CN112305041B - 多重定量电化学免疫传感器及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于电化学免疫传感领域，公开一种多重定量电化学免疫传感器及其构建方法，传感器包括检测探针，检测探针表面设置有：自组装分子层，与所述检测探针表面连接；捕捉抗体，与所述自组装分子层连接，用于捕捉总目标物蛋白所述总目标物蛋白包括磷酸化目标物蛋白和未磷酸化目标物蛋白；功能化电化学标记物，连接所述磷酸化目标物蛋白，用于在电化学测量时放大信号。本发明的多重定量电化学免疫传感器能够在一个样品溶液中同时捕获包含磷酸化目标物蛋白和未磷酸化目标物蛋白的总目标物蛋白；再通过功能化电化学标记物特异性捕获并定量检测磷酸化目标物蛋白，从而得到蛋白质磷酸化的水平程度。

Description

多重定量电化学免疫传感器及其构建方法
技术领域
本发明涉及电化学免疫传感领域，特别是涉及一种多重定量电化学免疫传感器及其构建方法。
背景技术
磷酸化普遍存在于蛋白质翻译后修饰过程中，对生命体进行调节，而相关蛋白质的磷酸化水平异常将会导致相应疾病的发生和发展，因此开发相关的磷酸化蛋白水平检测技术手段极为重要，对临床的诊断，治疗和病理学研究具有重大意义。
现有对磷酸化蛋白的检测手段中，已经开发了酶联免疫吸附测定，以及质谱法等技术手段，但这些方法需要特殊位点特异性的磷酸化蛋白抗体，检测前需要进行磷酸化蛋白富集，只能单独检测磷酸化蛋白的含量，且具有检测需要大量蛋白质、耗时、昂贵等缺点。
因此，有必要的对磷酸化蛋白的检测方法进行改进。
发明内容
本发明提出一种多重定量电化学免疫传感器及其构建方法，两种形式目标物蛋白(磷酸化和未磷酸化目标物蛋白)同时从一个样品溶液中捕获，不需要对磷酸化目标物蛋白进行预富集，实现总目标物蛋白含量和磷酸化目标物蛋白含量同步定量检测，得到磷酸化目标物蛋白和总目标物蛋白含量的比值，即蛋白质磷酸化的水平程度。
为此，本发明的一个目的在于提出一种多重定量电化学免疫传感器，包括检测探针，检测探针表面设置有：
自组装分子层，与所述检测探针表面连接；
捕捉抗体，与所述自组装分子层连接，用于捕捉总目标物蛋白，所述总目标物蛋白包括磷酸化目标物蛋白和未磷酸化目标物蛋白；
功能化电化学标记物，连接所述磷酸化目标物蛋白，用于在电化学测量时放大信号。
进一步的，所述功能化电化学标记物为辣根过氧化物酶/二氧化钛/多壁碳纳米管。
进一步的，所述自组装分子层为在检测探针表面修饰形成的MPA自组装分子层，所述自组装分子层经过羧氨反应修饰上所述捕捉抗体。
进一步的，所述自组装分子层还通过羧基封闭剂将未连接捕捉抗体的位点进行封闭，避免非特异性吸附。优选的，所述羧基封闭剂为EA。
进一步的，所述检测探针为金电极。
本发明的另一个目的在于提出一种多重定量电化学免疫传感器的构建方法，包括步骤：
S1：制备自组装分子层
将检测探针浸入含有自组装分子的有机溶剂中，获得与检测探针表面连接的自组装分子层；
S2：连接捕捉抗体
将自组装分子层活化，再将活化后的自组装分子层在含有捕捉抗体的溶液中反应，使捕捉抗体与自组装分子层连接；
S3：总目标物蛋白的EIS检测
将含有总目标物蛋白的溶液覆盖连接了捕捉抗体的检测探针，反应，使总目标物蛋白与捕捉抗体特异性结合，进行EIS测量，得到总目标物蛋白的阻抗值；
S4：连接功能化电化学标记物
将修饰了总目标物蛋白的检测探针浸入含有功能化电化学标记物的溶液中进行螯合反应，使功能化电化学标记物与磷酸化目标物蛋白连接，使用电化学测试单元进行磷酸化目标物蛋白的电化学测量。
进一步的，所述自组装分子层为MPA自组装分子层。
进一步的，制备所述自组装分子层的步骤包括：将清洁后的检测探针在室温下浸入含有4～8mM MPA的乙醇溶液中10～15h，获得与检测探针表面固定的MPA自组装分子层。
进一步的，所述将自组装分子层活化是通过EDC和NHS的混合溶液将MPA的羧基活化。
进一步的，在完成捕捉抗体与自组装分子层连接后，还包括使用羧基封闭剂将已活化但未连接捕捉抗体的羧基位点进行封闭。
