대상이 되는 표적 생체 분자와 결합할 수 있는 결합수단을 포함하는 미소 입자를 생체 시료에 투입하여 이를 혼합한다. 이때, 상기 미소 입자가 모든 생체 분자와 결합할 수 있도록 과량의 미소 입자를 생체 시료에 투입하는 것이 바람직할 수 있다. 이를 통해 표적 생체 분자가 미소 입자와 특이적 또는 비특이적 결합을 할 수 있도록 한다.

그 후, 자기장을 발생시키는 장치, 예를 들어 영구 자석(permanent magnet) 등의 외부 자력을 통해, 표적 생체 분자와 결합한 미소 입자와, 결합하지 않은 미소 입자를 분리한다.

상기 2) 단계 또는 3) 단계에서, 미소 입자와 표적 생체 분자를 혼합하고, 외부 자력을 이용하여 표적 생체 분자와 결합한 미소 입자와, 결합하지 않은 미소 입자를 분리하는 방법은 본 발명의 일실시예를 들어 보다 상세히 설명할 수 있으나, 자력(磁力)을 이용하여 분리하는 방법의 원리는 당해 분야의 통상적인 방법인 것으로 이해할 수 있다.

본 발명의 미소 입자를 이용하여 표적 생체 분자를 분리, 검출 및 분석하기 위해, 표적 생체 분자 및 이와 결합 가능한 미소 입자를 혼합하고 상온에서 교반하여 혼합물을 준비한다.

상기 혼합물을 마이크로 파이펫팁에 넣어준 뒤, 표적 생체 분자와 결합한 미소 입자와, 결합하지 않은 미소 입자를 영구자석 등의 외부자력(磁力)을 이용하여 분리하고, 생체 분자와 결합한 미소 입자만을 포집할 수 있다. 이때, 파이펫팁에 적절한 용매를 같이 첨가할 수 있는데, 용매의 밀도, 입자의 중량, 자석의 자력 및 부력(buoyancy) 등의 조건을 분리에 적절하도록 고려하여 분리 효율성을 높일 수 있다. 상기 용매로는 본 발명의 일례로서 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 고분자 용매를 사용할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 혼합물이 담겨있는 파이펫팁의 아래에 일례로서 영구자석 등의 외부 자력을 위치시켜, 생체 분자와 결합한 미소 입자만을 팁의 아래쪽으로 포집한다. 이때, 생체 분자와 결합하지 않은 미소 입자의 경우, 그 부력이 자석의 자력보다 크므로 용매 위쪽에 위치하게 되므로 분리가 가능하다.

상기 외부자력과 파이펫팁의 거리는, 본 발명의 일실시예로서 약 0.5 cm의 거리상에 위치하는 것이 바람직할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명의 일실시예로서 자석으로부터의 자속밀도(magnetic flux density)가 1 내지 1.3 테슬라(tesla, T) 수준, 보다 바람직하게는 약 1.1 테슬라(T)인 것이 보다 바람직할 수 있다.

상기한 방법으로 파이펫팁의 아래에서 표적 생체 분자와 결합한 미소 입자만을 포집하여 이를 수득할 수 있고, 특히, 이러한 분리 시의 정확성 및 효율성 증대는, 본 발명의 미소 입자가 자성물질 내부에 금속물질이 도핑된 구조인 것에서 유도되는 것일 수 있다.

상기에서 수득한 입자는 ICP-MS로 분석함으로써 단시간 내에 표적 생체 분자의 양을 측정할 수 있다. 종래, PCR 등을 이용한 분석에 소요되는 시간 등을 고려하였을 때, 시간의 효율성이 현저히 증가하는 것을 알 수 있다.

또한, 이러한 일련의 과정에서, 형광물질 분리 등의 공정이 필요하지 않아 공정의 간소화가 가능할 뿐만 아니라, 파이펫팁에 분석하고자 하는 물질을 넣고 대상 물질만을 모아 ICP-MS로 즉시 분석 가능하므로, 분석에 필요한 소요 시간이 감소하고, 그 분석의 정확도, 민감도가 우수하여 신뢰성 향상의 효과가 있다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실험예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 제조예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 제조예, 실험예에 의해 한정되지 않으며, 다양하게 수정 및 변경될 수 있다. 본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해질 것이다.

< 제조예 >

제조예 1. 세슘(Cs)이 도핑된 자성물질을 포함하는 미소 입자의 제조

세슘(Cs)이 도핑된 자기물질을 포함하는 미소 입자는 수정된 알칼리 공침법(modified alkaline co-precipitation)을 이용하여 제조하였다.

불활성 조건인 아르곤(Ar) 가스하에서, CsCl(300 mg)을 25 mL의 탈이온수(deionized water)에 녹이고, FeCl₃6H₂O 및 FeCl₂4H₂O과 혼합(혼합비는 2.7: 1의 중량비) 하여 80℃에서 가열하였다. 그 뒤에 12.5 mL의 수산화 암모늄(ammonium hydroxide)과 반응시켰다.

