CN101923934B - 有机膦酸功能化磁性纳米材料的制备及在蛋白富集中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一类R-CH2-PO3-M修饰的磁性纳米粒子作为磷酸化蛋白富集材料，提出了其制备方法及其在磷酸化蛋白富集中的应用。通过对有机膦酸R基团修饰羧基基团，实现将磁性纳米粒子与膦酸基团的功能相结合的目的。有机膦酸功能化的磁性纳米材料的合成方法简单、快速、绿色。该类材料对于磷酸化蛋白有着良好的富集作用，MALDI-TOF MS可以检测到10-8M的牛血清β-酪蛋白消化液中磷酸化肽段。这些结果表明，通过将磁性纳米粒子和有机膦酸结合，可以构筑一类良好的磷酸化蛋白富集材料。
Description
技术领域
本发明涉及磁性纳米材料领域，是一类集磁性纳米粒子与有机膦酸功能于一体的新型功能化磁性纳米材料。
背景技术
磁性纳米材料由于其独特的物理及化学性能，如高的比表面积和易于分离等特点，在药物传输、生物分离等领域有着广泛的应用。有机膦酸(R-CH2-PO3H2)化学的特点在于通过对R基团的化学修饰，使其成为同时具备膦酸基团和其他基团的功能分子，实现了满足不同功能的化学调控。
蛋白质的可逆磷酸化过程是蛋白质翻译后修饰中最普遍和重要的形式，与多种生命活动过程有关。但由于磷酸化蛋白质的丰度低，难于进行分析检测，对磷酸化蛋白的富集在蛋白质组学中的研究显的非常重要。目前用于蛋白富集的磁性材料，主要是通过在氧化铁磁性纳米粒子外层包裹金属氧化物(Al2O3，TiO2，Ga2O3，ZrO2)，去选择性地结合磷酸化蛋白达到富集目的。还有一类是通过在氧化铁磁性纳米粒子外层修饰多羧酸基团，然后与金属离子(Fe3+，Ce4+，Zr4+等)结合，形成富集磷酸化蛋白的探针。另外，包裹磷酸锆的磁性材料是通过在氧化铁磁性纳米粒子外结合NH2基团，然后在POCl3及2，4，6-三甲基吡啶的无水乙腈溶液中反应，得到N-PO3 2-基团与Zr4+结合，实现富集磷酸化蛋白。上述材料的制备或需要高温，或步骤繁琐非绿色。因此，制备简单、清洁新型的磁性纳米材料作为蛋白富集的材料，在蛋白的分离、检测领域有更广泛的需求和应用。
发明内容
本发明的目的在于提出一类M-PO3-CH2-R(M为金属离子)修饰的磁性纳米粒子作为磷酸化蛋白富集材料，提出了其制备方法及其在磷酸化蛋白富集中的应用。
本发明的技术方案如下：
有机膦酸功能化磁性纳米材料组成结构是核部分为磁性纳米粒子，金属有机膦酸分子通过酰胺键与包裹带氨基的硅烷偶联基团的纳米粒子结合，具有如下特征结构：
其中磁性纳米粒子包括Fe3O4，γ-Fe2O3纳米粒子中的一种或混合物；R为任意有机基团；M为能与膦酸配位的金属离子，优选Zr，Fe；m为正整数，如1，2，3等。
所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其特征在于：通过对有机膦酸分子中R基团修饰羧基基团，可与磁性纳米粒子上的NH2通过简单快速的酰胺化反应，使有机膦酸分子修饰到磁性纳米粒子表面。
所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其特征在于：通过改变金属离子的种类，如Zr，Fe等具有不同的配位性能，以及通过改变膦酸基团的数目m(m可以为1，2，3等)，可以调控磁性纳米材料的表面性能。
所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其合成路线及步骤如下：
