CN101600454A - 诱导碳水化合物特异性细胞免疫性的微生物及其片段 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及预防和治疗与特定碳水化合物表位出现有关的疾病的领域。更具体地，本发明涉及碳水化合物表位阳性肿瘤的预防和治疗。其涉及用于诱导有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的制剂和方法。
Description
技术领域
1本发明涉及预防和治疗特征在于出现特定碳水化合物表位的疾病的领域。本发明提供保健食品(nutraceutical)和药物组合物，其包括对于碳水化合物表位呈阳性的微生物及其片段，所述微生物及其片段诱导有效的针对碳水化合物阳性细胞和疾病的碳水化合物特异性细胞免疫应答。此外，其提供用于选择、分离和鉴定碳水化合物阳性微生物的方法，所述碳水化合物阳性微生物适于用作保健食品或药物组合物的有效部分。其提供用于产生碳水化合物特异性树突细胞和细胞系以及碳水化合物特异性T细胞、T细胞克隆和T细胞系的方法。本发明还提供用于预防和治疗与特定碳水化合物表位相关的疾病的制剂和方法。
背景技术
2碳水化合物抗原经常与人类疾病共同出现。例如，异常糖基化为癌细胞的典型标志，由此形成不存在或几乎不存在于正常人类细胞上的新的碳水化合物结构。认为这些碳水化合物结构对于肿瘤疫苗的产生是合适的候选物，但是碳水化合物自身为归类到T细胞非依赖型抗原的不良的免疫原性结构。因此，疫苗开发集中在产生基于合成碳水化合物的抗肿瘤疫苗上，由此碳水化合物表位偶联到免疫加强载体结构或天然蛋白质或寡肽(例如MUC1)，并与其它的佐剂组合以诱导免疫应答，特别是诱导细胞免疫应答。将多糖连接到免疫原性多肽例如破伤风或白喉类毒素或KLH或T辅助表位，以改变从T细胞非依赖性到T细胞依赖性的免疫应答，从而产生免疫记忆。此类疫苗的生产非常困难和昂贵。此外，此类疫苗代表具有未知作用或不良副作用的非天然或人工抗原。
3直到最近还认为碳水化合物不被抗原呈递细胞(例如树突细胞)呈递到免疫效应细胞，并且不介导T细胞免疫应答。
4目前几乎没有报道显示复合碳水化合物在糖蛋白加工期间不被抗原呈递细胞除去，并且可以与肽一起呈递到主要的组织相容性复合物II限制性T细胞(complex II restricted T cells)。
5在MUC1抗原的情况下，可以显示在树突细胞上的糖蛋白的内在化、加工和呈递。带有短唾液酸化的碳水化合物的MUC1诱导树突细胞的激活和成熟，表型上与细菌LPS诱导的相似，因而缺乏特异性，但是这些DCs在与异源CD4+T细胞共培养之后不能诱导Th1型免疫应答或细胞毒性CD8应答(Carlos等.(2005)J Immunol 175：1628-1635)。
6用Tn表位O-糖基化的MUC1-衍生肽在小鼠中诱导细胞免疫原性，但用负载有糖肽的树突细胞进行的免疫显示无免疫治疗作用、非选择性裂解人MUC1的表达鼠细胞系和诱发的CTLs显示糖基化形式和非糖基化形式的相同肽之间的交叉反应，因此该免疫应答不是有效的并且不是CH-特异性的(Stepensky等(2005)Clin Exp Immunol143：139-149)。
7携带从单糖至四糖的短糖基团(short sugar moieties)的癌症相关MUC1(例如肿瘤抗原Tn，TF，S-Tn和S-TF)甚至能够诱导人类T细胞应答的抑制(Agrawal等Nat Med 1998 Jan；4(1)：43-9)。
8由于涉及糖基化系统的酶的不同特征谱，细菌糖基化完全不同于真核糖基化。细菌的大多数多糖为带负电的多糖，其显然不能激活T细胞，因此通常被归类为2型T细胞非依赖性抗原。最近，公开了来自特定细菌的两性离子荚膜多糖具有激活CD4+T细胞的能力。然而，两性离子多糖抗原的MHCII限制还不清楚，T细胞以多克隆非抗原特异性的模式激活，所述多克隆非抗原特异性模式不是抗原或表位特异的，但显示广泛的(broad)Vβ利用和与由有丝分裂原诱导的广泛激活明显类似的交叉反应(Cobb和Kasper，Cell Microbiol 2005；Eyon，Zenewicz，Flavell，Cell，2005)。
9此外，已知碳水化合物抗原通常为弱的免疫原。
10认为Th1型免疫性在肿瘤排斥中和在各种疾病中引发有效的免疫应答上是重要和必需的(Kobayashi等，1998，J.Immunol.160：5869-5873)。显示一些短肿瘤碳水化合物可以与某些氨基酸一起作为组合的必需结合基序被呈递和识别。然而，这不导致Th1型免疫应答。相反，在MUC1的情况下，去唾液酸化的MUC1(desialylated MUC1)(呈递短糖部分例如Tn或TF)不能诱导T细胞细胞因子产生，因此没有T细胞激活，或在唾液酸化的糖的情况下，出现与肿瘤转移、肿瘤发展和不良预后有关的细胞因子例如TNFα和IL-6的分泌诱导，因此不能激活所需的TH1应答，甚至认为与肿瘤逃脱免疫应答有关(Carlos等，J.Immunol，)。
11现有技术教导包括人类碳水化合物肿瘤抗原的天然分子不能诱导有效的针对碳水化合物表位的细胞Th1和细胞毒性免疫性，并且来自细菌的多糖，特别是荚膜多糖，不能诱导抗原特异性免疫应答。
12因此，这些碳水化合物分子的使用不适合用于使用以下的肿瘤疫苗方法：(i)用于呈递碳水化合物抗原的树突细胞，当在人类中给药时所述碳水化合物不诱导有效的细胞毒性免疫应答；以及不适合用于使用以下的肿瘤疫苗方法：(ii)用于呈递碳水化合物抗原的APC例如DC，以用于在Th1应答中产生抗原特异性T细胞，从而用于在患者中的采用T细胞的治疗。
13然而，由于在病理学疾病例如癌症的发展中碳水化合物抗原的重要性，获得用于诱导有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的方法将是有利的。
14本发明的目的在于提供相应的方法。
发明内容
15为了克服本领域的上述缺陷，本发明提供用于诱导有效的针对碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答的方法，所述碳水化合物表位在来自与人类或动物的疾病相关的所述人类或动物细胞的分子上呈递。
16据我们所知，在诱导由天然分子诱导的碳水化合物特异性Th1型免疫应答上该令人惊奇的发现为首次报道。
17更令人惊奇的是，我们首次表明，有效的碳水化合物特异性细胞Th1型和细胞毒性T细胞免疫应答可以通过给药合适量的至少一种微生物或至少一种其片段来诱导，所述微生物表达人类或动物疾病相关的碳水化合物表位。
18通常存在于人类胃肠道的细菌的使用产生不引起不期望的副作用的预防和治疗剂。碳水化合物性质是缺乏相关致耐受性(tolerogencity)的原因并且显示没有相关的过敏反应。
19由于在微生物中的糖基化完全不同于在人类或动物中的糖基化，因此令人惊奇的发现：由本发明提供和可获得的微生物表达“人类”碳水化合物表位或其部分，就像其出现在人类细胞表面或产自人类细胞一样，并且在负载有所述微生物负载之后该人类抗原或其部分由树突细胞呈递，诱导有效的针对所述碳水化合物抗原的细胞免疫应答，所述针对所述碳水化合物抗原的细胞免疫应答在本发明意义上还可以是或包括有效的针对包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的细胞免疫应答。这些负载的树突细胞为功能活性的并且刺激和激活T细胞。
20最令人惊奇地是，该免疫应答还为碳水化合物特异性的，并且例如不被基础肽序列(underlying peptide sequence)显著触发。
21本发明的一个重要方面为碳水化合物阳性微生物被至少一种碳水化合物结合分子例如碳水化合物表位特异性抗体识别。因此，碳水化合物阳性微生物被碳水化合物表位特异性抗体特异性地结合，当与所述抗体接触时。从而在本发明的碳水化合物阳性微生物中，对于所述碳水化合物表位特异性抗体而言所述碳水化合物结构是可接近的，并且不被其它结构“隐藏”。在测试(合适的测试描述于以下)时，该重要特性确保碳水化合物阳性微生物和/或其碳水化合物阳性片段或裂解产物携带目的碳水化合物表位，从而至少免疫化学上实际上与目的碳水化合物表位等同，而不是与目的碳水化合物表位仅仅相似的表位。该特点对于确保免疫应答由所述碳水化合物阳性微生物触发是重要的，所述碳水化合物阳性微生物对于目的碳水化合物表位是充分特异性的。此类碳水化合物表位特异性抗体，其可用于确定微生物携带目的碳水化合物表位，特异性地识别例如在肿瘤相关环境中以及因此作为天然出现的碳水化合物表位。这进一步确保微生物携带触发所需免疫应答的形式的目的碳水化合物表位。
22因此碳水化合物表位特异性抗体可用于确定本发明的碳水化合物阳性微生物携带碳水化合物结构，所述碳水化合物结构模仿例如在肿瘤上呈递的目的碳水化合物表位。该特性-碳水化合物表位特异性-对于本发明微生物触发所需免疫应答的能力而言是决定性的。
23由于以下事实：本发明的微生物为真正碳水化合物阳性的和相应选择的-其可以通过使用碳水化合物表位特异性抗体来确定/完成-本发明提供碳水化合物阳性微生物，其诱导或增强针对目的碳水化合物表位的特异性和因而有效的免疫应答。如上所述，所述碳水化合物表位优选为人类碳水化合物表位，以及因此为在人类细胞上发现或由人类细胞呈递的碳水化合物表位。本发明的制剂通过诱导特异性的高抗碳水化合物表位抗体水平以肿瘤特异性的方式激活免疫系统。据我们所知，本发明为能够激活针对肿瘤的特异性免疫防护的首例抗原特异性食品添加剂/保健食品或药物，和能够诱导碳水化合物特别是Core-1肿瘤抗原特异性免疫应答的首例食品添加剂。
24根据一个实施方式，本发明提供鉴定根据本发明的碳水化合物阳性微生物的方法，所述碳水化合物阳性微生物因此能够触发特异性免疫应答。
25因此，提供了用于从微生物的混合物中分离优选携带人类目的碳水化合物表位的碳水化合物阳性微生物的方法，包括：
(a)使对目的碳水化合物表位特异的碳水化合物结合分子与微生物混合物接触，和
(b)从所述混合物中分离至少一种结合至所述碳水化合物结合分子的微生物，
(c)任选地通过测试分离的微生物特异地结合至所述碳水化合物结合分子来测试分离的微生物为碳水化合物阳性微生物。
26该选择方法允许鉴定微生物，所述微生物携带目的碳水化合物表位从而为根据本发明制剂的合适组分。如上所述，所述碳水化合物表位优选为人类碳水化合物表位，例如肿瘤标记。
27如从实例明显看出的那样，存在几种与疾病特别是癌症(参见例如表1)相关的碳水化合物表位。此外，还存在已知的特异性结合所述人类目的碳水化合物表位的结合分子(参见表2)。此外，本文还描述用于产生对目的碳水化合物表位特异性的碳水化合物结合分子的方法。
28根据优选实施方式，所述方法还包括通过所述微生物和/或其片段和/或裂解产物在体内或体外测试有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答和/或体液免疫应答的诱导。根据此优选的实施方式，所述碳水化合物阳性微生物在至少一个人类或动物中诱导或增强针对目的碳水化合物表位的免疫应答，其识别目的碳水化合物表位和/或对所述碳水化合物表位呈阳性的肿瘤细胞。由于微生物对所述目的碳水化合物表位呈阳性的事实，在给药鉴定出的微生物时，诱导/增强针对目的碳水化合物表位的免疫应答。从而建立免疫监视机制，其可以例如消除新产生的携带目的碳水化合物表位的肿瘤细胞，从而预防原发肿瘤生长，和/或其增强免疫系统和/或改进免疫应答。
29因此，根据优选实施方式，步骤(d)包括优选在至少一个动物或人类中和/或在体外，通过所述碳水化合物阳性微生物和/或其片段和/或裂解产物，测试有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答的诱导，所述免疫应答针对CD4阳性Th1型T细胞的激活和/或针对细胞毒性CD8阳性T细胞的激活。
30根据一个实施方式，在步骤(d)进行的所述细胞免疫应答包括：
i.)使至少一种树突细胞负载在步骤(a)至(c)中鉴定的碳水化合物阳性细胞；
ii.)使合适量的负载有所述碳水化合物阳性微生物的所述至少一种树突细胞与合适量的免疫细胞接触，所述免疫细胞能够被树突细胞激活或抑制；
iii.)培养以允许所述免疫细胞与所述负载的树突细胞相互作用；
iv.)添加合适量的抗原呈递细胞(APC)，所述抗原呈递细胞负载有合适量的至少一种携带与碳水化合物阳性微生物相同碳水化合物表位的第二化合物，其中所述第二化合物不同于所述碳水化合物阳性微生物；
v.)培养以再刺激所述免疫细胞
vi.)确定是否发生免疫细胞的再刺激。
31通过进行该细胞应答测试，可以确定所述碳水化合物阳性微生物上的特定碳水化合物表位是否能够触发细胞免疫应答。迄今为止现有技术推测碳水化合物不能触发细胞免疫应答。然而，现在已经发现特定碳水化合物表位能够引起细胞免疫应答。因此，提供测试系统是重要的，以用于确定由本发明方法鉴定的碳水化合物阳性微生物是否能够确实触发各自的细胞应答，从而确定所述微生物是否适于例如治疗。所述测试使用树突细胞，这是因为树突细胞能够启动并因而刺激免疫细胞例如T-细胞。树突细胞加工它们遇到的化合物，并且在它们的表面上呈递加工的化合物/抗原。然而，MHC细胞例如树突细胞仅能呈递特定种类的抗原，而确定目的抗原/表位是否能够由树突细胞呈递是重要的，因为仅此类抗原/表位能够引发细胞免疫应答。
32因此，使树突细胞负载有在步骤(a)至(c)中鉴定的碳水化合物阳性微生物。本文描述用于负载的合适条件。
33然后使所述负载的树突细胞与免疫细胞、特别是淋巴细胞例如T细胞接触。免疫细胞可以获自例如人类供体。呈递与免疫细胞的受体匹配的抗原的树突细胞可以激活并因而刺激淋巴细胞，由此使它们增殖和存活。与由树突细胞呈递的抗原不匹配的淋巴细胞不被激活并死亡。
34该第一轮刺激提供激活的淋巴细胞，其对由所述负载的树突细胞呈递的任何相应抗原是特异性的。然而，本步骤的目的在于鉴定碳水化合物阳性微生物是否能够刺激对碳水化合物表位特异的细胞应答。
35因此，进行选择步骤，其中淋巴细胞被再刺激以确定碳水化合物阳性微生物的碳水化合物表位是否刺激淋巴细胞并因而触发细胞应答。在所述选择步骤中，抗原呈递细胞例如树突细胞负载有也携带目的碳水化合物的第二化合物。然而，所述第二化合物不同于碳水化合物阳性微生物。该第二化合物也被APCs加工，并且抗原由所述APCs呈递。由于第二化合物不同于碳水化合物阳性微生物，大多数呈递的抗原，优选所有的抗原(包括目的碳水化合物)不同于在第一轮中呈递的抗原。这具有以下效果：仅那些找到匹配的由所述APCs呈递的抗原的淋巴细胞在再刺激的第二轮存活。在第一轮的树突细胞以及第二轮的APCs都呈递包括目的碳水化合物表位或由目的碳水化合物表位组成的抗原的情况下，由于它们也被再刺激，识别所述抗原的淋巴细胞被刺激并因而存活。当与负载有所述第二化合物的所述APCs接触时，未找到匹配的伴侣的那些淋巴细胞由于缺乏再刺激而死亡，其中所述第二化合物携带目的碳水化合物表位。该选择步骤确保检测针对目的碳水化合物的细胞应答。
36关于提供的可与本发明协同使用的测试系统的进一步实施方式描述于权利要求书和以下内容中。
37具有所述特性和优点的由所述方法鉴定的碳水化合物阳性微生物可用于根据本发明的制剂。根据本发明的制剂可用于预防和/或治疗目的和/或支持免疫学活性。
38本发明还提供制剂，其可用作药物组合物和用作保健食品，并且能够通过一系列不同的给药途径，包括全身给药，例如但不限于腹膜内、静脉内、皮内、皮下，甚至当通过口服途径给药微生物或其片段时令人惊奇地通过介导全身免疫应答的口服给药，来诱导针对在人类或动物细胞上的碳水化合物表位或针对疾病的免疫应答。
39本发明的制剂为保健食品或药物组合物，其包括至少一种被至少一种碳水化合物结合分子特异性结合的微生物，或其片段或裂解产物，所述至少一种碳水化合物结合分子结合在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位，由此所述微生物或其片段或裂解产物，或所述制剂，所述保健食品，或所述药物组合物在至少一个动物或人类中诱导有效的针对所述碳水化合物抗原的碳水化合物特异性细胞免疫应答，优选细胞毒性T细胞应答。
40在本发明的一个实施方式中，本发明的制剂可以为保健食品，并且提供用于诱导针对与特定碳水化合物表位或抗原相关的疾病的特异性免疫防护(immune shield)的手段。这与传统的益生菌(probiotics)和益菌元(prebiotics)相反，其不引起抗原特异性免疫应答，而是引起整体的免疫系统的非特异性诱导。与传统的接种策略相比，将本发明制剂用作保健食品具有几个优点。其中之一为对于患者或使用其的人而言重要的方便性。免疫刺激为碳水化合物表位或抗原特异性的，并且甚至在疾病或肿瘤确立之前就能够良好地诱导，建立特异性的免疫防护，以预防、抑制或降低此类疾病的发展，或以与治疗或疾病的其它治疗组合使用。因此，可以避免具有严重副作用的侵蚀性治疗(aggressive therapies)(例如化疗、放疗或手术)。在优选的实施方式中，个人不必须访问医师以积极地追求疾病预防，但可以获得引入到食品中的必需制剂，从而降低针对其它预防可能性的心理屏障。
41本发明的药物组合物还具有以下优点：它们能够靶向高医疗需求疾病(其中碳水化合物起重要作用)。
42不旨在限制，此类疾病和相关人类碳水化合物表位的实例列于表1。
表1
| 疾病 | 碳水化合物表位： |
| 黑色素瘤 | GM2，GD2，GD3L，GD3，9-O-乙酰基GD2，9-O-乙酰基GD3 |
| B细胞淋巴瘤 | GM2，GD2 |
| 小细胞肺癌 | GM2，岩藻糖基GM1，Globo H，聚唾液酸，sLe a(唾液酸化-Lewis a(sialyl-Lewis a)) |
| 乳腺癌 | GM2，Globo H，TF，Core-1，Gal β1-3GalNAc-，Le y(Lewis-Y(Lewis-Y)) |
| 前列腺癌 | GM2，Globo H，Tn，sTn，TF，Le y，sLe a，Core-1 |
| 肺癌 | GM2 Globo H，Le y，Core-1 |
| 结肠癌 | GM2，sTn，TF，Le y，Core-1， |
| 卵巢癌 | GM2，Globo H，sTn，TF，Le y，Core-1 |
| 胃癌 | GM2，Le y，Le a，sLe a，Core-1 |
| 神经母细胞瘤(Neuroblastoma)， | GM2，GD2，GD3L，聚唾液酸 |
| 肉瘤 | GM2，GD2，GD3L，GD3 |
| 胰腺癌 | sLe a，sLe x(唾液酸化Lewisx(sialyl Lewis x)) |
| 胃肠癌 | sLe a，sLe x |
| CD4+CD56+瘤形成(neoplasia) | sLe x (CD15) |
43然而，碳水化合物表位还可适于其它适应症，例如但不限于用于肺癌、肝癌、胃癌、肾癌、前列腺癌的TF，以及用于肾癌和肝癌的Core-1。
44令人惊奇地是，在人类或动物中给药之后，本发明制剂起针对碳水化合物阳性疾病或肿瘤细胞的免疫监视机制的作用。其诱导或增强人类或动物中的碳水化合物特异性免疫应答，所述免疫应答预防或降低疾病或肿瘤细胞的出现，所述疾病或肿瘤细胞的特征在于应用到人类或动物的碳水化合物抗原的表达。
45本发明制剂诱导高的特异性抗碳水化合物抗体滴度和/或甚至更令人惊奇的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答，所述碳水化合物特异性细胞免疫应答识别碳水化合物抗原或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞。可以用本文描述的筛选方法和测试系统鉴定合适的碳水化合物阳性微生物。
46由于制剂的生物性质，作为传统的免疫治疗制剂的生产，其生产更加低廉和省时。
47令人惊奇地是，本发明制剂具有内部佐剂性质，因此额外的佐剂或免疫增强剂载体不是在所有情况下都必需的。
A营养制品和药物组合物
48本发明提供选自以下的制剂：保健食品和药物组合物，其包括当接触时被至少一种碳水化合物结合分子识别并因而结合的至少一种碳水化合物阳性微生物，或其片段或裂解产物，所述至少一种碳水化合物结合分子特异性地识别在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位，由此所述微生物或其片段或裂解产物，或所述包括这些的制剂，诱导有效的针对以下的碳水化合物特异性细胞免疫应答：所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞。
49本发明的一个重要方面是碳水化合物阳性微生物和/或其碳水化合物阳性裂解产物或片段，其被至少一种碳水化合物结合分子，优选碳水化合物表位特异性抗体识别。因此当与所述碳水化合物结合分子接触时，碳水化合物阳性微生物和/或其碳水化合物阳性裂解产物或片段被碳水化合物结合分子特异性地结合。因此，在本发明的碳水化合物阳性微生物中，对于所述碳水化合物结合分子而言，与目的碳水化合物表位类似或相同的碳水化合物结构(其优选为人类碳水化合物表位)是可接近的，并不被其它结构“隐藏”。测试(合适的测试描述于以下)时可以确定的该重要特性确保碳水化合物阳性微生物和/或其碳水化合物阳性片段或裂解产物携带目的碳水化合物表位，并因此免疫化学上实际等同于目的碳水化合物表位，而不是仅与目的碳水化合物表位类似的表位。该特征对于确保免疫应答由所述碳水化合物阳性微生物触发是重要的，所述碳水化合物阳性微生物对目的碳水化合物表位是充分特异性的。可用于确定微生物携带目的碳水化合物表位的此类碳水化合物结合分子，在例如肿瘤相关环境中特异性地识别碳水化合物表位。还包括这样的微生物：其不是天然碳水化合物阳性的，但可以通过化学处理例如高碘酸盐处理来转化成碳水化合物阳性微生物。如果各微生物由于化学处理然后被碳水化合物结合分子识别并因此转化成碳水化合物阳性微生物，它们可以在例如高碘酸盐处理之后(暴露Core-1)用作本发明制剂的组分。
50在本发明的优选实施方式中，所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的所述诱导出现在至少一个人类或动物中。
51在本发明的另一优选实施方式中，所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的所述诱导在体外进行。
52在本发明的优选实施方式中，所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答包括针对以下的CD4阳性Th1型T细胞的激活和/或CD8阳性细胞毒性T细胞的激活：所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞。
53在本发明的优选实施方式中，所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答包括针对以下的CD4阳性Th1型T细胞的激活和CD8阳性细胞毒性T细胞的激活：所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞。
54本发明提供包括呈递人类或动物碳水化合物表位的微生物、和/或其裂解产物和/或片段的制剂，其诱导有效的碳水化合物特异性免疫应答，更优选有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答，更优选所述细胞免疫应答包括Th1辅助T细胞和细胞毒性T细胞的激活。
55在优选的实施方式中，本发明提供选自保健食品和药物组合物的制剂，其包括被至少一种碳水化合物结合分子特异性结合的至少一种微生物，或其片段或裂解产物，所述碳水化合物结合分子结合在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位，由此所述微生物或其片段或裂解产物，或所述制剂，所述保健食品，或所述药物组合物诱导有效的针对以下的碳水化合物特异性细胞免疫应答：所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞。
56在另一优选实施方式中，本发明提供包括携带或呈递至少一个人类或动物碳水化合物表位的至少一种微生物、和/或其裂解产物和/或片段的保健食品，其诱导针对以下的有效的碳水化合物特异性免疫应答，更优选有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答：所述碳水化合物表位、或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞，更优选所述的细胞免疫应答包括Th1辅助T细胞和细胞毒性T细胞的激活。
57在优选的实施方式中，本发明提供包括携带或呈递至少一个人类或动物碳水化合物表位的至少一种微生物、和/或其裂解产物和/或片段的药物组合物，其诱导针对以下的有效的碳水化合物特异性免疫应答：所述碳水化合物表位、或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞，更优选有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答，更优选所述的细胞免疫应答包括Th1辅助T细胞和细胞毒性T细胞的激活。
58优选本发明的药物组合物用于防止或减少表达人类或动物碳水化合物表位的疾病细胞的出现，和/或防止或减少所述细胞的传播或转移，所述细胞例如但不限于表达或包括人类或动物碳水化合物表位的肿瘤细胞或癌症细胞。
59在本发明另一实施方式中，该药物组合物用于治疗表达人类或动物碳水化合物表位的疾病或肿瘤。
60在本发明的优选实施方式中，将本发明的保健食品或药物组合物用作针对细胞或疾病的疫苗，所述细胞或疾病的特征在于碳水化合物表位或介导特异性的其部分的出现。
61本文在别处列出与碳水化合物表位相关或表达碳水化合物表位的所述疾病或肿瘤。
62本发明的药物制剂包括至少一种碳水化合物阳性微生物和药学上可接受的载体。本发明制剂(例如包括碳水化合物阳性微生物的药物)的制备和给药符合已知技术。例如，该制剂可以与传统的草药佐剂(galenic adjuvant)组合以形成适合所需施用方法的组合物。例如，本发明的化合物可以与传统的赋形剂混合的形式使用，所述赋形剂即不与活性化合物起有害反应的适于胃肠外或肠内施用的药学上可接受的有机或无机载体物质。适合的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯(pentaeyritol fatty acid esters)、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、滑石等。
63本发明的保健食品或药物组合物可以通过不同的施用或给药途径来给药至人或动物。在本文别处描述本发明意义上优选的给药途径。
64在本发明优选的实施方式中，保健食品或药物组合物为口服给药至人类或动物。
65本发明提供选自保健食品和药物组合物的制剂，其包括被至少一种碳水化合物结合分子结合的至少一种微生物，或其片段或裂解产物，所述碳水化合物结合分子特异性识别在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位，由此所述微生物或所述片段或所述裂解产物，或包括这些的所述制剂在至少一个动物或人类中诱导有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答。因此，本文中其它任何地方针对碳水化合物表位的免疫应答还指针对包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的免疫应答。
66在优选的实施方式中，所述制剂在人类或动物中诱导或增强针对所述碳水化合物表位的特异性免疫应答。
67在优选的实施方式中，所述制剂在人类或动物中诱导或增强针对所述碳水化合物表位的特异性免疫应答，由此所述碳水化合物表位与在人类或动物中的疾病相关。
68在另一优选实施方式中，针对所述碳水化合物表位的所述特异性免疫应答包括针对所述碳水化合物表位的体液免疫应答。
69针对所述碳水化合物表位的所述体液免疫应答导致在人类或动物中产生碳水化合物特异性抗体，并可以被如下所述的体液免疫应答测试确定。体液免疫应答的增强是指在给药本发明制剂后，已存在的针对所述碳水化合物表位的抗体滴度的增加。
70在另一优选实施方式中，针对所述碳水化合物表位的所述特异性免疫应答包括有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答。
71在另一优选实施方式中，所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答包括针对所述碳水化合物表位的CD4阳性Th1型T细胞的激活和CD8阳性细胞毒性T细胞的激活。
72在另一优选实施方式中，针对所述碳水化合物表位的所述特异性免疫应答包括有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答和体液免疫应答。
73在本发明的优选实施方式中，碳水化合物表位选自以下：TF，Core-1，Tn，唾液酸化-Tn，唾液酸化-TF，Globo-H，Lewis-Y，唾液酸化-Lewis-A，唾液酸化-Lewis-X，聚唾液酸，Lewis-X，GM2，GD2，GD3，9-O-乙酰基GD3，9-O-乙酰基GD2，GD3L，岩藻糖基GM1，岩藻糖基GM1，Lewis-A，Lewis B，sLac，唾液酸化1型链(sialylatedtype 1 chain)，CA 19-9抗原，CA 72-4抗原和CA-50抗原。
74在本发明的优选实施方式中，碳水化合物结合分子选自以下：至少一种凝集素、至少一种选择素，和/或至少一种抗体，和/或至少一种从其衍生的分子，其结合至TF，Core-1，Tn，唾液酸化-Tn，唾液酸化-TF，Globo-H，Lewis-Y，唾液酸化-Lewis-A，唾液酸化-Lewis-X，聚唾液酸，Lewis-X，GM2，GD2，GD3，9-O-乙酰基GD3，9-O-乙酰基GD2，GD3L，岩藻糖基GM1，Lewis-A，Lewis-B，sLac，唾液酸化1型链，CA 19-9抗原，CA 72-4抗原或CA-50，或结合至包括任何这些碳水化合物结构或其部分的表位。
75在优选的实施方式中，本发明提供选自保健食品和药物组合物的制剂，其包括被至少一种碳水化合物结合分子结合的至少一种微生物，或其片段或裂解产物，所述碳水化合物结合分子特异性识别在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位，由此所述微生物、所述片段或所述裂解产物，或包括这些的所述制剂在至少一个动物或人类中诱导有效的针对以下的碳水化合物特异性细胞免疫应答：所述碳水化合物表位、和/或所述包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞；其中
(i)所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答包括针对以下的CD4阳性Th1型T细胞的激活和/或CD8阳性细胞毒性T细胞的激活：所述碳水化合物表位、和/或所述包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞；和
(ii)碳水化合物表位选自：TF，Core-1，Tn，唾液酸化-Tn，唾液酸化-TF，Globo-H，Lewis-Y，唾液酸化-Lewis-A，唾液酸化-Lewis-X，聚唾液酸，Lewis-X，GM2，GD2，GD3，9-O-乙酰基GD3，GD3L，岩藻糖基GM1，岩藻糖基GM1，Lewis-A，Lewis-B，sLac，唾液酸化1型链，CA 19-9抗原，CA 72-4抗原和CA-50抗原；和
(iii)碳水化合物结合分子选自凝集素、选择素、和/或抗体、和/或从其衍生的分子，其结合至TF，Core-1，Tn，唾液酸化-Tn，唾液酸化-TF，Globo-H，Lewis-Y，唾液酸化-Lewis-A，唾液酸化-Lewis-X，聚唾液酸(polysialic acid)，Lewis-X，GM2，GD2，GD3，9-O-乙酰基GD3，GD3L，岩藻糖基GM1，岩藻糖基GM1，Lewis-A，Lewis-B，sLac，唾液酸化1型链，CA 19-9抗原，CA 72-4抗原或CA-50抗原，或结合至包括任何这些碳水化合物表位或其部分的碳水化合物结构。
76不旨在限制，碳水化合物结构和相应的碳水化合物结合分子的实例列于表2。
表2
1 Orntoft等Electrophoresis 1999，20，362-371
2 Glycotope GmbH Berlin，www.glycotope.com
3 vector laboratories，www.vectorlabs.com
4 Amano等Clin Diagn Lab Immunol 1997(Sep)，540-544
5 Acris Antibodies GmbH，www.acris-antibodies.com
6 Reaman等Cancer Res 199050(1)：202-5
7 CHEMICON International，Inc.www.chemicon.com
8 Ye等1992；50(2)：197-201
9 Husmann等J Histochem Cytochem 1990；38(2)：209-15
10 Calbiochem www.Calbiochem.com
11 DakoCytomation Dako Deutschland GmbH，Germany，www.dakogmbh.de
12 Dianova，Hamburg，Germany
13 Livingston等Cancer Immunol Immunother(2005)54：1018-1025
14 Clausen等Mol Immunol(1988)25：199-204
77在本文的定义和别处详细描述所述碳水化合物阳性微生物和碳水化合物阳性微生物的片段和裂解产物和其组合，以及用于鉴定和分离所述微生物或其片段的方法。
78在进一步优选实施方式中，本发明提供包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物的保健食品或药物组合物，其在至少一个人类或动物中诱导或增强针对碳水化合物表位的碳水化合物特异性免疫应答，通过具有破环携带或包括所述碳水化合物表位的癌细胞的潜力，来起抗碳水化合物表位阳性癌细胞的防护的作用。
79本发明意义上的碳水化合物表位阳性癌细胞是指表达、携带或包括所述碳水化合物表位或产生所述碳水化合物表位或与该碳水化合物表位相关的癌细胞。
80在进一步优选实施方式中，本发明提供包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物的保健食品或药物制剂，其在至少一个人类或动物中诱导或增强碳水化合物特异性免疫应答，通过具有破环所述细胞的潜力，来起抗来自疾病的细胞的防护的作用，所述疾病与所述碳水化合物表位相关。
81在本发明的进一步优选实施方式中，使用保健食品以构建所述碳水化合物特异性免疫应答，其通过在(至少一个)健康个体中口服该保健食品具有破环如上所述细胞的潜力，来起抗碳水化合物细胞的防护的作用。
82在进一步优选实施方式中，通过在至少一个健康个体中口服该保健食品，来使用本发明的保健食品以减少或甚至进一步优选预防碳水化合物阳性疾病或肿瘤的出现。
83在本发明的优选实施方式中，包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物的药物组合物用于构建碳水化合物特异性免疫应答，如实施例中所示并在本文中所述的，其通过具有破坏本文所示的那些细胞的能力，起抗碳水化合物表位阳性癌细胞的防护的作用：例如通过诱导碳水化合物表位特异性抗体，针对碳水化合物表位阳性癌细胞的碳水化合物表位抗体的碳水化合物表位特异性补体依赖性细胞毒性有效地杀死那些细胞；或通过利用碳水化合物表位特异性T细胞应答分泌TNFα和/或INFγ，杀死携带碳水化合物表位的那些肿瘤细胞，所述特异性T细胞应答被本领域技术人员已知的替代标记科学地识别以用于特异性细胞毒性T细胞介导的肿瘤细胞。
84本发明的保健食品或药物组合物用于在至少一个人类或动物中治疗碳水化合物阳性疾病或肿瘤。
85在本发明的优选实施方式中，通过在遭受此疾病的患者中口服该保健食品，使用包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段的保健食品以治疗碳水化合物阳性疾病或肿瘤。
86在本发明的优选实施方式中，使用包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段的药物组合物以在遭受此疾病的患者中治疗碳水化合物阳性疾病或肿瘤。
87在进一步优选实施方式中，使用本发明的保健食品或药物组合物以减少或甚至更优选预防碳水化合物阳性疾病或肿瘤或转移瘤的出现。
88在进一步优选实施方式中，本发明提供包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段的保健食品或药物组合物，当给药时在至少一个人类或动物中其减少或防止碳水化合物阳性疾病或肿瘤的传播或转移。
89在进一步优选实施方式中，本发明提供选自包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段的保健食品或药物组合物的制剂，其用于预防和治疗与碳水化合物表位相关的人类或动物疾病。
90在进一步优选实施方式中，本发明提供药物组合物，其用于通过在遭受此疾病的患者中给药该药物组合物来预防或减少肿瘤的传播或转移瘤的转移或传播或碳水化合物表位阳性肿瘤或肿瘤细胞的复发时间，以改进生活质量或平均存活(median survival)或复发时间变率，或以治疗具有碳水化合物表位阳性肿瘤的肿瘤患者。
91在本发明进一步优选实施方式中，保健食品或药物组合物包括至少两种不同的碳水化合物阳性微生物或其片段。
92在本发明另一优选实施方式中，保健食品或药物组合物包括至少两种不同的碳水化合物阳性微生物或其片段，其中该碳水化合物阳性微生物或片段对同一碳水化合物是阳性的。
93在本发明另一优选实施方式中，保健食品或药物组合物包括至少两种不同的碳水化合物阳性微生物或其片段，其中碳水化合物阳性微生物或片段对不同的碳水化合物是阳性的。
94在本发明另一优选实施方式中，前述本发明的保健食品或药物组合物包括至少一种碳水化合物阳性微生物和优选来自一种以上碳水化合物阳性微生物的至少一种碳水化合物阳性微生物片段，由此碳水化合物阳性微生物和碳水化合物阳性微生物的片段对同一或不同碳水化合物是阳性的。
95在本发明进一步优选实施方式中，保健食品或药物制剂包括与至少一种其它有益微生物组合的至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段。
96所述有益微生物优选为乳酸菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)。
97在另一优选实施方式中，本发明的保健食品或药物组合物包括至少一种碳水化合物阳性微生物片段和至少一种碳水化合物阳性微生物。
98在进一步优选实施方式中，本发明的保健食品或药物组合物包括与至少一种其它有益微生物(例如但不限于乳酸菌和/或双歧杆菌)组合的至少一种碳水化合物阳性微生物片段，更优选与其它有益微生物组合的的不同菌株的碳水化合物阳性微生物的片段的组合。
99选自保健食品和药物组合物的本发明的制剂可以由微生物或其片段单独组成，或可以进一步包括本文别处所述的以下成分或组分：例如但不限于一种以上的微生物或其片段，或其它微生物或其片段，或缓冲液，或载体，或药学上可接受的载体或食品。
100本发明的所述保健食品可以由至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段单独组成，例如但不限于活的或死的、冻干的、或巴氏灭菌的微生物，其裂解产物或组分或片段，或在液体中以至少部分溶解的形式；或其可由其它组分组成，所述其它组分例如但不限于本领域技术人员已知的其它营养物质、营养添加剂或食品或饮料添加剂、溶液或乳剂。所述保健食品可以以不同形式口服施用，例如胶囊、片剂、乳剂、粉末、液体。该保健食品可以以自身的形式提供或将其混入食品或饮料。所述保健食品还可为任何食品、饮料、食品或饮料的组分、食品添加剂或独立的保健食品。
101在优选的实施方式中，保健食品用作胶囊或片剂。在另一优选实施方式中，保健食品混入例如但不限于本发明别处所列的食品或饮料。
102本发明还涉及包括被至少一种碳水化合物结合分子结合的至少一种微生物、或其片段或裂解产物的保健食品，所述碳水化合物结合分子特异性识别在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位，由此所述微生物、所述片段或所述裂解产物，或包括这些的所述制剂在至少一个动物或人类中诱导有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答。
103在本发明的优选实施方式中，所述保健食品作为食品或食品添加剂应用到人类或动物。
104本发明上下文中的食品为被活生物体消耗的任何物质，包括液体饮料。食品为动物/人类能量和营养的主要来源，并且通常是动物或植物源的。该食品优选为素食食品，其通常包括不含动物产品(例如肉、奶或蛋)的所有类型食品。本发明上下文中的食品还优选为包含动物产品的非素食食品。本发明上下文中的食品为：
(i)旨在或合理预期被人类消化的任何物质或产品，无论是否加工、部分加工或未加工，无论是否有营养价值；(ii)水和其它饮料；
(iii)口香糖或糖果产品；和/或
(iv)在制备食品中用作成分或组分的物品或物质。
105本发明上下文中的食品通过农业、牧业和渔业，以及打猎、觅食和对局部某些种群存活重要的、但对其它种群次要的其它方法来传统上获得。在现代，在发达国家，食品供应日益地依赖于农业、工业化农场(industrial farming)、水产养殖和鱼类养殖技术，其旨在最大化生产的食物的量同时最小化成本。这些包括对已经开发的机械化工具(从脱粒机、条播机到拖拉机和联合收割机等)的依赖。这些与农药组合使用以促进高作物产量和与降低产量的那些昆虫或哺乳动物作斗争。最近，存在向更可持续发展的农业实践的增长的趋势。被消费者的需要部分推动的该方法鼓励生物多样性、地方自助(localself-reliance)和有机农业(farming)方法。
106本发明上下文中制造的食品(包含至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段的食品)种类为：
107饮料：啤酒、汁、软饮料、果汁饮料(squash)、酒、包含奶的饮料、奶制品或其它酒精饮料或非酒精饮料，例如水，包括汽水、果汁和蔬菜汁、软饮料、鲜果汁(aguas frescas)、柠檬水、可乐、姜汁无酒精饮料(ginger ale)、苏格兰饮料(irn bru)、根汁汽水(rootbeer)、菝葜汽水(sarsaparilla)、加香草饮料(cream soda)、蒲公英和牛蒡(dandelion and burdock)、果汁饮料(squash)、用水稀释的水果加香糖浆、运动饮料、浸液(infusions)、咖啡、茶、乳饮料(dairydrinks)，例如牛奶、酸乳饮料、巧克力奶、泡沫牛奶(milkshake)、鸡蛋酒(egg nog)、杏仁奶、欧洽塔(Horchata)、酒精饮料、鸡尾酒-混合饮料、热饮料，例如热巧克力、热苹果酒、卡布奇诺咖啡(cappuccino)或珍珠奶茶。
