CN102826615B - 一种混合单分子膜改性磁小体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种混合单分子膜改性磁小体的方法,其通过在室温条件下,取磁小体与长度相同或不同的两种以上长链烷烃分子在水和/或有机溶剂中均匀混合反应,从而在所述磁小体表面自组装形成混合单分子膜,获得改性磁小体,而后再利用混合单分子膜的尾端连接的至少一种活性基团与生物分子中的活性基团反应,实现生物分子在磁小体上的连接。本发明通过引入自组装单分子膜系统,借助单分子膜尾端集团的羧基和氨基与生物大分子进行化学连接,减少空间位阻效应,提高磁小体固定生物大分子的数量和效率,使之可广泛应用于载药、基因治疗等生物医学领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种趋磁细菌磁小体的改性方法,尤其涉及一种利用混合单分子膜改性磁小体的方法,以利于趋磁细菌磁小体与生物大分子的化学连接,属于生物技术领域、表面化学领域及纳米材料生物医学领域。
背景技术
趋磁细菌磁小体(Bacterial magnetic nanoparticles,BMPs)为趋磁细菌(Magnetotactic bacteria)体内合成的含有单磁畴的氧化铁或硫化铁(Fe3O4或Fe3S4)晶体,大小均匀为纳米级(20-100纳米)。磁小体外有生物膜包被,因此有不团聚、无毒性、免疫原性低等特点,并且生物膜表面含有各种极性基团,这是膜表面结构的组成成份,如羧基、氨基、巯基、羟基、磷酸等,利用这些极性基团,通过化学分子对磁小体表面进行改性,实现磁小体与核酸、蛋白质等生物大分子及微生物的化学连接,使得磁小体可以成为药物、基因等的理想载体。此外,磁小体在外加磁场的作用下有趋磁性,因此可以利用磁小体的趋磁性,通过外加磁场使基因及药物传递具有磁靶向性。但是,由于存在空间位阻效应等不利因素,若直接在磁小体上固定生物大分子等材料,则其连接数量、效率等较为有限,通常难以满足生物医学等领域实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足,提供一种混合单分子膜改性磁小体的方法,其通过在磁小体表面的自组装形成混合单分子膜,能大幅提升生物分子等在磁小体表面的连接数量和连接效率等。
为达成前述发明目的,本发明采用了如下技术方案:
该混合单分子膜改性磁小体的方法包括:
在室温条件下,取磁小体与两种以上长链烷烃分子在水和/或有机溶剂中均匀混合反应,从而在所述磁小体表面自组装形成混合单分子膜,获得改性磁小体,并且,所述混合单分子膜的尾端连接有至少一种活性基团,所述活性基团可选自羧基、氨基和醛基中的一种或多种,但不限于此。
作为优选方案之一,所述长链烷烃分子可选自CH3(CH2)mP(O)(OH)2(m=3~9)、X(CH2)nP(O)(OH)2(n=8~18,X= -HOOC、-CHO、-NH2)。
作为优选方案之一,该方法中采用的长链烷烃分子包括摩尔比为1:1-1:3的第一长链烷烃分子和第二长链烷烃分子,其中,
第一长链烷烃分子可选自HOOC-(CH2)nP(O)(OH)2、OHC-(CH2)nP(O)(OH)2、 H2N-(CH2)nP(O)(OH)2 ,其中n=8~18。
第二长链烷烃分子可包括CH3(CH2)mP(O)(OH)2(m=3~9)。
作为优选方案之一,所述磁小体可来源于从太湖水体淤泥中经过富集和筛选的趋磁细菌、磁螺菌属模式菌株AMB-1(Magnetospirillum sp.AMB-l)和格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌MSR-1 (Magnetospirillum gryphiswaldense,MSR-1)中的一种或多种,但不限于此,且所述磁小体的粒径为30-60nm。
作为优选方案之一,所述有机溶剂包括甲醇。
作为优选方案之一,所述均匀混合反应的时间为24-72h。
作为优选方案之一,该方法还包括:将改性磁小体加入具有琥珀酰亚胺酯等基团的交联剂的水溶液中,并于室温下进行反应。