步骤1.将包裹含氨基硅烷的磁性纳米粒子超声分散到适量的二次水中，然后再分别加入适量的有机膦酸配体和EDC/NHS，PBS缓冲溶液调节pH值，室温下超声反应10-30分钟。
步骤2.将步骤1所得的悬浊液在外加磁场下，进行分离，然后用二次水充分洗涤，以此法洗涤三次。
步骤3.向步骤2所得的磁性纳米颗粒中加入适量的金属盐的稀盐酸溶液(0.2M)，室温下剧烈搅拌20分钟。然后在外加磁场下，分别用0.2M盐酸溶液和二次水洗涤三次。
将所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料应用于磷酸化蛋白的富集和检测，其步骤如下：
步骤1.向上述所得的磁性纳米粒子中加入适量一定浓度(10-7M或10-8M)的牛血清β-酪蛋白消化液，室温下振荡混合30秒，然后在外加磁场下，分离得到富集磷酸化蛋白后磁性纳米粒子，用0.15％TFA(三氟乙酸)乙腈水溶液(50％，v/v)充分洗涤三次，所得磁性纳米粒子分散于适量的50％(v/v)乙腈水溶液(20μL)。
步骤2.取适量的步骤1所得悬浊液(0.5μL)滴加于MALDI板上，然后再滴加适量的DHB(2，5-二羟基苯甲酸)与1％(v/v)的H3PO4的乙腈混合溶液，混合均匀，然后挥发结晶后进行MALDI-TOF MS测试。
本发明的原理
利用有机膦酸易于进行功能化修饰的特点，合成具有羧酸和膦酸基团的多齿配体，通过简单快速的酰胺化反应，将有机膦酸分子修饰到磁性纳米粒子外层。有机膦酸作为强配位能力的基团能稳定结合金属离子，形成富集磷酸化的蛋白的探针，同时利用磷酸化蛋白上磷酸基团与磁性纳米粒子上修饰的金属离子快速结合达到富集目的，最后通过MALDI-TOF MS手段直接对所富集磷酸化蛋白进行检测分析。
本发明的优点
1、通过对有机膦酸R基团修饰羧基基团，实现了其与磁性纳米粒子的结合，将磁性纳米粒子与膦酸基团的功能相结合。
2、通过改变R基团，可以调控不同空间结构和功能的有机膦酸分子，使其具有更好的结合富集蛋白的能力。
3、材料的合成方法简单、清洁、快速。
4、磷酸化蛋白富集效果好，可以检测到10-8M的牛血清β-酪蛋白消化液。
附图说明
图1为实施例1中的MALDI-TOF质谱图，其中，
(a)是β-酪蛋白消化液的MALDI-TOF质谱图(10-7M)；
(b)是Zr4+-NO2PA-MS磁颗粒富集后的β-酪蛋白消化液的MALDI-TOF质谱图(10-7M)；
(c)是Zr4+-NO2PA-MS磁颗粒富集后的β-酪蛋白消化液的MALDI-TOF质谱图(10-8M)。
图2为实施例2中β-酪蛋白以及磷酸化β-酪蛋白的MALDI-TOF质谱图，其中，
(a)是β-酪蛋白消化液的MALDI-TOF质谱图(10-7M)；
(b)是Zr4+-NC2P-MS磁颗粒富集后的β-酪蛋白消化液的MALDI-TOF质谱图(10-7M)；
(c)是Zr4+-NC2P-MS磁颗粒富集后的β-酪蛋白消化液的MALDI-TOF质谱图(10-8M)。
图3为实施例3中β-酪蛋白以及磷酸化β-酪蛋白的MALDI-TOF质谱图，其中，
(a)是β-酪蛋白消化液的MALDI-TOF质谱图(10-7M)；
(b)Zr4+-CP-MS磁颗粒富集后的β-酪蛋白消化液的MALDI-TOF质谱图(10-7M)；
(c)Zr4+-CP-MS磁颗粒富集后的β-酪蛋白消化液的MALDI-TOF质谱图(10-8M)。
具体实施方式
本发明实施例中选用的三种有机膦酸结构如下：
实施例1、Zr4+-NO2PA-MS的合成及对磷酸化蛋白的富集和检测称取包裹含氨基硅烷的磁性纳米粒子2mg，超声作用下分散在1mL的二次水中，然后各称取6mg的NO2PA，EDC和NHS，溶解于1mLPBS缓冲溶液(pH5.6)，加入混合后，室温下超声反应30分钟。然后在外加磁场下，进行洗涤分离，用二次水1mL洗涤三次。然后加入1mL 50mM的ZrOCl2的盐酸溶液(0.2M)，室温下剧烈搅拌20分钟。然后分别用0.2M盐酸溶液和二次水洗涤三次。