108面包对于许多国家是主食，由小麦或其它谷类发起来的面团(risen dough)制成，例如黑麦-小麦、吐司面包(toastbread)(白面包)、全粒(whole-grain)、小麦-黑麦、小麦面包、多种谷类(multi-grain)、黑麦、向日葵种子、南瓜种子、披萨、薄煎饼(chapatis)、玉米粉圆饼(tortillas)、法国棍子面包(baguettes)、皮塔饼(pitas)、拉法奇面包(lavash)、饼干、椒盐卷饼(pretzels)、圆盘烤饼(naan)、百吉饼(bagels)、普里面包(puris)、蛋糕、裸麦粗面包(pumpernickel)、全麦粉面包(wholemeal bread)、胚芽面包(wheatgerm bread)、全粒(wholegrain)、壳类面包(granary bread)和许多其它变体。
109蛋糕和饼干，例如天使蛋糕(angelfood cake)、bundt蛋糕、苹果蛋糕、巴布卡蛋糕(babka)、果仁馅的蛋糕(buccellato)、牛油蛋糕(butter cake)、蝴蝶蛋糕、胡萝卜蛋糕、酪饼(cheesecake)、巧克力蛋糕、圣诞蛋糕、戚风蛋糕(chiffon cake)、焦糖奶油松饼(croquembouche)、杯形蛋糕、魔鬼蛋糕(devil′s food cake)、葡萄干馅饼(eccles cake)、小仙人松糕(fairy cake)、水果蛋糕、德国巧克力蛋糕、热那亚式蛋糕(génoise cake)、姜饼(gingerbread)、水兵蛋糕(gob)、牛油蛋糕(gooey butter cake)、热牛奶蛋糕、冰激凌蛋糕、佳发蛋糕(jaffa cakes)、发酵蛋糕(leavened cake)、月饼、节日果子面包(panettone)、菠萝蛋糕、磅饼、伊丽莎白女王蛋糕、红豆糕(red bean cake)、红丝绒蛋糕(red velvet cake)、沙哈蛋糕(sachertorte)、重油水果蛋糕(simnel cake)、香草蛋糕(spicecake)、海绵蛋糕(sponge cake)、太阳饼(suncake)、茶点蛋糕(teacake)、塔坦姐妹蛋哒(tarte tatin)、香草切片蛋糕(vanillaslice)或结婚蛋糕。
110奶酪是凝固的奶制品，其中存在许多种类，例如撒丁奶酪(sardo cheese)、泰斯托里奶酪(testouri cheese)、南非软羊奶奶酪(bokmakiri cheese)、Kwaito奶酪、wookie奶酪(wookie cheese)、中东软牛奶奶酪(ackawi cheese)、篮奶酪(basket cheese)、浓缩酸奶(labneh)、jibneh arabieh奶酪(jibneh arabieh cheese)、kenafa奶酪(kenafa cheese)、中东白盐水奶酪(naboulsi cheese)、平房奶酪(paneer)、熟奶酪(affineur)、阿尔卑斯山奶酪羊酪(brimsen)、dachsteiner、具有灰芯的口感较重的奶酪(tyrolean greycheese)、福拉尔贝格奶酪(luneberg)、beauvoorde奶酪(beauvoordecheese)、布鲁塞尔奶酪(brussels′cheese)，荷芙奶酪(hervecheese)，林堡干酪(limburger cheese)，马里斯奶酪(maredsouscheese)，帕森达尔(passendale cheese)，高原荷芙奶酪(plateaude herve cheese)，波思泰尔奶酪(postel cheese)，里迈多奶酪(remedou cheese)，丹麦蓝奶酪(danish blue cheese)，丹麦太尔西特干酪或太尔西特哈瓦蒂干酪(danish tilsit or tilsit havarti)，阿苟以瑞士多孔干酪(
emmental cheese)，康宝诺拉奶酪(cambozola cheese)，哈尔茨奶酪(harzer cheese)，林堡干酪(limburger cheese)，
奶酪(
cheese)，希腊白软干酪(feta cheese)，塞浦路斯奶酪(halloumi cheese)或莫泽雷勒干酪(mozzarella cheese)。
111餐后甜点(dessert)通常为甜的菜(course)，一般在主菜(main course)后提供，例如冰淇淋如饼干(biscuits)或饼干(cookies)、蛋糕、酥皮水果甜点心(crumbles)、乳蛋糕(custards)、水果、明胶甜点(gelatin desserts)、冰淇淋、蛋白甜饼(meringues)、面粉糕饼(pastries)、馅饼或果馅饼(tarts)、布丁、果汁冰糕(sorbets)、蛋奶酥(soufflés)或屈莱弗甜食(trifles)。
112炸薯条(french fries)、片(chips)，例如马铃薯片或″油炸马铃薯片(crisps)″、玉米脆片(tortilla chips)或玉米片(cornchips)。
113功能性食品(功能性食品还被称为保健食品，为多用途的营养品和药物，可以包括被基因修饰的食品，一般种类包括由功能性食品成分制造、或用健康促进添加剂，如″富维生素″产品加强的加工食品，以及附加有有特殊要求的新鲜食品(例如蔬菜))。
114果酱和果冻，例如醋栗(gooseberries)-、红醋栗(redcurrants)-、黑醋栗(blackcurrants)-、柑橘(citrus fruits)-、苹果-、树莓(raspberries)、草莓-、黑莓-果酱或蜂王浆(royaljelly)。
115意大利面(pasta)，例如花饰意大利面(shaped pasta)、短意大利面(campanelle)、中等意大利面(casarecci)、卷心意大利面(cavatelli)、意大利贝壳粉(conchiglie)、大贝壳意大利面(conchiglioni)、蝴蝶面(farfalle)、花瓣状意大利面(fiori)、螺旋面(fusilli)、螺旋形布卡提通心粉(fusilli bucati)、螺纹状短型意大利面(gemelli)、短型意大利面(gigli)、短型意大利面(gramigna)、蜗牛面(lumache)、大蜗牛面(lumaconi)、小圆筒通心面(maltagliati)、耳朵面(orecchiette)、大弯通心粉(pipe)、短切形意大利面(quadrefiore)、层层面(radiatori)、双螺旋意大利面(ricciolini)、轮形短切形意大利面(rotelle)、轮形短切形意大利面(rotini)、spiralini意大利面(spiralini)、牧师扼杀者意大利面(strozzapreti)、火炬型意大利面(torchio)或小螺线意大利面(trofie)。
116馅饼，例如熏肉和鸡蛋馅饼、鸡肉蘑菇馅饼、咸牛肉馅饼、康瓦尔郡菜肉烘饼(cornish pasty)、鱼排(fish pie)、肉派(kalakukko)、俄罗斯胡荽三文鱼鳕鱼馅饼(kulebjaka)、比萨饼(pizza pie)、猪肉馅饼(pork pie)、肉馅饼(pot pie)、羊肉馅饼(scotch pie)、肉馅马铃薯馅饼(shepherd′s pie)、由沙丁鱼和其它五种海鱼制成的馅饼(stargazy pie)、牛肉馅饼(steak pie)、牛排腰子馅饼(steak and kidney pie)、苹果馅饼(apple pie)、香蕉奶油馅饼(banana cream pie)、黑莓馅饼(blackberry pie)、蓝莓馅饼(blueberry pie)、波士顿馅饼(boston cream pie)、浆果馅饼(bumbleberry pie)、樱桃馅饼(cherry pie)、巧克力奶油馅饼(chocolate cream pie)、椰子奶油馅饼(coconut cream pie)、蛋黄馅饼(custard pie)、荷兰苹果馅饼(dutch apple pie)、葡萄馅饼(grape pie)、浅绿莱姆馅饼(key lime pie)、柠檬蛋白馅饼(lemonmeringue pie)、柠檬馅饼(lemon pie)、混合浆果馅饼(mixed berrypie)、桔子馅饼(orange pie)、桃子馅饼(peach pie)、大黄馅饼(rhubarb pie)、草莓-大黄馅饼(strawberry-rhubarb pie)、草莓馅饼(strawberry pie)或醋馅饼(vinegar pie)。
117比萨，例如经典类型和它们各自的浇头(topping)，包括海员式沙司(marinara)或那不列塔那(napoletana)：西红柿、橄榄油、牛至和大蒜；玛格丽特比萨(margherita)：西红柿、橄榄油、鲜罗勒(basil)叶、和白牛奶(fior-di-latte)(由奶牛的奶制成的莫泽雷勒干酪(mozzarella))或莫泽雷勒奶酪(mozzarella di bufala)；formaggioe pomodoro：西红柿、橄榄油和帕尔玛奶酪(grated parmesan cheese)，罗勒叶是任选的；雪芭(ripieno)或半圆形烤乳酪馅饼(calzone)：白牛奶(fior-di-latte)或莫泽雷勒奶酪(mozzarella dibufala)，有时还有意大利乳清干酪(ricotta cheese)、橄榄油和萨拉米香肠(salami)、其它肉、蔬菜等或斯特隆波里比萨(Stromboli)：莫泽雷勒干酪、肉、蔬菜等。
118加工的肉(processed meats)，例如来自两栖类的肉、蟾蜍、人造肉(artificial meat)、仿制肉(imitation meat)、体外肉(invitro meat)、牛肉(牛(bovines))、水牛(buffalo)、牛(cattle)、牛排(steak)、小牛肉(veal)((小牛)calves)、牦牛、家禽(鸟)、鸡、鸭、猎鸟(game birds)、火鸡、犬科动物(canids)、海鲜、鱼、鲨鱼、甲壳类、螃蟹、兔子、羊肉(绵羊)、羔羊、猪肉(猪)、火腿(腰腿肉(haunch))、熏肉(熏制的肉条)或昆虫。
119三明治，例如阿拉姆三明治(aram sandwich)、法式长棍面包(filled baguette)、熏肉三明治(bacon butty)、小圆面包(bun)、汉堡包(burger)、墨西哥玉米煎饼(burrito)、薯条三明治(chipbutty)、总会三明治(club sandwich)、乳酪烤三明治(grilledcheese)、土耳其沙威玛
乔治亚热狗(georgia hots)、起士三明治(melt sandwich)：鲔鱼起士三明治(tuna melt)等、帕尼尼三明治panini)、牛排三明治(steak sandwich)、油炸三明治(taco)、茶点三明治(tea sandwich)、土司三明治(toastedsandwich)、墨西哥三明治(torta)或三明治(wrap)。
120色拉，例如凯撒色拉(caesar salad)、主厨色拉(chefsalad)、科布色拉(cobb salad)、希腊式色拉(greek salad)、意大利式色拉(italian salad)、什锦色拉(mesclun salad)、尼斯色拉
豆色拉(bean salads)例如绿豆色拉(green beansalad)、七豆色拉(seven bean salad)、鸡肉色拉(chicken salad)、鸡蛋色拉(egg salad)、水果色拉(fruit salad)(在其自己汁中的切片、剥皮的水果或带皮的水果)、泰式鸡肉色拉(larb)、意大利面色拉(pasta salad)、马铃薯色拉(potato salad)、日式色拉(somen salad)、青木瓜色拉(som tam)、它不理色拉(tabouli)、沃尔多夫色拉(waldorfsalad)或水门色拉(watergate salad)。
121沙司(sauce)，例如白沙司、蘑菇沙司、阿勒曼德沙司(sauceallemande)、美国沙司(sauce américaine)、家禽胸脯肉冻沙司
天鹅绒褐色沙司(eloutébrown sauces)、波尔多葡萄酒酱(bordelaise sauce)、勃艮第沙司(bourguignonnesauce)、烤里脊牛排沙司(chateaubriand sauce)、非洲沙司(sauceafricaine)、(sauce robert)、牛奶沙司(béchamel sauce)、茅内沙司(mornay sauce)、乳化沙司(emulsified sauces)、贝阿恩沙司(béarnaise sauce)、荷兰式沙司(hollandaise sauce)、蛋黄酱(mayonnaise)、鞑靼沙司(tartar sauce)、色拉奶油(salad cream)、奶油沙司(butter sauces)、奶油白沙司(beurre blanc)、巴黎咖啡沙司(caféde paris)、甜沙司(sweet sauces)、鱼沙司(fish sauce)、咖哩饭调味品(sambal)、烧烤沙司(barbecue sauce)、墨西哥巧克力辣沙司(mole)、马铃薯沙司(tomato sauce)或酸奶黄瓜沙司(tzatziki)。
122香肠，例如辣熏肠(andouille)、黑香肠(black pudding)、血肠(blood sausage)、南非香肠(boerewors)、德国熟香肠(bratwurst)、早餐香肠(breakfast sausage)、酒肠(butifarra)、蒜味辣肠(chorizo)、坎伯兰香肠(cumberland sausage)、法伦香肠(falukorv)、西班牙干肉肠(fuet)、苏格兰布丁(haggis)、用肉、血和谷类填充肠衣制得的东欧香肠(kieska)、波兰熏肠(kielbasa)、用肉、血和谷类填充肠衣制得的东欧香肠(kishka)、水煮和烘烤的腊肠(kishke)、德国蒜肠(knackwurst)、波兰香肠(kovbasa)、乡村猎人香肠
葡萄牙猪肉香肠肝肠(liversausage)、加利亚传统干香肠(lukanka)、生熏软质猪肉香肠(mettwurst)、甜馅(mincemeat)、意大利大香肠(mortadella)、意大利腊肠(salami)、由肉类、香料和辣椒制成的香肠(soujouk)、图林根肠(thüringer)、小牛肉香肠(weiβwurst)或白布丁(white pudding)。
123休闲食品(snack food)：糖果、马铃薯片、巧克力、硬饼干、块状糖(candy bars)、垃圾食品(junk food)例如煮花生、块状糖、芝多司(cheetos)、美国通用磨房公司制造的零食chex mix(chexmix)、饼干(cookies)、薄脆饼干(crackers)、套餐(combos)、牛奶巧克力软糖圆形小吃饼(fudge rounds)、呼拉圈(hula hoops)、冰淇淋(ice cream)、月饼(moon pies)、由Robert′s American Gourmet Food公司制造的休闲食品pirate′s booty(pirate′s booty)、爆米花(popcorn)、熏制猪肉皮(pork rinds)、马铃薯片(potato chips)、椒盐卷饼(pretzels)、聪明松饼(smart puffs)、软饮料(softdrinks)、雪球(snow balls)、学生食品(student food)、瑞士蛋糕卷(swiss cake rolls)、(tings)、奶油夹心饼(twinkies)、由Robert’s American Gourmet Food，Inc.制造的小吃veggie booty(veggiebooty)或斑马蛋糕(zebra cakes)。
124汤例如餐后甜点汤(dessert soups)(芋头甜点(gina taan)、(由椰子汁、牛奶、水果和西米露(tapioca pearls)制成的菲律宾汤))；甜豆汤(oshiruko)、一种日本赤豆汤或水果汤、甜瓜汤(winter melonsoup)、味噌汤(miso soup)、越南汤牛河(pho)、拉面(ramen)、汤面(saimin)、罗马尼亚马铃薯汤(romanian potato soup)、鸡肉柠檬蛋汤(avgolemono)、罗宋汤(borscht)、浓味鱼肉汤(bouillabaisse)、卡拉罗叶汤(callaloo)、韭菜鸡汤(cock-a-leekie)、牛奶和鳕鱼为基底的汤(fanesca)、西班牙凉菜汤(gazpacho)、小扁豆汤(lentilsoup)、蔬菜通心粉汤(minestrone)、咖哩肉汤(mulligatawny soup)、苏格兰浓汤(scotch broth)、荷兰豆子汤(snert)、色尔扬可汤(solyanka)、冻酸奶汤(tarator)或根特炖汤(waterzooi)。
125糖或糖产品例如糖浆、糖果或巧克力。
126酸奶、凝乳、酸奶油、搅奶油例如酸奶昔(lassi)、克菲尔(kefir)、稀酸奶(ayran)、气乳酪(doogh)或冻酸奶(tarator)。
127饮料粉或片例如维生素饮料或矿泉饮料(mineral drinks)。
胶囊或片
128治疗食品(治疗食品是为了特定目的，通常是营养、治疗目的而设计的食品)、功能性食品、医疗食品、肠道食品、胃肠外食品、特定健康用途的食品。
129实例为Ensure，一种最初为老人设计的加强奶昔饮料(fortified milkshake drink)，和Plumpy′nut，一种为严重营养不良儿童的紧急喂养而设计的花生类食品。
130在另一优选实施方式中，本发明的制剂制备成非处方药。
131所述针对碳水化合物表位的体液免疫应答是针对碳水化合物 表位的抗体应答，其可以被体液免疫应答测试1、2、3、4、5或6的至少一种检测。各测试还可与鉴定合适的根据本发明的碳水化合物阳性微生物的方法组合使用。
132在优选的实施方式中，本发明提供针对碳水化合物表位的体 液免疫应答测试(体液免疫应答测试1)，其包括：在ELISA中测试血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体至化合物例如携带碳水 化合物表位的蛋白质或多肽的结合，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：抗体至携带所述碳水化合物表位的化合物例如蛋白质或多肽的结合比抗体至无碳水化合物表位的化合物例如蛋白质或多肽或至在破坏碳水化合物表位的酶处理或化学处理之后的所述化合 物(例如蛋白质或多肽)的结合显著更高。在优选的实施方式中所述抗体的结合在给药保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂之后比在所述给药之前获得的相应血清中抗体或获自血清、血浆或粪便的抗体的结合显著更高。
133碳水化合物表位的所述酶处理或化学处理破坏碳水化合物表位的碳水化合物结构。碳水化合物表位的所述酶处理或化学处理可以使用本领域技术人员已知的技术进行，例如但不限于用神经氨酸酶、唾液酸酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖苷酶、外切糖苷酶、岩藻糖苷酶、β-N-乙酰氨基己糖苷酶(HexNAcase)或高碘酸处理(如实施例中所述的温和高碘酸盐氧化/高碘酸盐处理)。
134例如碳水化合物表位Core-1和Tn如实施例中所述被用高碘酸处理破坏。
135体液免疫应答测试1优选实施方式的实例在实施例11中详细描述。实施例11描述了在ELISA中针对以下测试针对碳水化合物表位Core-1的体液免疫应答：针对去唾液酸胎球蛋白(asialoglycophorin)，一种携带碳水化合物表位的蛋白质；血型糖蛋白(glycophorin)，其为相同蛋白但具有被唾液酸遮蔽的Core-1；以及针对高碘酸处理的去唾液酸胎球蛋白，由此使用高碘酸的处理破坏Core-1结构。
136在另一优选实施方式中，本发明提供针对碳水化合物表位的 体液免疫应答测试(体液免疫应答测试2)，其包括，在ELISA中，测试血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体至偶联到聚丙烯酰胺的碳水化合物结构(PAA缀合物)的结合，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：抗体至包括该碳水化合物表位的PAA-缀合物的结合比抗体至破坏该碳水化合物表位的酶处理或化学处理之后的相同PAA-缀合物显著更高，和/或抗体至包括该碳水化合物表位的PAA-缀合物的结合比不包括该碳水化合物表位的PAA-缀合物更高，优选两者。在优选的实施方式中，所述抗体至包括碳水化合物表位的PAA-缀合物的结合在给药保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂之后比在所述给药之前获得的相应血清中抗体或获自血清、血浆或粪便的抗体的结合显著更高。
137体液免疫应答测试2的优选实施方式在实施例11中详细描述。
138在另一优选实施方式中，本发明提供针对碳水化合物表位的 体液免疫应答测试(体液免疫应答测试3)，其包括，在流式细胞仪测试中，测试血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体至包括该碳水化合物表位的细胞和至不包括该碳水化合物表位的细胞的结合，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：抗体至包括该碳水化合物表位的细胞的结合比至对于该碳水化合物表位呈阴性的细胞显著更高。在优选的实施方式中，所述抗体至包括碳水化合物表位的细胞的结合在给药保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂之后比在所述给药之前获得的相应血清中抗体或获自血清、血浆或粪便的抗体的结合显著更高。体液免疫应答测试3的优选实施方式在实施例11中详细描述。
139在另一优选实施方式中，本发明提供针对碳水化合物表位的 体液免疫应答(体液免疫应答测试4)，其包括，在免疫荧光测试中，测试血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体至包括该碳水化合物表位的细胞和至对于该碳水化合物表位呈阴性的细胞的结合，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：抗体至包括该碳水化合物表位的细胞的结合比至不包括该碳水化合物表位的细胞和/或至破坏该碳水化合物表位的酶处理或化学处理之后包括该碳水化合物表位的细胞显著更高。在优选的实施方式中，至包括碳水化合物表位的细胞的结合在给药保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂之后比在所述给药之前获得的相应血清中抗体或获自血清、血浆或粪便的抗体的结合显著更高。通过连续稀释抗血清和/或通过在相同曝光条件下照相可以使免疫荧光测试更加定量。
140本领域技术人员能够鉴定合适的载体分子和偶联合适的结构以获得具有或不具有连接子的偶联到载体分子的所需要的碳水化合物结构。本领域技术人员还能够选择用或不用酶处理或化学处理的那些细胞或抗原，并且选择和修改合适的方法以测试对于碳水化合物表位的体液免疫应答。然而，本发明提供的上述体液免疫应答测试1至4，特别是本发明所提供的其优选的组合为明确优选的，并且从实施例中还可以看出在特异性方面具有明显的优点。
141另一优选实施方式中，本发明提供针对碳水化合物表位的体 液免疫应答测试(体液免疫应答测试5)，其包括：
a)将用合适量的标记例如铕或铬-51标记的合适量的包括碳水化合物表位的细胞与合适量的血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体以及合适量的补体(complement)一起孵育合适的时间(典型的在3至5小时之间或过夜)；
b)在a)的孵育之后通过确定标记例如铕或铬-51的释放测定细胞的裂解，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：包括该碳水化合物表位的细胞比不包括该碳水化合物表位的细胞裂解显著更高，和/或显示：包括该碳水化合物表位的细胞的裂解比不用补体的裂解和/或比不用抗体的裂解和/或比使用不结合到包括该碳水化合物表位的细胞或较少结合到其的抗体的裂解更高。
142所述体液免疫应答测试5在靶细胞裂解测试中，测试诱导的体液免疫应答或碳水化合物特异性抗体的碳水化合物特异性补体依赖性细胞毒性(CDC)，一种由特定抗体介导的效应子机制。该测试包括将用合适量的标记例如铕或铬-51标记的包括碳水化合物表位的合适量的细胞与合适量的血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体以及合适量的补体一起孵育合适的时间(典型的在3至5小时之间或过夜)。包括碳水化合物表位的细胞被允许测定被裂解的细胞的所述标记例如铕或铬-51标记。优选通过测定孵育后标记(例如铕或铬-51)的释放确定裂解细胞的量。合适的对照可以通过本领域技术人员确定，例如碳水化合物阴性细胞、不结合至靶细胞的抗体或抗体混合物和/或不使用补体。该测试在合适的抗体量、标记肿瘤细胞的数量、补体浓度和孵育时间方面可由本领域技术人员优化以用于本发明和之上所述。
143本发明的补体依赖性细胞毒性(CDC)优选使用铕释放检验(Europium Release Assay)确定。将靶细胞在4℃下在800μl铕缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，93mM NaCl，5mM KCl，2mM MgCl2，10mM二乙烯三胺五乙酸(diethylentriaminepentaacetic acid)，2mM乙酸铕(III))中孵育10分钟，在Multiporator(Eppendorf)中电穿孔(710V，1脉冲，30μs)，随后在冰上孵育又一10分钟。其后，在RPMI/5％FCS中洗涤该细胞5次，并接种在96孔圆底板(round-bottom plate)(Nunc；5x103/孔)中。然后添加20μl不同稀释倍数溶液的抗体或相应对照(培养基、同型对照人IgM)，之后在室温下孵育样品20分钟。将10μl 1∶10稀释的补体(仔兔补体)添加至相应的孔。在对照孔中添加10μl RPMI/5％ FCS以代替补体溶液。为了确定自发释放，将靶细胞仅与培养基孵育，用乙醇通过靶的完全裂解确定最大释放。随后在37℃下孵育4小时，将板在500x g下离心5分钟，将20μl来自每孔的无细胞上清液移液到在预制备的平底板(Nunc-I mmunoplateMaxisorp)上的200μl每孔的增强液(Perkin-Elmer Wallac)中。然后在室温下孵育15分钟，确定荧光(Victor2 Fluorometer，Perkin-ElmerWallac)。特异细胞毒性获自以下等式：(试验裂解-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)x100％。
144在另一优选实施方式中，本发明提供针对碳水化合物表位的 体液免疫应答测试(体液免疫应答测试6)，其包括：
a)将用合适量的标记例如铕或铬-51标记的合适量的包括碳水化合物表位的细胞和/或不包括碳水化合物表位的细胞与合适量的血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体以及合适量的至少一种免疫效应细胞或包括免疫效应细胞的细胞混合物或外周血单核细胞一起孵育合适的时间(典型的在3至5小时之间或过夜)，和
b)在a)的孵育之后通过确定标记例如铕或铬-51的释放测定细胞的裂解，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：包括碳水化合物表位的细胞比碳水化合物表位阴性细胞、比不用抗体的裂解和/或比使用不结合到包括该碳水化合物表位的细胞或较少结合到其的抗体的裂解更高。
145所述体液免疫应答测试6在靶细胞裂解测试中与免疫效应细胞组合，来测试诱导的体液免疫应答或碳水化合物特异性抗体的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)，一种通过特定抗体介导的效应子机制。该测试包括将合适量的标记的碳水化合物表位阳性靶细胞与合适量的血清中的抗体、或获自血清的抗体、或分离的碳水化合物表位抗体与合适量的免疫效应细胞例如在PBMC中呈递的那些细胞(外周血单核细胞)一起孵育合适的时间(典型的在3至5小时之间或过夜)。包括碳水化合物表位的细胞被允许测定被裂解的细胞的铕或铬-51标记。优选通过温育测定铕或铬-51的释放确定裂解细胞的量。合适的对照可以通过本领域技术人员确定，例如碳水化合物阴性细胞、不结合至靶细胞的抗体或抗体混合物和/或不使用免疫效应细胞(例如PBMC)。在合适的抗体量、标记肿瘤细胞的数量、免疫效应细胞数量和孵育时间方面可由本领域技术人员优化以用于本发明。
146本发明的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)优选使用铕释放检验确定。将靶细胞在4℃下在800μl铕缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，93mM NaCl，5mM KCl，2mM MgCl2，10mM二乙烯三胺五乙酸，2mM乙酸铕(III))中孵育10分钟，在Multiporator(Eppendorf)中电穿孔(710V，1脉冲，30μs)，随后在冰上孵育又一10分钟。其后，在RPMI/5％FCS中洗涤该细胞5次，并接种在96孔圆底板(Nunc；5x103/孔)中。然后添加20μl不同浓度(在200μl孵育体积中0.05至50μg/ml终浓度)的Core1-特异性抗体或相应对照(培养基、同型对照IgG)，使用从100∶1至10∶1、优选50∶1的不同效应细胞/靶细胞比，添加PBMC(人外周血单核细胞，80μl)作为效应细胞。为了确定自发释放，添加无效应细胞的80μl RPMI/5％ FCS。用乙醇在靶的完全裂解之后确定最大释放。
147随后在37℃下孵育4小时，将板在500xg下离心5分钟，将20μl来自每孔的无细胞上清液移液到在预制备的平底板(Nunc-Immunoplate Maxisorp)上的200μl每孔的增强液(Perkin-Elmer Wallac)中。然后在室温下孵育15分钟，确定荧光(Victor2 Fluorometer，Perkin-Elmer Wallac)。特异细胞毒性获自以下等式：(试验裂解-自发裂解)/(最大裂解自发裂解)x100％。
148在优选的实施方式中，在测试之前所述体液免疫应答测试1 至6进一步包括：
a.将保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物、或包括这些的制剂给药至人类或动物
b.分离血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体。
149在本发明的进一步优选实施方式中，包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物的保健食品或药物制剂诱导针对碳水化合物表位的体液免疫应答，所述碳水化合物表位对体液免疫应答测试1至6中的至少两种体液免疫应答测试呈阳性，优选对体液免疫应答测试1和3、更优选对体液免疫应答测试1，2和3、更优选对体液免疫应答测试1，2，3和4、更优选对体液免疫应答测试1，2，3，4和6、更优选对体液免疫应答测试1，2，3，4和5呈阳性，最优选对所有6种体液免疫应答测试呈阳性。
150还提供细胞免疫应答测试。所述针对碳水化合物表位的细胞 免疫应答为针对碳水化合物表位的T细胞应答，其可被细胞免疫应答测试1至5的至少一种检测。更优选的为针对碳水化合物表位的细胞免疫应答，其为针对碳水化合物表位的细胞毒性T细胞应答或Th1型辅助T细胞应答。最优选的为针对碳水化合物表位的细胞应答，其为针对碳水化合物表位可被细胞免疫应答测试1，2，3，4和5检测的细胞毒性T细胞应答或Th1型辅助T细胞应答。所述测试还可与本文所述的鉴定合适的碳水化合物阳性微生物的方法联合使用，以测试/分析哪一种碳水化合物阳性微生物也能够触发细胞免疫应答。
151所述细胞免疫应答测试包括使负载有碳水化合物阳性微生物的树突细胞与免疫细胞接触，在合适条件下培养合适的时间，随后添加负载有至少一种碳水化合物表位携带分子的树突细胞以用于再刺激，在合适条件下培养合适的时间，随后测定分泌的GM-CSF、TNFα或INFγ的量，或测定T细胞的增殖，或GM-CSF、TNFα或INFγ的分泌的抑制，或通过针对碳水化合物表位的抗体的增殖，或测定碳水化合物表位在树突细胞上的呈递，或通过激活的免疫细胞，优选通过激活的T细胞测定碳水化合物表位阳性细胞的裂解。
152所述树突细胞，本文还称为DC，可以为任何树突细胞或树突细胞的混合物或包括树突细胞或至少一种树突细胞的细胞混合物。它们可以源自健康或有疾病的人类供体或源自动物，所述疾病例如但不限于肿瘤疾病或克罗恩病(Crohns disease)或碳水化合物表位阳性疾病或本文别处所列的疾病的一种。所述DCs可以如本领域技术人员已知的那样获得和加载，并且典型地获自来自人类血液或骨髓的CD34阳性前体细胞或CD14阳性单核细胞，其中使用本领域技术人员已知的合适分子的特定组合，其分化成未成熟的树突细胞(iDC)。iDCs负载有碳水化合物阳性微生物或碳水化合物表位携带分子，或合适的对照，使用本领域技术人员已知的合适分子的特定组合，使其进一步成熟以获得负载的树突细胞，所述负载的树突细胞对应于能够激活T细胞的负载的成熟树突细胞(mDC)。这些DC还具有朗格汉斯(Langerhans)细胞型。
153在优选的实施方式中，所述DC源自树突细胞系，例如但不限于人类树突细胞系NEMOD-DC(获自Glycotope GmbH Berlin，德国；www.glycotope.com)或Mutz-3。
154所述树突细胞的负载是指树突细胞以合适的分化和成熟状态与合适量的碳水化合物阳性微生物，或其片段或裂解产物或至少一种碳水化合物表位携带分子一起孵育合适的时间，典型地这发生在与合适的分子组合的上述成熟步骤内，典型地24至48小时，产生能够激活免疫细胞的负载的树突细胞，优选T细胞，包括碳水化合物表位特异性T细胞。
155所述免疫细胞可为PBMC(外周血单核细胞)或包括CD4+和/或CD8+T细胞，优选CD4+和CD8+T细胞的其它细胞群。本领域技术人员知道如何从人类或动物中获得这些细胞，这些细胞的产生可以包括从人类血液或从leukaphereses的血液细胞中通过聚蔗糖梯度(ficoll gradient)制备，并且在通过T细胞进一步富集的情况下可以包括特定的磁分选技术。
156在优选的实施方式中，树突细胞与免疫细胞在至少一种MHC类分子中，优选在MHC I类分子或MHC II类分子中，更优选在至少一种MHC I类分子和一种MHC II类分子中，更优选在更多MHC分子中，最优选在所有MHC分子方面匹配。后者可以通过从同一个体中获得树突细胞和免疫细胞来实现。
157对于免疫细胞与负载的树突细胞的培养以及对于随后负载的树突细胞的添加而言的合适时间和条件对于本领域技术人员是已知的，并且可由其考虑细胞所处的条件来优化。典型地孵育时间对于两步(初次激活和再刺激)的每一步为7至10天。
158所述碳水化合物表位携带分子在所述细胞免疫应答测试意义上是指充分量的携带碳水化合物表位的细胞或肿瘤细胞、携带碳水化合物表位的蛋白质、或携带碳水化合物表位的多肽。所述携带碳水化合物表位的细胞或肿瘤细胞可为活的或死的，或来自这些细胞的裂解产物或其片段，更优选裂解产物。携带碳水化合物表位的蛋白质可以为携带碳水化合物表位的任何蛋白质，例如其上碳水化合物表位结合在肿瘤上的载体蛋白。携带碳水化合物表位的多肽可以为携带碳水化合物表位的任何多肽，优选可以用碳水化合物表位在mDC上呈递的那些。
159所述碳水化合物阳性微生物在所述细胞免疫应答测试意义上是指充分量的特定碳水化合物阳性微生物，其可为活的或死的，或来自这些细胞的裂解产物或其片段，更优选其裂解产物或片段。
160对照用于进一步确认免疫应答的阳性。本领域技术人员能够使用合适的对照，如以下和实施例12中更详细描述的那些。实例为使用这样的对照，其负载到如上所述针对碳水化合物表位携带分子DC上，用于再刺激，并且可以包括：(i)对于碳水化合物表位呈阴性或不包括其的细胞，优选与碳水化合物表位阳性细胞有关或最大可能类似的细胞，其以相应的形式例如活的或死的，或来自这些细胞的裂解产物或其片段；(ii)不携带碳水化合物表位的蛋白质，优选与所用碳水化合物表位携带分子相同但无碳水化合物表位的蛋白质，优选无任何糖基化或具有不包括碳水化合物表位的伸长或缩短的碳水化合物结构；(iii)不携带碳水化合物表位的多肽，优选与所用碳水化合物表位携带分子相同但无碳水化合物表位的多肽，优选无任何糖基化或具有不包括碳水化合物表位的伸长或缩短的碳水化合物结构。其它对照可为(iv)以与负载有碳水化合物表位携带分子的mDC相同方法处理的未负载mDC，包括对于成熟必需的分子和条件，但无任何与碳水化合物表位携带分子或上述对照(i-iii)相应的其它分子。实例和优选实施方式详细地描述了最合适的对照，同时其它合适的对照可由本领域技术人员选择。
161在本发明的优选实施方式中，树突细胞为获自白血病细胞系MUTZ-3[如在DE10139428 A1，WO2003/023023A1，EP01419240，US20040265998，CA2457287，10139428.4(DE)，PCT/EP02/09260，02758474.7(EP)，US10/486,966，CA2,457,287中所述)]的功能性树突细胞或衍生自MUTZ-3的细胞，例如NEMOD-DC(例如NMD-100或NMD-200，获自Glycotope GmbH Berlin，德国[www.Glycotope.com])。这些树突细胞为活性树突细胞，其能够充分激活T细胞和在其表面上(包括在MHC类分子上)加工和/或呈递抗原。在本发明进一步优选实施方式中，树突细胞为获自MUTZ-3的功能性树突细胞或衍生自MUTZ-3的细胞，例如NMD-100或NMD-200，并且免疫细胞与MHC I类分子例如HLA-A2或HLA-B44，优选HLA-A2和HLA-B44匹配。在进一步优选实施方式中，包括碳水化合物表位的细胞的裂解产物用作碳水化合物表位携带分子。
162由于来自试验的变化，其对于本领域技术人员已知的细胞免疫方法特别典型，如本领域技术人员已知对于测试必须平行地设立对照。
163根据一个实施方式，本发明提供针对目的碳水化合物表位的 体外细胞免疫应答测试，其包括
a)使至少一种树突细胞负载第一碳水化合物阳性化合物，其中所述碳水化合物阳性化合物携带目的碳水化合物表位；
b)使合适量的负载有所述碳水化合物阳性化合物的所述至少一种树突细胞与合适量的可被树突细胞激活或抑制的免疫细胞接触；
c)培养以允许所述免疫细胞与所述负载的树突细胞相互作用；
d)添加合适量的抗原呈递细胞(APC)，其中所述抗原呈递细胞负载有合适量的至少一种第二化合物，所述第二化合物携带与所述第一化合物相同的碳水化合物表位，其中所述第二化合物不同于所述第一碳水化合物阳性化合物；
e)培养以再刺激所述免疫细胞；
f)确定再刺激的免疫细胞的量。
164本发明提供用于确定特定碳水化合物表位是否能够触发细胞免疫应答的方法。迄今为止现有技术推断碳水化合物不能够触发胞免疫应答。然而，现在已经发现特定碳水化合物表位能够引发细胞免疫应答。因而提供用于确定特定碳水化合物是否能够确实触发各自的应答，从而确定所述碳水化合物表位是否是合适的作用点(例如用于治疗)的检测系统，这是重要的。所以本发明使用树突细胞，这是由于树突细胞能够引发并因而刺激免疫细胞例如T细胞。树突细胞加工它们遇到的化合物并将加工的化合物/抗原在其表面呈递。然而，MHC细胞例如树突细胞仅能呈递特定种类的抗原，确定目的抗原/表位是否由树突细胞呈递是重要的，因为仅此类抗原/表位能够引发细胞免疫应答。该细胞免疫应答测试的原理还在图22中说明。
165因此，使树突细胞负载有目的化合物，所述目的化合物推断为目的碳水化合物结构/表位或携带有目的碳水化合物结构/表位。所述化合物可为例如携带如本文所述目的碳水化合物表位的微生物、肿瘤细胞或任何其它携带目的碳水化合物表位的化合物。本文描述用于负载的合适条件和合适的携带碳水化合物结构的化合物。
166然后使所述负载的树突细胞与免疫细胞，特别是淋巴细胞例如T细胞接触。免疫细胞可以获自例如人类供体。呈递与免疫细胞受体匹配的抗原的树突细胞激活并因而刺激淋巴细胞，从而允许它们增殖和存活。不与由树突细胞呈递的抗原匹配的淋巴细胞不激活并死亡。
167该第一轮刺激提供激活的淋巴细胞，其对任何相应的由所述负载的树突细胞呈递的抗原是特异的。然而，本方法的目的在于鉴定该目的碳水化合物表位/抗原是否能够刺激细胞应答。
168因此，进行选择步骤，其中淋巴细胞被再刺激以确定该目的碳水化合物是否刺激淋巴细胞并因而触发细胞应答。在所述选择步骤，使抗原呈递细胞例如树突细胞负载也携带目的碳水化合物的第二化合物。然而，所述第二化合物不同于第一化合物。该第二化合物也被APCs加工并且该抗原由所述APCs呈递。由于第二化合物不同于第一化合物，大多数呈递的抗原，优选所有的抗原(包括目的碳水化合物表位)不同于在第一轮中呈递的抗原。这具有以下效果：仅找到匹配的由所述APCs呈递的抗原的那些淋巴细胞在再刺激的第二轮中存活。在第一轮的树突细胞以及第二轮的APCs都呈递包括目的碳水化合物表位或由目的碳水化合物表位组成的抗原的情况下，识别所述抗原的淋巴细胞被刺激并因而存活，因为它们也被再刺激。当与负载有携带目的碳水化合物表位的所述第二化合物的所述APCs接触时未找到匹配的伴侣的那些淋巴细胞由于缺乏再刺激而死亡。该选择步骤确保检测针对目的碳水化合物的细胞应答。
169在最后一步确定淋巴细胞是否确实被再刺激。这可以通过例如确定以下来完成：
-如果淋巴细胞被(再)刺激，分泌的淋巴细胞的分泌产物例如干扰素α、干扰素γ或GM-CSF
-T细胞的增殖。
170此处描述用于确定再刺激是否发生的合适测试。
171当被树突细胞/APCs呈递时，通过使用特异性识别所述目的碳水化合物表位的碳水化合物结合结构能够增强所述测试的特异性。根据所述实施方式，在识别所述目的碳水化合物表位的碳水化合物结合分子的存在下，至少部分根据步骤c)的所述刺激的淋巴细胞与合适量的抗原呈递细胞(APC)接触，所述抗原呈递细胞负载有合适量的携带与所述第一化合物相同碳水化合物表位的至少一种第二化合物，其中所述第二化合物不同于所述碳水化合物阳性化合物。所述识别所述目的碳水化合物表位的碳水化合物结合分子阻断APCs与所述淋巴细胞的相互作用，从而防止再刺激，因此使细胞存活。该另外步骤进一步确保目的碳水化合物特异性刺激淋巴细胞并因而触发特异性细胞免疫应答。该特异性增强/确认步骤可以平行完成(通过拆分根据步骤c刺激的淋巴细胞)或通过另外地进行所述增强/确认步骤，并因而向后继续(afterwards).