作为优选方案之一,所述交联剂可选自N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、戊二醛中的任意一种或多种,但不限于此。
一种混合单分子膜改性磁小体的方法,包括如下步骤:
(1)在室温条件下,取磁小体与两种以上长链烷烃分子在水和/或有机溶剂中均匀混合反应,从而在所述磁小体表面自组装形成混合单分子膜,获得改性磁小体,并且,所述混合单分子膜的尾端连接有至少一种活性基团,所述活性基团至少选自羧基、氨基和醛基中的任意一种;
(2)在室温条件下,将改性磁小体与生物分子于相应的缓冲液体系中反应,使生物分子中的活性基团与改性磁小体表面的混合单分子膜内的活性基团反应,从而将生物分子连接至磁小体表面。
作为优选方案之一,该方法还包括如下步骤:
(1A)将步骤(1)所获改性磁小体加入具有琥珀酰亚胺酯等基团的交联剂的水溶液中,并于室温下进行反应,而后进行步骤(2)的操作。
具体实施方式
有鉴于现有技术的诸多缺陷,本案发明人经长期研究和实践,提出了本发明的技术方案,其以纳米级别的趋磁细菌磁小体为目标分子,通过混合单分子膜在磁小体表面的自组装对磁小体进行表面改性,实现磁小体与生物分子的高效化学连接。
概括的讲,本发明的方法可以包括如下步骤:
(1) 趋磁菌磁小体的提取与纯化,处理与定量;
(2) 改性分子的选择和制备;
(3) 自组装混合单分子层的形成与表征;
(4) 与生物大分子的连接。
其中,步骤(1)-(2),特别是步骤(2)可以是本领域技术人员根据实际应用的需要而选择进行的。
作为优选方案,前述单分子膜由两种或两种以上的长链烷烃分子经过自组装过程形成。
前述磁小体可来源于从太湖水体淤泥中经过富集和筛选的趋磁细菌、磁螺菌属模式菌株AMB-1(Magnetospirillum sp.AMB-l)、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense,MSR-1),且磁小体粒径大小为30-60纳米。
前述磁小体可采用与如下优选方案类似的方式进行提取、纯化、处理与定量,即:采用超声波破碎或细胞压榨机破碎菌体,离心沉淀磁小体,用磁铁吸取磁小体,以大量PBS冲洗干净,对纯净的磁小体进行γ射线照射灭菌,测定OD660定量。
前述长链烷烃分子可优选自CH3(CH2)5P(O)(OH)2、HOOC(CH2)9P(O)(OH)2、CH3(CH2)9P(O)(OH)2)、NH2(CH2)9P(O)(OH)2,但不限于此。
作为本发明的一典型实施方案,其可以包括如下步骤:
(1)趋磁菌磁小体的提取与纯化,处理与定量:采用超声波破碎或细胞压榨机破碎菌体,离心沉淀磁小体,用磁铁吸取磁小体,大量PBS冲洗干净,对纯净的磁小体进行γ射线照射灭菌,测定OD660定量。
(2)选取10-PDA (HOOC(CH2)9P(O)(OH)2)、1-HPA (CH3(CH2)5 P(O)(OH)2)、1-DPA (CH3(CH2)9P(O)(OH)2)、NH2(CH2)9 P(O)(OH)2等烷烃链分子,按照不同的比例进行单分子膜的自组装,反应溶剂可以选用水或甲醇等,反应时间可以为24-72小时,混合单分子膜通过AFM、FT-IR、XPS、SEM进行成膜形态及结构的表征,并反馈于成膜过程中反应分子比例及反应时间的调控;
(3)将改性后的磁小体置于交联剂,如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺,N-hydroxysuccinimide)、EDC{1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺,[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide]}、戊二醛中,通过混合分子的末端氨基和羧基基团与抗体及核酸分子进行共价结合,完成磁小体与生物大分子的连接。