색이 어두워지면(turning into black), 이 반응 용액을 20분간 더 가열하며 반응시켰다. 형성된 다중 코어부는 탈이온수와 에탄올을 번갈아가며 세 차례 워시(wash)한 뒤 에탄올에 보관하였다.

상기 다중 코어부를 이용한 다중코어 미소 입자(multicore nanoparticle)는 물-헵탄 시스템(water-heptane system)을 이용한 역 마이크로에멀젼(reverse microemulsion) 방법을 통한 실란화 반응(silanization)을 통해 제조하였다.

이를 위해, 860 μL 물 속에 포함된 세슘이 도핑된 자성물질을 포함하는 코어부(10mg)는, 헵탄(48 mL) 및 도큐세이트 나튜륨염(docusate sodium) 2.2 g과 혼합하여 30 분간 반응시켰다.

이때, 20 μL APTEOS(((3-Aminopropyl) triethoxysilane, >98%, Sigma-Aldrich Chem. Co., USA))와 3mL의 에탄올에 포함된 4 mg FITC(Fluorescein isothiocyanate isomer I, >90%, Sigma-Aldrich Chem. Co., USA)의 반응을 통해 제조된 실리카 코어 용액 약 300 μL를 더 첨가하였다.

그리고 나서, 430 μL 테트라에틸 오쏘실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS)와 260 μL 암모니아를 넣고 암실에서 24시간 동안 교반하였다. 아민화를 위해, 준비된 10 mL 에탄올에 포함된 150 mg의 세슘 도핑된 다중코어부는 1 mL의 APTMS((3-Aminopropyl)trimethoxysilane)와 3 시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 에탄올로 세 차례 워시하였다. 이러한 제조방법의 개략적인 scheme을 도 1에 나타내었다.

상기한 방법을 통하여, 결합수단으로 아민기가 도입된 다중코어 미소 입자를 수득하였다.

제조예 2. 미소 입자상에 1차 항체 고정

상기 제조예 1에서 제조된 미소 입자를 장티푸스균(Salmonella typhi)의 항체와 반응시켜, 미소 입자 상의 아민기와 항체 상의 카르복시기가 반응하는 아마이드 결합(amide bond)을 통해 미소 입자 상에 1차 항체(ab8274)를 고정하였다.

이를 위해, 30분 동안의 소니피케이션(sonification)을 통해 2.12 mg 다중 미소 입자를 1 mL의 Phosphate buffered Saline (PBS) 용액에 용해하였다. 그리고 나서, 3.7 mg의 EDC(N-3-dimethyl amino propyl)-N-ethyl carbodiimmide hydrochloride, 99%, Sigma Aldrich)와 2.52 mg의 NHS(Nhydroxy succinimide, 98%, Sigma Aldrich)를 추가한 혼합물을 10μL의 항체와 1 시간 동안 반응하였다.

과량의 아민기는 500 μL PBS에 용해된 3.3 mg BSA(Bovine serum albumin)를 통해 차단(inhibited)하였다.

그 뒤, 1차 항체가 결합된 미소 입자는 PBS 용액으로 세 차례 워시(wash)하고, 1 mL의 PBS 용액에 보관하였다.

< 실험예 > 장티푸스균(Salmonella typhi )의 자기영동 분리 (Magnetophoretic separation)

5 μL의 장티푸스균(Salmonella typhi)을 첨가한 1 mL의 Phosphate buffered Saline(PBS) 용액에, 50 μL의 상기 제조예 2의 미소 입자를 첨가하고 1 시간 동안 상온에서 교반하여 혼합물을 제조하였다.

분리를 위해, 상기 혼합물 50 μL 파이펫팁(pipet tip)에 넣고(pipetted), 여기에 80 μL의 폴리에틸렌글리콜(25%, wt/wt)을 차례로 첨가하였다. 그리고 나서, 장티푸스균이 결합한 미소 입자를 분리, 포집하여 추출하기 위해, 상기 파이펫팁과 0.5 cm 거리의 아래에 영구자석(permanent magnet)을 위치시켰다.

상기 파이펫팁 아래쪽에 모인 약 30 μL의 용액을 모으고, 1% HF 및 2% HNO₃ 혼합물 1mL에 용해하였다. 이후, 정량을 위해 10 μL 루프(loop)를 포함하는 플로우 인젝터(flow injector, (Analytical injector 9010, Rheodyne, USA))를 통하여 ICP-MS(Perkin-Elmer, DRC-e, USA)에 도입하였다. 이때 실시한 분석 조건은 하기 표 1에 기재하였다.