172根据第一实施方式(细胞免疫应答测试1)，再刺激淋巴细胞的量/程度通过测定GM-CSF分泌来确定。例如分泌的GM-CSF的量可由ELISA或ELISPOT测定。
173根据优选实施方式，提供针对碳水化合物表位的细胞免疫应 答测试(细胞免疫应答测试1的实施方式)，其包括：
a)使合适量的负载有合适量的碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段、包括这些的制剂、本发明的保健食品或药物组合物的树突细胞与合适量的可被树突细胞激活或抑制的免疫细胞接触，所述树突细胞包括至少一种树突细胞、树突细胞(dendritic cells)或包括至少一种树突细胞的细胞混合物，所述免疫细胞包括至少一种免疫细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、包括至少一种T细胞的细胞混合物、或外周血单核细胞
b)在合适条件下培养合适的时间
c)添加负载有合适量的至少一种碳水化合物表位携带分子的合适量的树突细胞，所述树突细胞包括至少一种树突细胞、树突细胞(dendritic cells)或包括至少一种树突细胞的细胞混合物
d)在合适条件下培养合适的时间以再刺激
e)通过ELISA或ELISPOT测定分泌的GM-CSF的量，由此针对碳水化合物表位的阳性细胞免疫应答显示：(i)用负载有碳水化合物表位携带分子的所述树突细胞再刺激的所述免疫细胞的GM-CSF分泌比用相应未负载的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的GM-CSF分泌和/或比用相应的负载有未携带或包括碳水化合物表位的分子的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的GM-CSF分泌显著更高，和/或(ii)用负载有携带或包括碳水化合物表位的蛋白质、多肽或分子的所述树突细胞再刺激的所述免疫细胞的GM-CSF分泌比用负载有未携带或不包括碳水化合物表位的相应的蛋白质、多肽或分子的相应的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的GM-CSF分泌显著更高，和/或(iii)用负载有携带或包括碳水化合物表位的蛋白质、多肽或分子的所述树突细胞再刺激的所述免疫细胞的GM-CSF分泌比用携带或包括碳水化合物表位但化学处理或酶处理以破坏碳水化合物表位的相应的蛋白质、多肽或分子的相应的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的GM-CSF分泌显著更高，和/或(iv)用负载有包括碳水化合物表位的细胞裂解产物或片段的所述树突细胞再刺激的所述免疫细胞的GM-CSF分泌比用负载有对碳水化合物表位阴性的细胞裂解产物或不包括其的相应的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的GM-CSF分泌显著更高。
174相应的免疫细胞是指相同的免疫细胞，其为或包括至少一种免疫细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、包括至少一种T细胞的细胞混合物、或外周血单核细胞、或别处所述的其它细胞或细胞混合物，其可被树突细胞激活或抑制，其用于与用于所述免疫细胞的那些相比的对照和比较测试，以用于允许比较，所述对照和比较测试使用对照或测试分子、分子混合物、细胞、细胞裂解产物或片段、微生物或其片段的。
175相应的树突细胞是指相同的树突细胞，其为或包括能够激活T细胞，负载有合适量的至少一种碳水化合物表位携带分子的至少一种树突细胞(dendritic cell)、树突细胞(dendritic cells)或包括至少一种树突细胞的细胞混合物或别处所述的其它细胞和细胞混合物，其用于与用于所述树突细胞的那些相比的对照和比较测试，以用于允许比较，所述对照和比较测试使用对照或测试分子、分子混合物、细胞、细胞裂解产物或片段、微生物或其片段的。
176这对于本领域技术人员是已知的，并且它们可由本领域技术人员选择。其在实施例中更详细地显示。为清楚起见：例如，使来自相同制品(preparation)的相同量的免疫细胞与相同量的来自负载有相同量的去唾液酸胎球蛋白的制品的树突细胞接触，并且平行地与相同量的血型糖蛋白或高碘酸盐处理的去唾液酸胎球蛋白接触，并用于测试以允许最优比较。
177变化对于本领域技术人员是已知的，并且可以由其确定或更详细地描述于实施例。
178所述细胞免疫应答测试1通过测定特异性诱导的GM-CSF的分泌使用碳水化合物阳性微生物测试对碳水化合物表位特异的CD4+和/或CD8+T细胞的激活，其包括：使负载有碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段的树突细胞与免疫细胞接触，在合适条件下培养合适的时间，随后添加负载有碳水化合物表位携带分子的树突细胞以再刺激，在合适条件下培养合适的时间，随后测定应答于该再刺激分泌的GM-CSF的量。所述测定分泌的GM-CSF的量优选通过ELISA或ELISPOT、更优选ELISA来完成，并且对于本领域技术人员是已知的。在本发明最优选实施方式中，细胞免疫应答测试1包括：使获自源自负载有碳水化合物阳性微生物的MUTZ-3，NMD-100或NMD-200的细胞的功能性树突细胞与PBMC(外周血单核细胞)接触，所述PBMC至少在MHC I类(HLA-A2)和(HLA-B44)中匹配，在合适条件下培养这些细胞合适的时间，典型的7至10天，随后添加功能性树突细胞以再刺激，所述功能性树突细胞获自源自负载有包括碳水化合物表位的细胞的裂解产物或负载有碳水化合物携带分子的MUTZ-3的细胞，在合适条件下培养合适的时间，典型的7至9天，随后在ELISA或ELISPOT分析中测定分泌的GM-CSF的量。GM-CSF释放的ELISA和ELISPOT分析对本领域技术人员是已知的，并详细地描述于实施例。针对碳水化合物表位的阳性细胞免疫应答显示：用负载有包括碳水化合物表位的细胞裂解产物的DC再刺激的免疫细胞的GM-CSF分泌比负载有碳水化合物表位阴性细胞的DC再刺激的免疫细胞的GM-CSF分泌显著更高，和/或其显示：用负载有碳水化合物表位携带分子的DC再刺激的免疫细胞的GM-CSF分泌比用负载有碳水化合物表位阴性分子的DC再刺激的免疫细胞的GM-CSF分泌显著更高。细胞免疫应答测试1的优选实施方式在实施例12中更详细地描述。
179根据第二实施方式(细胞免疫应答测试2)，通过测定INFγ或TNFα分泌的量来确定再刺激淋巴细胞的量/程度。在优选的实施方式中，针对碳水化合物表位的所述细胞免疫应答测试2包括：
a)使合适量的负载有合适量的碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段、包括这些的制剂、本发明的保健食品或药物组合物的树突细胞与合适量的可被树突细胞激活或抑制的免疫细胞接触，所述树突细胞包括至少一种树突细胞、树突细胞(dendritic cells)或包括至少一种树突细胞的细胞混合物，所述免疫细胞包括至少一种免疫细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、包括至少一种T细胞的细胞混合物、或外周血单核细胞
b)在合适条件下培养合适的时间
c)添加负载有合适量的至少一种碳水化合物表位携带分子的合适量的树突细胞，所述树突细胞包括至少一种树突细胞、树突细胞(dendritic cells)或包括至少一种树突细胞的细胞混合物
d)在合适条件下培养合适的时间以再刺激，和
e)通过ELISA或ELISPOT测定分泌的IFNγ和/或分泌的TNFα的量，由此针对碳水化合物表位的阳性细胞免疫应答显示：(i)用负载有携带或包括碳水化合物表位分子的所述树突细胞再刺激的所述免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌比用相应未负载的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌显著更高，和/或用负载有携带或包括碳水化合物表位分子的所述树突细胞再刺激的所述免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌比用相应的负载有未携带或未包括碳水化合物表位的分子的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌更高，和/或(ii)用负载有携带或包括碳水化合物表位的蛋白质、多肽或分子的所述树突细胞再刺激的所述免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌比负载有未携带或不包括碳水化合物表位的相应的蛋白质、多肽或分子的相应的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌显著更高，和/或(iii)用负载有携带或包括碳水化合物表位的蛋白质、多肽或分子的所述树突细胞再刺激的所述免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌比用负载有携带或包括碳水化合物表位但化学处理或酶处理以破坏碳水化合物表位的相应的蛋白质、多肽或分子的相应的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌显著更高，和/或(iv)用负载有包括碳水化合物表位的细胞裂解产物或片段的所述树突细胞再刺激的所述免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌比用负载有对碳水化合物表位阴性的细胞裂解产物或不包括其的相应的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的IFNγ和/或TNFα分泌显著更高。
180所述细胞免疫应答测试2通过碳水化合物阳性微生物测试细胞毒性T细胞的激活，所述细胞毒性T细胞例如CTL(细胞毒性T淋巴细胞)和/或碳水化合物表位特异性激活的细胞毒性T细胞的Th1型细胞毒性T辅助细胞。所述测定分泌的IFNγ和/或TNFα的量优选通过ELISA或ELISPOT、更优选ELISPOT来完成，并且对于本领域技术人员是已知的。在本发明最优选实施方式中，细胞免疫应答测试2 包括：使获自源自负载有碳水化合物阳性微生物的MUTZ-3，NMD-100或NMD-200的细胞的功能性树突细胞与PBMC(外周血单核细胞)接触，所述PBMC至少在MHC I类(HLA-A2和HLA-B44)中匹配，在合适条件下培养这些细胞合适的时间，典型的7至10天，随后添加以再刺激功能性树突细胞，所述功能性树突细胞获自源自负载有包括碳水化合物表位或碳水化合物表位携带分子的细胞的裂解产物的MUTZ-3、NMD-100或NMD-200的细胞，在合适条件下培养合适的时间，典型的7至9天，随后通过ELISPOT分析测定分泌的IFNγ的量，和/或通过ELISA分析确定分泌的TNFα的量。TNFα和/或IFNγ的ELISA和ELISPOT分析对本领域技术人员是已知的，并详细地描述于实施例。细胞免疫应答测试2的优选实施方式详细地描述于实施例12。
181根据第三实施方式(细胞免疫应答测试3)，通过测定增殖和/或增殖诱导来确定再刺激淋巴细胞的量/程度。在优选的实施方式中，针对碳水化合物表位的所述细胞免疫应答测试3包括：
a)使合适量的负载有合适量的碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段、包括这些的制剂、本发明的保健食品或药物组合物的树突细胞与合适量的可被树突细胞激活或抑制的免疫细胞接触，所述树突细胞包括至少一种树突细胞、树突细胞(dendritic cells)或包括至少一种树突细胞的细胞混合物，所述免疫细胞包括至少一种免疫细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、包括至少一种T细胞的细胞混合物、或外周血单核细胞
b)在合适条件下培养合适的时间
c)添加负载有合适量的至少一种碳水化合物表位携带分子的合适量的树突细胞，所述树突细胞包括至少一种树突细胞、树突细胞(dendritic cells)或包括至少一种树突细胞的细胞混合物
d)在合适条件下培养合适的时间以再刺激，和
e)优选通过与比色测定联用的WST反应(如实施例中所述)，测定增殖和/或增殖诱导，由此针对碳水化合物表位的阳性细胞免疫应答显示：(i)当用负载有携带或包括碳水化合物表位的分子的所述树突细胞再刺激时，培养特定时间后的免疫细胞的增殖或T细胞的数量比当用相应未负载的树突细胞再刺激时的增殖或数量，和/或当用相应的负载有未携带或未包括碳水化合物表位的分子的树突细胞再刺激时的增殖或数量显著更高，和/或(ii)当用负载有携带或包括碳水化合物表位的蛋白质、多肽或分子的所述树突细胞再刺激时，培养特定时间后的免疫细胞的增殖或T细胞的数量比当用负载有未携带或不包括碳水化合物表位的相应的蛋白质、多肽或分子的相应的树突细胞再刺激时的增殖或数量显著更高，和/或(iii)当用负载有携带或包括碳水化合物表位的蛋白质、多肽或分子的所述树突细胞再刺激时培养特定时间后的免疫细胞的增殖或T细胞的数量比用负载有携带或包括碳水化合物表位但化学处理或酶处理以破坏碳水化合物表位的相应的蛋白质、多肽或分子的相应的树突细胞再刺激时的相应免疫细胞的增殖或数量显著更高，和/或(iv)当用负载有携带或包括碳水化合物表位的细胞裂解产物或片段的所述树突细胞再刺激时，培养特定时间后的免疫细胞的增殖或T细胞的数量比当用负载有对碳水化合物表位阴性的细胞裂解产物或不包括其的相应的树突细胞再刺激的相应的免疫细胞的增殖或数量显著更高。
182所述细胞免疫应答测试3通过测定T细胞增殖的诱导，使用碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物，测试碳水化合物表位特异性激活的T细胞的CD4+和CD8+T细胞的激活。其包括：使负载有碳水化合物阳性微生物的树突细胞与免疫细胞接触，在合适条件下培养合适的时间，随后添加负载有碳水化合物表位携带分子的树突细胞以再刺激，在合适条件下培养合适的时间，随后测定增殖。所述增殖诱导的测定优选使用与比色测定联用的WST反应以及仅DC和仅未再刺激的免疫细胞的推断来完成，这对本领域技术人员是已知的，并且描述于实施例12。在本发明最优选实施方式中，细胞免疫应答测试3包 括：使获自源自负载有碳水化合物阳性微生物或其裂解产物或片段的MUTZ-3，NMD-100或NMD-200的细胞的功能性树突细胞与PBMC(外周血单核细胞)接触，所述PBMC至少在MHC I类(HLA-A2和HLA-44)中匹配，在合适条件下培养这些细胞合适的时间，典型的7至10天，随后添加功能性树突细胞以用于再刺激，所述功能性树突细胞获自源自负载有包括碳水化合物表位或碳水化合物表位携带分子的细胞的裂解产物的MUTZ-3、NMD-100或NMD-200的细胞，在合适条件下培养合适的时间，典型的7至9天，随后如上和如实施例12详细所述测定增殖率。针对碳水化合物表位的阳性细胞免疫应答显示：用负载有碳水化合物表位携带分子的DC再刺激的T细胞的增殖比仅DC或与未负载mDC接触的T细胞或用负载有相应对照的DC的T细胞的增殖率更高。细胞免疫应答测试3的优选实施方式详细地描述于实施例12。
183在本发明另一优选实施方式中，提供针对碳水化合物表位的 细胞免疫应答测试(细胞免疫应答测试4)，其包括：
a)使合适量的负载有合适量以下的树突细胞(dendritic cell)、树突细胞(dendritic cells)或包括至少一种树突细胞的细胞混合物与合适量的至少一种碳水化合物结合分子接触：
(i)碳水化合物阳性微生物，其裂解产物或片段，
(ii)包括这些的制剂，
(iii)本发明的保健食品或药物组合物，或
(iv)携带或包括碳水化合物表位的分子，
(v)包括碳水化合物表位携带分子的混合物，
(vi)对碳水化合物表位、其裂解产物或片段呈阳性或包括碳水化合物表位、其裂解产物或片段的细胞；
b)测试所述碳水化合物结合分子的结合。
184当以下情况时存在碳水化合物表位在所述树突细胞上的阳性呈递：当碳水化合物结合分子至负载有碳水化合物表位携带分子的所述树突细胞的结合高于其至相应的未负载的树突细胞，和/或至负载有未携带或包括碳水化合物表位的分子的相应的树突细胞或携带或包括碳水化合物表位分子但经破坏碳水化合物表位的酶处理或化学处理后的相应的树突细胞的结合时；和/或当碳水化合物结合分子至负载有碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段、保健食品、药物组合物或其制剂的树突细胞的结合高于至相应的未负载的树突细胞，或至负载有未被碳水化合物结合分子结合的微生物的相应的树突细胞，或至负载有破坏碳水化合物表位的酶处理或化学处理后的碳水化合物阳性微生物的相应的树突细胞时。
185所述细胞免疫应答测试4测试在负载有碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物后，树突细胞在其表面呈递碳水化合物表位的能力，显示负载的树突细胞加工和呈递微生物来源的碳水化合物表位至免疫细胞例如T细胞的潜力，其包括：使合适量的碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物和处于合适的分化和成熟状态的树突细胞一起(优选使用本领域技术人员已知的合适的分子鸡尾酒随后成熟为mDC的未成熟DC)，以及通过测试本发明的碳水化合物结合分子至所述负载的DC的结合，测定负载的DC对碳水化合物表位的呈递。所述结合的测试通过合适的方法，优选本领域技术人员已知并描述于实施例的免疫细胞化学、免疫荧光或流式细胞仪，更优选通过免疫细胞化学来进行。
186当碳水化合物结合分子至负载有碳水化合物阳性微生物的DC的结合高于至未负载的DC，或更优选至负载有未被碳水化合物结合分子结合的微生物的DC，或负载有破坏碳水化合物表位的酶处理或化学处理后的碳水化合物阳性微生物的DC时，测试显示负载DC的阳性呈递。在本发明的优选实施方式中，细胞免疫应答测试4包括使合适量的功能性未成熟树突细胞与碳水化合物阳性微生物的裂解产物接触，所述功能性未成熟树突细胞获自衍生自MUTZ-3或NMD-100或NMD-200的细胞，随后使用例如实施例12中所述的合适的分子鸡尾酒，培养和成熟24h-48h，并且使用碳水化合物表位特异性抗体通过免疫荧光显微法(免疫细胞化学)测试碳水化合物表位的呈递。
187细胞免疫应答测试4的优选实施方式详细地描述于实施例12。
188本发明还提供针对碳水化合物表位的细胞免疫应答测试(细胞免疫应答测试5)，其包括：
a)在合适条件下使合适量的靶细胞与针对碳水化合物表位的至少一种免疫细胞或包括针对碳水化合物表位的至少一种免疫细胞的细胞混合物一起孵育合适的时间(典型地3-6小时或过夜)；所述靶细胞来自包括用合适量的标记例如铕或铬-51标记的碳水化合物表位的细胞系；和
b)通过确定标记例如铕或铬-51的释放测定靶细胞的裂解，由此针对碳水化合物表位的阳性细胞免疫应答显示：包括碳水化合物表位的细胞的裂解比碳水化合物表位阴性细胞的裂解显著更高，和/或其显示：与针对碳水化合物表位的免疫细胞一起孵育的包括碳水化合物表位的细胞的裂解比与不针对碳水化合物表位的相应的对照免疫细胞一起孵育的包括碳水化合物表位的细胞的裂解显著更高。
189所述CIRT 5测试针对碳水化合物表位的免疫效应细胞的碳水化合物表位特异性细胞毒性，所述免疫效应细胞例如但不限于T细胞、T细胞克隆、T细胞系、CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞，NK细胞和/或PBMCs。
190针对碳水化合物表位的免疫细胞的产生在本文别处描述。
191在本发明的优选实施方式中，针对碳水化合物表位的免疫细胞通过给药本发明的制剂、碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物给人类或动物，更优选通过给药本发明的制剂、碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物给人类或动物，然后从人类或动物中分离免疫细胞来获得。
192在本发明另一优选实施方式中，针对碳水化合物表位的免疫细胞在将它们用于CIRT 5之前用负载有本发明的制剂、碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物、或碳水化合物表位携带分子或肿瘤细胞的树突细胞再刺激至少一次。
193在本发明更优选实施方式中，针对碳水化合物表位的免疫细胞在将它们用于CIRT 5之前用负载有本发明的制剂、碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物碳水化合物表位携带分子或肿瘤细胞的树突细胞再刺激一次以上，由此将在不同载体(例如但不限于在微生物、分子、蛋白质或肿瘤细胞上或来自其的碳水化合物表位)上的碳水化合物表位用于再刺激的不同轮。
194该测试包括使合适量的标记的碳水化合物表位阳性靶细胞与合适量的针对碳水化合物表位的免疫细胞一起孵育合适的时间，典型地3至6小时或过夜。碳水化合物表位阳性细胞用允许测定被裂解的细胞的铕或铬-51标记。裂解细胞的量优选通过孵育后测定铕或铬-51的释放来确定。合适的对照可由本领域技术人员确定，例如碳水化合物表位阴性细胞或相应的不针对碳水化合物表位的对照免疫细胞。该测试在合适的标记肿瘤细胞的数量、免疫效应细胞的数量和孵育时间方面可由本领域技术人员最优化以用于本发明。
195在优选的实施方式中，使用铕释放检验(Europium ReleaseAssay)进行CIRT 5。将靶细胞在4℃下在800μl铕缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，93mM NaCl，5mM KCl，2mM MgCl2，10mM二乙烯三胺五乙酸，2mM乙酸铕(III))中孵育10分钟，在Multiporator(Eppendorf)中电穿孔(710V，1脉冲，30μs)，随后在冰上孵育又一10分钟。其后，在RPMI/5％ FCS中洗涤该细胞5次，并接种在96孔圆底板中(Nunc；5x103/孔)。其后，使用从100∶1至5∶1的不同效应细胞/靶细胞比，优选从50∶1至20∶1的效应细胞/靶细胞比，将针对碳水化合物表位的免疫细胞或相应的免疫细胞作为效应细胞添加(100μl/孔)。为了确定自发释放，添加100μl无效应细胞的RPMI/5％FCS。用乙醇在靶的完全裂解后确定最大释放。
196随后在37℃下孵育4小时，将板在500xg下离心5分钟，将20μl来自每孔的无细胞上清液移液到在预制备的平底板(Nunc-Immunoplate Maxisorp)上的200μl每孔的增强液(Perkin-Elmer Wallac)中。然后在室温下孵育15分钟，确定荧光(Victor2 Fluorometer，Perkin-Elmer Wallac)。特异性细胞毒性获自以下等式：(试验裂解-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)x100％。
197在本发明进一步优选实施方式中，包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其裂解产物或片段的保健食品或药物组合物诱导有效的针对碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答，所述碳水化合物表位对细胞免疫应答测试1至5中的至少两种细胞免疫应答测试呈阳性。
198在本发明更进一步优选实施方式中，包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其裂解产物或片段的保健食品或药物组合物诱导针对碳水化合物表位的的体液和细胞免疫应答，所述碳水化合物表位对至少一种体液免疫应答测试和至少一种细胞免疫应答测试呈阳性。
199在本发明更进一步优选实施方式中，包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其裂解产物或片段的保健食品或药物组合物诱导针对碳水化合物表位的的体液和细胞免疫应答，所述碳水化合物表位对至少两种体液免疫应答测试和至少两种细胞免疫应答测试呈阳性，优选对体液免疫应答测试1和3以及细胞免疫应答测试1和3，更优选对体液免疫应答测试1、2和3以及细胞免疫应答测试1、2和3，更优选对体液免疫应答测试1、2、3和4以及细胞免疫应答测试1、2、3和4，更优选对体液免疫应答测试1、2、3、4和6以及所有5种细胞免疫应答测试、更优选对体液免疫应答测试1、2、3、4和5以及所有5种细胞免疫应答测试呈阳性，最优选对所有6种体液免疫应答测试以及所有5种细胞免疫应答测试呈阳性。
200在另一优选实施方式中，本发明提供细胞免疫应答测试1至5，其中当与所述免疫细胞接触时，树突细胞、包括树突细胞的细胞混合物包括为成熟树突细胞的至少一种树突细胞。
201在另一优选实施方式中，本发明提供细胞免疫应答测试1至5，其中树突细胞、细胞混合物包括获自从MUTZ-3衍生的细胞的功能性树突细胞。
202在另一优选实施方式中，本发明提供细胞免疫应答测试1至5，其中所述免疫细胞与所述树突细胞至少在一种MHC I类分子中匹配。
203在另一优选实施方式中，本发明提供细胞免疫应答测试1至5，其中碳水化合物表位携带分子为包括碳水化合物表位的细胞的裂解产物或片段。
204在另一优选实施方式中，本发明涉及上述任何免疫应答测试在用于确定针对碳水化合物表位的免疫应答方面的用途，所述免疫应答在至少一个人类或动物中由根据本发明的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂诱导或增强。
205在另一优选实施方式中，本发明涉及上述任何免疫应答测试在用于测试未给药，或给药保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂至至少一个人类或动物之前，人类或动物中天然存在的免疫应答方面的用途。
206在另一优选实施方式中，本发明涉及上述任何免疫应答测试在用于确定和最优化本发明的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂的有效量、最大有效量、剂量、给药方案(dose regimen)、给药途径、组合物、制剂、载体和和与其使用的其它分子方面的用途。
207B)提供碳水化合物阳性微生物和用于测试碳水化合物阳性微生物诱导免疫应答的潜力的方法、用于分离碳水化合物阳性微生物的方法、用于鉴定对于保健食品和药物组合物合适的碳水化合物阳性微生物的方法。
208本发明提供碳水化合物阳性微生物，其可被至少一种碳水化合物结合分子识别/结合，所述碳水化合物结合分子还特异性识别在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位，由此所述微生物在至少一个动物或人类中诱导有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答。
209各碳水化合物阳性微生物和用于获得它们的方法的特性和优点描述于以上和以下。由于碳水化合物阳性微生物被至少一种碳水化合物结合分子结合并因而识别，所述碳水化合物结合分子还在其“天然”环境(例如在人类或动物细胞，如例如在肿瘤细胞上)中特异性地识别目的碳水化合物表位，这确保碳水化合物阳性微生物和/或其碳水化合物阳性片段或裂解产物携带碳水化合物结构，所述碳水化合物结构与目的碳水化合物表位在至少免疫化学上实际上等同。该特性对于确保免疫应答由对于目的碳水化合物表位充分特异的所述碳水化合物阳性微生物来触发是重要的。可用于确定微生物携带目的碳水化合物表位的此类碳水化合物结合分子，优选抗体，在例如肿瘤相关环境中特异性的识别碳水化合物表位。
210本发明提供碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物，当接触时其被至少一种碳水化合物结合分子识别并因而结合，所述碳水化合物结合分子特异性识别在来自人类或动物的分子上呈递的碳水化合物表位，所述碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物在至少一个动物或人类中，诱导有效的针对所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的碳水化合物特异性细胞免疫应答和/或体液免疫应答。
211在优选的实施方式中，碳水化合物阳性微生物在至少一个动物或人类中诱导有效的针对所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的碳水化合物特异性细胞免疫应答，优选包括CD4阳性Th1型T细胞的激活和/或CD8阳性细胞毒性T细胞的激活。
212本发明提供合适的碳水化合物阳性微生物以用于选自本发明的保健食品和药物组合物的本发明制剂，其中碳水化合物阳性微生物被至少一种碳水化合物结合分子结合，所述碳水化合物结合分子特异性识别在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位，由此所述微生物优选在至少一个动物或人类中诱导有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答。
213在另一优选实施方式中，所述免疫应答在体外诱导。
214本发明提供碳水化合物阳性微生物，其优选在至少一个人类或动物中和/或在体外诱导有效的针对所述碳水化合物表位、碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或碳水化合物表位阳性疾病的碳水化合物特异性细胞免疫应答。
215在优选的实施方式中，本发明提供或使用以下：
(i)本发明的碳水化合物阳性微生物，或
(ii)包括碳水化合物阳性微生物的保健食品或药物制剂，所述碳水化合物阳性微生物选自以下：
大肠杆菌(Escherichia coli)、链球菌(Streptococcus)、类杆菌(Bacteroides)、瘤胃球菌(Rhuminococcu s)、乳酸菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、梭杆菌(Fusobacterium)、约翰森菌(Johnsonella)、奇异菌(Atopobium)、葡萄球菌(Staphylococcus)、真细菌(Eubacterium)、芬戈尔德菌(Finegoldia)、梭菌(Clostridium)、埃格特菌(Eggerthella)、丁酸杆菌(Butyribacterium)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、螺杆菌(Helicobacter)、丙酸杆菌(Propionibacterium)和棒状杆菌(Corynebacterium)。
216更优选选自：大肠杆菌(Escherichia coli)、拟杆菌(Bacteroides)例如卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、嗜酸拟杆菌(Bacteroidesacidophilus)、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)。
217更优选选自：柏林(德国)Robert-
-Str.10，13125的Glycotope GmbH，于2006年10月20日保藏在不伦瑞克(Braunschweig)(德国)的“DSMZ-德国微生物和细胞培育采集中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)的新菌株Bacteroides ovatus AG6(DSM 18726)、新菌株Bacteroidesovatus MU1(DSM 18728)和新菌株Escherichia coli LH2(DSM 18727)。最优选新菌株AG6或MU1。
218在本发明进一步优选实施方式中，保健食品或药物制剂的碳水化合物阳性微生物为不同菌株的碳水化合物阳性微生物的组合。
219在进一步优选实施方式中，根据本发明制剂的碳水化合物阳性微生物为选自菌株AG6，MU1和LH2的不同菌株的碳水化合物阳性微生物的组合。
220在进一步优选实施方式中，本发明的保健食品或药物组合物包括与至少一种其它有益微生物组合的至少一种碳水化合物阳性微生物，所述有益微生物例如但不限于乳酸菌(lactobacillus)和/或双歧杆菌(bifidobacterium)，更优选与其它有益微生物组合的不同菌株的碳水化合物阳性微生物的组合。
221在本发明的优选实施方式中，碳水化合物阳性微生物为非致病性微生物。
222在本发明进一步优选实施方式中，碳水化合物阳性微生物分离自健康供体。
223在本发明进一步优选实施方式中，碳水化合物阳性微生物可以分离自健康供体。
224在本发明进一步优选实施方式中，碳水化合物阳性微生物作为活生物体用于保健食品或药物组合物。
225在本发明进一步优选实施方式中，碳水化合物阳性微生物以活生物体形式使用，并且口服。
226在本发明进一步优选实施方式中，用于保健食品或药物组合物的碳水化合物阳性微生物对至少一种抗生素敏感。
227在本发明进一步优选实施方式中，用于保健食品的碳水化合物阳性微生物可以移居到内脏。
228在本发明另一优选实施方式中，用于保健食品或药物组合物的碳水化合物阳性微生物是死的。
229在本发明更优选实施方式中，用于保健食品或药物组合物的碳水化合物阳性微生物是巴氏灭菌的。
230在本发明更优选实施方式中，碳水化合物阳性微生物作为活生物体用于保健食品或药物组合物，分离自健康人类供体，可以移居到人类内脏并且是抗生素敏感的。
231在本发明更优选实施方式中，碳水化合物阳性微生物以巴氏灭菌的形式用于保健食品，分离自健康人类供体的内脏，并且是抗生素敏感的。
232在本发明另一优选实施方式中，用于药物组合物的碳水化合物阳性微生物是死的或裂解的。
233在本发明进一步优选实施方式中，用于保健食品或药物组合物的碳水化合物阳性微生物是冻干的。
234本发明还提供用于测试碳水化合物阳性微生物或其片段诱导 针对碳水化合物表位的体液免疫应答的潜力的方法，其包括：
a)给药合适量的碳水化合物阳性微生物或其片段至至少一个人类或动物
b)在针对碳水化合物表位的体液免疫应答测试1-6中至少一种中测试免疫应答。
235本发明还提供用于测试碳水化合物阳性微生物或其片段诱导 有效的针对碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答的潜力 的方法，其包括：
a)给药合适量的碳水化合物阳性微生物或其片段至至少一个人类或动物
b)在至少一种针对碳水化合物表位的细胞免疫应答测试中测试免疫应答。
236在优选的实施方式中，本发明提供用于测试任何保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂诱导免疫应答的潜力和确定哪一种免疫应答被诱导的方法。
237在另一优选实施方式中，本发明提供确定剂量、给药方案、给药途径、制剂、用于保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂的载体或其它组分或与其一起使用的载体或其它组分。
238本发明还提供用于测试碳水化合物阳性微生物诱导体液免疫 应答的潜力的方法，所述测试方法包括体液免疫应答测试1至6中至少一种，优选至少两种，更优选3种，更优选4种，更优选5种，最优选所有6种体液免疫应答测试，由此至少一个动物或人类以口服或全身给药的方式(具有或不具有其它佐剂)给予以合适量的要测试的微生物，并且优选测试血清中的抗体或获自血清、血浆或粪便的抗体以与给予微生物之前的血清中的抗体或获自血清、血浆或粪便的抗体比较。本领域技术人员能够确定合适量的微生物和方法以从血液中获得抗体和合适的对照。本文和/或在实施例11中详细地描述该测试。
239本发明还提供用于测试碳水化合物阳性微生物诱导细胞免疫 应答的潜力的方法，所述测试方法包括细胞免疫应答测试1至5的至少一种，优选至少两种，更优选3种，更优选4种，最优选所有5种细胞免疫应答测试。
240本发明还提供用于测试碳水化合物阳性微生物诱导细胞毒性 细胞免疫应答的潜力的方法，所述方法包括至少细胞免疫应答测试2，优选2和1，更优选2、3，最优选所有5种细胞免疫应答测试。
241在本发明的两种实施方式中，测试要么如上所述在体外进行，要么细胞免疫应答测试1至3和5通过以口服或全身给药的方式(具有或不具有其它佐剂)给予至少一个动物或人类合适量的待测试微生物来进行，免疫细胞获自血液，并且(i)根据如上所述的细胞测试1至3或5测试，或(ii)根据如上所述的细胞测试1至3或5测试，区别在于免疫细胞不与负载有碳水化合物阳性微生物的树突细胞接触，仅添加负载有碳水化合物表位携带分子的树突细胞以用于再刺激。(i)优选用于增强体外效应和改善较弱的应答的读数，(ii)优选用于强应答。本领域技术人员能够确定合适量的微生物和合适的对照。该测试详细地描述于实施例12。
242在优选的实施方式中，本发明还提供用于测试碳水化合物阳 性微生物诱导体液和细胞免疫应答的潜力的方法，所述方法对应于上述方法的组合，包括体液免疫应答测试1至6的至少一种和细胞免疫应答测试1至5的至少一种，优选体液免疫应答测试1至6的至少两种和细胞免疫应答测试1至5的至少一种(更优选至少两种)，更优选体液免疫应答测试1至6的至少三种(更优选体液免疫应答测试1至6的至少4种)和所有的细胞免疫应答测试1至5，更优选体液免疫应答测试1至6的至少5种和所有的细胞免疫应答测试1至5，最优选所有6种体液免疫应答测试1至6和所有的细胞免疫应答测试1至5。
243本发明还提供鉴定本发明意义上的碳水化合物阳性微生物的方法和从碳水化合物表位阳性和阴性微生物的混合物中分离碳水化合物阳性微生物的方法。