进一步的，在步骤S2中完成羧基封闭后，先进行第一次EIS测量，得到初始的阻抗值，在步骤S3中，进行第二次EIS测量，得到总目标物蛋白的阻抗值；将两次次EIS测量得到的阻抗值进行归一化处理，得出总目标物蛋白的含量。
进一步的，所述功能化电化学标记物为HRP/TiO2/MWCNTs。
进一步的，所述HRP/TiO2/MWCNTs的制备步骤包括：
(1)制备二氧化碳溶胶溶液，将碳纳米管与二氧化碳溶胶溶液混合，获得TiO2/MWNTs纳米复合材料；
(2)将TiO2/MWNTs纳米复合材料在酸液中处理，使表面形成羧基官能团；
(3)将TiO2/MWNTs纳米复合材料进行活化；
(4)将HRP加入活化后的TiO2/MWNTs纳米复合材料中反应，得到HRP/TiO2/MWCNTs纳米材料。
本发明的有益效果在于：
本发明的多重定量电化学免疫传感器通过捕捉抗体在一个样品溶液中同时捕获包含磷酸化目标物蛋白和未磷酸化目标物蛋白的总目标物蛋白，得到总目标物蛋白的含量，不需要对磷酸化目标物蛋白进行预富集；再通过功能化电化学标记物特异性捕获并定量检测磷酸化目标物蛋白，得到磷酸化目标物蛋白的含量，从而得到磷酸化目标物蛋白和总目标物蛋白含量的比值，即蛋白质磷酸化的水平程度，避免了只检测单一组分磷酸化目标物蛋白的个体差异。
本发明检测探针表面通过与短链巯基化合物3-巯基丙酸(MPA)形成Au-S键固定自组装单分子层，有利于在磷酸化目标物蛋白检测时电信号物质的电子传递；通过HRP/TiO2/MWCNTs特异性捕获并定量检测修饰有总目标物蛋白的电极上的磷酸化目标物蛋白，TiO2可以高特异性螯合磷酸化目标物蛋白上的磷酸根，并用HRP与相应的底物作为电信号进行高灵敏度定量检测。
附图说明
图1是根据本发明一个实施例的检测探针的示意图；
图2是根据本发明一个实施例的多重定量电化学免疫传感器构建方法示意图；
图3是根据本发明一个实施例的检测探针的另一视角示意图；
图4是根据本发明一个实施例的电化学测试单元的示意图。
其中，检测探针表面10，自组装分子层20，捕捉抗体30，羧基封闭剂40，未磷酸化目标物蛋白50，磷酸化目标物蛋白60，功能化电化学标记物70，聚乙烯保护层80，电化学系统测试接头90；
检测探针1，铂对电极2，Ag/AgCl参比电极3，测试溶液4，电化学测试单元5。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
参考图1-图4，本发明提出了一种多重定量电化学免疫传感器及其构建方法。
根据本发明的实施例，如图1所示，该传感器包括：包括检测探针1，具有检测探针表面10，所述检测探针表面10设置有：自组装分子层20，与检测探针表面10连接；捕捉抗体30，与自组装分子层20连接，用于捕捉总目标物蛋白，所述总目标物蛋白包括未磷酸化目标物蛋白50和磷酸化目标物蛋白60；功能化电化学标记物70，连接所述磷酸化目标物蛋白60，用于在电化学测量时放大信号。进一步的，所述功能化电化学标记物70为辣根过氧化物酶/二氧化钛/多壁碳纳米管(HRP/TiO2/MWCNTs)，是通过辣根过氧化物酶及二氧化钛功能化的多壁碳纳米管；所述自组装分子层20为在检测探针表面10修饰形成的MPA自组装分子层，所述MPA自组装分子层经过羧氨反应修饰上所述捕捉抗体30，所述自组装分子层20还通过羧基封闭剂40将未连接捕捉抗体30的羧基位点进行封闭，以防止非特异性结合。
如图3所示，检测探针1还包括聚乙烯保护层80和电化学系统测试接头90。具体的，检测探针1为金工作电极。
检测探针1可插入电化学测试单元5中进行电化学检测，电化学测试单元5的结构如图4所示，还包括铂对电极2和Ag/AgCl参比电极3，金工作电极1、铂对电极2和Ag/AgCl参比电极3插入测试溶液4中进行电化学检测。
下面对根据本发明一个具体实施例的多重定量电化学免疫传感器构建方法进行详细描述。继续参考图2，该方法包括：
S1：制备自组装分子层20