本发明通过引入自组装单分子膜系统,借助单分子膜尾端集团的羧基和氨基与生物大分子进行化学连接,减少空间位阻效应,提高磁小体固定生物大分子的数量和效率,为磁小体载药、基因治疗等生物医学领域应用提供方法。
以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的说明,但其不能理解为对本发明的保护范围可产生任何限制。
实施例1 取从太湖水域中富集培养的趋磁细菌,7000g-10000g离心沉淀菌体,超声震荡破碎,将磁小体用磁铁吸附,在磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)中反复清洗,配合以轻微超声震荡,并重新悬浮与PBS中。取清洗干净的磁小体,进行γ-射线(15kGy)照射灭菌,用无菌PBS缓冲液悬浮,采用吸光值法测定OD660,定量磁小体,备用。
10-膦酰基癸酸的制备(10-phosphonodecanoic acid,10PDA):初始物为10-溴代癸酸(bromodecanoic acid,Sigma),首先通过形成乙酯基从而将羧基端基保护起来,再与亚磷酸三乙酯反应,将磷酸基团接合到链的另一端,反应完成后,将产物置于浓盐酸中回流,过滤并用纯水充分清洗后数次重结晶,多次清洗干净在空气中干燥备用(所用的试剂均为分析纯)。
在密闭容器内,将清洗干净并灭菌的磁小体置于含有HPA (CH3(CH2)5P(O)(OH)2)与10-PDA (HOOC(CH2)9P(O)(OH)2)的水溶液中室温反应36小时,其中两种分子的浓度比例为HPA:10-PDA=2:1~3:1。此时已在磁小体表面自组装形成了混合单分子膜,尾部基团为羧基和甲基,其中羧基基团用于与抗体分子的氨基相连接。
随后将磁小体放置于50/100 nmol/L NHS与100/200 nmol/L EDC的水溶液放置 20-30分钟,用纯水清洗,N2吹干。琥珀酰亚胺酯基团即与10-PDA的羧基端基相连接。
接下来将磁小体放入抗体分子 (0.1, 1 g/L)的PBS缓冲液中浸泡2小时,洗净吹干。
实施例2 取纯净的AMB-1磁小体,进行γ-射线(15kGy)照射灭菌,将磁小体用磁铁吸附起来,用无菌PBS缓冲液(pH7.4)反复清洗磁小体,并用PBS缓冲液悬浮磁小体,采用吸光度法测定OD660,进行磁小体定量,备用。
在密闭容器内,将清洗干净并灭菌的磁小体置于含有10-PDA (HOOC(CH2)9P(O)(OH)2)和DPA (CH3(CH2)9P(O)(OH)2)的水溶液中室温反应36小时,其中两种分子的浓度比例为DPA:10-PDA=2:1~3:1。此时已在磁小体表面自组装形成了混合单分子膜,尾部基团为羧基和甲基,其中羧基基团用于与DNA分子的氨基末端相连接。
10-膦酰基癸酸的制备(10-phosphonodecanoic acid,10PDA)同实施例1中所述。
与具有氨基末端基团的DNA分子接合:将含有1 μmol/L的5’端修饰上氨基端基的DNA探针(经色谱柱纯化)和200-300 nmol/L EDC的0.1 mol/L MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲溶液(pH 5,加入0.25 M NaCl)加入到前述表面自组装形成有混合单分子膜的磁小体上,放置4-6小时,在缓冲液中将多余的DNA探针清洗干净,N2吹干。
实施例3 取纯净的MSR-1磁小体,进行γ-射线(15kGy)照射灭菌,将磁小体用磁铁吸附起来,用无菌PBS缓冲液(pH7.4)反复清洗磁小体,并用PBS缓冲液悬浮磁小体,采用吸光度法测定OD660,进行磁小体定量,备用。
在密闭容器内,将清洗干净并灭菌的磁小体置于含有HPA (CH3(CH2)5P(O)(OH)2)和NH2(CH2)9P(O)(OH)2的水溶液中室温反应36-48小时,其中两种分子的浓度比例为2:1~3:1。此时已在磁小体表面自组装形成了混合单分子膜,尾部基团为氨基和甲基,其中羧基基团用于与DNA分子的氨基末端相连接。
随后将磁小体与2.5%戊二醛交联剂反应0.5~1小时,用纯水清洗,N2吹干。醛基基团基团即与NH2(CH2)9P(O)(OH)2的氨基端基相连接。