244本发明还提供从微生物混合物中分离携带目的碳水化合物结构的碳水化合物阳性微生物的方法，其包括：
(a)使对目的碳水化合物结构特异的碳水化合物结合分子与微生物混合物接触，和
(b)从所述混合物中分离结合至所述碳水化合物结合分子的至少一种微生物，
(c)测试分离的微生物为碳水化合物阳性微生物并携带目的碳水化合物结构。
245各方法的细节也如上所述。
246在优选的实施方式中，本发明还提供用于从微生物混合物中分离碳水化合物阳性微生物的方法，其中在步骤(b)中磁性颗粒用于分离/富集结合至所述碳水化合物结合分子的微生物。
247在优选的实施方式中，本发明涉及用于分离本文别处所述微生物的方法，包括：
(a)使所述碳水化合物结合分子与微生物混合物接触；和
(b)分离至少一种结合至所述碳水化合物结合分子的微生物；和
(c)测试分离的微生物至所述碳水化合物结合分子的特异性结合，和
(d)测试有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答和/或体液免疫应答的诱导。
248所述碳水化合物表位可以(例如)为包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的部分。优选各体液或细胞应答在至少一个动物或人类中由所述微生物和/或其片段和/或裂解产物触发。
249在优选的实施方式中，本发明涉及用于分离本文别处所述微生物的方法，包括：
(a)使所述碳水化合物结合分子与微生物混合物接触；和
(b)分离至少一种被所述碳水化合物结合分子结合的微生物；和
(c)测试分离的微生物至所述碳水化合物结合分子的特异性结合，和
(d)通过所述微生物和/或其片段和/或裂解产物，优选在至少一个动物或人类中和/或在体外，优选对于CD4阳性Th1型T细胞的激活和/或对于细胞毒性CD8阳性T细胞的激活，测试有效的针对所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的诱导。
250在优选的实施方式中，本发明还提供用于从微生物混合物中 分离碳水化合物阳性微生物的方法，其中所述微生物为选自来自健康人类和/或患者、动物、土壤、食品和/或植物的微生物的至少两种微生物的混合物。
251在优选的实施方式中，本发明还提供用于从微生物混合物中 分离碳水化合物阳性微生物的方法，其中所述微生物混合物为包括来自健康个体或患者的人类胃肠道、人类粪便、人类血液、人类组织或人类体液的微生物的混合物。
252在优选的实施方式中，本发明还提供用于从微生物混合物中 分离碳水化合物阳性微生物的方法，其在允许分离厌氧碳水化合物阳性微生物的厌氧条件下进行。
253所述微生物混合物可为至少两种微生物的任意混合物，所述微生物例如但不限于在自然中，例如但不限于在土壤、食品、植物、动物、健康个体或患者的人类胃肠道、人类血液、人类组织、人类体液中出现的那些，最优选为来自健康个体的微生物混合物。在将混合物与碳水化合物结合分子接触之前，优选将微生物溶入合适的溶液。碳水化合物结合分子优选偶联到载体，例如磁珠上，其允许分离结合至所述载体上的微生物。将碳水化合物结合分子与微生物混合物混在一起之后，从不结合到抗体上的那些微生物中分离结合到碳水化合物结合分子上的那些微生物。在作为选择的实施方式中，碳水化合物结合分子不偶联到载体，并且通过使用特异性分离抗体的方法，碳水化合物阳性微生物与碳水化合物结合分子一起分离，所述抗体例如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或抗-IgM抗体或抗-IgG抗体，其自身偶联到载体例如磁珠、色谱床材料上。本发明的优选实施方式中，结合至碳水化合物结合分子的碳水化合物阳性微生物用合适的缓冲液(例如PBS-a)彻底地洗涤，并平板接种(plated)在选择性或非选择性培养基上，例如但不限于MRS，BSM，KF，，N，S，WC，BHI，CBA和ST(详细参见表3)。所得的克隆从板上刮下，并用碳水化合物特异性分子应用另一轮亲和富集。挑取、重新培养(re-streak)和在ELISA和免疫荧光中分析克隆的碳水化合物的表达(更具体参见实施例1-9)。从这些描述和从实施例中本领域技术人员能够调整或最优化用于来自各种来源的各种细菌的方法。
254在优选的特定实施方式中，在允许分离厌氧碳水化合物阳性微生物的厌氧条件下进行该方法，其对于例如来自人类内脏的大多数微生物而言是重要的。
255该方法详细地描述于实施例1至9。
256在另一优选实施方式中，微生物分离自食品。在更优选实施方式中，微生物分离自胃肠系统，更优选来自人类粪便。
257该方法详细地描述于实施例1至9。
258本发明还提供用于鉴定合适的碳水化合物阳性微生物以用作 本发明的保健食品和药物组合物的成分的方法，其包括：
a)测试微生物至至少一种碳水化合物结合分子的结合；
b)如本文所述鉴定被至少一种碳水化合物结合分子结合的该碳水化合物阳性微生物。
259在本发明的优选实施方式中，通过ELISA完成微生物至至少一种碳水化合物结合分子的结合的测试，由此碳水化合物阳性微生物显示具有至少一种碳水化合物结合分子的ELISA信号，所述ELISA信号为背景信号的至少3倍，更优选至少5倍，更优选至少10倍。
260优选的为这样的碳水化合物阳性微生物，其在如本文别处所述用破坏碳水化合物表位的酶或化学药品处理碳水化合物阳性微生物之后，显示降低的碳水化合物结合分子的结合。
261在优选的实施方式中，本发明涉及用于鉴定如本文别处所述碳水化合物阳性微生物的方法，包括
a)使所述碳水化合物结合分子与微生物或微生物混合物接触；和
b)鉴定被所述碳水化合物结合分子特异性结合的微生物；和
c)测试由所述微生物和/或其片段或裂解产物诱导的细胞和/或体液免疫应答；
由此所述微生物优选在至少一个动物或人类中和/或在体外，诱导针对所述碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的有效的碳水化合物特异性细胞和/或体液免疫应答。
262在另一优选实施方式中，本发明涉及用于鉴定如本文别处所述微生物的方法，包括：
a)使所述碳水化合物结合分子与微生物或微生物混合物接触；和
b)鉴定被所述碳水化合物结合分子特异性结合的微生物；和
c)测试由所述微生物和/或其片段或裂解产物诱导的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答，
由此所述微生物优选在至少一个动物或人类中和/或在体外，诱导针对所述碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答。
263针对所述碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的诱导可以通过本文所述的细胞免疫应答测试或者通过本领域技术人员已知的方法测定。
264在优选的实施方式中，本发明涉及用于鉴定合适的碳水化合物阳性微生物以用于本发明的保健食品和药物组合物的方法，其包括：
a)测试碳水化合物阳性微生物至至少一种碳水化合物结合分子的结合；和
b)测试其在人类或动物中诱导识别碳水化合物表位和/或碳水化合物表位阳性细胞或肿瘤细胞的免疫应答的能力，和
c)鉴定该微生物，其被本文所述至少一种碳水化合物结合分子结合，并且通过对本文所述1-6中至少一种体液免疫应答测试或1 5中至少一种细胞免疫应答测试呈阳性，在人类或动物中诱导识别碳水化合物表位和/或碳水化合物表位阳性细胞或肿瘤细胞的免疫应答。
265在优选的实施方式中，本发明涉及用于鉴定合适的碳水化合物阳性微生物以用作本发明的保健食品和药物组合物的成分的方法，其中在人类或动物中给药根据本发明的制剂之后诱导的免疫应答为对于针对碳水化合物表位的至少一种体液免疫应答测试，和针对如本文别处所述碳水化合物表位的至少一种细胞免疫应答测试呈阳性的免疫应答。
266用于鉴定合适的碳水化合物阳性微生物以用作本发明的保健食品和药物组合物的成分的方法可用于从存在的菌株中鉴定合适的微生物，所述存在的菌株例如在DSMZ或其它微生物的收藏发现的或来自由根据本发明的从微生物混合物中分离碳水化合物阳性微生物的方法分离的碳水化合物阳性微生物。
267本发明还涉及用于分离和鉴定碳水化合物阳性细菌的方法，其包括：
a)从粪便样品中分离全部细菌(whole bacteria)，
b)使用一种或多种碳水化合物结合分子在有氧或厌氧条件下进行碳水化合物表位阳性细菌的亲和富集，
c)将富集的细菌平板接种(plating)在不同的选择性培养基，并且筛选结合至碳水化合物结合分子的细菌。
268在另一优选实施方式中，本发明涉及用于分离和鉴定碳水化合物阳性细菌的方法，其包括：
a)从粪便样品中分离包括全部细菌的微生物混合物，
b)使碳水化合物结合分子与微生物混合物接触
c)在有氧或厌氧条件下使用磁性颗粒分离来分离结合碳水化合 物结合分子的微生物，
d)将富集的细菌平板接种在至少一种选择性培养基上
e)鉴定被至少一种碳水化合物结合分子结合的微生物。
269在另一优选实施方式中，本发明涉及用于分离和鉴定碳水化合物阳性细菌的方法，其包括：
a)产生被至少一种碳水化合物结合分子结合的纯细菌菌株；和/或
b)测试所述纯细菌菌株在至少一个人类或动物中诱导或增强针对碳水化合物表位的免疫应答的能力。
270在另一优选实施方式中，本发明提供用于测试碳水化合物阳性微生物诱导碳水化合物表位特异性免疫应答的潜力的方法，其包括以下步骤：
1)鉴定碳水化合物阳性微生物和在纯培养物中生产；
2)鉴定免疫有效的内脏细菌菌株；
3)产生有效的、免疫学上和毒性学上测试的碳水化合物阳性制品，作为为人类测试准备的营养添加剂；
4)在人类中诱导或增强碳水化合物特异性免疫应答；并且如果需要
5)分离、鉴定和测试所述微生物的免疫有效的限定的碳水化合物表位阳性片段或组分。
271在本发明的优选实施方式中，上述方法的碳水化合物结合分子选自单克隆抗体、多克隆抗体、凝集素和/或选择素和/或从其衍生的分子。
272在本发明的优选实施方式中，上述方法的碳水化合物表位选自：TF，Core-1，Tn，唾液酸化-Tn，唾液酸化-TF，Globo-H，Lewis-Y，唾液酸化-Lewis-A，唾液酸化-Lewis-X，聚唾液酸，Lewis-X，GM2，GD2，GD3，9-O-乙酰基GD3，9-O-乙酰基GD2，GD3L，岩藻糖基GM1，岩藻糖基GM1，Lewis-A，Lewis B，sLac，唾液酸化1型链，CA 19-9抗原，CA 72-4抗原和/或CA-50抗原。
273该方法详细地描述于实施例1-10。
274本发明还涉及用于产生碳水化合物阳性微生物的方法，其包括：
a)在杀死大多数微生物的条件下，通过化学和/或物理诱变剂，例如但不限于EMS、UV、甲氨蝶呤、微波、致癌物质(cancerogenicsubstances)、致癌物(carcinogen)、诱变剂或放射，使微生物与用于突变诱导的原(agens)接触，和
b)在合适条件下培养存活的微生物
c)富集、分离和/或鉴定如本文别处所述的碳水化合物阳性微生物；
d)测试所述微生物在至少一个人类或动物中诱导或增强针对碳水化合物表位的免疫应答的能力。
275本发明还涉及用于通过基因工程产生碳水化合物阳性微生物的方法，其包括
a)将基因、部分基因、DNA、RNA、反义RNA、寡核苷酸、寡肽或蛋白质在微生物中引入、敲除和/或沉默，由此影响碳水化合物表位生物合成、碳水化合物表位降解或侧翼碳水化合物的生物合成或降解，和
b)富集、分离、鉴定和/或测试如本文别处所述的碳水化合物阳性微生物。
276在优选的实施方式中，所述微生物为碳水化合物表位阴性微生物。
在进一步优选实施方式中，所述微生物为用于肠道的有益微生物，例如但不限于乳酸菌(Lactobacillus)或双歧杆菌(Bifidobacterium)。
277在进一步优选实施方式中，所述微生物为用于生产传统食品的微生物，例如但不限于乳酸菌(Lactobacillus)或双歧杆菌(Bifidobacterium)。
278在另一实施方式中，所述微生物为已经碳水化合物表位阳性的，使用该方法以增加在细胞表面上表达的碳水化合物表位的量。
279在优选的实施方式中，将由任何上述方法分离或鉴定的碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物，用于制造预防和/或治疗与所述碳水化合物表位有关的疾病的药物或保健食品，由此所述微生物和/或片段和/或裂解产物在至少一个动物或人类中诱导针对所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的有效的碳水化合物特异性细胞和/或体液免疫应答。
280在另一优选实施方式中，将由任何上述方法分离或鉴定的碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物，用于制造预防和/或治疗与所述碳水化合物表位有关的疾病的药物或保健食品，由此所述微生物和/或片段和/或裂解产物在至少一个动物或人类中诱导针对所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答，优选该免疫应答包括CD4阳性Th1型T细胞的激活和/或CD8阳性细胞毒性T细胞的激活。
281合适的制造方法和条件对于本领域技术人员是已知的，或可由本领域技术人员调整。
282C)碳水化合物阳性微生物片段的提供
283本发明提供本发明的碳水化合物阳性微生物的片段，由此碳水化合物阳性微生物表位在来自人类或动物细胞的分子上呈递，由此所述碳水化合物阳性微生物的片段在至少一个动物或人类中诱导有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答，所述碳水化合物表位被至少一种特异性识别碳水化合物的碳水化合物结合分子结合。
284本发明提供合适的本发明的碳水化合物阳性微生物的片段，以用于选自保健食品或药物组合物的本发明的制剂。
285本发明提供本发明的碳水化合物阳性微生物的片段，其在人类或动物中诱导针对碳水化合物表位或碳水化合物表位阳性细胞或肿瘤细胞的碳水化合物特异性免疫应答。
286所述碳水化合物阳性微生物的片段是指所述微生物的较小部分的制品或纯化品，例如细胞壁制品、包膜制品、裂解产物、脂多糖制品、荚膜制品或荚膜多糖制品，其描述于实施例(实施例10)中，或者本领域技术人员能够优化和选择一种合适的方法或合适方法的组合。它们优选包括所述碳水化合物阳性微生物的至少一种碳水化合物阳性组分。它们还可以通过从至少一种碳水化合物阳性微生物中制备或纯化来获得。所述制品或纯化品可以通过本领域技术人员已知的方法来获得，所述方法例如上述的那些方法，或单步细胞分级分离或连续细胞分级分离(single or sequential cell fractionation)、酚水提取、醚提取、溶菌酶消化或色谱方法。碳水化合物阳性组分或包含碳水化合物阳性组分的片段通过在测试系统中片段至至少一种碳水化合物结合分子的结合来检测，所述测试系统例如但不限于本领域技术人员已知的ELISA或斑点印迹。在本发明的优选实施方式中，包括碳水化合物阳性组分的片段通过使用至少一种碳水化合物结合分子的亲和色谱来获得。
287在优选的实施方式中，使用单的制备或纯化步骤。在另一优选实施方式中，使用至少制备和纯化步骤的组合。
288在进一步优选实施方式中，与完整微生物相比，碳水化合物阳性组分在所述片段中富集，这可通过以下来确定：例如通过ELISA，并且优选在相同体积中的包含的生物材料的重量相等时，至少一种碳水化合物结合分子至片段的结合与微生物相比增加。
289所述碳水化合物阳性组分是指被至少一种碳水化合物结合分子结合的碳水化合物阳性微生物的任意组分。所述碳水化合物阳性组分包括至少一种碳水化合物结构或碳水化合物模仿结构，其可以其天然分子的形式获得，其中其为微生物上的部分，例如肽、寡肽、多肽、多糖、脂质、神经酰胺、碳水化合物、脂蛋白、多糖、寡糖、多糖、蛋白聚糖、脂多糖或糖蛋白，或作为所述天然分子的部分，或单独。碳水化合物阳性组分同样地可用作本发明意义的碳水化合物阳性微生物的片段，或偶联到其它天然载体结构，例如蛋白质、脂质、化学分子例如聚丙烯酰胺。优选其以其天然形式使用。碳水化合物阳性组分可以包括单一碳水化合物表位结构或碳水化合物模仿结构或所述结构的重复单元，并且可以包含另外的碳水化合物结构或单元或其它生物分子结构。所述碳水化合物模仿结构为被至少一种碳水化合物结合分子结合的结构，并且诱导针对碳水化合物表位的免疫应答，优选针对所述碳水化合物表位的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答或体液免疫应答，更优选针对所述碳水化合物表位和/或与所述碳水化合物表位有关的细胞的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答和体液免疫应答。
290碳水化合物阳性片段衍生自的碳水化合物阳性微生物在本发明别处表述。
291在本发明进一步优选实施方式中，保健食品或药物制剂的碳水化合物阳性微生物的片段(活性组分)包括来自一种碳水化合物阳性微生物或优选来自不同菌株的不同碳水化合物阳性微生物的片段的组合。片段可以具有相同或不同的制备或纯化型，优选为碳水化合物阳性组分的组合，所述碳水化合物阳性组分具有不同分子载体或模拟结构，例如但不限于肽、寡肽、多肽、脂质、神经酰胺、碳水化合物、脂蛋白、多糖、寡糖、多糖、蛋白聚糖或糖蛋白，或作为另一天然或合成分子的部分。
292在本发明另一优选实施方式中，碳水化合物阳性组分不是细菌脂多糖的部分。
293在进一步优选实施方式中，所述碳水化合物阳性微生物的片段包括至少两种不同菌株的碳水化合物阳性微生物的碳水化合物阳性组分的组合。
294在本发明另一优选实施方式中，所述碳水化合物结构或所述其重复单元通过从碳水化合物阳性微生物中富集和/或纯化和/或分离来获得。
295在本发明进一步优选实施方式中，所述碳水化合物结构或所述其重复单元通过化学合成，本领域技术人员已知的技术来获得。
296在本发明进一步优选实施方式中，所述碳水化合物结构或所述其重复单元通过从菌株AG6中富集和/或纯化和/或分离来获得。
详细资料示于实施例10中。
297在本发明进一步优选实施方式中，所述碳水化合物结构或所述其重复单元通过化学合成来获得。
298本领域技术人员能够确定用于化学合成根据图8的碳水化合物结构或其重复单元的合适的条件和方法。
299D)用于产生针对碳水化合物表位的免疫细胞的方法。
300本发明提供用于产生针对所述碳水化合物表位的功能性树突细胞的方法，其包括：使合适量的树突细胞或树突细胞的混合物或包括至少一种树突细胞的细胞混合物与合适量的如本文别处所述的制剂在合适的条件下接触合适的时间，以产生至少一种针对所述碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的功能性树突细胞。如上所述，所述碳水化合物表位优选为人类表位并且优选不带电的。优选地，所述树突细胞不负载有携带目的碳水化合物表位的肽。
301本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的功能性树突细胞的方法，其包括：使合适量的树突细胞或树突细胞的混合物或包括至少一种树突细胞的细胞混合物与合适量的如本文别处所述的至少一种碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段在合适的条件下接触合适的时间，以产生至少一种负载有碳水化合物表位的功能性树突细胞。
302本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的功能性树突细胞的方法，其包括：使合适量的树突细胞或树突细胞的混合物或包括至少一种树突细胞的细胞混合物与合适量的如本文别处所述的至少一种碳水化合物表位携带分子或至少一种与碳水化合物表位相关的疾病细胞或至少一种碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或其裂解产物或片段在合适的条件下接触合适的时间，以产生至少一种负载有碳水化合物表位的功能性树突细胞。
303所述针对碳水化合物表位的功能性树突细胞为树突细胞或树突细胞的混合物，其激活针对碳水化合物表位的至少一种T细胞，这可优选通过本发明的细胞免疫应答测试来测试，并且在本文别处所述的细胞免疫应答测试的至少一种中针对碳水化合物表位呈阳性。在优选的实施方式中，功能性树突细胞在其表面上呈递碳水化合物表位，并且可被碳水化合物表位特异性抗体或例如在细胞免疫应答测试4中所述的碳水化合物结合分子检测。在本发明的优选实施方式中，针对碳水化合物表位的功能性树突细胞通过以下获得：使未成熟树突细胞或未成熟树突细胞的混合物或包括至少一种未成熟树突细胞的树突细胞混合物与合适量的如本文别处所述的至少一种碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段在合适的条件下接触合适的时间，以使用如本文别处所述和本领域技术人员已知的合适条件使所述树突细胞成熟为负载有碳水化合物表位的功能性树突细胞，所述合适条件包括例如分子TNFα(肿瘤坏死因子α)、LPS(脂多糖)或BCG(卡介苗)、IFNγ(干扰素γ)、地塞米松和/或TGFβ(转化生长因子β)。在本发明的优选实施方式中，树突细胞源自MUTZ-3或NemodDC(获自Glycotope GmbHBerlin，Germamy；www.glycotope.com)，进一步优选的未成熟树突细胞在合适的条件下产生自MUTZ-3细胞或NemodDC，所述合适的条件包括使用I L-4和GM-CSF典型地约一周，所得的未成熟树突细胞或iNMDC与所述合适量的至少一种碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段接触，使用合适的条件包括例如TNFα、LPS、BCG、IFNγ、地塞米松或TGFβ，优选TNFα典型地约1至2天使细胞成熟，产生与所述针对碳水化合物表位的功能性树突细胞相对应的负载有碳水化合物表位的成熟树突细胞。
304在优选的实施方式中，本发明提供由上述方法产生的功能性树突细胞，其中该功能性树突细胞针对碳水化合物表位、包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构，碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞。
305在另一优选实施方式中，本发明提供由上述方法产生的功能性树突细胞，其中该功能性树突细胞针对所述碳水化合物抗原或包括所述碳水化合物抗原的哺乳动物细胞，并且诱导有效的针对表达所述碳水化合物表位的细胞和/或疾病的碳水化合物特异性细胞免疫应答和/或体液免疫应答。
306在优选的实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系的方法，其包括：
(a)使合适量的如上所述的至少一种功能性树突细胞，与合适量的至少一种T细胞或T细胞的混合物或包括至少一种T细胞的细胞混合物接触，在合适条件下使所述T细胞或T细胞的混合物与所述负载的功能性树突细胞一起培养合适的时间，以激活或引发针对所述碳水化合物表位的T细胞，
(b)用合适量的至少一种功能性树突细胞再刺激所述T细胞，所述功能性树突细胞负载有携带所述碳水化合物表位的人类或动物细胞或分子。
307本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的激活的T细胞的方法，其包括：
(a)使合适量的至少一种功能性树突细胞或包含至少一种功能性树突细胞的细胞混合物，与至少一种T细胞接触，所述功能性树突细胞负载有合适量的碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段，
(b)在合适条件下使所述T细胞与所述负载的功能性树突细胞一起培养合适的时间，以激活或引发针对所述碳水化合物表位的T细胞。
308本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的激活的T细胞的方法，其包括：
(a)使合适量的至少一种功能性树突细胞或包含至少一种功能性树突细胞的细胞混合物，与T细胞或包含至少一种T细胞的细胞混合物接触，所述功能性树突细胞负载有合适量的碳水化合物表位携带分子、碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或包括碳水化合物表位的细胞，或其裂解产物或片段
(b)在合适条件下使所述T细胞或包含至少一种T细胞的细胞混合物与所述负载的功能性树突细胞一起培养合适的时间，以激活或引发针对碳水化合物表位的T细胞。
309在优选的实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的激活的T细胞的方法，其包括：
(a)使合适量的功能性树突细胞与T细胞接触，所述功能性树突细胞负载有合适量的碳水化合物阳性微生物或其裂解产物或片段
(b)在合适条件下使所述T细胞与所述负载的功能性树突细胞一起培养合适的时间，以激活或引发针对碳水化合物表位的T细胞
(c)添加功能性树突细胞以再刺激，所述功能性树突细胞负载有碳水化合物表位携带分子或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或包括碳水化合物表位的细胞或其裂解产物或片段
(d)在合适条件下培养合适的时间
310在优选的实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的激活的T细胞的方法，其包括：
(a)使合适量的至少一种功能性树突细胞与合适量的至少一种T细胞或T细胞混合物或包含至少一种T细胞的细胞混合物接触，所述功能性树突细胞负载有合适量的至少一种碳水化合物阳性微生物或其裂解产物或片段
(b)在合适条件下使所述T细胞或T细胞混合物或包含至少一种T细胞的细胞混合物与所述负载的功能性树突细胞一起培养合适的时间，以激活或引发针对碳水化合物表位的T细胞。
311在优选的实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的激活的T细胞的方法，其包括：
(a)使合适量的至少一种功能性树突细胞与合适量的至少一种T细胞或T细胞混合物或包括至少一种T细胞的细胞混合物接触，所述功能性树突细胞负载有合适量的至少一种碳水化合物表位携带分子、碳水化合物表位阳性肿瘤细胞、或包括碳水化合物表位的细胞或其裂解产物或片段
(b)在合适条件下使所述T细胞或T细胞混合物或包含至少一种T细胞的细胞混合物与所述负载的功能性树突细胞一起培养合适的时间，以激活或引发针对碳水化合物表位的T细胞。
312在另一优选实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的激活的T细胞的方法，其包括之前方法的步骤(a)和(b)，并且随后包括：
(c)添加合适量的至少一种功能性树突细胞以用于再刺激，所述功能性树突细胞负载有合适量的至少一种碳水化合物表位携带分子或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或包括碳水化合物表位的细胞，或其裂解产物或片段；
或添加合适量的至少一种功能性树突细胞以用于再刺激，所述功能性树突细胞负载有合适量的至少一种碳水化合物阳性微生物，其裂解产物或片段；以及
(d)在合适条件下培养合适的时间。
313在另一优选实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的T细胞系的方法，其包括之前方法的步骤(a)、(b)、(c)和(d)，并且随后包括至少另一轮再刺激，由此一轮再刺激包括步骤(e)和(f)或步骤(g)和(h)，其中：
(e)添加合适量的至少一种功能性树突细胞以用于再刺激，所述功能性树突细胞负载有合适量的至少一种碳水化合物表位携带分子或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或包括碳水化合物表位的细胞，或其裂解产物或片段；
(f)在合适条件下培养合适的时间
(g)或添加合适量的至少一种功能性树突细胞以用于再刺激，所述功能性树突细胞负载有合适量的至少一种碳水化合物阳性微生物，其裂解产物或片段
(h)在合适条件下培养合适的时间。
314在进一步优选实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的T细胞系的方法，其额外地包括另两轮所述再刺激。
315在更优选的实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的T细胞系的方法，其包括另三轮所述再刺激。
316在更优选的实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的T细胞系的方法，其包括另五轮所述再刺激。
317在进一步优选实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的T细胞克隆的方法，其中在所述轮的再刺激中一轮之前另外克隆细胞的步骤进行至少一次。
318在优选的实施方式中，激活的T细胞为针对碳水化合物表位的T细胞系，由此优选与一轮再刺激相对应的(c)和(d)进行至少两次，更优选三次，更优选4次，最优选进行超过4轮再刺激的T细胞系。
319在优选的实施方式中，激活的T细胞为针对碳水化合物表位的T细胞克隆，由此优选与一轮再刺激相对应的(c)和(d)进行至少两次，更优选三次，更优选4次，最优选这样的T细胞系，其进行4轮以上再刺激，并且在再刺激前例如通过单细胞稀释(single celldilution)将细胞克隆至少一次。
320在进一步优选实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的T细胞克隆的方法，其中所述功能性树突细胞为成熟树突细胞。
321在进一步优选实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的T细胞克隆的方法，其中所述功能性树突细胞和T细胞为人类细胞。
322在进一步优选实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系的方法，其中所述功能性树突细胞源自MUTZ-3[专利申请10139428.4(DE)，PCT/EP02/09260，02758474.7(EP)，US10/486,966，CA2,457,287，DE10139428A1，WO2003/023023A1，EP01419240，US20040265998，CA2457287]，例如但不限于Nemod-DC(获自Glycotope GmbH Berlin，德国，www.glycotope.com)。
323在进一步优选实施方式中，本发明提供用于产生针对碳水化合物表位的激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系的方法，其中所述功能性树突细胞和T细胞在至少一种MHC类分子方面匹配。
324在优选的实施方式中，本发明提供由任何上述方法生产的激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系，其中激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞。
325在进一步优选实施方式中，本发明提供由任何上述方法生产的激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系，其中激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞，并且诱导有效的针对碳水化合物表位和/或与所述碳水化合物表位相关的细胞和/或疾病的碳水化合物特异性细胞免疫应答。
326在本发明的优选实施方式中，所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的所述诱导发生在至少一个人类或动物中。
327在本发明另一优选实施方式中，所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的所述诱导发生在体外进行。
328在进一步优选实施方式中，本发明提供由上述方法获得的激活的针对碳水化合物表位的T细胞、包括针对碳水化合物表位的T细胞的细胞组合物、针对碳水化合物表位的T细胞系或针对碳水化合物表位的T细胞克隆。
329在进一步优选实施方式中，本发明提供如上所述的激活的针对碳水化合物表位的T细胞、包括针对碳水化合物表位的T细胞的细胞组合物、针对碳水化合物表位的T细胞系或针对碳水化合物表位的T细胞克隆，其包括针对碳水化合物表位的至少一种CD4+辅助细胞。
330在进一步优选实施方式中，本发明提供如上所述的激活的针对碳水化合物表位的T细胞、包括针对碳水化合物表位的T细胞的细胞组合物、针对碳水化合物表位的T细胞系或针对碳水化合物表位的T细胞克隆，其包括针对碳水化合物表位的至少一种细胞毒性T细胞。
331在进一步优选实施方式中，本发明提供如上所述的激活的针对碳水化合物表位的T细胞、包括针对碳水化合物表位的至少一种T细胞的细胞组合物、针对碳水化合物表位的T细胞系或针对碳水化合物表位的T细胞克隆，其杀死至少一种碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或与碳水化合物表位相关的疾病细胞或分泌介导杀死至少一种肿瘤细胞的分子。
332本发明的激活的针对碳水化合物表位的T细胞、包括针对碳水化合物表位的T细胞的细胞组合物、针对碳水化合物表位的T细胞系或针对碳水化合物表位的T细胞克隆，其杀死至少一种碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或疾病细胞或分泌介导杀死至少一种肿瘤细胞或疾病细胞的分子，这是指所述针对碳水化合物表位的细胞毒性T细胞杀死碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或疾病细胞，其可通过使用相应的本文别处所述的测定IFNγ或TNFα分泌的细胞免疫应答测试或通过细胞毒性测试(例如细胞免疫应答测试5)来确定，其中至少一种标记的碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或疾病细胞按照本领域技术人员已知的原理，通过使用本发明的T细胞(例如CTL或Th1细胞)或通过诱导介导相应体液和细胞免疫应答的激活的特异性CD4T辅助应答来裂解，这导致杀死至少一种碳水化合物表位阳性肿瘤细胞。
333通过本文公开的方法和材料，本领域技术人员能够进行所述任务。他们可以确定获得这些功能性树突细胞或T细胞的最佳条件、给药的最好途径和/或包括这些的合适组合物，和/或进一步描述于优选实施方式中并且在专利申请DE10139428A1、WO2003/023023A1、EP01419240、US20040265998、CA2457287中生产和使用。
334所述激活的针对碳水化合物表位的T细胞是指产生的T细胞或包括T细胞的细胞组合物对本发明至少一种细胞免疫测试、优选对于两种、更优选对于三种，最优选对于所有4种呈阳性。优选它们包括至少一种CD4+辅助细胞，更优选包括能够杀死至少一种碳水化合物表位阳性肿瘤细胞的至少一种细胞毒性T细胞。
335用于接触的所述T细胞为至少一种在通过本领域技术人员已知的标准方法分离或富集的CD4+和/或CD8+T细胞，或为包括至少一种CD4+和/或CD8+T细胞的细胞组合物。
336所述裂解产物可为分别来自碳水化合物表位阳性微生物或来自碳水化合物表位阳性肿瘤细胞的任何裂解产物，例如但不限于通过重复的冷冻-解冻、通过超声波、通过机械力或通过温度诱导产生的裂解产物。
337对于碳水化合物表位特异性T细胞的产生的细节，参见实施例12。
338功能性树突细胞为可以激活T细胞的细胞。
339T细胞的激活是指增殖刺激或将幼稚T细胞转化为活性T细胞。活性T细胞分泌分子，所述分子诱导或帮助针对以下目标的免疫应答：碳水化合物表位、肿瘤细胞或携带碳水化合物表位的疾病细胞，优选介导杀死碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或疾病细胞的那些细胞毒性T细胞。
340在优选的实施方式中，所述功能性树突细胞为成熟树突细胞。更优选成熟细胞衍生自其的树突细胞前体获自人类，更优选获自从其获得T细胞的人类，或其在至少一种MHC类分子中匹配。在更优选实施方式中，功能性树突细胞源自MUTZ-3，更优选MUTZ-3细胞或从其衍生的细胞使用I1-4和GM-CSF分化，使其负载有合适量的碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段或碳水化合物表位携带分子或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞、其裂解产物或片段，并且使用例如合适量的TNF-α进一步成熟成符合本发明功能性树突细胞的成熟树突细胞。在更优选实施方式中，负载的功能性树突细胞和至少在MHC I类(HLA-A2)和(HLA-B44)中匹配的PBMC(外周血单核细胞)一起使用。
341本领域技术人员能够确定用于产生功能性树突细胞的合适条件，所述功能性树突细胞负载有碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段或碳水化合物表位携带分子或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或疾病细胞，或其裂解产物或片段，以及T细胞的合适量和富集或纯化方法以及用于一起培养两种细胞的合适条件，例如包括时间、培养基、培养条件和其它所需因子。在6-10天内功能性树突细胞典型地从前体细胞分化，并且负载和成熟另外1至2天。将所述T细胞与所述负载的功能性树突细胞一起培养典型地进行7至10天，添加和培养负载的功能性树突细胞以用于再刺激，对于每一轮再刺激典型地为7至9天。其它详细资料显示于实施例12。