将金电极检测探针进行机械抛光和电化学清洁后，在室温下浸入含有4～10mMMPA的乙醇溶液中10～15h，获得表面修饰有MPA自组装分子层(SAMs)的检测探针。
其中，机械抛光和电化学清洁可以使用现有的方法进行处理，属于本领域的常规技术手段，为本领域技术人员所公知，并非本发明的发明点，在此不再赘述。
电子在长链巯基化合物上的传递速度较慢，而在短链巯基化合物上传递速度相对较快，本发明使用短链巯基酸3-巯基丙酸(MPA)在金电极表面构建自组装分子层20用以固定捕捉抗体30，有利于在磷酸化目标物蛋白60检测时电信号物质的电子传递。
S2：连接捕捉抗体30
将MPA自组装分子层浸入等体积混合的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC,0.4-0.8M)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,0.1-0.2M)溶液活化MPA上的羧基15-30min，再将活化后的MPA自组装分子层浸入捕捉抗体30(1μM)溶液中反应1-3h，使捕捉抗体30上的氨基与MPA自组装分子层上的羧基完成羧氨反应，从而使捕捉抗体30连接到MPA自组装分子层上，之后使用羧基封闭剂40(EA，0.5-1.0M)将已活化但未连接捕捉抗体30的羧基位点进行封闭。由此，在用羧基封闭剂40封闭后即完成了检测探针1的构建，将检测探针1进行第一次EIS测量，得到初始的阻抗值。
S3：总目标物蛋白的EIS检测
将10-15μL含有总目标物蛋白的待测样本覆盖连接了捕捉抗体30的检测探针1，反应1-3h，使总目标物蛋白与捕捉抗体30形成特异性结合而捕获所有的未磷酸化目标物蛋白50和磷酸化目标物蛋白60，之后进行第二次EIS测量，得到总目标物蛋白的阻抗值。然后将第一次EIS测量得到的初始的阻抗值与第二次EIS测量得到的总目标物蛋白的阻抗值进行归一化处理，由此得出总目标物蛋白的含量。
S4：连接功能化电化学标记物70
将修饰了总目标物蛋白的检测探针1浸入含有HRP/TiO2/MWCNTs的溶液中进行螯合反应0.5-1h，使HRP/TiO2/MWCNTs与磷酸化目标物蛋白60连接。之后使用电化学测试单元5进行磷酸化目标物蛋白60的电化学测量，由此得到磷酸化目标物蛋白60的含量。结合以上检测的总目标物蛋白的含量，得到磷酸化目标物蛋白和总目标物蛋白的比值，即蛋白质磷酸化的水平程度。由此可以避免单组分检测中存在的实际个体差异，更加准确的评估生物标志物蛋白的磷酸化水平，有效准确的评估与蛋白质磷酸化水平相关联的疾病，为疾病的诊断和预后提供监测。
具体的，Ti4+可以特异性螯合磷酸根，因此可以用来识别含磷酸根的磷酸化目标物蛋白，但Ti4+容易水解生成沉淀，在水溶液中不稳定。而其氧化物TiO2性质稳定，也可以用来特异性螯合磷酸根，从而捕获磷酸化目标物蛋白60。使用碳纳米管材料可以通过化学修饰与特异性识别磷酸根的TiO2粒子和作为电化学信号的辣根过氧化物酶键合形成功能化的碳纳米管，以功能化的碳纳米管作为功能化电化学标记物70优点为性质稳定，生物相容性好，能将整个体系的电化学信号放大，提高了低丰度磷酸化目标物蛋白60的检测灵敏度。
其中，HRP/TiO2/MWCNTs的制备步骤包括：制备二氧化碳溶胶溶液，将碳纳米管与二氧化碳溶胶溶液混合，获得TiO2/MWNTs纳米复合材料，将TiO2/MWNTs纳米复合材料在强酸溶液(H2SO4和H2NO3)中处理，使表面形成羧基官能团，将TiO2/MWNTs纳米复合材料进行活化，将HRP加入活化后的TiO2/MWNTs纳米复合材料中反应，得到HRP/TiO2/MWCNTs纳米材料。
在上述制备方法中以钛酸酯为原材料，采用溶胶-凝胶法可在碳纳米管上负载TiO2薄膜。碳纳米管用强酸处理后表面会产生羧基，可以与电化学活性酶共价键合形成稳定的功能化复合材料，由于碳纳米管的高比表面积，使其可键合多个电化学活性酶，从而增加电化学信号的强度。