吸取50μL(1mg/mL)所制得的Zr4+-NO2PA-MS粒子悬浊液，向其中加入50μL(10-7M或10-8M)β-酪蛋白消化液，室温下振荡混合30秒。然后在外加磁场下，用200μL0.15％TFA乙腈水溶液(50％，v/v)充分洗涤三次，所得磁性纳米粒子分散于20μL的50％(v/v)乙腈水溶液。取所得悬浊液(0.5μL)滴加于MALDI板上，然后再滴加0.5μL的DHB(2，5-二羟基苯甲酸)与1％(v/v)的H3PO4的乙腈混合溶液，混合均匀，然后挥发结晶后进行MALDI-TOF MS测试。
通过对前原液和富集后的MS结果比较表明，该材料对β-酪蛋白消化液中磷酸化蛋白有特异的结合富集能力，当浓度为10-8M时，依然有很好的富集效果。当消化液浓度为10-7M时，富集的磷酸化肽段分别为β1(m/z 2062)和β2(m/z2556)，m/z为1982的信号为β1中丢失了HPO3片段。β3(m/z 3122)为四个磷酸化位点的肽段，在MS结果中没有出现，是由于信号压制和该肽段难以电离所致。当浓度降到10-8M时，β1(m/z 2062)和β1-HPO3依然可以检测出。此结果表明所制备的磁性纳米材料对于磷酸化蛋白有着良好的富集作用。
实施例2、Zr4+-NC2P-MS的合成及对磷酸化蛋白的富集和检测
称取包裹含氨基硅烷的磁性纳米粒子1mg，超声作用下分散在1mL的二次水中，然后称取3mg的NC2P溶于1mLPBS缓冲溶液(pH 5.6)，称取3mg EDC和3mg NHS，加入混合液后，室温下超声反应30分钟。然后在外加磁场下，用二次水1mL洗涤三次。然后加入500μL50mM的ZrOCl2的盐酸溶液(0.2M)，室温下剧烈搅拌20分钟。然后分别用0.2M盐酸溶液和二次水洗涤三次。
吸取50μL(1mg/mL)所制得的Zr4+-NC2P-MS悬浊液，向其中加入50μL(10-7M或10-8M)β-酪蛋白消化液，室温下振荡混合30秒。然后在外加磁场下，用200μL0.15％TFA乙腈水溶液(50％，v/v)充分洗涤三次，所得磁性纳米粒子分散于20μL的50％(v/v)乙腈水溶液。滴加0.5μL的DHB(2，5-二羟基苯甲酸)与1％(v/v)的H3PO4的乙腈混合溶液于MALDI板上，然后取所得悬浊液(0.5μL)滴加混合均匀，挥发溶剂结晶后进行MALDI-TOF MS测试。
MALDI-TOF MS结果表明，该材料对β-酪蛋白消化液中磷酸化蛋白有特异的结合富集能力，原液中的非磷酸化蛋白片段被洗涤掉，β1(m/z 2062)磷酸化肽段很好地富集。当浓度降到10-8M时，依然可以检测到β1(m/z 2062)肽段。结果表明Zr4+-NC2P-MS磁性纳米粒子为较好的磷酸化蛋白富集材料。
实施例3、Zr4+-CP-MS的合成及在磷酸化蛋白富集和检测的应用
称取包裹含氨基硅烷的磁性纳米粒子1mg，超声作用下分散在1mL的二次水中，然后加入含3mg CP的PBS缓冲溶液(pH 5.6)，再称取3mg EDC和3mgNHS，加入以上混合液，室温下超声反应30分钟。然后在外加磁场下，用二次水1mL洗涤三次。然后加入500μL50mM的ZrOCl2的盐酸溶液(0.2M)，室温下剧烈搅拌20分钟。然后分别用0.2M盐酸溶液和二次水洗涤三次。