342在另一优选实施方式中，将来自不同来源的不同树突细胞或功能性树突细胞，例如MUTZ-3衍生或来自人类的供体衍生的树突细胞，用于引发和再刺激的不同步骤。本领域技术人员能够选择最佳的组合细节。
343针对碳水化合物表位的T细胞、包括T细胞的细胞组合物、CD4+和/或CD8+T细胞，可以通过使用本发明的至少一种细胞免疫应答测试来测试。进一步的细节描述于本文别处。优选至少两种细胞免疫应答测试是阳性的，更优选3种，更优选4种，最优选所有5种。
344此处对于树突细胞、其用途和用于其用途的合适条件和分子的描述对于本文别处所述的细胞免疫应答测试也是有效的，反之亦然，并且将对本发明所有其它部分都有效。
345在另一实施方式中，本发明提供针对碳水化合物表位的激活的T细胞。
346在另一实施方式中，本发明提供包括至少一种针对碳水化合物表位的激活的T细胞。
347在另一实施方式中，本发明提供针对碳水化合物表位的激活的T细胞系。
在另一实施方式中，本发明提供针对碳水化合物表位的激活的T细胞克隆。
348在优选的实施方式中，T细胞系或T细胞克隆这样产生：使用MUTZ-3衍生的负载有碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段的功能性树突细胞(例如Nemod-DC)，与用MUTZ-3衍生的功能性树突细胞再刺激至少一轮组合，所述功能性树突细胞负载有：至少一种碳水化合物表位携带分子，碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或疾病细胞，或其裂解产物或片段，其来自健康供体，更优选来自患者，更优选来自其疾病或肿瘤对于与碳水化合物结合分子、优选与碳水化合物表位特异性抗体结合而言呈阳性的患者。
349本发明还提供用于生产至少一种激活的T细胞以用作肿瘤治疗的方法，其包括将激活的针对碳水化合物表位阳性肿瘤细胞的T细胞给药至患者。
350E)用于诱导针对与碳水化合物表位相关的疾病的免疫防护(immune shield)的方法和用于预防和/或治疗与碳水化合物表位相关的疾病的方法
351本发明提供用于在至少一个动物或人类中诱导或增强针对所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答和/或特异性体液免疫应答的方法，包括在人类或动物中施用有效量的如本文别处所述的制剂。
352在优选的实施方式中，本发明提供用于在至少一个动物或人类中诱导或增强针对所述碳水化合物表位、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的方法，包括在人类或动物中施用有效量的如本文别处所述的制剂，优选所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答包括CD4阳性Th1型T细胞和/或CD8阳性细胞毒性T细胞的激活，更优选所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答包括CD4阳性Th1型T细胞的激活和CD8阳性细胞毒性T细胞的激活。
353所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答的诱导优选通过如本文别处所述的细胞免疫应答测试来测定。
354在优选的实施方式中，本发明提供治疗癌症患者或遭受与碳水化合物表位相关的疾病的患者的方法，其包括给药任何以下物质：如上所述针对碳水化合物表位的激活的T细胞、包括至少一种针对碳水化合物表位的T细胞的细胞组合物、针对碳水化合物表位的T细胞系、或针对碳水化合物表位的T细胞克隆或包括这些的组合物。
355在优选的实施方式中，本发明提供治疗癌症患者或遭受与碳水化合物表位相关的疾病的患者的方法，其包括：给药如上所述合适量的至少一种针对碳水化合物表位的功能性树突细胞或包括这些的组合物。
356在优选的实施方式中，本发明提供治疗癌症患者的方法，其中该患者具有对碳水化合物表位呈阳性的癌症细胞。
357在更优选的实施方式中，本发明提供治疗癌症患者或遭受与碳水化合物表位相关的疾病的患者的方法，其中该功能性树突细胞为自体同源的。
358在另一优选实施方式中，本发明提供治疗癌症患者或遭受与碳水化合物表位相关的疾病的患者的方法，其中该功能性树突细胞异源地(allogeneic)源自供体。
359在另一优选实施方式中，本发明提供治疗癌症患者或遭受与碳水化合物表位相关的疾病的患者的方法，其中该功能性树突细胞衍生自MUTZ-3。
360在另一优选实施方式中，本发明提供治疗癌症患者或遭受与碳水化合物表位相关的疾病的患者的方法，其中该功能性树突细胞与所述患者共有至少一种MHC类分子。
361本发明还提供治疗癌症患者或遭受与碳水化合物表位相关的疾病的患者的方法，其包括给药任何以下物质：本文别处所述针对碳水化合物表位的激活的T细胞、包括至少一种针对碳水化合物表位的T细胞的细胞组合物、针对碳水化合物表位的T细胞系、或针对碳水化合物表位的T细胞克隆或包括这些中至少一种的组合物。
362本发明还提供治疗癌症患者或遭受与碳水化合物表位相关的疾病的患者的方法，其包括：给药本文别处所述合适量的至少一种针对碳水化合物表位的功能性树突细胞或包括这些的组合物。
363在本发明的优选实施方式中，将至少一种所述方法用于具有对碳水化合物表位呈阳性的癌症细胞的患者，所述碳水化合物表位通过至少一种碳水化合物结合分子或碳水化合物表位特异性抗体和在本文别处所述的其优选实施方式中为可检测的。
364在本发明的优选实施方式中，将至少一种所述方法用于具有与碳水化合物表位相关的疾病的患者，所述碳水化合物表位可被如本文别处所述的至少一种碳水化合物结合分子或碳水化合物表位特异性抗体检测。
365进一步优选的为这样的方法，其中功能性树突细胞为同种异体源的，进一步优选当功能性树突细胞源自供体时，更优选当功能性树突细胞衍生自MUTZ-3时，更优选当任何所述功能性树突细胞与其要给予的个体共有至少一种MHC类分子时。
366本发明提供用于诱导或增强针对碳水化合物表位、碳水化合物表位携带分子或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或碳水化合物表位阳性疾病细胞的特异性体液和/或细胞免疫应答的的方法，其包括：在人类或动物中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物组合物、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
367本发明提供用于诱导或增强有效的针对碳水化合物表位、碳水化合物表位携带分子或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或碳水化合物表位阳性疾病细胞的碳水化合物特异性细胞免疫应答的的方法，其包括：在人类或动物中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物组合物、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
368在优选的实施方式中，本发明提供用于在至少一个个体中诱导有效的针对碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答的方法，其包括：针对碳水化合物表位的Th1型CD4阳性T辅助细胞和/或细胞毒性CD8阳性T细胞的激活，其可被本文别处所述至少一种免疫应答测试检测。
369在另一优选实施方式中，本发明提供用于在至少一个个体中诱导有效的针对碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答的方法，其包括：针对碳水化合物表位的Th1型CD4阳性T辅助细胞和细胞毒性CD8阳性T细胞的激活，其可被本文别处所述至少一种免疫应答测试检测。
370本发明提供用于诱导或增强针对碳水化合物表位、碳水化合物表位携带分子或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或碳水化合物表位阳性疾病细胞的特异性体液和细胞免疫应答的方法，其包括：在人类或动物中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物组合物、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
371本发明提供用于诱导或增强碳水化合物表位特异性免疫应答的方法，其通过具有破环至少一种碳水化合物表位阳性癌症或疾病细胞的潜力，起抗碳水化合物表位阳性癌症或疾病细胞的防护的作用。
372在优选的实施方式中，本发明提供用于诱导碳水化合物表位特异性免疫应答的方法，其通过具有破环本文所示那些细胞的潜力，如实施例中所示和本文中所示，例如通过诱导碳水化合物表位特异性抗体，通过诱导针对碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或疾病细胞的碳水化合物表位特异性抗体的碳水化合物表位特异性补体依赖性细胞毒性有效地杀死那些细胞，和/或通过使用碳水化合物表位特异性T细胞应答分泌TNFα和/或IFNγ以用于针对携带碳水化合物表位的肿瘤细胞或疾病细胞的特异性细胞毒性T细胞介导的细胞杀死，来起抗碳水化合物表位阳性癌症细胞的防护的作用，所述碳水化合物表位特异性T细胞应答对本领域技术人员是科学识别地替代标记；所述方法包括：在人类或动物中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
373本发明还提供用于降低或甚至优选用于预防肿瘤、优选碳水化合物表位阳性肿瘤的出现的方法，其包括：在人类或动物中，优选在健康个体中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
374本发明还提供用于降低或甚至优选用于预防疾病、优选碳水化合物表位阳性疾病的出现的方法，其包括：在人类或动物中，优选在健康个体中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
375本发明还提供用于降低或甚至优选用于预防肿瘤、优选碳水化合物表位阳性肿瘤的传播或转移的方法，其包括：在人类或动物中，给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
376本发明提供治疗肿瘤，优选碳水化合物表位阳性肿瘤的方法，其包括：在人类或动物中，给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
377本发明提供治疗疾病，与碳水化合物表位相关的疾病的方法，其包括：在人类或动物中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
378本发明还提供用于降低或甚至优选用于预防碳水化合物表位阳性疾病或肿瘤的出现的方法，其包括：在人类或动物中，优选在健康个体中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
379在优选的实施方式中，本发明提供用于针对碳水化合物表位免疫或接种人类或动物的方法，所述碳水化合物表位在来自人类或动物细胞的分子上呈递(或也称为“出现”)，其包括：
(i)给药人类或动物以有效量的免疫细胞或包括至少一种免疫细胞的细胞混合物，所述免疫细胞针对如本文别处所述的碳水化合物表位，并且通过所述免疫细胞在人类或动物中诱导免疫应答(引发)，和
ii)通过给药有效量的本文别处所述的制剂来增强该免疫应答。
380在优选的实施方式中，本发明提供用于针对碳水化合物表位免疫或接种人类或动物的方法，所述碳水化合物表位在来自人类或动物细胞的分子上呈递，其包括：
(i)给药人类或动物以有效量的免疫细胞或包括至少一种免疫细胞的细胞混合物至少一次，所述免疫细胞针对碳水化合物表位，并且通过所述免疫细胞在人类或动物中诱导免疫应答(引发)，和
ii)通过给药有效量的包括碳水化合物阳性微生物和/或其片段的药物组合物来增强该免疫应答。
381所述针对碳水化合物表位的免疫细胞可以选自：树突细胞、树突细胞系、T细胞、T细胞系和/或T细胞克隆，或包括这些的混合物，由此所述免疫细胞针对碳水化合物表位。所述免疫细胞的产生描述于本文别处。
382在本发明的优选实施方式中，给药所述免疫细胞和引发进行一次。
383在本发明另一优选实施方式中，给药所述免疫细胞和引发进行两次。
384在本发明另一优选实施方式中，给药所述免疫细胞和引发进行至少三至五次。
385在本发明的优选实施方式中，通过给药有效量的包括碳水化合物阳性微生物和/或其片段的药物组合物的免疫应答的增强进行一次。
386在本发明另一优选实施方式中，增强进行2-10次，更优选超过10次，更优选达20次，最优选增强以定期的时间间隔连续地进行几个月至几年。
387在本发明的优选实施方式中，紧接引发进行免疫应答的增强1-5次，其后间隔为从3个月至1年，或1年至10年。
388在优选的实施方式中，本发明提供用于诱导有效的针对碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞和/或体液免疫应答、优选细胞毒性T细胞应答的方法，其在来自人类或动物细胞的分子上呈递，所述方法包括：
i)口服给药包括碳水化合物阳性微生物或其裂解产物或片段的保健食品给人类或动物
ii)重复口服给药以诱导抵抗疾病出现的的免疫防护，所述疾病的特征在于碳水化合物表位的呈递。
389本发明的保健食品可为任何食品或食品添加剂或膳食补充剂或医学食品(medical food)或特定健康目的的食品或特定膳食目的的食品或功能性食品，并且可以如本文别处所述的不同形式应用。
在本发明的优选实施方式中，保健食品以不定期的间隔服用。
390在本发明的优选实施方式中，保健食品以每天至每周的定期间隔服用，更优选以至少每周间隔起始定期服用1-6个月，随后不定期间隔的重复服用。
391在本发明的优选实施方式中，保健食品用作临床食品。在更优选实施方式中，在活组织检查优选潜在的肿瘤前和/或后使用保健食品。更优选在肿瘤手术前和/或后使用保健食品，所述肿瘤优选对碳水化合物表位呈阳性。更优选保健食品与其它治疗组合使用。
392在另一优选实施方式中，本发明提供用于针对碳水化合物表位和/或碳水化合物表位阳性疾病或肿瘤免疫或接种人类或动物的方法，其包括：
ii)给药人类或动物以有效量的功能性树突细胞或包括至少一种功能性树突细胞的细胞混合物至少一次，所述功能性树突细胞针对碳水化合物表位，并且通过所述功能性树突细胞在人类或动物中诱导免疫应答，和
iii)通过给药有效量的包括至少一种碳水化合物阳性微生物和/或其片段和/或裂解产物的药物组合物至少一次来增强该免疫应答。
393在另一优选实施方式中，本发明提供用于针对碳水化合物表位和/或碳水化合物表位阳性疾病或肿瘤接种人类或动物的方法，所述碳水化合物表位在来自人类或动物细胞的分子上呈递，其包括：
i)给药人类或动物以有效量的针对碳水化合物表位的激活的T细胞、T细胞克隆、T细胞系或包括至少一种激活的T细胞的细胞混合物至少一次，并且通过所述激活的T细胞在人类或动物中诱导免疫应答，和
ii)通过给药有效量的包括至少一种碳水化合物阳性微生物和/或其片段和/或裂解产物的药物组合物至少一次来增强该免疫应答。
394功能性树突细胞、激活的T细胞、T细胞系和T细胞克隆的产生描述于本文别处。
395在本发明的优选实施方式中，根据之前方法在(i)处的给药进行一次。
396在另一优选实施方式中，根据之前方法在(i)处的给药进行两次。
397在另一优选实施方式中，根据之前方法在(i)处的给药进行至少三至五次。
398在本发明的优选实施方式中，根据之前方法(ii)通过给药有效量的药物组合物增强免疫应答进行一次。在本发明另一优选实施方式中，增强进行2-10次，更优选超过10次，更优选达20次，最优选增强以定期的时间间隔连续地进行几个月至几年。
399在本发明的优选实施方式中，紧接引发进行免疫应答的增强1-5次，其后间隔为从3个月至1年，或1年至10年。
400在优选的实施方式中，本发明提供用于预防和/或治疗碳水化合物表位阳性肿瘤和/或疾病的方法，其包括：给药人类或动物以合适量的针对本文别处所述的碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的制剂的碳水化合物阳性微生物或其片段、功能性树突细胞或激活的T细胞、T细胞系或T细胞克隆。
401本发明提供用于降低或甚至优选用于预防碳水化合物表位阳性疾病的传播的方法，其包括：在人类或动物中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
402本发明提供用于治疗碳水化合物表位阳性疾病的方法，其包括：在人类或动物中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂。
403本发明提供增强免疫系统或提高免疫应答的方法，其包括：在人类或动物中给药本文别处所述的有效量的保健食品、或药物组合物、或碳水化合物阳性微生物、或其片段、或包括这些的制剂。这可为例如但不限于例如抗传染病或肿瘤的免疫系统的状况的总的提高、其它免疫刺激剂或益生菌或益菌元活性的提高，或作为佐剂的作用。
404在优选的实施方式中，上述方法中的本文别处所述的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂包括选自以下的至少一种微生物、裂解产物或片段：菌株卵形拟杆菌AG6(DSM 18726)、菌株卵形拟杆菌MU1(DSM 18728)，和/或菌株大肠杆菌LH2(DSM 18727)，更优选选自由(德国)柏林Robert-
-Str.10，13125的Glycotope GmbH于2006年10月20日在不伦瑞克(braunschweig)(德国)的“DSMZ-德国微生物和细胞培育采集中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)”保藏的菌株AG6和/或MU1。
405术语制剂是指以适合给药形式的任何物质或物质的组合物，包括保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段中的至少一种，其可包括药学上可接受的载体或食品添加剂和/或保健食品可接受的载体，或仅仅保健食品、药物组合物、或碳水化合物阳性微生物或其片段。
406术语防止出现是指使用保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂给患者，以旨在降低发展碳水化合物表位阳性癌症或碳水化合物表位阳性疾病的风险或速度或可能性。
407术语降低或预防肿瘤或碳水化合物表位阳性疾病的传播或肿瘤的转移是指使用保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂给患者，以旨在降低疾病转移或传播到体内其它器官或其它部位或其它个体的风险或速度或可能性。
408术语治疗是指使用保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂给个体或受试者，以旨在治愈(cure)、治愈(heal)、减轻、缓解、改变、矫正(remedy)、改善、改进或影响癌症、癌症症状、癌症诱因、存活时间或发展时间。
409所述碳水化合物表位阳性疾病或与所述碳水化合物表位有关的疾病或特征在于呈递所述碳水化合物表位的疾病为与朊病毒、病毒、微生物、细菌或其它生物材料有关的任何疾病，以上生物材料可被至少一种碳水化合物结合分子，优选被至少一种碳水化合物表位特异性抗体结合，或其与身体组分有关，或出现于人类或动物的身体中，例如但不限于被至少一种碳水化合物结合分子结合，优选被至少一种碳水化合物表位特异性抗体结合的细胞、微生物、病毒或颗粒。
410术语任何保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂的“有效量”包括活的或死的微生物或这些微生物的裂解产物或片段，其相当于或衍生自约1x106至约1x1014cfu每人每天(cfu/人/天)，其中cfu为用于微生物测定的克隆形成单位，其被本领域技术人员所知并且可由其确定。
411在本发明另一实施方式中，有效量为保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂的量，其在至少一个个体中诱导可被本文别处所述的针对碳水化合物表位的至少一种免疫应答测试检测的针对碳水化合物表位的体液或细胞免疫应答，优选针对碳水化合物表位的体液和细胞免疫应答。在本发明另一实施方式中，有效量为为保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂的量，其在至少一个个体中诱导可被本文别处所述的至少一种免疫应答测试检测的针对碳水化合物表位的有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答，优选包括针对碳水化合物表位的Th1型CD4阳性T辅助细胞和/或细胞毒性CD8阳性T细胞的激活。
412在本发明另一实施方式中，有效量为这样的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂的量，其需要在至少一个个体中赋予针对碳水化合物表位阳性肿瘤细胞的免疫防护，以具有抗癌的预防效果，或以具有抗癌的治疗效果，或具有抗另一碳水化合物表位阳性疾病的预防或治疗效果。
413对于个体或个体的群的有效量可由本领域技术人员优选使用本文别处所述的至少一种针对碳水化合物表位的免疫应答测试，并且优选本文别处所述作为优选实施方式的针对碳水化合物表位的免疫应答测试的组合，和/或本领域技术人员已知或本文别处所述的临床应答测试，来确定和/或最优化。
414这些有效量对人可例如依赖于受试者，给药次数和时间表，保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段的配制或形式，给药途径和时间表，使用其的目的例如预防或治疗，碳水化合物表位阳性疾病或癌症的状态，从上述量或剂量或本文别处所述的优选量或剂量而变化；它们还可以依赖于物种、种族和在个体动物或个体人类之间而变化，所述个体动物或个体人类接受保健食品、药物组合物、或碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂。对于个体或对于个体的群，本领域技术人员能够通过使用说明书和本文所述的本发明的实施方式，来确定合适的和/或最优的剂量、给药途径和时间表。
415优选的为这样的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂的有效量和剂量，其在超过一个个体中，更优选在相当数量的个体中，更优选在至少10％，更优选在至少20％，更优选在至少30％，更优选在至少40％，更优选在至少50％，最优选在大多数个体中诱导或增强所述针对碳水化合物表位的免疫应答。
416在优选的实施方式中，有效量为这样的所述保健食品、所述药物组合物、或碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂的量，其在至少一个个体中诱导针对碳水化合物表位的免疫应答。
417在优选的实施方式中，所述诱导或增强的免疫应答为针对碳水化合物表位的体液和细胞免疫应答，其可被体液免疫应答测试1至6的至少一种和细胞免疫应答测试1至5的一种检测。
418在优选的实施方式中，有效量为这样的所述保健食品、所述药物组合物、所述碳水化合物阳性微生物或所述其片段或所述包括这些的制剂的量，其需要针对在至少一个个体中赋予针对碳水化合物表位阳性肿瘤细胞的免疫防护，以具有抗癌的预防效果，或以具有抗癌的治疗效果，或具有抗另一碳水化合物表位阳性疾病的预防或治疗效果。
在另一优选实施方式中，有效量为这样的所述保健食品、所述药物组合物、所述碳水化合物阳性微生物或所述其片段或所述包括这些的制剂的量，其在至少一个个体中诱导最大或接近于最大的针对碳水化合物表位的免疫应答。
419在更优选实施方式中，优选的有效量为这样的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂的量，其诱导最大或接近于最大的针对碳水化合物表位的免疫应答，所述免疫应答由本领域技术人员在针对碳水化合物表位的免疫应答测试中检测，由此该最大免疫应答不必在所有免疫应答测试中都为阳性，但优选这样，其给出针对碳水化合物表位的最高抗体应答或抗体滴度和/或针对碳水化合物表位(更优选针对碳水化合物表位阳性肿瘤细胞，更优选针对两者)的最高T细胞应答，最优选在针对碳水化合物表位的体液免疫应答测试1和3中显示最高抗体滴度和/或至少在细胞免疫应答测试1或2或3中显示针对碳水化合物表位的最高T细胞应答。
420在优选实施方式中，包括活的或死的微生物、这些微生物的裂解产物或片段的所述保健食品、所述药物组合物、所述碳水化合物阳性微生物或所述其片段或所述制剂的有效量，相当于或源自约1x106至约1x1014cfu每个体每剂量。
421在更优选实施方式中，包括活的或死的微生物、这些微生物的裂解产物或片段的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂的有效量，相当于或源自1x107至1x1013cfu/人/天，更优选2x108至1x1012，更优选1x109-1x1011cfu/人/天。
422如本领域技术人员所意识到的，有效量或有效剂量也可以依赖于给药途径、赋形剂的使用、与其它制剂共同使用的可能性而变化，所述其它制剂例如用于免疫增强、用于诱导免疫应答或建立免疫防护，或预防或治疗癌症的那些。
423如本领域技术人员所意识到的，有效量或有效剂量也可以依赖于使用形式以及如果它们包括活的或死的微生物、其裂解产物或片段，以及剂量次数以及剂量间的间隔时间而变化，所述使用形式例如用作保健食品、用作药物组合物、用作碳水化合物阳性微生物或用作其片段或用作包括这些的制剂。这些可由本领域技术人员优选通过使用本发明的提供的发明、测试和方法来确定和优化。
424在优选的实施方式中，保健食品为口服给药，从每天多于一剂量至每天、每周或每月一剂量，从短期间隔至常年使用，优选每天或每周使用4周至2年。
425在另一优选实施方式中，将单剂量给药至个体。
426在另一优选实施方式中，将多剂量给药至个体。
427在另一优选实施方式中，有效量对应于单剂量。
428在另一优选实施方式中，有效量对应于多剂量。
429在优选的实施方式中，药物组合物可以以少至仅一剂量至许多剂量，优选每周至每月至每月3剂量或每月6剂量或其交错组合来全身给药，并且可与以下免疫恢复组合：每月至每年6剂量，至每年5剂量至每年10剂量。
430在本发明另一优选实施方式中，包括至少一种碳水化合物阳性微生物或其裂解产物或片段的保健食品制剂的有效剂量在人类中为0,1mg/m2-10g/m2，更优选10mg/m2-10g/m2，更优选0,1g/m2-10g/m2。
431在另一优选实施方式中，制剂首先全身给药，随后口服免疫更新(oral refreshments of the immunization)。
432术语给药是指使人类或动物与有效量的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂接触，对于其可使用另外的载体。给药途径包括使人类或动物与有效量的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂接触的任何方法。优选的为这些给药途径，例如但不限于口服给药、全身给药、通过吸入或通过与皮肤或另一表皮接触给药，其导致针对碳水化合物表位的免疫应答、针对碳水化合物表位或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞的免疫防护、抗癌的预防效果或抗癌的治疗效果，其可以上述或本文别处所述的优选形式被确定。本领域技术人员可以选择最合适的给药途径。
433优选给药途径和制剂的实例描述于以下：
保健食品优选口服给药，例如以任何食品或饮料的形式，作为胶囊、片剂、乳剂、粉末、液体，或作为食品或饮料的组分例如食品添加剂。保健食品可以其本身或与至少一种其它组分混合的形式给予。保健食品自身或其与至少一种其它组分的混合物可以其本身或混入食品或饮料的形式给予。
434保健食品、以及药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂的用于口服给药的制剂可为任何口服可接受的剂型或有效量的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂，其包括但不限于，片剂、胶囊、纳米颗粒、乳剂和水悬浮液、分散液和溶液。用于片剂的常用载体包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂，例如硬脂酸镁，也典型地添加至片剂。对于以胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当水悬浮液或乳剂口服给药时，活性成分可悬浮或溶解于与乳化剂或悬浮剂组合的油相。如果需要，可以添加特定的甜味剂、调味剂或着色剂。
435用于口服给药的制剂可为任何口服可接受的剂型或有效量的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段或包括这些的制剂，其包括但不限于，片剂、胶囊、纳米颗粒、乳剂和水悬浮液、分散液和溶液。用于片剂的常用载体包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂，例如硬脂酸镁，也典型地添加至片剂。对于以胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当水悬浮液或乳剂口服给药时，活性成分可悬浮或溶解于与乳化剂或悬浮剂组合的油相。如果需要，可以添加特定的甜味剂、调味剂或着色剂。
436本发明的制剂可以口服或胃肠外给药。胃肠外给药包括注射例如滴注，皮下、静脉内或肌肉内注射，用软膏剂或透皮药物的透皮给药，用栓剂的直肠给药。当组合物口服给药时，其可以以下形式制备：硬胶囊、软胶囊、颗粒、粉末、微粒剂、锭剂、丸剂、片剂、梯度活性成分递送系统、液体和悬浮液。制备可通过药物领域的传统方法容易地进行。
437给药模式和剂型将理所当然影响对于给定的治疗应用所必需和有效的化合物或组合物的治疗量。当本发明的制剂以口服给药的形式制备时，组合物可以在正常药物中使用以下传统的药物成分制备：填料、增补剂(extender)、粘结剂、崩解剂、表面活性剂、稀释剂例如润滑剂和赋形剂。传统成分的具体实例包括受体(recipients)例如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸；粘结剂例如水、乙醇、单糖浆(simple syrup)、葡萄糖液体、淀粉液体、明胶溶液、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、磷酸钾和聚乙烯基吡咯烷酮；崩解剂例如干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂粉末、海带多糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters)、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉和乳糖；腐败抑制剂(decay inhibitor)例如白糖、硬脂酸、可可脂和氢化油；吸收助剂(absorbefacients)例如季铵盐和十二烷基硫酸钠；保湿剂例如甘油和淀粉；吸收剂例如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸；润滑剂例如纯滑石和硬脂酸盐。如果需要，制备进一步包括着色剂、防腐剂、芳香剂、调味剂和甜味剂。合适的药学上可接受的盐对本领域技术人员是已知的，并且包括无机和有机酸的碱盐，所述无机和有机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、乙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、水杨酸、苯基乙酸和扁桃酸。此外，本发明化合物的药物上可接受的盐也可与药学上可接受的阳离子形成，例如如果取代基包括羧基部分。合适的药学上可接受的阳离子在本领域是已知的，并且包括碱金属、碱土金属铵盐和季铵盐阳离子。
438在优选的实施方式中，药物组合物的给药途径选自：静脉内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、颅内注射、肿瘤内注射、上皮内注射、透皮给药、经食道给药(per oesophageal administration)、腹腔内给药(intraabdominal administration)、intraapendicularadministration)、动脉内给药(intraarterial administration)、关节内给药(intraarticular administration)、支气管内给药、口内给药(intrabuccal administration)、囊内给药(intracapsularadministration)、心脏内给药、软骨内给药、腔内给药(intracavitary administration)、脑内给药(intracephalicadministration)、结肠内给药(intracolic administration)、皮内给药(intracutaneous administration)、囊内给药(intracysticadministration)、真皮内给药(intradermal administration)、管内给药(intraductal administration)、十二指肠内给药(intraduodenal administration)、纤维束内给药(intrafascicularadministration)、油脂内给药(intrafat administration)、丝内给药(intrafilar administration)、裂内给药(intrafissuraladministration)、胃内给药(intragastric administration)、腺内给药(intraglandular administration)、肝内给药(intrahepaticadministration)、肠内给药(intraintestinal administration)、皮层内给药(intralamellar administration)、损伤区给药(intralesional administration)、韧带内给药(intraligamentousadministration)、舌内给药(intralingual administration)、乳房内给药(intramammary administration)、髓内给药(intramedullaryadministration)、脑脊膜内给药(intrameningeal administration)、心肌内给药(intramyocardial administration)、鼻内给药(intranasal administration)、眼内给药(intraocularadministration)、心包内给药(intraoperative administration)、口内给药(intraoral administration)、骨内给药(intraosseousadministration)、卵巢内给药(intraovarian administration)、胰腺内给药(intrapancreatic administration)、壁内给药(intraparietal administration)、骨盆内给药(intrapelvicadministration)、心包内给药(intrapericardial administration)、会阴内给药(intraperineal administration)、腹膜内给药(intraperitoneal administration)、胎盘内给药(intraplacentaladministration)、胸膜内给药(intrapleural administration)、脑桥内给药(intrapontine administration)、前列腺内给药(intraprostatic administration)、肺内给药(intrapulmonaryadministration)、脊柱内给药(intrarachidian administration)、直肠内给药(intrarectal administration)、肾内给药(intrarenaladministration)、巩膜内给药(intrascleral administration)、阴囊内给药(intrascrotal administration)、段内给药(intrasegmental administration)、蝶鞍内给药(intrasellaradministration)、脊柱内给药(intraspinal administration)、脾内给药(intrasplenic administration)、胸骨内给药(intrasternaladministration)、基质内给药(intrastromal administration)、滑膜内给药(intrasynovial administration)、跗骨内给药(intratarsal administration)、睾丸内给药(intratesticularadministration)、胸内给药(intrathoracic administration)、扁桃体内给药(intratonsillar administration)、气管内给药(intratracheal administration)、输卵管内给药(intratubaladministration)、鼓室内给药(intratympanic administration)、输尿管内给药(intraureteral administration)、尿道内给药(intraurethral administration)、子宫内给药(intrauterineadministration)、阴道内给药(intravaginal administration)、血管内给药(intravascular administration)、心室内给药(intraventricular administration)、脊柱内给药(intravertebraladministration)、膀胱内给药(intravesical administration)和玻璃体内给药(intravitreous ad-ministration)。