综上可知，本发明首先通过在金电极表面形成Au-S键固定3-巯基丙酸(MPA)自组装单分子层，再经过羧氨反应修饰上与目标物蛋白对应的捕捉抗体，为防止非特异性吸附，用乙醇胺盐酸盐(EA)对已活化的羧基位点进行封闭，将包含未磷酸化和磷酸化的两种目标物蛋白的总目标物蛋白在已修饰相应捕捉抗体的金电极上共同免疫捕获，使得总目标物蛋白含量可以通过电化学阻抗谱(EIS)一步检测。随后，通过辣根过氧化物酶(HRP)及二氧化钛(TiO2)功能化的多壁碳纳米管(HRP/TiO2/MWCNTs)特异性捕获并定量检测总目标物蛋白修饰电极上的磷酸化目标物蛋白并实现电化学信号放大。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例
1.对裸露的金(Au)电极(直径2mm)进行机械抛光和电化学清洁。将裸金电极用0.05mm的氧化铝粉在抛光材料上打磨直至表面光滑，然后将打磨好的金电极浸入干净的二次水和乙醇中超声以除去表面的抛光粉和其他杂质。再用0.5M的稀H2SO4溶液进行循环伏安电化学处理，以彻底清除电极表面上残留的杂质。扫描时选择的电位为-0.1～1.5V，扫速先取0.5V/s进行快速多次扫描，再取0.1V/s进行慢速多次扫描，直至电极扫描出的CV曲线重合性好，达到稳定。
2.将清洁后的Au电极在室温下浸入含有4mM MPA的乙醇溶液中避光过夜，以获得MPA自组装单层膜(SAMs)改性的Au电极。
3.然后，在室温下通过等体积混合的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC,0.4M)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,0.1M)溶液活化MPA上的羧基30min。
4.活化后电极表面在1μM捕捉抗体(p53抗体)溶液中反应1-3h，使抗体上的氨基与MPA上的羧基完成羧氨反应，从而使捕捉抗体(p53抗体)连接到MPA SAMs上。
5.之后用0.5M的EA溶液处理所得的捕捉抗体(p53抗体)修饰电极，对已活化但未覆盖的羧基位点进行封闭。
6.对于总目标物蛋白(p53蛋白)的EIS检测，将10μL总目标物蛋白(p53蛋白)溶液覆盖在捕捉抗体修饰电极上反应1-3h，以实现总目标物蛋白(p53蛋白)和捕捉抗体(p53抗体)之间的特异性识别。
总目标物蛋白EIS测量条件：测量在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原电对(摩尔比1:1)溶液中，频率范围为0.1Hz至100kHz，AC电位为10mV，并叠加在0.225V的DC电位上。阻抗数据显示在奈奎斯特图中并由Gamry Echem Analyst软件拟合。
7.对于磷酸化目标物蛋白的电化学测量，在总目标物蛋白修饰的电极浸入酶/TiO2/MWCNTs溶液中螯合反应0.5-1h，冲洗干净后进行电化学测量。
HRP/TiO2/MWCNTs纳米材料的合成：将摩尔比钛酸四丁酯：二次水：乙醇：硝酸为1:1.5:20:0.16的溶液置于烧杯中，用磁力搅拌器搅拌形成均匀的溶胶。然后，将约1％的MWNTs与溶胶溶液混合，并在烧杯中用磁力搅拌2h。最后，通过将上述凝胶在40℃的烘箱中干燥，研磨后在Ar气保护下500℃热处理2h获得TiO2/MWNTs纳米复合材料。将获得的TiO2/MWNTs纳米复合材料在H2SO4：HNO3为3:1的强酸溶液中，在70℃下超声处理4-6h，使其表面形成羧基官能团，二次水重复洗涤至溶液呈中性，然后用等体积混合的EDC(0.4M)和NHS(0.1M)活化后离心洗涤，去除多余的EDC和NHS。将浓度为1mg/mL的HRP加入活化后的TiO2/MWNTs纳米复合材料中反应2-3小时，离心，清洗后得到HRP/TiO2/MWCNTs纳米材料备用。
磷酸化目标物蛋白电化学测量条件：在3mL含H2O2的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物中进行电化学检测。循环伏安法(CV)，在-0.3V至0.7V的范围内，以100mV/s的扫描速率进行。在100mV下进行安培检测，电压固定为-0.1V，在HRP氧化还原反应达到稳态后的50s处测量电还原电流。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种多重定量电化学免疫传感器，其特征在于，包括检测探针，所述检测探针表面设置有：