吸取50μL(1mg/mL)所制得的Zr4+-CP-MS悬浊液，向其中加入50μL(10-7M或10-8M)β-酪蛋白消化液，室温下振荡混合30秒。然后在外加磁场下，用200μL0.15％TFA乙腈水溶液(50％，v/v)充分洗涤三次，所得磁性纳米粒子分散于20μL的50％(v/v)乙腈水溶液。滴加0.5μL的DHB(2，5-二羟基苯甲酸)与1％(v/v)的H3PO4的乙腈混合溶液于MALDI板上，然后取所得悬浊液(0.5μL)滴加混合均匀，挥发溶剂结晶后进行MALDI-TOF MS测试。
MALDI-TOF MS实验表明，β-酪蛋白消化液经Zr4+-CP-MS磁性纳米粒子富集后，原液中磷酸化蛋白肽段有效地得以富集。当β-酪蛋白消化液浓度为10-7M时，β1(m/z2062)磷酸化肽段很好地富集，同时β2(m/z2556)和β3(m/z3122)。肽段也能富集后检测出信号。降低消化液浓度到10-8M时，依然可以检测到β1(m/z2062)肽段。结果表明Zr4+-CP-MS磁性纳米粒子为一种良好的富集磷酸化蛋白的材料。
Claims (9)
1.一种有机膦酸功能化磁性纳米材料，组成结构是核部分为磁性纳米粒子，金属有机膦酸分子通过酰胺键与包裹带氨基的硅烷偶联基团的纳米粒子结合，具有如下特征结构：
其中磁性纳米粒子包括Fe3O4，γ-Fe2O3纳米粒子中的一种或多种；R为任意有机基团；M为能与膦酸配位的金属离子；m为正整数。
2.根据权利要求1所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其特征在于：M为Zr离子或Fe离子。
3.根据权利要求1所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其特征在于：m为1或2或3。
4.根据权利要求1所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其特征在于：通过对有机膦酸分子中R基团修饰羧基基团，能与磁性纳米粒子上的NH2通过简单快速的酰胺化反应，使有机膦酸分子修饰到磁性纳米粒子表面。
5.根据权利要求1所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其特征在于：通过改变金属离子的种类使所述磁性纳米材料具有不同的配位性能，以及通过改变膦酸基团的数目来调控磁性纳米材料的表面性能。
6.根据权利要求5所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其特征在于：所述金属离子包括Zr离子或Fe离子。
7.根据权利要求5所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其特征在于：所述膦酸基团的数目为1或2或3。
8.根据权利要求1所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料，其特征在于：制备步骤如下：
步骤1，将包裹含氨基硅烷的磁性纳米粒子超声分散到适量的二次水中，然后再分别加入适量的有机膦酸配体和EDC及NHS，PBS缓冲溶液调节pH值，室温下超声反应10-30分钟；
步骤2，将步骤1所得的悬浊液在外加磁场下，进行分离，然后用二次水充分洗涤，以此法洗涤三次；
步骤3，向步骤2所得的磁性纳米颗粒中加入适量的金属盐的稀盐酸溶液，室温下剧烈搅拌20分钟，然后在外加磁场下，分别用0.2M盐酸溶液和二次水洗涤三次。
9.根据权利要求1所述的有机膦酸功能化磁性纳米材料在磷酸化蛋白的富集和检测中的应用。
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