439在本发明更优选实施方式中，给药途径的实例(＝接触)包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、口服、透皮(局部)、透粘膜、腹膜内、鼻内、直肠和口服给药。
440本发明制剂可在其中包括组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(acid addition salt)，其用无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，和有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等。生理学上可容忍的载体在本领域是已知的。液体载体的实例为无菌水溶液，其不含除了活性成分和水之外的材料，或包含缓冲液例如生理pH值下的磷酸钠、生理盐水和二者，例如磷酸盐缓冲生理盐水。此外，水性载体可包含一种以上缓冲盐，以及盐例如氯化钠和氯化钾、右旋糖、丙二醇、聚乙二醇和其它溶质。除水之外和排除水之外，液体组分还可包含液相。此类其它液相的实例为甘油、植物油例如棉籽油、有机酯例如油酸乙酯和水-油乳剂。制剂包含本发明的碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段，碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段典型的量为总组合物重量的0.1重量百分比。重量百分比为碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段的重量相对于总组合物的比。因而，0.1重量百分比为每100克总组合物中0.1克碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段。
441术语″药学上可接受的盐″是指化合物的这样的盐，其保留生理有效性和游离碱的性质，并且其可以通过与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲基苯磺酸、水杨酸等反应而获得。药学上可接受的盐包括，例如碱金属盐，例如钠和钾，碱土金属盐和铵盐。
442包括碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段作为活性成分的制剂可以为适于口服的形式，例如，作为片剂、锭剂(troches)、水或油悬浮液、分散粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。旨在口服使用的组合物可以根据制造药物组合物领域的任何已知方法来制备，并且此类组合物可包含一种或多种选自以下的试剂：甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以提供药学上雅致的和可口的制剂。片剂包含与非毒性药学上可接受的赋形剂混合的活性成分，所述赋形剂适于制造片剂。这些赋形剂可为例如，惰性稀释剂例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂例如玉米淀粉或褐藻酸；粘结剂例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可未包衣或它们可通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并且由此提供较长时间的缓释作用。例如，可以使用延时材料例如甘油单硬脂酸酯或甘油双硬脂酸酯。它们可以通过描述于U.S.Pat.Nos.4,256,108、4,166,452和4,265,874中的技术来包衣，以形成控制释放的渗透治疗片剂。根据本发明的制剂还可以，或作为选择地包含一种或多种药物，所述药物可连接到调制剂或在组合物中可为游离的。实际上，如本文所述，任何药物可以与调制剂组合给药，以为了如下所述各种目的。可与调制剂一起给药的药物类型的实例包括镇痛剂、麻醉剂、防心绞痛剂、抗真菌剂、抗生素、抗癌药物(例如红豆杉醇或丝裂霉素C)、消炎剂(例如异丁苯丙酸和茚甲新)、驱肠虫剂、抗抑郁剂、解毒剂、止吐剂、抗组胺剂、抗高血压剂、抗疟剂、抗微管剂(例如秋水仙素或长春碱)、抗偏头痛剂、抗微生物剂、抗精神病剂(antiphsychotics)、退热剂、防腐剂(antiseptics)、抗信号剂(anti-signaling agents)(例如蛋白激酶C抑制剂或细胞内钙动员抑制剂)、抗关节炎剂、抗凝血酶剂、抗结核剂、止咳剂、抗病毒剂、食欲抑制剂、心血管药物、化学依赖性药物(chemicaldependency drugs)、泻剂、化疗剂、冠状动脉(coronary)、脑或末梢血管扩张剂、避孕剂、镇静剂、利尿剂、祛痰剂、生长因子、激素剂、催眠剂、免疫抑制剂、抗麻醉剂、拟副交感剂、镇静剂(sedative)、刺激剂、类交感神经剂、毒素(例如霍乱毒素)、安定剂(tranquilizer)和尿抗感染剂(urinary antiinfective)。
443口服用制剂还可作为硬明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合，例如花生油、液态石蜡或橄榄油。水悬浮液包含与适于制造水悬浮液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可为天然发生的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物，例如聚环氧乙烷硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐(hexitol anhydrides)的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。水悬浮液还包含一种或多种防腐剂，例如乙基或正丙基、对羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，以及一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
444油悬浮液可通过将活性成分悬浮于以下油来配制：植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油；或矿物油例如液体石蜡。油悬浮液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。甜味剂例如上述那些，可以添加调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。
445适于通过添加水制备水悬浮液的分散粉末或颗粒提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。例举合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，还可存在例如润湿剂、调味剂和着色剂。
446本发明的制剂还可为水包油乳剂的形式。油相可为植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂可为天然发生的胶例如阿拉伯树胶或黄蓍胶，天然发生的磷脂例如大豆、卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯例如脱水山梨醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳剂还也包含甜味剂和调味剂。
447糖浆和酏剂可以用甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖来配制。此类制剂可包含缓和剂、防腐剂和调味剂以及着色剂。药物组合物可为无菌注射水悬浮液或油悬浮液的形式。该悬浮液可以根据已知技术使用如上已提到的合适的分散剂或润湿剂和悬浮液来配制。无菌注射制品可以为在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为1，3-丁二醇中的溶液(absolution)。可使用的可接受的载体和溶剂为水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油传统上用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成单-或二甘油酯。此外，发现脂肪酸例如油酸可用于可注射的制剂。数量级从约0.01mg至约140mg每千克体重每天的剂量水平可用于治疗上述症状(约2.5mg至约7g每患者每天)。例如，碳水化合物表位阳性肿瘤可通过给药约0.01至50mg化合物每千克体重每天(约0.5mg至约3.5g每患者每天)来有效地治疗。可与载体材料组合以生产单一剂型的活性成分的量将依赖于治疗的宿主和特定的给药模式而变化。例如，旨在口服给药至人类的制剂可从总组合物的约5至约95％变化。单位剂型一般包含约1mg至约10g的活性成分。然而，应该理解对于具体患者的具体剂量水平将依赖于各种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、给药的饮食时间、给药途径、排泄速度、药物组合和正在治疗的特定疾病的严重性。根据本发明化合物的有效剂量将依赖于以下因素而变化：包括特定化合物、毒性和抑制活性、治疗的状况，以及化合物是单独给药还是与其它治疗一起。典型地有效剂量的范围为从0.0001mg/kg至1500mg/kg，更优选1至1000mg/kg，更优选约1至150mg/kg体重，最优选约50至100mg/kg体重。本发明还涉及用于治疗上述病理学状况的方法或过程。本发明的化合物可以优选以有效针对所述紊乱的量预防学上或治疗学上地给药至温血动物，例如需要此类治疗的人类，化合物优选以药物组合物或保健食品的形式使用。
448药学上可接受的赋形剂和载体溶液的制剂对本领域技术人员是已知的，按现状开发合适的剂量和治疗方案以将本文所述的特定组合物用于各种治疗方案，包括例如，口服、胃肠外、静脉内、鼻内和肌肉内给药和制剂。
449 A口服递送
在特定应用中，本文所述制剂可以通过口服给药递送给人类或动物。同样地，这些组合物可以用惰性稀释剂或用可吸收可食用的载体来配制，或者它们可以包封在硬或软壳明胶胶囊中，或它们可以压制成片，或将它们可以直接引入饮食的食品。
450甚至可以将活性化合物引入赋形剂，并以可摄取的片剂、口含片(buccal tables)、锭剂(troches)、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、包药干糊片(wafer)等的形式使用。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含以下：可以添加粘结剂例如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或凝胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；以及甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型为胶囊时，除了上述种类材料之外，其可包含液体载体。各种其它材料可作为包衣存在，或另外改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用虫胶、糖或二者包衣。酏剂的糖浆可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯，染料和调味剂例如樱桃或桔子口味。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学纯的，并且在所用的量中基本上无毒。此外，可将活性化合物混入缓释制品(preparation)和制剂(formulation)。
451典型地，这些制剂可以包含至少约0.1％以上的活性化合物，当然虽然活性成分的百分比可以变化，并且可以方便地为总制剂重量或体积的约1或2％至约60％或70％以上。自然地，在各治疗学上有用的组合物中的活性化合物的量可以以这样的方式制备以在化合物的给定单位剂量中获得适合的剂量。因素例如溶解度、生物利用度、生理半衰期、给药途径、产品贮藏寿命、以及其它药理学上的考虑将被制备此类药物制剂领域中的技术人员考虑，并且同样地，可能需要各种剂量和治疗方案。
452为了口服给药，作为选择，本发明的组合物可与一种或多种赋形剂以以下形式合并：漱口液、牙膏、口含片、口腔喷剂或舌下口服给药制剂。例如，可以以所需的量在合适的溶剂中引入活性成分来制备漱口液，所述合适溶剂例如硼酸钠溶液(多贝尔氏溶液(Dobell′sSolution))。作为选择，可将活性成分引入口服溶液，例如包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的口服溶液，或分散入牙膏，或以治疗有效的量/有效剂量添加至组合物，所述组合物可以包括水、粘结剂、研磨剂、调味剂、起泡剂和润湿剂。作为选择，组合物可制成可置于舌下或另外溶于嘴中的片剂或溶液形式。
453 B注射给药
454在某些情况下，需要胃肠外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内地递送本文所述的制剂。作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在适于与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合的水中制备。分散液还可在甘油、液体聚乙二醇或其混合物和在油中制备。在贮存和使用的普通条件下，这些制品包含防腐剂以防止微生物的生长。
455适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于即时(extemporaneous)制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须流化到存在容易的可注射性的程度。在制备和贮存条件下其必须是稳定的，并且必须抵抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可为溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和/或植物油。可以通过例如使用包衣，例如卵磷脂，通过在分散液的情况下保持所需的粒径和通过使用表面活性剂，保持合适的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金(parabens)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、噻汞撒等促进微生物作用的预防。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在延迟吸收的制剂(例如单硬脂酸铝和明胶)的组合物中使用，引起可注射组合物的长期吸收。
456为了在水溶液中胃肠外给药，例如，如果需要溶液应该适当地缓冲，并且液体稀释液首先用足够的盐水或葡萄糖来赋予等渗性。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。关于这一点，可以使用的无菌水性介质按照本说明书对本领域技术人员是已知的。例如，一剂量可以溶于1ml等渗的NaCl溶液，或添加至1000ml皮下输液或在提议的输注部位注射。依赖于治疗的患者的状况，将必然地出现剂量上的一些变化。无论如何，负责给药的人将确定用于个体患者的合适剂量。此外，对于人类给药，制品应该满足如国家或地区局生物标准的无菌性、致热原性(pyrogenicity)和一般安全性和纯度标准。
457无菌注射液通过将在合适溶剂中的所需量的活性化合物与各种以上列举的其它组分按照需要合并，然后无菌过滤来制备。通常，通过将各种无菌活性成分合并入无菌载体来制备，所述无菌载体包含基本分散介质和所需的来自以上列举的那些的其它成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自之前无菌过滤液的活性成分以及任何其它所需组分的粉末。
458本文所述的组合物可以以中性或盐形式配制。药学上可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的游离氨基形成)，或其用无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。用游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，和有机碱例如异丙胺、三甲胺、组胺、普鲁卡因等。配制时，溶液可以以与剂型制剂相容的形式和以治疗学上有效的量给药。制剂容易以各种剂型例如注射液、药物释放胶囊等来给药。
459如本文所用，″载体″包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介(vehicles)、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。用于药学上活性物质的此类介质和试剂的使用在本领域是已知的。除了在任何传统的介质或试剂与活性成分不相容的范围，其在治疗组合物中的使用是预期的。辅助活性成分也可引入组合物。
460短语″药学上可接受的″是指当给药至人类时不产生过敏或类似不利反应的分子实体和组合物。包含蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备在本领域很好理解。典型地，此类组合物制备为可注射的，作为液体溶液或悬浮液；注射前适合溶于或悬浮于液体的固体形式也可以制备。制品还可以被乳化。
461在另一优选实施方式中，本发明提供诱导或增强碳水化合物表位特异性免疫应答和/或预防或治疗碳水化合物表位阳性疾病的方法，其中将所述保健食品、所述药物组合物、所述碳水化合物阳性微生物或所述其片段或所述包括这些的制剂给药至健康个体。
462在另一优选实施方式中，本发明提供诱导或增强碳水化合物表位特异性免疫应答和/或预防或治疗碳水化合物表位阳性疾病的方法，其中将所述保健食品、所述药物组合物、所述碳水化合物阳性微生物或所述其片段或所述包括这些的制剂给药至具有与碳水化合物表位相关的疾病、癌症、肿瘤、至少一种肿瘤或癌细胞、或至少一种转移瘤(metastasis)的个体。
463具体地，保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂可以用于诱导针对癌症、肿瘤、癌细胞或从其衍生的转移瘤的免疫应答，用于诱导起针对肿瘤细胞、癌症、肿瘤、癌细胞或从其衍生的转移瘤的免疫防护作用的免疫应答，用于治疗肿瘤或癌症、转移瘤；和/或用于降低或预防癌症、肿瘤、癌细胞或从其衍生的转移瘤在健康个体或患者中的出现、传播或转移，各自分别优选包括至少一种碳水化合物表位阳性肿瘤细胞，其选自以下或本文别处所述的癌症、肿瘤或癌症或肿瘤疾病。例如，治疗针对原发肿瘤或癌症、最小残存肿瘤(minimal residual tumor)或癌症疾病、复发和/或转移或其部分。肿瘤或癌症的治疗还可作为辅助治疗起作用。保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂还可用于预防碳水化合物阳性肿瘤疾病、肿瘤或肿瘤细胞。例如，预防性应用涉及预防肿瘤和转移瘤。这些抗肿瘤剂根据公知的方法或本文别处所述以合适的形式给药。优选的变体为注射或以以下方式给药这些抗肿瘤剂或药物：口服、静脉内、在体腔内局部，例如腹膜内、直肠内、胃肠内途径，局部地，例如直接在肿瘤、在器官或在淋巴管中(淋巴结内)，以及皮下地、皮内地或在皮肤上，以及肌肉内。在优选的方式中，给药类型还可以组合，在这种情况下给药可以在如本文别处详细所述的不同天的治疗或在治疗的一天起影响。根据本发明，还可以组合两种或多种创造性的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物或其片段、或包括这些的制剂，以及将一种或这些的组合与一种或多种药物或肿瘤治疗组合，例如抗体治疗、化疗或放疗、在相同的时间或在时间上分别地合适地给药或施用。
464癌症、肿瘤、肿瘤细胞、癌细胞或从其衍生的转移瘤选自以下的癌症疾病或肿瘤疾病：耳-鼻-喉区域、肺、纵隔、胃肠道、泌尿生殖系统、妇科系统、乳房、内分泌系统、皮肤、骨和软组织肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、中枢神经系统的瘤、幼年期间的癌症疾病或肿瘤疾病、淋巴瘤、白血病、副肿瘤综合症、不明原发灶肿瘤(CUP综合症)、腹膜癌扩散、免疫抑制相关的恶性肿瘤和/或肿瘤转移。
465更具体地，癌症、肿瘤、肿瘤细胞、癌细胞或从其衍生的转移瘤可以包括以下类型的癌症：乳房、前列腺和结肠的腺癌；在支气管开始的所有形式的肺癌；骨髓癌、黑素瘤、肝瘤、成神经细胞瘤；乳头状瘤；胺前体摄取与脱羧细胞瘤(apudoma)；迷芽瘤；鳃原性瘤；恶性类癌综合症；类癌心脏病、癌(carcinoma)(例如，沃克癌(Walkercarcinoma)、基底细胞癌、鳞癌(squamobasal carcinoma)、布-皮二氏癌(Brown-Pearce carcinoma)、乳腺管癌、艾利希氏瘤(Ehrlichtumor)、原位癌、2型癌症(cancer-2 carcinoma)、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、粘液癌、非小细胞支气管癌、燕麦细胞癌、乳头状腺癌、硬癌、细支气管肺泡癌、支气管癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)；组织功能障碍；白血病(例如与B细胞白血病相关、混合细胞白血病、裸细胞白血病、T细胞白血病、慢性T细胞白血病、HTLV-II相关白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、肥大细胞白血病和骨髓白血病)；恶性组织细胞增生症、霍奇金病(Hodgkindisease)、非霍奇金淋巴瘤、孤立性浆细胞瘤、网状内皮组织增殖、软骨母细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨大细胞瘤、组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；白血病性肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；伊汶氏肉瘤(Ewing sarcoma)；滑膜瘤；腺纤维瘤；腺淋巴瘤；癌肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间叶瘤(mesenchymoma)；中肾瘤、肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤、成绒(毛)膜细胞瘤、腺癌、腺瘤；胆管瘤；圆柱瘤；囊腺癌、囊腺瘤；粒膜细胞瘤；两性母细胞瘤(gynadroblastoma)；汗腺腺瘤；胰岛细胞瘤；莱迪希细胞瘤；乳头状瘤；睾丸支持细胞瘤、泡膜细胞瘤、平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤、神经胶质瘤；髓母细胞瘤、脑膜瘤；神经鞘瘤；神经母细胞瘤；神经上皮瘤、神经纤维瘤、神经瘤、副神经节瘤、非嗜铬性亚神经节瘤、血管角化瘤、血管淋巴样增生伴嗜酸细胞增多、硬化性血管瘤(sclerotizing angioma)；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤、血管肉瘤；淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤；松果体瘤；叶状囊性肉瘤；血管肉瘤；淋巴管肉瘤；粘液肉瘤、卵巢癌；肉瘤(例如实验上地伊汶氏肉瘤、卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)；瘤(例如，骨瘤、乳腺瘤、消化系统的瘤、结肠直肠瘤、肝瘤、胰瘤、脑垂体瘤、睾丸瘤、眼眶瘤，头和颈、中枢神经系统的瘤，听力器官、骨盆、呼吸道和泌尿生殖道的瘤)；神经纤维瘤病和宫颈鳞状上皮非典型增生，和/或从这些衍生的任一的转移瘤。
466在优选的实施方式中，癌症、肿瘤、肿瘤细胞、癌细胞或从其衍生的转移瘤选自癌症疾病或肿瘤疾病，其包括对根据本发明定义的碳水化合物表位呈阳性的至少一种细胞或优选显著量的细胞或更优选大多数肿瘤细胞，选自：耳-鼻-喉区域的肿瘤，包括鼻内、鼻窦、鼻咽、嘴唇、口腔、口咽、喉、下咽、耳、唾液腺的肿瘤和副神经节瘤，肺的肿瘤，包括非小细胞支气管癌、小细胞支气管癌，纵隔的肿瘤，胃肠道的肿瘤，包括食道、胃、胰腺、肝、胆囊和胆道、小肠、结肠和直肠癌以及肛门癌的肿瘤，泌尿生殖瘤包括肾、输尿管、膀胱、前列腺、尿道、阴茎和睾丸的肿瘤，妇科肿瘤包括子宫颈、阴道、外阴、子宫癌、恶性滋养细胞疾病、卵巢癌的肿瘤，输卵管的肿瘤(TubaFaloppii)、腹腔、乳腺癌的肿瘤，内分泌的肿瘤包括甲状腺、甲状旁腺、肾上腺皮质、内分泌胰腺肿瘤、类癌瘤和类癌瘤综合症、多发性内分泌瘤病、骨和软骨肉瘤、间皮瘤、皮肤瘤的肿瘤，黑素瘤包括皮肤和眼内黑素瘤，中枢神经系统的肿瘤，幼儿期间的肿瘤包括视网膜母细胞瘤、维尔姆斯瘤(Wilms tumor)、神经纤维瘤病、神经母细胞瘤、伊汶氏肉瘤肿瘤家族、横纹肌肉瘤，淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、中枢神经系统的初生淋巴瘤、霍奇金氏病，白血病包括急性白血病、慢性骨髓和淋巴白血病、浆细胞瘤、脊髓发育不良综合症、副肿瘤综合症、不明原发灶肿瘤(CUP综合症)、腹膜癌，免疫抑制相关的恶性肿瘤包括AIDS相关的恶性肿瘤例如卡波西肉瘤、AIDS相关的淋巴瘤、AIDS相关的中枢神经系统肿瘤、AIDS相关的霍奇金疾病和AIDS相关的肛门与生殖器瘤、移植相关的恶性肿瘤，转移的肿瘤包括脑转移瘤、肺转移瘤、肝癌、肝转移瘤、骨转移瘤、胸膜和心包转移瘤，以及恶性肿瘤腹水，和/或从这些衍生的任一转移瘤。
467在另一优选实施方式中，癌症、肿瘤、肿瘤细胞、癌细胞或从其衍生的转移瘤选自癌症疾病或肿瘤疾病，例如乳腺癌、胃肠肿瘤包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、早期胃癌、小肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、肾细胞癌、恶性黑素瘤和/或肝癌，和/或从这些衍生的任一转移瘤。
468在进一步优选实施方式中，癌症、肿瘤、肿瘤细胞、癌细胞或从其衍生的转移瘤选自癌疾病或肿瘤疾病(其包括对根据本发明定义的碳水化合物表位呈阳性的至少一种细胞、优选显著量的细胞或更优选大多数肿瘤细胞)，其选自：乳腺癌、胃肠肿瘤包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、早期胃癌、小肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、肾细胞癌、恶性黑素瘤和/或肝癌，和/或从这些衍生的任一转移瘤。
469在另一优选实施方式中，本发明提供诱导或增强碳水化合物表位特异性免疫应答和/或预防或治疗碳水化合物表位阳性疾病、癌症、肿瘤、至少一种肿瘤或癌细胞、或至少一种转移瘤的方法，所述转移瘤包括至少一种为碳水化合物表位阳性的细胞。
470在进一步优选实施方式中，本发明提供诱导或增强碳水化合物表位特异性免疫应答和/或预防或治疗碳水化合物表位阳性疾病的方法，其中患者具有癌症、肿瘤、至少一种肿瘤或癌细胞，或至少一种选自以下的转移瘤：癌症疾病或肿瘤疾病包括乳腺癌、胃肠肿瘤包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、早期胃癌、小肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、肾细胞癌、恶性黑素瘤和/或肝癌，和/或从这些衍生的任一转移瘤。
471在本发明的优选实施方式中，与碳水化合物表位或碳水化合物表位阳性疾病相关的疾病选自：胃肠失调、惠普尔病(whipple sdisease)、关节炎、结节病、败血病或放射性骨坏死。
472胃肠失调优选选自功能性肠障碍和炎性肠疾病，由此炎性肠疾病选自克罗恩氏病、回肠炎和/或溃疡性结肠炎，机能性肠障碍选自：胃食管反流、消化不良、肠易激综合症和/或功能性腹痛。本发明上下文中的胃肠道由以下组件组成：口(口腔；包括唾液腺、粘膜，牙齿和舌头)、咽、食道和贲门、胃(其包括窦(antrum)和幽门)、肠(bowel)或肠(intestine)：小肠，其具有三部分：十二指肠、空肠、回肠；大肠，其具有三部分：盲肠(阑尾连接在盲肠上)、结肠(升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠)、直肠和/或肛门。
473本发明意义上的与碳水化合物表位相关的疾病还为全部或部分由自身抗体的形成和它们对全生物体或器官系统的损害作用导致的、即由自身攻击导致的疾病。可以分类成器官特异性、媒介性和/或全身性自身免疫疾病。优选的器官特异性自身免疫疾病为乔本氏甲状腺炎(HASHIMOTO thyroiditis)、原发性粘液水肿、甲状腺毒症(巴西多氏病(BASEDOW disease))、恶性贫血、艾迪生病(ADDISONdisease)、重症肌无力和/或小儿糖尿病。优选的媒介性自身免疫疾病为古德帕斯丘综合征(GOODPASTURE syndrome)、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性白细胞减少、特发性血小板减少、寻常型天疱疮、交感性眼炎、原发性胆汁硬化、自身免疫性肝炎、溃疡性结肠炎和/或干燥综合症(
syndrome)。优选的全身自身免疫疾病为类风湿性关节炎、风湿热、系统性红斑狼疮、皮肌炎/多肌炎、进行性系统性硬化病、韦氏肉芽肿病(WEGENER granulomatosis)、全动脉炎和/或变应性血管炎。典型的自身免疫疾病为甲状腺毒症、甲状腺引起的粘液水肿、乔本氏甲状腺炎、一般的内分泌病、恶性贫血、慢性A型胃炎、血液的单一或全部血球元素的疾病(例如自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少或血小板病、特发性白细胞减少或粒性白血球缺乏症)、寻常型天疱疮和类天疱疮、交感性眼炎和许多形式的葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化和慢性攻击性自身免疫性肝炎、I型糖尿病、克罗恩病和溃疡性结肠炎、干燥综合症、艾迪生病、播散性红斑狼疮和所述疾病的盘形形式、皮肌炎和硬皮病、类风湿性关节炎(＝原发性慢性多关节炎)、抗肾小球基底膜肾炎。原理为由于对自主决定(self-determinants)的免疫耐受的崩溃导致的攻击性免疫反应和T抑制细胞(具有淋巴细胞标记T8)的活性的降低或T辅助细胞(具有淋巴细胞标记T4)相对于抑制子细胞的过量；此外，可以通过例如以下形成自身抗体：通过将宿主蛋白偶联到半抗原(例如药物)、通过个体发生组织不发育直到自身耐受性已经发育、通过作为与例如被病毒或细菌感染有关的蛋白质构象变化结果解掩蔽的蛋白质组分，以及通过与瘤形成有关的新蛋白质。
474本发明意义上的败血病疾病为由于病原性细菌和/或其毒素的连续或周期性入侵，从疾病的病灶和它们沿淋巴-血液途径的传播至形成全面或局部感染而导致的疾病。
475本发明意义上的败血病优选伤口败血病(蜂窝织炎、血栓性静脉炎、淋巴管炎)、产后败血病(在产褥热的情况)、耳原性败血病(在中耳炎的情况)、tonsillogenic败血病(在咽喉痛、扁桃体周炎的情况)、胆管炎性败血病(在化脓性胆囊炎、胆管炎的情况)、门静脉炎性败血病(在门静脉炎的情况)、脐带败血病(在脐炎的情况等)、尿路感染引起的败血症(urosepticemia)、以及牙肉芽瘤。本发明意义上的败血病可为急性至高度急性(爆发性)、亚急性(例如亚急性细菌性心内膜炎)或慢性，当然，还可为新败血病。
476因此，本发明意义上的败血病为患者中所有病理变化，其与间歇热和cold chills有关，与脾肿瘤、骨髓或血液的毒性反应或损伤(多核白细胞增多、贫血、溶血、血小板减少)有关、或与心脏和血管舒缩神经中的病理反应(心动过速、血液循环的集中(centralization)、水肿、少尿；可能的休克)或在消化道中的的病理反应(干燥的、舌苔，腹泻)有关，或与脓毒败血病(具有脓毒梗塞和转移性脓肿形成的脓血症)有关。
477在本发明意义上，优选的疾病包括：AIDS、痤疮、蛋白尿(albuminuria)(蛋白尿(proteinuria))、戒酒综合征、过敏、脱发症(头发失去)、ALS(肌萎缩性脊髓侧索硬化症)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、视网膜黄斑变性(retinal macula seniledegeneration)、贫血、地中海贫血、焦虑综合征、炭疽(anthrax)(炭疽(milzbrand))主动脉硬化、闭塞性动脉病、动脉硬化、动脉闭塞、动脉颞肌(arteriitis temporalis)、动静脉瘘、哮喘、呼吸衰竭、自身免疫疾病、椎间盘脱出、腹膜发炎、胰腺癌、贝克肌营养不良、良性前列腺增生(BPH)、膀胱癌、血友病、支气管癌、乳腺癌、BSE、衣原体感染、慢性疼痛、硬化、脑震荡(commotio cerebri)(脑震荡(brainconcussion))、克-雅氏病(Creutzfeld-Jacob disease)、肠癌、肠结核、抑郁症、尿崩病、糖尿病、幼年糖尿病(diabetes mellitusjuvenilis)、糖尿病性视网膜病、进行性假肥大性肌营养不良、十二指肠癌、进行性肌营养障碍(dystrophia musculorum progressive)、营养不良、埃博拉病毒(Ebola)、湿疹、勃起功能障碍、肥胖症、纤维变性、子宫颈癌、子宫癌、脑出血、脑炎、脱发、偏瘫、溶血性贫血、血友病、尿失禁、宠物过敏(动物毛发过敏)、皮肤癌、带状疱疹、心肌梗塞形成、心功能不全、心瓣炎、大脑麻痹、脑卒中(cerebralstroke)、脑癌、睾丸癌、局部缺血、卡勒氏病(Kahler′s disease)(浆细胞瘤)、小儿麻痹症(脊髓灰质炎)、骨质疏松、结肠癌、接触性湿疹、瘫痪、肝硬化、白血病、肺纤维症、肺癌、肺水肿、淋巴结癌、霍奇金病(Morbus Hodgkin)、淋巴肉芽肿病、淋巴瘤、狂犬病、胃癌、脑膜炎、粘液粘稠病(囊纤维化)、多发性硬化(MS)、心肌梗塞、神经性皮炎、神经纤维瘤病、神经元瘤(neuronal tumors)、肾癌(肾细胞癌)、骨质疏松症、胰腺癌、肺炎、多发性关节炎、多神经病、潜在疾病(potency disorders)、进行性系统硬化(PSS)、前列腺癌、直肠癌、胸膜炎、颅脑创伤、阴道癌、窦炎、食道癌、震颤、肺结核、肿瘤疼痛、灼伤/烫伤、中毒、病毒性肺炎、绝经、软组织肉瘤、软组织肿瘤、脑血液循环失调、CNS肿瘤。
478为了测试，应该进行使用健康人类志愿者的研究，其中针对Core-1的血清抗体滴度通过在首次应用保健食品前，使用体液免疫应答测试1至6中至少一种，确定存在的针对Core-1的抗体应答来确定，优选对于人类测试选择无或具有较低抗Core-1抗体水平的志愿者。在这些志愿者中，包括AG6或MU1或安慰剂的保健食品应该口服给药3至30个周。应该进行至少两种不同剂量的口服给药。在口服保健食品开始之前和在口服保健食品开始之后以合适的间隔，通过使用体液免疫应答测试1至6和/或细胞免疫应答测试1至5中至少一种，通过确定针对Core-1的抗体和/或T细胞应答进行免疫应答。如果制剂具有所需的性质，与通过在体液免疫应答测试1至6中至少一种和/或细胞免疫应答测试1至5中至少一种呈阳性的阳性测试的研究前的滴度相比，在接受保健食品的志愿者组中的显著量的志愿者中，观察到针对Core-1的抗体应答和/或针对Core-1的T细胞应答显著升高。在安慰剂组中，针对Core-1的抗体或T细胞应答的升高较少频繁地观察到或至较低的程度。
479这显示保健食品在人类中用于构建针对Core-1的免疫应答的有效性，所述免疫应答起针对Core-1阳性癌症细胞的防护作用以用于预防、降低Core-1阳性肿瘤或转移瘤的传播或用于其治疗。
480为了测试治疗潜力，应该用具有Core-1阳性肿瘤的人类免疫活性癌症患者进行研究，所述Core-1阳性肿瘤经过手术以除去大块肿瘤。然后在首次服用药物组合物前，通过使用用于确定针对Core-1的抗体应答的存在的体液免疫应答测试1至6中至少一种，确定针对Core-1的血清抗体滴度。口服、腹腔内或静脉内给药包括AG6或MU1或安慰剂的药物组合物几次，持续3至70个周。进行至少两种不同的剂量的口服给药。在服用保健食品开始之前和在服用保健食品开始之后以合适的间隔，通过使用体液免疫应答测试1至6和/或细胞免疫应答测试1至5和/或临床应答中至少一种，通过确定针对Core-1的抗体和/或T细胞应答进行免疫应答。与通过在体液免疫应答测试1至6中至少一种和/或细胞免疫应答测试1至5中至少一种或部分或全部临床应答呈阳性的阳性测试的研究前的滴度相比，在接受本发明的制剂的组中的显著量的志愿者中，观察到针对Core-1的抗体应答和/或针对Core-1的T细胞应答显著升高，或在接受制剂的显著数量的患者中，存在延长的发展时间或存活时间。在安慰剂组中，针对Core-1的抗体或T细胞应答的升高较少频繁地观察到或至较低的程度和/或观察到无或显著较低的临床应答。