接下来将磁小体放入抗体分子 (0.01~0.1, 1 g/L)的PBS(pH=7.4)缓冲液中常温反应4-6小时或4℃过夜,洗净吹干。
最后需要指出的是,以上较佳实施例仅用于说明本发明的内容,除此之外,本发明还有其他实施方式,但凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示,而采用等同替换或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种混合单分子膜改性磁小体的方法,其特征在于,它包括:
在室温条件下,取粒径为30-60nm的磁小体与两种以上长链烷烃分子在水和/或有机溶剂中均匀混合反应,从而在所述磁小体表面自组装形成混合单分子膜,获得改性磁小体,
并且,所述长链烷烃分子包括CH3(CH2)mP(O)(OH)2和/或X(CH2)nP(O)(OH)2,其中,m=3~9,n=8~18,X至少选自-HOOC、-CHO和-NH2中的任意一种;
同时,所述混合单分子膜的尾端连接有至少一种活性基团,所述活性基团至少选自羧基、氨基和醛基中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的混合单分子膜改性磁小体的方法,其特征在于,该方法中采用的长链烷烃分子包括摩尔比为1:1-1:3的第一长链烷烃分子和第二长链烷烃分子,其中,
第一长链烷烃分子至少选自HOOC-(CH2)nP(O)(OH)2、OHC-(CH2)nP(O)(OH)2和H2N-(CH2)nP(O)(OH)2中的任意一种,其中n=8~18;
第二长链烷烃分子包括CH3(CH2)mP(O)(OH)2,其中,m=3~9。
3.根据权利要求1所述的混合单分子膜改性磁小体的方法,其特征在于,所述磁小体至少来源于从太湖水体淤泥中经过富集和筛选的趋磁细菌、磁螺菌属模式菌株AMB-1和格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌MSR-1中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的混合单分子膜改性磁小体的方法,其特征在于,所述有机溶剂包括甲醇。
5.根据权利要求1所述的混合单分子膜改性磁小体的方法,其特征在于,所述均匀混合反应的时间为24-72h。
6.根据权利要求1所述的混合单分子膜改性磁小体的方法,其特征在于,该方法还包括:将改性磁小体加入具有琥珀酰亚胺酯基团或醛基基团的交联剂的水溶液中,并于室温下进行反应。
7.根据权利要求6所述的混合单分子膜改性磁小体的方法,其特征在于,所述交联剂至少选自N-羟基琥珀酰亚胺、(1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、戊二醛中的任意一种。
8.一种混合单分子膜改性磁小体的方法,其特征在于,它包括如下步骤:
(1)在室温条件下,取磁小体与两种以上长链烷烃分子在水和/或有机溶剂中均匀混合反应,从而在所述磁小体表面自组装形成混合单分子膜,获得改性 磁小体,并且,所述混合单分子膜的尾端连接有至少一种活性基团,所述活性基团至少选自羧基、氨基和醛基中的任意一种;
(2)在室温条件下,将改性磁小体与生物分子于相应的缓冲液体系中反应,使生物分子中的活性基团与改性磁小体表面的混合单分子膜内的活性基团反应,从而将生物分子连接至磁小体表面;
其中,所述长链烷烃分子包括CH3(CH2)mP(O)(OH)2和/或X(CH2)nP(O)(OH)2,其中,m=3~9,n=8~18,X至少选自-HOOC、-CHO和-NH2中的任意一种,
所述磁小体的粒径为30-60nm。
9.根据权利要求8所述的混合单分子膜改性磁小体的方法,其特征在于,该方法还包括如下步骤:
(1A)将步骤(1)所获改性磁小体加入具有琥珀酰亚胺酯基团的交联剂的水溶液中,并于室温下进行反应,而后进行步骤(2)的操作。
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