自组装分子层，与所述检测探针表面连接，所述自组装分子层为在检测探针表面修饰形成的MPA自组装分子层，所述自组装分子层经过羧氨反应修饰上捕捉抗体；
捕捉抗体，与所述自组装分子层连接，用于捕捉总目标物蛋白，所述总目标物蛋白包括磷酸化目标物蛋白和未磷酸化目标物蛋白；
功能化电化学标记物，连接所述磷酸化目标物蛋白，用于在电化学测量时放大信号，所述功能化电化学标记物为辣根过氧化物酶/二氧化钛/多壁碳纳米管。
2.根据权利要求1所述的多重定量电化学免疫传感器，其特征在于，所述自组装分子层还通过羧基封闭剂将未连接所述捕捉抗体的位点进行封闭。
3.一种权利要求1-2任一项所述的多重定量电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，包括步骤：
S1：制备自组装分子层
将检测探针浸入含有自组装分子的有机溶剂中，获得与检测探针表面固定的自组装分子层；
S2：连接捕捉抗体
将自组装分子层活化，再将活化后的自组装分子层在含有捕捉抗体的溶液中反应，使捕捉抗体与自组装分子层连接；
S3：总目标物蛋白的 EIS 检测
将含有总目标物蛋白的溶液覆盖连接了捕捉抗体的检测探针，反应，使总目标物蛋白与捕捉抗体特异性结合，进行EIS测量，得到总目标物蛋白的阻抗值；
S4：连接功能化电化学标记物
将修饰了总目标物蛋白的检测探针浸入含有功能化电化学标记物的溶液中进行螯合反应，使功能化电化学标记物与磷酸化目标物蛋白连接，使用电化学测试单元进行磷酸化目标物蛋白的电化学测量。
4.根据权利要求3所述的多重定量电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，所述自组装分子层为MPA自组装分子层，制备所述MPA自组装分子层的步骤包括：将清洁后的检测探针在室温下浸入含有4-8 mM MPA的乙醇溶液中10-15 h，获得与检测探针表面连接的MPA自组装分子层。
5.根据权利要求3所述的多重定量电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，所述自组装分子层为MPA自组装分子层，所述将自组装分子层活化是通过EDC和NHS的混合溶液将MPA的羧基活化。
6.根据权利要求5所述的多重定量电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，完成捕捉抗体与自组装分子层连接后，还包括使用羧基封闭剂将已活化但未连接捕捉抗体的羧基位点进行封闭。
7.根据权利要求6所述的多重定量电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，在步骤S2中完成羧基封闭后，先进行第一次EIS测量，得到初始的阻抗值，在步骤S3中，进行第二次EIS测量，得到总目标物蛋白的阻抗值；将两次EIS测量得到的阻抗值进行归一化处理，得出总目标物蛋白的含量。
8.根据权利要求3所述的多重定量电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，所述功能化电化学标记物为HRP/TiO2/ MWCNTs，其制备步骤包括：
（1）制备二氧化碳溶胶溶液，将碳纳米管与二氧化碳溶胶溶液混合，获得TiO2 /MWNTs纳米复合材料；
（2）将TiO2 /MWNTs纳米复合材料在酸液中处理，使表面形成羧基官能团；
（3）将TiO2 /MWNTs纳米复合材料进行活化；
（4）将HRP加入活化后的TiO2 /MWNTs纳米复合材料中反应，得到HRP/TiO2/ MWCNTs纳米材料。
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