481这显示药物组合物在人类中用于构建针对Core-1的免疫应答的有效性，所述免疫应答起针对Core-1阳性癌症细胞的防护作用以用于预防、降低Core-1阳性肿瘤或转移瘤的传播或用于其治疗。
482 Core-1阳性微生物或其片段在活生物体(人类/动物)的体内的接触可以在显著量的人类或动物中引发结合Core-1、Core-1抗原或Core-1阳性肿瘤细胞的抗体的产生。
483令人惊奇地是，针对Core-1的抗体可以起针对新产生的癌症细胞的免疫监视机制的作用。更令人惊奇地是，可以在显著量的人类或动物中实现Core-1特异性细胞免疫应答，其包括针对Core-1和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的CD4阳性Th1型T细胞的激活和/或CD8阳性细胞毒性T细胞的激活。
484在用健康人类志愿者的研究中，针对Tn或Lewis-或Lewis-Y的血清抗体滴度可以在首次服用保健食品之前通过使用体液免疫应答测试1至6的至少一种确定存在的针对Tn或Lewis Y的抗体应答来确定，对于人类测试优选选择无或具有较低Tn或Lewis Y抗体水平的志愿者。在这些志愿者中，包括Tn阳性微生物或Lewis-Y阳性微生物或安慰剂的保健食品口服给予3至30个周。进行至少两种不同的剂量的口服给药。在口服保健食品开始之前和在服用保健食品开始之后以合适的间隔，通过使用体液免疫应答测试1至6和/或细胞免疫应答测试1至5中至少一种，通过确定针对Tn或Lewis Y的抗体和/或T细胞应答进行免疫应答。对于合适的制剂，与通过在体液免疫应答测试1至6中至少一种和/或细胞免疫应答测试1至5中至少一种呈阳性的阳性测试的研究前的滴度相比，在接受保健食品的志愿者组中的显著量的志愿者中，应该分别观察到针对Tn或Lewis Y的抗体应答和/或针对Tn或Lewis Y的T细胞应答显著升高。在安慰剂组中，针对Tn或Lewis Y的抗体或T细胞应答的升高较少频繁地观察到或至较低的程度。细胞免疫应答的诱导的特征在于Tn-或Lewis Y-特异性T细胞例如CD4阳性Th1细胞和/或CD8阳性细胞毒性T细胞的激活，分别表明有效的Tn-或Lewis Y-特异性细胞免疫应答的诱导。
485这显示保健食品在人类中用于构建针对Tn或Lewis Y的免疫应答的有效性，所述免疫应答起针对Tn或Lewis Y阳性癌症细胞的防护作用以用于预防、降低Tn或Lewis Y阳性肿瘤或转移瘤的传播或用于其治疗。
486在用遭受Lewis-Y阳性肿瘤的人类免疫活性(immuno-competent)癌症患者的研究中，在首次施用药物组合物之前，针对Lewis-Y的血清抗体滴度通过使用体液免疫应答测试1至6的至少一种确定存在的针对Lewis-Y的抗体来确定。
487在除去大块肿瘤之后在辅助装置(adjuvant setting)中治疗患者。口服、腹腔内或静脉内给药包括Lewis-Y阳性细菌菌株或安慰剂的药物组合物几次，持续3至70个周。进行至少两种不同的合适剂量的给药。通过使用体液免疫应答测试1至6和/或细胞免疫应答测试1至5的至少一种，通过确定针对Lewis-Y的抗体和/或T细胞应答进行免疫应答。通过在给药药物组合物开始之前和在给药药物组合物开始之后以合适的间隔，通过确定发展时间(time to progression)、无瘤存活率(tumor free survival)和/或肿瘤体积和/或位点来进行临床应答。与通过在体液免疫应答测试1至6中至少一种和/或细胞免疫应答测试1至5中至少一种或部分或全部临床应答呈阳性的阳性测试的研究前的滴度相比，在接受本发明的制剂的组中的显著量的志愿者中，观察到针对Lewis-Y的抗体应答和/或针对Lewis-Y的T细胞应答显著升高，或在接受制剂的显著数量的患者中，存在延长的发展时间或存活时间。
488诱导的T细胞应答显示有效Lewis-Y特异性细胞免疫应答的特征，所述Lewis-Y特异性细胞免疫应答包括CD4阳性Th1 T细胞和CD8阳性细胞毒性T细胞的激活。在安慰剂组中针对Lewis Y的抗体或T细胞应答的升高较少频繁地观察到或至较低的程度，和/或无或显著低的临床应答被观察到。
489这显示药物组合物在人类中用于构建针对Lewis-Y的免疫应答的有效性，所述免疫应答起针对Lewis Y阳性癌症细胞的防护作用以用于预防、降低Lewis Y阳性肿瘤或转移瘤的传播或用于其治疗。
490 Lewis-Y阳性微生物或其片段在活生物体(人类/动物)的体内的接触可以在显著量的人类或动物中引发结合Lewis-Y、Lewis-Y抗原或Lewis-Y阳性肿瘤细胞的抗体的产生。令人惊奇地是，针对Lewis-Y的抗体可以起针对新产生的癌症细胞的免疫监视机制的作用。有效的Lewis-Y特异性细胞免疫应答的诱导可以导致在患者中杀死残余的或新产生的Lewis-Y阳性肿瘤细胞。
F)试剂盒
491本发明涉及用于在人类或动物中诱导针对如本文别处所述的碳水化合物表位或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞的特异性体液和/或细胞免疫应答的试剂盒，其包括本文别处所述的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段，或包括这些的制剂，以及关于试剂盒用途的信息。
492本发明还涉及用于在人类或动物中诱导有效的针对如本文别处所述的碳水化合物表位或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞或疾病细胞的碳水化合物特异性细胞免疫应答的试剂盒，其包括本文别处所述的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段，或包括这些的制剂，以及关于试剂盒用途的信息。
493本发明还涉及用于降低或预防碳水化合物表位阳性疾病或肿瘤，优选碳水化合物表位阳性肿瘤的出现的试剂盒，其包括本文别处所述的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段，或包括这些的制剂，以及关于试剂盒用途的信息。
494本发明还涉及用于降低或预防碳水化合物表位阳性疾病的传播或肿瘤，优选碳水化合物表位阳性肿瘤的转移的试剂盒，其包括本文别处所述的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段，或包括这些的制剂，以及关于试剂盒用途的信息。
495本发明还涉及用于治疗碳水化合物表位阳性疾病或肿瘤，优选碳水化合物表位阳性肿瘤的试剂盒，其包括本文别处所述的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段，或包括这些的制剂，以及关于试剂盒用途的信息。
496本发明还涉及加强免疫系统或提高本文别处所述的免疫应答的试剂盒，其包括本文别处所述的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段，或包括这些的制剂，以及关于试剂盒用途的信息。
497试剂盒可以包括解释如何组合试剂盒组分的信息(说明书，因特网地址)。所述信息还可以涉及治疗方案。
498本发明还涉及用于确定针对碳水化合物表位的免疫应答的试剂盒，所述针对碳水化合物表位的免疫应答的确定包括本文所述的针对碳水化合物表位的免疫应答测试的至少一种，优选至少两种，更优选至少一种体液和一种细胞免疫应答测试，所述试剂盒包括在相应免疫应答测试下所述的至少一种材料，以及关于试剂盒用途的信息。在优选的实施方式中额外地包括相应的对照，更优选至少一种本文别处所述的保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段，或包括这些的制剂。
499本发明还涉及用于产生至少一种针对碳水化合物表位的功能性树突细胞的试剂盒，其包括保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段，或包括这些的制剂，以及关于试剂盒用途的信息。
500在优选实施方式中，用于产生至少一种针对碳水化合物表位的功能性树突细胞的试剂盒进一步包括衍生自树突细胞系例如但不限于MUTZ-3或Nemod-DC的未成熟树突细胞。
501本发明还涉及用于产生至少一种针对碳水化合物表位的激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系的试剂盒，其包括保健食品、或药物制剂、或碳水化合物阳性微生物或其片段，或包括这些的制剂，以及关于试剂盒用途的信息。
502本发明还涉及用于分离包括至少一种碳水化合物表位携带分子或结构的碳水化合物阳性微生物或微生物的片段的试剂盒，其包括至少一种碳水化合物表位特异性抗体或碳水化合物结合分子，以及关于试剂盒用途的信息。
503本发明还涉及用于鉴定包括至少一种碳水化合物表位携带分子或结构的碳水化合物阳性微生物或微生物的片段的试剂盒，其包括至少一种碳水化合物表位特异性抗体或碳水化合物结合分子，以及关于试剂盒用途的信息。
504本发明还涉及用于鉴定或分离包括至少一种碳水化合物表位阳性分子或结构的碳水化合物阳性微生物或微生物的片段，或用于鉴定合适的碳水化合物阳性微生物以用作本发明保健食品和药物组合物的组分的试剂盒，其包括至少一种碳水化合物表位特异性抗体或碳水化合物结合分子，以及关于试剂盒用途的信息。
505在优选的实施方式中，试剂盒包括至少一种碳水化合物阳性微生物、其裂解产物或片段作为阳性对照。
G)用于抗体产生的方法
506本发明还提供用于产生识别目的碳水化合物表位的抗体或抗体组合物或多克隆血清的方法，包括：
(a)使保健食品、药物制剂、碳水化合物阳性微生物或其片段与人类或动物接触
(b)诱导或增强识别碳水化合物表位和/或碳水化合物表位阳性肿瘤细胞的体液免疫应答
(c)分离所述抗碳水化合物表位抗体或抗体组合物。
507根据一个实施方式，在步骤(c)中产生至少一种产生所述抗碳水化合物表位抗体或抗体组合物的细胞。所述最终的步骤(c)可以通过各种方法例如以下来完成：
(i)优选通过与无限增殖细胞系(immortal cell line)按照杂交瘤技术中所进行的来融合，或优选通过用合适的病毒例如艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr Virus)(EBV)感染，或通过与引起细胞无限增殖化的至少一种基因例如来自EBV的E1来重组转染，使至少一种产生所述抗碳水化合物表位抗体的细胞无限增殖化；或
(ii)分析负责抗体特异性的抗碳水化合物表位抗体的至少可变区或抗碳水化合物表位抗体的至少结合区的肽序列，并且用编码以下的DNA来转化细胞：作为任何同种型(isotype)的全抗体的抗碳水化合物表位抗体或其片段，或抗碳水化合物表位抗体的片段的融合蛋白，或具有至少一种其它氨基酸或多肽序列的全抗体。
508优选能够稳定产生抗体的细胞，这意味着细胞可以传代合适量的周期以用于产生抗体，其例如但不限于杂交瘤细胞和其它无限增殖细胞，或通过重组稳定转化的细胞例如但不限于CHO、NS0、SP2、Y0、PerC.6、Hec293。然而，例如在COS或Hec293细胞或B细胞中瞬时表达也为本发明的实施方式。所述抗碳水化合物表位单克隆抗体可以从培养上清液中分离。在本发明的优选实施方式中，所述产生抗碳水化合物表位单克隆抗体的细胞通过单细胞克隆获得。
509在优选的实施方式中，本发明提供编码抗碳水化合物表位单克隆抗体或其片段的核酸例如DNA。
510在优选的实施方式中，本发明提供抗碳水化合物表位抗体或抗体组合物或多克隆血清、抗碳水化合物表位单克隆抗体或其至少一种片段。在另一实施方式中，本发明提供产生抗碳水化合物表位抗体或抗体组合物或其至少一种片段的细胞。在进一步优选实施方式中，本发明提供抗碳水化合物表位单克隆抗体或片段，其为人源化抗体或来自转基因鼠的人抗体。
511在优选的实施方式中，本发明提供如上所述产生抗碳水化合物表位抗体或抗体组合物、抗碳水化合物表位单克隆抗体或其至少一种片段的细胞。
512本发明意义上的所述抗碳水化合物表位抗体可为任何在人类或动物中识别目的碳水化合物表位和/或携带目的碳水化合物表位的肿瘤细胞的可诱导的抗体，优选为这样的抗体，其为具有如本文定义或别处所述的结合或特异性标准的碳水化合物表位特异性抗体。
513所述碳水化合物表位抗体可通过本领域技术人员已知的技术具有和形式为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或从其衍生的任何片段，例如但不限于Fab，F(ab)2、单链抗体、单结构域抗体、多体(multibodies)、抗体融合蛋白、双特异性抗体和人源化或嵌合抗体(chimaerized antibodies)。
514可使任何动物或人类与保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物和/或其片段接触，优选的为人类和小鼠、大鼠、兔、山羊、骆驼、鸡、仓鼠、豚鼠或猴子，更进一步优选的是本领域技术人员已知特别适用于产生抗体应答的动物，例如但不限于用于多克隆抗体血清的兔、山羊、大鼠、人类、黑猩猩和小鼠，和本领域技术人员已知特别适用于产生单克隆抗体的那些动物，例如但不限于小鼠、大鼠、人类，更优选的是携带至少部分人类抗体基因的转基因小鼠和人类。
515使接触是指用于给药能够诱导针对目的碳水化合物表位的体液免疫应答的保健食品、药物组合物、碳水化合物阳性微生物和/或其片段的本文别处所述的任何给药方法或途径。可以使用其它佐剂以用于增加免疫原性，这对于本领域技术人员是已知的。优选的为口服和全身给药以及在后者内，静脉内、皮内、或皮下和甚至腹膜内给药。
516针对目的碳水化合物表位的体液免疫应答的诱导可以在本发明体液免疫应答测试中测定，并且如本文别处所述体液免疫应答测试1至6中至少一种必须为阳性，由此在优选的实施方式中，所述获自血清、血浆或粪便的抗体还包括这样的抗体，其获自产生针对目的碳水化合物表位的抗体的细胞，例如B-细胞、或无限增殖的B-细胞、或重组地表达抗碳水化合物表位抗体的细胞。这些抗体可以以本领域技术人员已知的各种方式获得，在优选的实施方式中，将针对合适抗原被预吸收的来自血液的血清、或血清的片段，在体液免疫应答测试1至6中至少一种中用作获自血清、血浆或粪便的抗体，所述合适抗原例如对目的碳水化合物表位呈阴性的微生物抗原，优选对目的碳水化合物表位呈阴性的微生物，或来自抗体产生细胞的抗体，或纯化抗体，其例如如上所述以全细胞或分级的细胞上清液的形式。
定义
517保健食品
根据本发明，术语“保健食品”是指可被人类或动物口服摄取的任何保健食品、保健食品的组合物或制剂，例如但不限于保健食品、营养添加剂、食品添加剂、膳食补充剂、临床食品或营养品、药物食品或营养品、肠道食品、肠道临床营养品、健康护理营养品或食品、特定膳食用途的食品、特定健康用途的食品或功能性食品，其可以以不同的形式口服施用，例如但不限于胶囊、片剂、乳剂、粉末、液体，以及以任何食品或饮料或作为其部分的形式。在特定情况下，保健食品可以胃肠外给予(胃肠外食品)。保健食品可以通过自身或与至少一种其它成分混合给予。通过自身或与至少一种其它成分混合的保健食品可以通过自身或混入食品或饮料给予。术语保健食品还指任何食品、饮料、胶囊、片剂、乳剂、粉末或液体。
518药物组合物
根据本发明，术语“药物组合物”是指可以用作药物、或药品、或生物制剂的任何组合物，或为药物或或药品、或生物制剂的任何组分。
519根据本发明，术语“碳水化合物阳性微生物”是指当接触时被至少一种碳水化合物结合分子识别并因而结合的任何微生物，所述碳水化合物结合分子特异性识别通常在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位(如本文别处定义)。优选在用碳水化合物结合分子的结合研究期间，当与微生物一起孵育时，该结合被以下所抑制：温和的高碘酸盐处理，和/或碳水化合物表位或包括碳水化合物表位的碳水化合物结构的部分或全部化学或酶除去或改变，和/或用合适量的另一种识别所述碳水化合物表位的碳水化合物结合分子抑制碳水化合物结合分子的结合、和/或用合适量的碳水化合物表位或分子、分子的混合物或包括所述碳水化合物表位的细胞抑制碳水化合物结合分子的结合。术语“碳水化合物阳性微生物”还包括这样的微生物，其中仅在化学处理或酶处理例如高碘酸盐处理后暴露目的碳水化合物表位。因此，所述处理后，当接触时所述微生物被至少一种相应的碳水化合物结合分子识别并因而结合。
520碳水化合物阳性微生物可为任何微生物，例如但不限于细菌、蓝细菌、真细菌、藻类、真菌(蘑菇、酵母、黑粉菌、霉菌等)、病毒和原生动物，优选细菌微生物，例如但不限于从土壤、从植物、动物、人类或其它高等活生物体例如猫、狗、猪、奶牛、山羊、大鼠、小鼠、黑猩猩等中分离的微生物。在优选的实施方式中，碳水化合物阳性微生物为源自人类胃肠系统的微生物。
521碳水化合物结合分子
根据本发明，术语碳水化合物结合分子是指依赖于特定碳水化合物，识别特定碳水化合物结构或结合至其表位的分子，例如但不限于碳水化合物特异性单克隆和多克隆抗体、凝集素和选择素和/或从其衍生的分子。优选地，所述碳水化合物结合分子特异性地识别在人类或动物细胞上呈递的碳水化合物表位例如肿瘤标记。通过使用对“人类”碳水化合物表位特异的各碳水化合物结合分子，可以分离携带与目的碳水化合物表位等同或模拟目的碳水化合物表位的结构的碳水化合物阳性微生物，所述目的碳水化合物表位可以通过结合优选为抗体的所述碳水化合物结合分子来确定。合适的碳水化合物结合分子的实例例如描述于表2。
522所述碳水化合物特异性抗体可为来自任何动物或人类例如小鼠、大鼠、人类、骆驼的全抗体、人源化或嵌合的IgM，IgG，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgD或抗体的任何片段，只要其包括针对碳水化合物的结合特异性或依赖性，其例如Fab，F(ab)2、单链Fv、或单结构域抗体。这些抗体还可包含至少一种其它氨基酸或突变或多肽序列，例如标记、连接子或多聚化结构域(multimerizationdomains)，并且它们还源自其它来源例如动物、此类植物以及例如选自合成抗体文库，所述合成抗体文库例如使用噬菌体展示或核糖体展示或通过重组构建体。
523碳水化合物表位
根据本发明，术语“碳水化合物表位”是指当接触时被碳水化合物结合分子结合的结构：
524由此所述碳水化合物表位可等于被所述碳水化合物结合分子结合的碳水化合物部分，或碳水化合物表位可包括被碳水化合物结合分子结合的碳水化合物部分。为进一步清楚起见，比如例如但不限于(i)所述碳水化合物表位可以等于四糖Lewis Y以及对于结合碳水化合物结合分子单克隆抗体A70-C/C8是必须的所有四碳水化合物单元，或所述碳水化合物表位还为包括四糖H-2型的Lewis Y，所述四糖H-2型为碳水化合物结合分子单克隆抗体A46-B/B10所需的最小结合特异性并且其还结合四糖Lewis Y，和/或(ii)所述碳水化合物表位等于被碳水化合物分子结合的碳水化合物部分，但是其连接不同，例如但不限于β连接代替α连接或反之亦然或通过不同的碳水化合物原子连接。
525术语碳水化合物表位还可指碳水化合物抗原，其可与碳水化合物表位相同或为包括除了例如肽部分之外的本文别处所述的碳水化合物表位的任何结构。
526碳水化合物表位可由碳水化合物结构或碳水化合物模拟结构组成，例如这样的化学结构的多肽、肽、脂质或碳水化合物或其组合，其不同于碳水化合物但具有可被本发明碳水化合物结合分子识别的构象结构，并且因此具有免疫化学上相似或相同的性质。
527碳水化合物表位可以连接至其它分子或为其部分，例如但不限于多糖、肽聚糖、糖蛋白、糖脂、脂多糖、糖胺聚糖、荚膜多糖或O-抗原。
528碳水化合物表位还可通过各种连接子和各种密度连接至天然或合成载体上，例如聚丙烯酰胺(本文还称为PAA)或其它分子例如色谱床材料(例如琼脂糖)、生物素或蛋白质，例如胎牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(Ova)、匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)(KLH)、毒素、类毒素、T辅助表位。
529碳水化合物表位产生或对应于(例如模拟)来自人类或动物细胞的碳水化合物表位，并且可以在细胞表面上或细胞内呈递或可以通过人类或动物细胞分泌。优选地，所述碳水化合物表位为疾病标记，例如肿瘤标记。
530有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答(ECSCIR)
根据本发明，术语“有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答”是指通过给药包括碳水化合物表位的免疫原诱导的细胞免疫应答，其优选显示以下特性：
531(i)免疫应答针对碳水化合物表位，是指免疫应答为碳水化合物特异性或依赖于碳水化合物或碳水化合物的可用性，由此针对碳水化合物表位的免疫应答还可为或包括针对包括所述碳水化合物表位的至少一种碳水化合物结构，碳水化合物缀合物和/或哺乳动物细胞的免疫应答。
(ii)免疫应答为MHC依赖性的
(iii)免疫应答包括Th1型免疫应答，其包括CD4阳性Th1型T细胞的激活，和/或
(iv)CD8阳性细胞毒性T细胞的诱导
优选CD4阳性Th1型T细胞的激活和CD8阳性细胞毒性T细胞的诱导。
532 Th1型免疫性的特征在于T细胞的增殖和细胞因子IFNγ和/或TNFα和GM-CSF的分泌，其可由本文别处所述的细胞免疫应答测试或通过本领域技术人员已知的技术，例如但不限于增殖实验、ELISA，ELISpot或流式细胞仪来确定。
533 CD8阳性细胞毒性T细胞的诱导可以通过本文别处所述的细胞免疫应答测试或通过本领域技术人员已知的技术来确定。
534细胞免疫应答的碳水化合物特异性可以通过以下来确定：用碳水化合物表位，优选用在载体上的碳水化合物表位再刺激激活的T细胞，所述载体不同于用于引发T细胞应答的载体，其例如但不限于来自表达碳水化合物表位或携带碳水化合物表位的蛋白质或多肽的细胞的裂解产物或片段(在用微生物上的碳水化合物表位引发的情况下)，和/或通过用碳水化合物结合分子和/或MHC类特异性抗体来阻断增殖和/或细胞因子分泌，优选细胞免疫应答的碳水化合物特异性通过以下来确定：用在载体上的碳水化合物表位再刺激激活的T细胞，所述载体不同于用于引发T细胞应答的载体，和通过用碳水化合物结合分子来阻断增殖和/或细胞因子分泌。
535碳水化合物阳性微生物的片段
根据本发明，术语碳水化合物阳性微生物的片段是指所述微生物的部分的制品或纯化品，例如但不限于细胞壁制品、包膜制品、裂解产物、脂多糖制品、荚膜制品或荚膜多糖制品。它们包括所述碳水化合物阳性微生物的至少一种碳水化合物阳性组分，所述碳水化合物阳性微生物被识别所选的碳水化合物表位和/或抗原的所述碳水化合物结合分子的至少一种结合。它们可以通过制备、纯化和/或制备或纯化步骤从至少一种碳水化合物阳性微生物中获得。所述制品和/或纯化品可以通过本领域技术人员已知的方法例如上述方法获得，或例如但不限于单次或连续细胞分级分离、酚水提取、醚提取、溶菌酶消化或色谱方法或其组合。此外，术语碳水化合物阳性微生物的片段还包括人工产生的碳水化合物阳性组分，其也在本发明碳水化合物阳性微生物上发现。例如图19显示一些Core-1阳性组分以及Core-1阳性微生物片段(此处：AG6)。这些Core-1阳性微生物AG6的Core-1阳性组分/片段还可以化学地产生。碳水化合物阳性组分或包含水化合物阳性组分的片段通过将片段在测试系统中结合至至少一种碳水化合物结合分子来检测，所述测试系统例如但不限于本领域技术人员已知的ELISA、流式细胞仪、免疫荧光或斑点印迹。在本发明的优选实施方式中，包括碳水化合物阳性组分的片段通过使用至少一种碳水化合物特异性抗体的亲和色谱来获得。在优选的实施方式中，使用单次制备或纯化步骤。在另一优选实施方式中，使用至少两步制备和/或纯化步骤的组合。
536碳水化合物阳性组分
根据本发明，术语碳水化合物阳性组分是指当接触时可被至少一种碳水化合物特异性抗体或碳水化合物结合分子结合的碳水化合物阳性微生物的任何组分。所述碳水化合物阳性组分包括至少一种碳水化合物结构，所述碳水化合物结构包括定义或本文别处所述的可以其天然分子的形式获得的碳水化合物表位，其中其为微生物的部分，例如肽、寡肽、多糖、脂质、神经酰胺、碳水化合物、脂蛋白、多糖、寡糖、多糖、蛋白聚糖或糖蛋白，或为所述天然分子的部分，或单独。在本发明意义上，碳水化合物阳性组分可以同样地用作碳水化合物阳性微生物的片段或偶联至其它天然载体结构，例如但不限于蛋白质、脂质、化学分子例如聚丙烯酰胺。优选其以其天然形式或作为所述天然分子的部分使用。碳水化合物阳性组分可以包括具有单碳水化合物表位或多碳水化合物表位或所述结构的重复单元的一种或不同的碳水化合物链型，并且可以包含其它碳水化合物结构或单元或其它生物分子结构。如本文别处所述，碳水化合物表位还可为或包括碳水化合物模拟结构，其可被至少一种碳水化合物特异性抗体或结合分子结合和/或诱导针对碳水化合物的免疫应答，优选针对碳水化合物的体液免疫应答，更优选有效的针对碳水化合物的的细胞免疫应答，更优选针对碳水化合物的体液免疫应答和有效的针对碳水化合物的的细胞免疫应答。
537天然分子
根据本发明，术语“天然分子”是指在至少一种活或死生物体(例如但不限于朊病毒、病毒、微生物、原生动物、病菌、藻类、真菌、植物、动物、人类)中出现的或由该生物体产生的任何生物分子或其部分。
538天然分子可以全生物体(例如微生物或病毒)的形式使用，或可以从天然来源中分离，或可以以与其在自然中出现的相同的结构精确地合成。
539优选地，天然分子不是不以该组合形式在生物体中出现的生物分子或其部分的组合，并且不偶联或缀合至天然或合成载体例如蛋白质、肽、KLH、OVA、BSA、毒素、类毒素、T辅助表位、生物素、PAA、珠、纳米颗粒或色谱床材料。
540不旨在限制，将参考以下实施例更详细地的解释本发明。
附图说明
541图1
用邻接法(7)获得的基于分离的AG6，MU1、与它们亲缘关系最近的菌株(closest relatives)和E.coli型菌株的明确比对序列(1248碱基对)的无根树。
542图2
2a：用引物OPL07扩增后获得的LH E.coli菌株的PCR产物，
-泳道1-1kb ladder；泳道2-11-LH菌株2-5，8，13-16，18；泳道12-菌株32E.coli DSMZ 8697
2b：用引物OPA18扩增后获得的MU菌株和AG6，
-泳道1-1kb ladder；泳道2-5-MU菌株1，3-5；泳道6-AB12；泳道7-多形类杆菌(B.thetaiotaomicron)DSMZ 2079；泳道8卵形拟杆菌(B.ovatus)DSMZ 1896；泳道9-普通类杆菌(B.vulgatus)DSMZ 1447；泳道10-产酸拟杆菌(B.acidifaciens)DSMZ 15896；泳道11-13-AG6。
543图3
使用包被的细菌菌株AG6，LH2和MU1(5x106细菌/ml)和Core-1特异性单克隆抗体Nemod-TF1，Nemod-TF2和较低特异的A68-B/A11和对照抗体A63-B/C2的ELISA。
544图3a
使用包被的细菌菌株幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)NCTC11637，大肠杆菌(E.coli)菌株DSMZ 8697(菌株32)和卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)菌株MU1(各自以对应于10xOD650nm 0,1的密度)和单克隆抗体Nemod-TF1 Nemod-TF2和A68-BA11的ELISA(OD450/630nm减去对照抗体A63-B/C2的OD450/630nm)。
545图4
菌株AG6的荚膜制品的SDS-PAGE和蛋白免疫印迹(westernblot)分析
A)SDS-聚丙烯酰胺的阿利新蓝染色
B)蛋白免疫印迹的DIG-glycan染色
C)使用Nemod-TF2的蛋白免疫印迹染色
546图5
通过反相色谱的core-1-阳性多糖的富集
547图6
卵形拟杆菌(B.ovatus)菌株AG6的core-1-阳性荚膜多糖的重复单元的序列
548图7
卵形拟杆菌(B.ovatus)菌株AG6的core-1-阳性荚膜多糖的重复单元的结构(L-Fuc：L-岩藻糖，D-Gal：D-半乳糖，HexNAc：N-乙酰基己糖胺，D-Hex：D-己醣，OMe：O-甲基)
549图8
卵形拟杆菌(B.ovatus)菌株AG6的core-1-阳性荚膜多糖的重复单元结构(L-Fuc：L-岩藻糖，D-Gal：D-半乳糖，HexNAc：N-乙酰基己糖胺，D-Hex：D-己醣，OMe：O-甲基)
550图9
通过体液免疫应答测试1的小鼠血清分析。
在来自用PBS(组L)、Core-1阴性细菌(组I)和Core-1阳性细菌(组K)免疫的小鼠的血清中通过ELISA确定针对AGP和高碘酸处理的AGP的IgM抗体
血清稀释度1∶200，第21天。
551图10
关于碳水化合物-PAA缀合物的免疫血清的ELISA信号：来自针对PAA缀合物Gal β1-3GalNAc α1-PAA的4 C3H小鼠的ELISA信号的平均值与针对GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcα-PAA的ELISA信号的比较(血清的稀释度1∶100)。
552图11a至e
在第21天来自用PBS(组L)、Core-1阴性细菌(组I)和Core-1阳性细菌(AG6，组K)免疫的小鼠的血清的FACS分析
A)FACS分析的平均荧光强度
B)重叠图(histogram overlay)(黑色：组L，蓝色：组I，红色，组K)
553图11c显示使用细菌菌株卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)MU-1、大肠杆菌(E.coli)LH2、大肠杆菌(E.coli)AG3、大肠杆菌(E.coli)O86 DSMZ 8697＝32免疫的小鼠的血清的体液免疫应答测试1的结果(显示每组4只小鼠的平均值)。
554图11d显示使用细菌菌株卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)MU-1、大肠杆菌(E.coli)LH2、大肠杆菌(E.coli)AG3、大肠杆菌(E.coli)O86 DSMZ 8697＝32免疫的小鼠的血清的体液免疫应答测试2的结果(显示每组4只小鼠的平均值)。
555图11e显示使用细菌菌株卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)MU-1、大肠杆菌(E.coli)LH2、大肠杆菌(E.coli)AG3、大肠杆菌(E.coli)O86 DSMZ 8697＝32免疫的小鼠的血清的体液免疫应答测试3的结果(显示每组4只小鼠的平均值)
556图12
来自无菌小鼠的血清的体液免疫应答测试1(对照小鼠和用细菌菌株AG6免疫的3只不同小鼠)
557图13
来自C3H小鼠的血清的体液免疫应答测试1，所述小鼠在第0至28天每天使用A)2x1011(组A)或B)2x1010(组B)的菌株AG6的巴氏灭菌的细菌口服免疫。显示针对个体小鼠的针对血型糖蛋白(GP)、去唾液酸胎球蛋白(AGP)和高碘酸盐处理的AGP(AGP+PJ)的在第21天的ELISA信号。
558图14
来自用巴氏灭菌的Core-1阳性细菌(菌株AG6)口服免疫的C 3H小鼠的血清的体液免疫应答测试3。来自第0天和第28天的血清以1∶300稀释，并且在流式细胞仪中分析在细胞系NM-wt和NM-D4上的结合。
559图15
在用来自人类肿瘤细胞系的负载有Core1-阳性MN-D4(DC/D4)或-阴性NMwt(DC/wt)细胞裂解产物的DC再刺激后，通过产生Core1-阳性细菌裂解产物(AG6和MU1)的T细胞的细胞因子的生产。通过使负载裂解产物的NM-DC与Core1-特异性抗体(DC/D4+Ak)一起预孵育抑制细胞因子生产。
A)通过T细胞的GM-CSF生产(CIRT 1)
B)通过T细胞的TNFα生产(CIRT 2)
560图16
细胞免疫应答测试2：在用来自人类肿瘤细胞系的负载有Core1-阳性(DC/D4)或-阴性(DC/wt)细胞裂解产物DC再刺激后，通过反应T细胞(responder T cell)的IFN-γ生产的酶联免疫斑点检测(ELISpot assay)结果，并且通过使负载裂解产物的NM-DC与Core1-特异性抗体(DC/D4+Ak)一起预孵育抑制细胞因子生产。
561图17
细胞免疫应答测试3：在用来自人类肿瘤细胞系的负载有Core1-阳性(DC/D4)或-阴性(DC/wt)细胞裂解产物DC再刺激后，反应细胞(responder cells)(R)的T细胞增殖检测(WST)，并且通过使负载裂解产物的NM-DC与Core1-特异性抗体(DC/D4+Ak)一起预孵育抑制增殖。
562图18
细胞免疫应答测试4：负载有Core-1阴性(AG3)或Core-1阳性(AG6)细菌或Core-1阴性(NM-wt)或Core-1阳性(NM-D4)人细胞系的mNM-DC的免疫荧光分析。
563图19
Core-1阳性组分的碳水化合物结构
L-Fuc：L-岩藻糖，D-GalNAc：N-乙酰半乳糖胺，D-Gal：D-半乳糖胺，Hex：己糖，HexNAc：N-乙酰己糖胺，OMe：O-甲基化。此类结构例如在AG6上发现。
564图20
隐藏和暴露的Core-1抗原
565图21
图21显示在第21天时针对PAA缀合物Galβ1-3GalNAc a PAA和PAA缀合物Galβ1-3 GlcNAc a-PAA的ELISA信号。如果在PAA 48上的信号比PAA 43上的信号高至少30％，则将血清视为阳性。考虑此标准，来自6只小鼠的5只(A1，A2，A3，B1和B5)显现core-1特异性体液免疫应答。
566图22
显示表格，其中所选择的Core-1阳性菌株以及为非Core-1阳性的菌株的特征在于它们针对不同抗生素的敏感性。
567图23
根据本发明的细胞应答测试的综述。
具体实施方式
实施例1厌氧培养技术和培养基
568用于细菌培养的厌氧技术基于之前所述已由Breznak和Costilow总结的方法。将用盐酸半胱氨酸(cysteine·HCl)作为还原剂制备的培养基分散于厌氧培养管(Ochs，Bovenden，德国)或玻璃血清瓶，剩下约一半至三分之一总容器体积作为气体顶部空间，并用丁基橡胶塞密封。将不使用还原剂(例如PBS-a)制备的溶液在分散前煮沸。高压灭菌前，用N2/CO2(80/20，v/v)代替气相。为了实现此目的，将针刺穿丁基橡胶塞住的瓶，借助于真空泵(Vacuubrand，Wertheim，德国)将所述瓶抽空。抽空后，在整个过程中重复地摇晃的瓶用N2/CO2(80/20，v/v)充气。该抽空和充气步骤总共进行3次。进入容器前，使气体混合物经过热钯催化剂以除去气体混合物中存在的残余痕量氧气。刃天青(1mg l-1)用作氧化还原指示剂。
569将用于平板接种的培养基灌入层流净化罩(laminar flowhood)并且使用前在厌氧条件下贮存至少24小时。这在具有加压(1.5×105Pa)厌氧瓶中实现，所述厌氧瓶中具有3.5 l AnaeroGen(Oxoid，Basingstoke，England)或具有重复冲洗的N2/CO2/H2(80/10/10，v/v/v)厌氧室气塞(Don Whitley Scientific，Shipley，England)。样品的操作在厌氧室中进行(MACS variable atmosphere workstation，Don Whitley Scientific，Shipley，England或Coy LaboratoryProducts，Grass Lake，USA)。
570未灭菌溶液和材料通过高压灭菌(121 C，1.2x105Pa，15min)来灭菌。使热不稳定化合物作为在milli-Q超纯水(milli-Q water)中的浓缩原液来制备、无菌过滤(0.22μm，混合纤维素酯，Roth，Karlsruhe，Germany)并以所需浓度加至培养基。
实施例2 core-1阳性微生物的亲和富集
571 2.1 TF1和TF2包被的
的制备
将各自体积100μl的
(M-450 Rat Anti-Mouse IgM，Dynal Biotech ASA，Oslo，Norway)置于2ml Safe-Lock Eppendorf管(Eppendorf，Hamburg，Germany)，使用Dynal Magnetic Particle-S(
-S，Dynal Biotech，Oslo，Norway)，用2ml磷酸盐缓冲的生理盐水a(PBS-a：8.1g l-1 NaCl，0.16g l-1 NaH2PO4·H2O，0.98g l-1 Na2HPO4·2H2O，1g l-1 BSA，pH 7.4)冲洗2次，并悬浮于25μl PBS-a。将冻干的TF1或TF2细胞培养上清液溶于1ml milli-Q合成级水(Millipore，Billerica，MA，USA)。将溶解的TF1或TF2细胞培养上清液(1ml)加到具有
的管，并在4C下在试管旋转器(model 34528，Snijders Scientific，Netherlands)上孵育30min。管置于-S中，并在用移液管除去液体前静置3min。使
再悬浮于2ml PBS-a，置于
-S中，并通过移液管除去液体。该洗涤步骤进行3次。洗涤的
悬浮于100μl最初体积的PBS-a。以此方式制备的