장티푸스균의 분리를 위한 실험 방법은 도 2에 간단히 나타내었다.

샘플 내의 장티푸스균은 미소 입자 상의 항체와 반응한다. 그리고 나서, 장티푸스균과 결합한 미소 입자의 복합체는 외부 자력에 의해 마이크로 파이펫팁의 바닥으로 포집된다. 반면, 장티푸스균과 반응하지 않은 미소 입자는 파이펫팁의 상부에 남아있게 된다.

이후, 파이펫팁의 바닥으로 결합한 미소 입자만을 수득하여, 이를 ICP-MS를 이용하여 분석함으로써, 생체 분자의 일례로서 장티푸스균을 분석할 수 있다.

즉, 본 발명의 미소 입자는 자기영동 분리 및 ICP-MS를 이용한 검출에 모두 적용 가능하므로, 보다 간편하고 용이하게 원하는 생체 분자의 검출 및 분석이 가능하다.

이상 살핀 바와 같이, 본 발명에 따른 미소 입자 및 이를 이용하는 분석 방법을 적용하는 경우, 박테리아, 바이러스 등과 같은 생체 분자를 검출한계 약 100 셀/mL 단위 수준에서 시료전처리나 증폭 없이 측정이 가능하도록 해준다. 또한, 빠르고, 간편하고 경제적일 뿐만 아니라 우수한 진단 정확도 및 신뢰도를 바탕으로 생물학적 샘플 내 다양한 형태의 생체 분자 분석에 광범위하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.

특히, 본 발명의 미소 입자는 포함되는 금속물질의 종류 변경에 따라 다양한 생체 분자 분석에 적용이 가능하므로, 다중 검출(multiplex detection)이 용이하다는 의의 또한 가진다.

Claims (14)

1. 자성물질 및 상기 자성물질 내부에 도핑된 금속물질을 포함하는 코어부;
   상기 코어부 상에 형성된 실리카 코팅층; 및
   상기 실리카 코팅층 상에 형성된, 표적 생체 분자와 결합하는 결합수단을 포함하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 코어부는 실리카 코어입자 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 자성물질은 철, 코발트, 니켈 및 이들의 산화물로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 금속물질은 란타넘, 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 프로메튬, 사마륨, 유로퓸, 가돌리늄, 터븀, 디스프로슘, 홀뮴, 어븀, 툴륨, 이터븀, 루테튬, 티타늄, 알루미늄, 구리, 망간, 셀레늄, 아연, 안티몬, 비소, 붕소, 나트륨, 칼슘, 크롬, 리튬, 마그네슘, 수은, 이트륨, 몰리브덴, 비스무트, 금, 백금, 은, 스트론튬, 주석, 우라늄, 란타노이드, 세슘, 납, 카드뮴 또는 이들의 산화물로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 결합수단은 알데하이드기, 에테르기, 에스터기, 케톤기, 설파이드기, 티올기, 아릴기, 아민기, 카르복실기, 히드록시기 및 표적 생체 분자를 항원으로 인식하는 항체로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
6. 청구항 5에 있어서,
   상기 결합수단은, 상기 알데하이드기, 에테르기, 에스터기, 케톤기, 설파이드기, 티올기, 아릴기, 아민기, 카르복실기 및 히드록시기로부터 선택되는 1종 이상과 결합된, 표적 생체 분자를 항원으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 결합수단은 표적 생체 분자를 항원으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 표적 생체 분자는 바이러스 또는 박테리아인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 표적 생체 분자는 장티푸스균(Salmonella typhi)인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
10. 청구항 1에 있어서,
    상기 미소 입자의 평균 직경은 100 내지 300nm인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
11. 청구항 1에 있어서,
    상기 금속물질은 단위 미소 입자당 1.0X 10³ 개 내지 5.0X 10⁴개가 포함되는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석용 미소 입자.
12. 청구항 1의 생체 분자 분석용 미소 입자를 이용한 생체 분자 분석 방법으로서,
    1) 표적 생체 분자와 결합하는 결합수단을 포함하는 미소 입자를 준비하는 단계;
    2) 상기 미소 입자와 상기 표적 생체 분자를 혼합하는 단계;
    3) 상기 생체 분자와 결합하거나, 결합하지 않는 미소 입자를 자성을 이용하여 분리하는 단계;
    4) 상기 표적 생체 분자와 결합한 미소 입자만을 취득하고, ICP-MS로 분석하여 상기 표적 생체 분자의 양을 측정하는 단계를 포함하는 생체 분자 분석 방법.
13. 청구항 12에 있어서,
    상기 3) 단계의 자성을 이용하여 분리하는 단계는, 외부 자력을 가하여 상기 생체 분자와 결합한 미소 입자만을 포집하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.
14. 청구항 13에 있어서,
    상기 외부 자력은 영구자석을 이용하여 발생하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.

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