或者立即使用，或者用2ml PBS-a重复3次洗涤步骤后在制备的两周内使用。
2.2用于
富集的粪便样品的收集和处理
572将8名志愿者(表3)的粪便样品收集在穿孔的塑料管中，使用AnaeroGen Compact(Oxoid，Basingstoke，England)保持在厌氧条件下，并在处理前在4℃下贮存最多4h。志愿者为健康成人，其在取样日期前至少三个月未服用抗生素，并且吃他们的平时饮食。
573表3粪便样品收集时的个体参数
574在PBS-b(PBS-b：8.5g l-1 NaCl，0.3g l-1 KH2PO4，0.6gl-1Na2HPO4，pH 7.0包含0.1g l-1蛋白胨和0.25g l-1盐酸半胱氨酸)中制备粪便样品的10倍(w/v)稀释液。添加6只灭菌的直径3mm的玻璃珠，并通过低速旋转使稀释的样品匀质化。将匀质化的样品离心(300xg，1min，21C)以使碎片(debris)沉淀。将200μl部分所得悬浮液加至1.8ml PBS-b，产生最初粪便样品的约100倍稀释液。这些稀释液用2ml PBS-b(8000xg，5min，21C)洗涤一次，使小球悬浮于2ml PBS-b。
575 2.3
磁珠富集过程
将来自100倍稀释液的20μl体积加至2ml包含180μl PBS-a和5μl TF1或TF2抗体包被的的管。将管在试管旋转器上在4C下孵育30min。将管置于
-S中并在通过用注射器和针除去尽可能多的上清液之前静置3min。用2ml PBS-a洗涤样品3次，再次尽可能多的除去上清液。
576 2.4使洗涤的样品悬浮于1ml PBS-b，将100μl等分试样平铺接种在各种选择性和非选择性培养基(表4)，并在无氧室中在37C下孵育48h。
577表4用于平铺接种的培养基
578根据制造商说明书制备固体培养基。ST琼脂的组分如下：1gl-1朊间质蛋白胨(proteose peptone)，9g l-1来自肉的蛋白胨，3gl-1 NaCl，2g l-1 Na2HPO4·2H2O，3g l-1肉汁(meat extract)，4g l-1酵母提取物，6g l-1 D(+)-葡萄糖，0.5ml l-1 Tween 80，0.25g l-1盐酸半胱氨酸，1mg l-1刃天青，0.1g l-1 MgSO4·7H2O，5mg l-1 FeSO4·7H2O，0.5g l-1，3.4mg l-1 MnSO4·2H2O，1.5g l-1细菌琼脂，pH 7.0。
579对于受试者1至4，选择来自富集过程的克隆以用于基于ELISA的筛选。对于受试者5至8，如下重复两次
富集过程：孵育48h后，将克隆从板上刮下，悬浮于PBS-b，其中马克法兰氏浊度标准(McFarland turbidity standards)的范围为3至5(如在(13)中制备)。如以前一样，将20μl此悬浮液的等分试样加至180μlPBS-a。如前所述，总共进行3次富集和平板接种过程。
580针对Core 1阳性细菌，富集另外4个受试者(5AB，6MU，7LH和8CA)的粪便样品。稍微修改富集过程，总共进行3次富集。即将最初分离后获得的克隆从板上刮下，进行进一步的富集。以此方式获得60种新分离株。
581实施例3分离株的鉴定
3.1生物化学
使用VITEK系统(Biomérieux，Marcy l′Etoile，France)鉴定细菌。根据制造商说明书制备细菌，使用的标志卡如下：ANI卡，用于能够在MRS肉汤(MRS broth)中生长的厌氧分离株和兼性厌氧革兰氏阳性杆菌(悬浮的乳酸杆菌)，GPI卡，用于革兰氏阳性分离株，和GNI+卡，用于革兰氏阴性好氧分离株。
582使用VITEK系统(Biom érieux，Marcy l’Etoile，France)获得的分离株的生物化学鉴定总结于表5。厌氧分离株AG6，MU(1，3-5)和AB12都属于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)家族，而厌氧分离株为肠杆菌科(enterobacteriaceae)的所有成员；二者都是革兰氏阴性的。
583表5基于生化特性(VITEK)分离菌株的鉴定
584 3.2分子(测序)
用Invisorb基因组DNA试剂盒III(Invitek，Berlin，Germany)遵照制造商说明书的IIIB策略提取DNA，同时使从液体培养基中获得的洗涤的细胞团悬浮在1ml裂解缓冲液D中。引物27f(5’AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG)和1492r(5’TAC CTT GTT ACG ACT T)(10)用于扩增细菌16S核糖体RNA基因。
585每次PCR进行一式三份，并且反应混合物(50μl)包含：50mMKCl，20mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.25mM各dNTP，1μM各引物，2.5单位Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Karlsruhe，德国)和1μl模板DNA。PCR程序为：94℃ 5min，30个循环的94℃ 1min，55℃ 1min和72℃ 1min，以及最后72℃ 10min。用高纯PCR产物纯化试剂盒(High Pure PCR Product Purification Kit)(Roche，Indianapolis，USA)按照制造商说明书来纯化PCR产物。通过在Tris-乙酸-EDTA缓冲液(4.84g l-1 Tris，1.142ml l-1冰醋酸0.372gl-1 EDTA，pH 8.0)在1％琼脂糖凝胶(w/v)上电泳来分析产物。使用Low DNA Mass Ladder(Invitrogen，Carlsbad，USA)来测定DNA浓度。
586为了测序，我们使用引物27f，338f(5’GCT GCC TCC CGTAGG AGT)(2)，338r(5’ACT CCT ACG GGA GGC AGC)，968f(5’AACGCG AAG AAC CTT AC)(14)，或1492r。用DYEnamicTM ET Dye TerminatorCycle Sequencing Kit(Amersham Biosciences，Little Chalfont，England)按照制造商说明书进行测序反应。用MegaBACE 1000 System(Molecular Dynamics，Sunnyvale，USA)分析测序产物。使用VectorNTI Suite 9.0.0(Invitrogen，Carlsbad，USA)的ContigExpress功能拼接和手动调整序列。随后将它们与用国家生物技术信息中心(NCBI)(1)的BLAST功能获得的高度相似序列(92％以上相似性)比对。使用Bioedit软件5.0.9版的Sequence Identity Matrix功能或核糖体数据库设计(Ribosomal Database Project)1.1版的Similarity Matrix从明确比对的序列计算相似性百分比。通过与获自16S rRNA基因测序服务供应者(AMODIA，Braunschweig，德国)的序列比较来确认测序结果。
587分离株的同一性描述于表6，基于分离株AG6、MU1、与它们亲缘关系最近的菌株和大肠杆菌ATCC 11755型菌株的序列的无根系统发育树描述于图1。
588
表6：使用1.1版Ribosomal Database Project(5)的相似性基质功能(similaritymatrix function)基于16S rRNA基因的明确比对序列鉴定分离菌株
589 3.3随机扩增多态DNA(RAPD)
用重复
富集方法获得的一些Core1阳性分离株在其细胞和克隆形态上似乎十分相似，尽管分离自不同培养基。在用VITEK系统获得的其生化特性方面，菌株也十分相似。这样产生分离的细菌是否是同一菌株的问题。RAPD为不需要序列信息的方法，其能够用于区分菌株。简要的说，在低严谨条件下用10碱基对引物PCR扩增总基因组DNA，以使DNA的随机序列基于存在于靶DNA上的引物的同源序列而扩增。所得的PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳来分离，所得的图谱(pattern)可以在菌株间比较。所得的所有LH菌株的带型对于所用的5种RAPD引物(OPL07，M13，OPX14，OPA16，OPA18)而言是同功的(analogous)。图谱明显地不同于大肠杆菌菌株DSMZ 8697(图2a)，其为已经报道具有B型血活性的菌株。MU菌株也似乎十分相似(图2b)；然而它们的带型明显地不同于其它拟杆菌菌株，包括AG6。似乎在分离过程期间一种Core 1阳性菌株重复地从各阳性供体中富集。个体间分离的菌株不同。
实施例4 基于ELISA筛选的细菌的生长和固定
590良好分离的克隆从选择性和非选择性琼脂板上任意挑选，并且在非选择性培养基上再划线培养(re-streaked)三次。挑选单一克隆并且依赖于哪一个给予最好地生长，接种入ST(如上，省略琼脂)、WC或MRS肉汤，在37℃下生长过夜。这些培养物接种(1％)入300ml新鲜ST、WC或MRS肉汤，并在37℃下生长过夜。使细胞成团(8000×g，15min，4C)并再悬浮于10ml PBS-c(8g l-1 NaCl，0.2g l-1 KCl，1.44g l-1 Na2HPO4，0.24g l-1 KH2PO4)(12)。通过添加30ml 4％的PBS-c中的多聚甲醛(PFA)溶液(根据(8)制备)，将该悬浮液在4C下固定3至4小时。接下来，用40ml PBS-c(8000×g，15min，4C)洗涤样品，并使团悬浮于15ml PBS-c，然后添加等体积的96％冰冷乙醇。样品贮存在-20C下直到分析。
591培养物的纯度通过比较细胞形态学以及革兰氏染色行为来检查。将培养物有氧地平板接种在CBA上以确定它们在氧气存在下生长的能力，以及检查有氧污染物的不存在。
592实施例5分离株的保持
根据制造商说明书将冰冷原液保持在Microbank保存管(Microbank tubes)(MAST Diagnostica，Reinfeld，Germany)，并贮存在-80C。工作原液保持在WC、ST或MRS肉汤中。每14天将这些次代培养。通过在有氧和无氧条件下观察革兰氏染色行为、细胞形态学和周期性比较CBA划线平板上的克隆形态来确定培养物的纯度。
593实施例6用于动物试验的细菌的生长、固定和冻干
为了用于动物试验，如上第3节所述使细菌生长和固定，并具有以下改变：起始培养体积等于约4 l。固定前，细菌用100ml PBS-b(8000×g，15min，4C)洗涤一次，并再悬浮于尽可能最少体积的PBS-b中。将该悬浮液分为两等份，一份用于固定(7.1)、另一份用于冻干(7.2)
594 6.1固定
将固定部分洗涤(8000×g，15min，4C)和再悬浮于30mlPBS-c中。该悬浮液加至90ml 4％在PBS-c中的PFA溶液，并在4℃下固定3-4小时。为了增强PFA的除去，样品用120ml PBS-c(8000×g，15min，4C)洗涤3次。细胞团再悬浮于45ml PBS-c中，然后添加等体积的96％冰冷乙醇。将样品贮存在-20℃下。
595给动物服用前，固定的细菌在无菌条件下在LidBac管(Eppendorf，Hamburg，德国)中冻干以使乙醇蒸发。为了确保固定的细菌的无存活性，将它们接种(1％)入WC肉汤并平板接种到CBA，一个周内监视不存在生长。
596 6.2巴氏灭菌
将细菌悬浮液在PBS中洗涤两次，并再悬浮于小体积的PBS中。细菌悬浮液在72℃下孵育30min。作为成功灭活的对照，将细菌如实施例4中所述接种于合适的培养基。
597 6.3冻干
将用于冻干的部分加至等体积的24％无菌过滤的蔗糖，并以300μl部分等分到2mlLidBac管。这些等份试样在液氮中快速冷冻1h，并在将它们放在预冷至-80℃的支架后冻干(Alpha 2-4，Christ，Osterode，德国)。冻干后，将管的盖子密封，并使用
C小型气体发生器系统(Merck，Darmstadt，Germany)将它们在4℃贮存，其中添加有橙色硅胶(Roth，Karlsruhe，Germany)作为干燥剂。
6.4细菌制品的计数(enumeration)
598固定和冻干的细菌制品的总细胞数量用0.01mm深细菌计数器(Thoma-chamber)(LO-Laboroptik，Friedrichsdorf，Germany)来确定。对于冻干的细菌，在冻干前和后立刻通过将10倍连续稀释液平板接种在过夜培养物的WC琼脂上来确定克隆形成单位(CFU)。为此目的，将冻干物溶于300μl WC肉汤，静置15min，通过低速旋转再悬浮并连续稀释。冻干制品的CFU在用于动物试验前和后计数以确保存活性。制品的纯度如第4节所述来检查。
实施例7 血清样品
599用S-monvette系统(Sarstedt，N ümbrecht，Germany)收集血液，根据制造商说明书制备血清。分析前血清样品以等份试样形式在-80℃下贮存。
实施例8粪便IgA提取
600收集粪便样品、贮存在-80℃。将粪便冻干并记录净干重。所有操作在冰上进行。粪便IgA根据具有一些改变的Grewal(6)提取。冻干的样品(-30mg)以15μl/mg干重的比悬浮在IgA提取缓冲液(PBS-Dulbecco(Biochrom，Berlin，Germany)，具有1g l-1BSA)并使其均匀，所述IgA提取缓冲液具有蛋白酶抑制剂(5μg ml-1亮肽素(Calbiochem，Merck)，48μg ml-1 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(Merck)，1μg ml-1抑肽酶aprotinin，2μg ml-1苯丁抑制素(bestatin)(Sigma，Steinheim，Germany)。通过每10min旋转使样品混合。孵育1h后，将样品离心(16000xg，10min，4℃)并将上清液收集在一个新管。残留的团(pellet)以10μl/mg干重悬浮于IgA提取缓冲液中并使其均匀。重复提取步骤，所得的上清液与第一提取步骤的上清液合并。将这些上清液离心(16000xg，10min，4℃)，所得的上清液分配到新管，在液氮中快速冷冻，并在-80℃贮存直到分析。
实施例9通过酶联免疫吸收检测筛选细菌菌株
601固定的细菌在PBS中稀释，调整细胞数量至1x105，1x106，5x106，1x107，1x108或5x108细胞/ml。
602 96孔微量滴定板的每孔包被50μl细菌溶液，在37℃下过夜。用PBS/0,02％ Tween 20洗涤板3次(每次孵育步骤后进行相同的洗涤步骤)。用PBS/2％ BSA阻断板后，将ELISA板与杂交瘤培养上清液一起孵育，所述杂交瘤培养上清液以不同的稀释度包含不同的Core-1识别单克隆抗体(Nemod-TF1，Nemod-TF2或较不特异的A68/BA11，)或对照抗体(A63-B/C2)。作为二抗，提供过氧化物酶缀合的多克隆羊抗鼠免疫球蛋白(Dako P0260)。检测用TMB作为底物来显影，通过添加2.5N H2SO4来终止，在450/630nm下测定消光(extinction)。为了确定抗体结合的高碘酸盐敏感性，在与抗体孵育之前使包被的ELISA板与高碘酸钠一起孵育。因此，用乙酸钠缓冲液(50mM，pH 4,5)洗涤板5min，其后与10mM在乙酸钠缓冲液中的高碘酸在黑暗中一起孵育1h。用乙酸钠缓冲液洗涤板(5min)，通过添加50mM在PBS中的硼氢化钠来终止反应(30min)。
603此类ELISA结果的实例示于图3和3a。
604实施例10包含Core-1的细菌组分的制备
10.1通过SDS-PAGE和Western印迹分析的粗荚膜制品(crudecapsule preparation)的分析
605根据Pantosti等(1991，Infect.Immun.59，2075-2082)进行菌株AG6的粗荚膜制品。
606通过SDS-PAGE分析荚膜制品，制品中的多糖通过阿利新蓝染色(在Karlyshev等(2001，J.Clin.Microbiol.39，279-284)后)来检测，显示各种包含碳水化合物的带和高百分比的在制品内的高分子量碳水化合物(图4A)。Western印迹后，通过DIG-Glycan DetectionKit(LaRoche Diagnostics)来检测多糖，在37和26kDa显示强带(图4B)。使用core-1特异性抗体NEMOD-TF2(培养上清液)进行在wes tern印迹上包含core-1的多糖的检测，在37kDa显示core-1阳性带(图4C)。
607 10.2 core-1阳性多糖的色谱富集
在菌株AG6的荚膜制品内，仍然有脂多糖的污染，如通过按照Hara等(1989，Anal.Biochem.179，162-166)测定KDO含量为11,2pmol/μg或通过SDS-PAGE所示。
608因此，根据Hashimoto等(2001，Eur.J.Biochem.268，3139-3144)通过反相色谱在C18柱上使用丙醇/甲醇梯度液分离荚膜多糖和脂多糖(参见图5)。通过洗脱液B(在0.1M乙酸铵中的72％丙醇/8％甲醇，pH 4.5)的梯度洗脱多糖。通过斑点印迹和DIG-Glycan-Kit进行片段内的多糖的检测。使用core-1特异性抗体Nemod-TF1和Nemod-TF2进行core-1的检测。以浓度14-19％和25-43％的丙醇洗脱多糖。Core-1特异性碳水化合物仅在29-29,4％丙醇(RP1)和39-42％丙醇(RP2)中检出，参见图5，显示通过本方法core-1阳性多糖的强富集。
609 Core-1阳性片段用于通过温和酸解的其它色谱分离，然后根据Tzianabos等(1992，J.Biol.Chem.267，18230-18235)使用0-0.5M NaCl梯度液进行DEAE-色谱。通过此方法，Core-1阳性多糖分离成在0M NaCl(D1)，0,04M NaCl(D2)和0,9-0,17M NaCl(D3)洗脱的三个片段，导致Core-1阳性多糖的进一步富集。
610在根据本发明的方法中，纯化卵形拟杆菌(B.ovatus)AG6的荚膜多糖，并通过质谱分析结构。优选地，卵形拟杆菌(B.ovatus)AG6的荚膜多糖通过如Pantosti等1991已经描述的酚水提取然后醚提取来累积。其后，core-1阳性多糖通过反相色谱(C18 Synergi 4Fusion-RP 80i，250mmx10mm，Phenomenex)从天然荚膜多糖制品(CPS)中累积。天然荚膜多糖提取物和纯化的core-1阳性多糖的单糖含量通过HPAEC-PAD分析(高pH阴离子交换色谱，脉冲安培检测(pulsed amperometric detection))确定。最后，core-1阳性荚膜多糖的结构通过质谱来分析。
611 10.3卵形拟杆菌(B.ovatus)AG6的粗荚膜制品提取物和纯化的荚膜提取物的单糖分析
在第一步骤，卵形拟杆菌(B.ovatus)AG6的粗荚膜制品的core-1阳性多糖通过已经如上所述的反相色谱来累积。其后，通过HPAEC-PAD分析确定纯化品的产量以及累积的core-1阳性多糖的单糖含量。
612进行单糖分析前，用2N三氟乙酸(TFA)在100℃下将多糖提取物完全水解4h。TFA水解期间，失去乙酰基。因此，单糖葡糖胺和半乳糖胺(GlcNH2和GalNH2)不能从N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基半乳糖胺(GlcNAc和GalNAc)中区分。单糖通过高pH阴离子交换色谱分离，通过已经如上所述的脉冲电流分析法来检测。为了鉴定单糖和为了确定其浓度，使用外部和内部单糖标准(external and internalmonosaccharide standards)。
613粗CPS提取物的单糖含量比例，确定其以用于LPS和CPS比较(如上所述))根据为用于比较确定的粗CPS提取物的单糖含量比例明显地变化。两种粗CPS提取物从卵形拟杆菌(B.ovatus)AG6的不同培养物制备，其可为上述单糖含量变化的解释。
614通过反相色谱累积的core-1阳性多糖的产率为30％。粗和纯化荚膜提取物的单糖含量比例的比较揭示增加量的岩藻糖、GalNAc/GalNH2、半乳糖和葡萄糖，而葡萄糖可能为污染物(表7)。通过反相色谱，鼠李糖、GlcNH2/GlcNAc和甘露糖的含量比例可能降低(表7)。半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，其为荚膜多糖的特征组分，不能在纯化的core-1阳性多糖提取物中鉴定出。这些可能表明：卵形拟杆菌(B.ovatus)AG6具有一种以上荚膜多糖。两种荚膜多糖可通过反相色谱彼此分离。Tzianabos等(1992)等还描述脆弱拟杆菌(B.fragilis)的荚膜由两种不同多糖组成。
615表7：粗荚膜多糖提取物(CPS)和通过反相色谱纯化的core-1阳性多糖提取物的单糖分析。单糖含量比例与单糖总量相关。
| 单糖 | 粗CPS提取物(％) | 纯化的CPS提取物(％) |
| 岩藻糖 | 9,5 | 11,4 |
| 鼠李糖 | 17,7 | 3,1 |
| GalNH2/GalNAc | 5,2 | 14,9 |
| GlcNH2/GlcNAc | 14 | 3,5 |
| 半乳糖 | 4,6 | 6,9 |
| 葡萄糖 | 44,2 | 50 |
| 甘露糖 | 18,2 | 6,9 |
| 半乳糖醛酸 | 10 | 0 |
| 葡萄糖醛酸 | 0,5 | 0 |
| n.d. | 3 | 2 |
616岩藻糖、GalNH2/GalNAc和半乳糖的累积可能为这些单糖是core-1阳性多糖重复单元的组分的指标。而强烈降低的单糖可能是低的污染物。
617 10.4通过质谱法的core-1阳性多糖的结构分析
core-1阳性多糖的结构通过已经如上所述的基质辅助激光解吸时间飞行质谱(matrix-assisted laser time-off flight massspectrometry)(MALDI-TOF-MS)和通过电喷雾离子阱质谱(ESI-Ion-Trap-MS)来分析。
618对于ESI-Ion-Trap质谱，累积的core-1阳性多糖通过用1％醋酸(acidic acid)水解(1,5h，100℃)或用软骨素酶(chondroitinase)ABC(裂解β1-4GalNAc/GlcNAc结合)或用β1-3半乳糖苷酶酶消化来片段化。此外，通过用软骨素酶ABC/α1-3，4岩藻糖苷酶或1％醋酸(acidic acid)/β1-3半乳糖苷酶(所有酶购自Glyko GmbH)双酶切消化(dobble digestion)来片段化。所有酶消化在37℃下孵育过夜。以阳性和以阴性模式进行质谱分析(MS以及MS/MS)。分析进行前，所有样品通过Carbograph SPE(AalltechAssociates Inc.)按照制造商手册所述来脱盐，并稀释于2,5mM NH3/40％乙腈中。
619 core-1阳性聚糖片段的结构，其已经通过MALDI-MS分析鉴定，可以通过ESI-Ion-Trap测定来验证。其它片段也可以通过ESI-Ion-Trap质谱来鉴定(表8)。
620表8通过ESI-Ion-Trap质谱的结构分析(阳性模式)。纯化的core-1阳性多糖通过用1％醋酸(acidicacid)在100℃下水解1,5h来片段化。
HexNAc：N-乙酰基己糖胺，Hex：己糖，desHex：脱氧己糖，M：甲基基团
621core-1阳性荚膜多糖的重复单元的序列通过重叠片段来确定(图6)。
622酶消化的core-1阳性多糖的质谱分析给出单糖间糖苷键的标志。此外，可以鉴定半乳糖(通过β1-3半乳糖苷酶成功地裂解)和岩藻糖(通过α1-3，4岩藻糖苷酶成功地裂解)(图7)。
623结果与上述单糖分析一致，其揭示岩藻糖、半乳糖和GalNAc的累积。
624 10.5作为荚膜多糖重复单元的支链二糖的core-1结构的验证
在重复单元中的支链core-1结构、Galbeta1-3GalNAc应该通过用外切酶β1-3半乳糖苷酶和乙酰氨基己糖苷酶(HexNAcase)(β1-2，3，4，6GalNAc/GlcNAc裂解)双消化，然后如上所述单糖分析来鉴定。
625将包含等量core-1阳性多糖的两个样品过滤以纯化它们，避免游离单糖。其后，两个样品之一用β1-3半乳糖苷酶在37℃下消化过夜。再次过滤两个样品以从消化的样品中分离游离半乳糖，而未消化的样品用作阴性对照。随后，收集滞留物(retentats)并用HexNAcase消化。最后再次过滤两个样品。所有洗脱液通过HPAEC-PAD分析。
626为了控制，如果core-1结构通过双消化被除去，但是未被HexNAcase消化(阴性对照)接触，通过斑点印迹使用DIG-GlykanDetection Kit(Roche Diagnostics)分析滞留物以检测多糖和core-1特异性抗体Nemod-TF1，来确认core-1结构。
627在双消化的样品的两种洗脱液中，半乳糖(第一洗脱液)和GalNAc(第二洗脱液)可以通过单糖分析来鉴定。而在阴性对照的洗脱液中，其仅用外切酶HexNAcase消化，半乳糖和GalNAc都不能被鉴定。这是支链core-1结构，Galbeta1-3GalNAc的强烈标志。
628使用DIG-Glykan detection Kit的双消化的残留物和HexNAcase消化的样品的斑点印迹分析揭示相似的多糖浓度，其用于硝酸纤维素膜。core-1结构不能在双消化的样品中检测到，而在HexNAcase消化的样品中，core-1结构仍然可以通过使用Nemod-TF1抗体的免疫印迹来鉴定。
629 10.6通过分析其分离的片段，验证core-1阳性多糖结构
为了进一步验证core-1阳性多糖结构，通过用1％醋酸(acidicacid)水解(1,5h，100℃)使聚糖片段化。聚糖片段用被J.C.Bigge等(1995)已经描述的荧光团2-氨基苯甲酰胺(2-AB)来标记。对于此步骤，通过在Carbograph SPE柱(Alltech Associates Inc.)上纯化和冻干使样品无颗粒和无盐。将团溶于5□l在DMSO中的2-AB/冰醋酸/氰基硼氢化钠，并在60℃下孵育2h。通过纸色谱将2-AB标记的片段与无2-AB的分离。最后2-AB缀合的片段用水洗脱。冻干后，将团溶于50％乙腈。基于它们的尺寸，片段通过具有荧光检测的正相HPLC(柱：Luna 3□NH2 A100，Phenomenex，洗脱液A：15mM NH4-乙酸盐，洗脱液B：乙腈)来分离。通过ESI质谱分析片段序列。最后，为了验证糖苷键和更好地鉴定为片段组分的单糖，将寡糖用如已经之前所述的外切酶β1-3半乳糖苷酶、α1-3，4岩藻糖苷酶和HexNAcase来消化。通过ESI质谱控制消化的成功，末端单糖的除去通过如已经之前所述的HPAEC-PAD来鉴定。
630 core-1阳性多糖的重复单元的已经鉴定的结构通过两种分析确认，得到预期的寡糖片段和裂解的单糖(表9)。
表9
| 寡糖片段 | 外切酶 | ESI-MS分析 | 单糖分析 |
| HexNAc-Hex | β1-3半乳糖苷酶 | HexNAcHexHexNAc-Hex | GalNAc/GalNH2半乳糖 |
| DesHex-desHex-desHexM | α1-3，4岩藻糖苷酶 | desHexMDesHex-desHexMDesHex-desHex | 岩藻糖 |
| DesHex-desHex | α1-3，4岩藻糖苷酶 | desHex | 岩藻糖 |
| DesHex-desHexM-HexNAcM-HexNAc | HexNAcase(α1-2，3，4，6GalNAc/GlcNAc) | HexNAcDesHex-desHexM-HexNAc | n.d |
631总之，core-1阳性荚膜多糖的重复单元的结构(图8)通过各种分析确认。
632此外，结果揭示(也请参见图19，特别是#5)，Gal-GalNAc和主链GalNAc分子之间的糖苷键是α异头的(alpha-anomeric)。该发现被使用mAbs TF1、TF2和HH8的斑点印迹分析支持，其对TF的α异头是特异的。还使用对TFβ特异的mAbs A68-E/A2和A68-E/E3。由此，在卵形拟杆菌(B.ovatus)AG6的荚膜多糖的支链结构内鉴定出肿瘤特异性AgTFα。
实施例11动物模型
633 11.1用死细菌腹膜内免疫小鼠
11.1.1通过体液免疫应答测试1分析小鼠血清
雌性Balb/c小鼠(Charles River，每组4只)以50mg/kg体重的剂量在第1天用环磷酰胺处理。在第0、7、14天用在PBS中的5x108细菌(core-1阴性菌株AG3(组I)、32或53或core-1阳性菌株AG6(组K))、或单独用PBS(组L)腹膜内注射小鼠。在第4、21、27和30天取血清样品。
634分析小鼠血清在ELISA中至core-1的结合。作为Core-1携带抗原提供去唾液酸胎球蛋白。作为阴性对照使用高碘酸处理的去唾液酸胎球蛋白。高碘酸盐处理破环core-1的外部碳水化合物环，由此破坏Core-1表位。
635 96孔平底微量过滤板用去唾液酸胎球蛋白A(AGP)以2μg/ml的浓度包被。用PBS/Tween将板洗涤3次。
一半板用高碘酸盐如下处理：
636将孔用50mM pH 4.5的乙酸钠缓冲液孵育5min，然后用10mM乙酸盐缓冲液中的高碘酸在黑暗中孵育1h。将孔用50mM pH 4.5的乙酸钠缓冲液孵育5min。通过与硼氢化纳(在PBS中50mM，30min)一起孵育终止反应。接下来，用PBS/Tween将板洗涤5次。
637然后通过添加2％ BSA阻断板30min。
638与不同稀释度的小鼠血清一起孵育进行1,5h。用过氧化物酶缀合的羊抗鼠I gM抗体(在PBS/1％ BSA中1∶5000)检测结合的鼠免疫球蛋白。检验用TMB作为底物显影，通过添加2,5N H2SO4终止反应。
639图9显示血清IgM-抗体至core-1阳性AGP和core-1阴性AGP(AGP+PJ)的结合。四只用Core-1-阳性细菌免疫(组K)的小鼠中的仅三只的血清显示强烈的至AGP的结合，而用PJ裂解Core-1后信号降低。
640因此，core-1阳性细菌能够在小鼠中诱导针对core-1的体液免疫性。
641 11.1.2通过体液免疫应答测试2分析小鼠血清
雄性C3H小鼠(Charles River，每组4只)用在200μl PBS中的来自Core-1阳性和Core-1阴性菌株的5x108巴氏灭菌的细菌在第0、7和14天腹膜内免疫。免疫前和在第13、21和28天收集血清，并在体液免疫应答测试2中分析
642将96孔平底微孔过滤板用不同的碳水化合物-PAA缀合物(GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcalpha-PAA，Fucalpha1-2Galβ1-3GalNAcalpha-PAA，GalNAcalpha1-3Galβ-PAA，Galalpha1-3-GalNAcβ-PAA，Gal beta1-3GalNAc alpha1-PAA)以5μg/ml在包被缓冲液(8,4g/l NaHCO3，3,56g/l Na2CO3，pH＝9,49)中包被，并且在4℃下孵育过夜。
643将板用PBS/Tween洗涤3次。
644然后通过添加2％BSA将板阻断30min。
645与不同稀释度的小鼠血清一起孵育进行1,5h。用过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgM抗体(在PBS/1％BSA中的1∶5000)检测结合的小鼠免疫球蛋白。检验用TMB作为底物显影，通过添加2,5N H2SO4终止反应。
646图10显示，对于来自每组4只小鼠的血清在第0(免疫前血清)和第21天，针对PAA缀合物Gal beta1-3GalNAc alpha 1-PAA的ELISA信号相对于针对GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcalpha-PAA的ELISA信号的平均值[相对ELISA信号用以下等式计算：(针对Galbeta1-3GalNAc alpha1-PAA的ELISA信号)*100/(针对GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcalpha-PAA ELISA信号)]。如果免疫血清比免疫前血清显示至少50％的增加，则将血清计算为阳性。可以看出仅Core-1阳性菌株AG6和MU1在小鼠中诱导Core-1特异性体液免疫应答。
647 11.1.3通过体液免疫应答测试3分析小鼠血清
雌性Balb/c小鼠(Charles River，每组4只)以50mg/kg体重的剂量在第1天用环磷酰胺处理。在第0、7、14天用在PBS中的5x108细菌(core-1阴性菌株AG 3(组I)、32或53或core-1阳性菌株AG6(组K))、或单独用PBS(组L)腹膜内注射小鼠。在第4、21、27和30天取血清样品。
648进行流式细胞仪分析以分析小鼠血清至Core-1阳性和Core-1阴性人类肿瘤细胞系(分别为NM-wt和NM-D4，NM-wt是NM-D4的亲本细胞，如在WO2005/017130 A2和EP1654353中所述，NM-D4保藏在DSMZ，名称为DSM ACC2605)的结合。使每管3x105细胞成团，并将团悬浮在50μl小鼠血清(在PBS/10％FCS中以1∶50稀释)、对照抗体或单独PBS/10％FCS中。将样品在4℃下孵育20min，用PBS洗涤和离心。接下来，将细胞与Cy3-缀合的羊抗鼠IgM抗体(JacksonImmuno Research，在PBS/10％FCS中1∶200)在4℃一起孵育20min，用PBS洗涤并再悬浮于200μl PBS中以用于流式细胞仪分析。
649图11a和b显示来自小鼠血清的IgM抗体至人类细胞系NM-wt(Core-1阴性)和NM-D4(core-1阳性)的结合。而至Core-1阴性NM-wt系的结合在用Core-1阴性细菌(组I)和Core-1阳性细菌(组K)免疫的小鼠之间比较，四只来自组K的小鼠中的三只比Core-1阳性NM-D4系有显著强的结合。这指示在用Core-1阳性细菌免疫的小鼠中体液免疫应答的core-1特异性。
650 11.1.4通过体液免疫应答测试1、2和3分析小鼠血清
C3H小鼠(Charles River，每组4只)在第0、7、14天用在200μlPBS中的1x109的巴氏灭菌细菌腹膜内免疫，所述巴氏灭菌细菌来自Core-1阳性卵形拟杆菌菌株卵形拟杆菌MU-1、A68-BA11-阳性大肠杆菌菌株LH2和Core-1阴性大肠杆菌菌株(AG3，E.coli O86 DSMZ 8697＝32)。免疫前和在第13、21和28天收集血清，并在如上所述的体液免疫应答测试1、2和3中分析。
651由于菌株AG3对于所有体液免疫应答测试都是阴性，收集自用菌株E.coli O86和LH2免疫后小鼠的血清在HIRT 1中显示AGP反应性抗体。无论如何，仅Core-1阳性菌株MU-1除了在HIRT中诱导AGP特异性抗体之外，还显示强烈的针对Core-1的抗Core 1特异性体液免疫应答，所述Core-1在PAA缀合物(HIRT 2)和在人类肿瘤细胞s(HIRT 3)上。
因此，我们可以仅使用卵形拟杆菌(MU-1)的Core-1阳性微生物来诱导强烈的Core-1特异性体液免疫应答。
652图11c至e显示结果。
653 11.2.用活Core-1阳性细菌口服免疫无菌小鼠
无菌C3H小鼠在第2、3、4、9、10、11、16、17和18天用2x109菌株AG6的活细菌口服免疫。在第0天(免疫前血清)和第14和21天取血清样品，并且分析在体液免疫应答测试1中的AGP特异性IgM抗体。
654如通过使小鼠血清结合至AGP包被的微孔过滤板所示，与对照小鼠相比，免疫小鼠显示增加的抗core-1滴度。结合小鼠IgM的检测用过氧化物酶偶联的抗鼠IgM抗体来进行。对于core-1信号的特异性通过用高碘酸处理(破环碳水化合物结构)后ELISA信号的降低来显示。在第14或21天后，三只小鼠中的三只具有升高的针对Core-1的IgM抗体水平，而对照小鼠与如图12所示的AGP+PJ相比，未显示针对AGP的ELISA信号的增加。
655 11.3用巴氏灭菌的和活的Core-1阳性细菌口服免疫传统小鼠
在第0至28天每天用1x1011(组A)或1x1010(组B)巴氏灭菌的菌株AG6的细菌口服免疫C 3H小鼠。在第1天(免疫前血清)和在13、21、28和35天取血清样品，并分析在体液免疫应答测试1中的AGP特异性IgM抗体。
656如通过使小鼠血清结合至用GP或AGP(用或未用高碘酸处理)包被的微孔过滤板所示，免疫后收集自小鼠的血清显示增加的抗core-1滴度。结合小鼠IgM的检测用过氧化物酶偶联的抗鼠IgM抗体来进行。对于core-1信号的特异性通过用高碘酸(处理破环碳水化合物结构，降低至少30％)后ELISA信号的降低和通过降低的针对GP的信号(AGP信号增加至少50％)来显示。
657显示6只来自组A的小鼠中的5只和8只来自组B的小鼠中的5只已经在第21天左右显影Core-1特异性抗体(图13)。
658在体液免疫应答测试3中，通过流式细胞仪分析小鼠血清至Core-1阳性肿瘤细胞系NM-D4和至Core-1阴性细胞系NM-wt的结合的比较。使每管3x105细胞成团，并将团悬浮于50μl小鼠血清(在PBS/1％BSA中以1∶300稀释)、对照抗体或单独PBS/1％BSA。将样品在4℃下孵育60min，用PBS洗涤和离心。接下来，细胞与生物素缀合的羊抗鼠IgM抗体(Jackson Immuno Research；在PBS/1％BSA中1∶200)在4℃下一起孵育60min，并用PBS洗涤。随后的细胞与Cy3缀合的抗生蛋白链菌素(streptavidin)(Jackson Immuno Research，在PBS/1％BSA中1∶200)在4℃下一起孵育60min，并再悬浮于200μl PBS中以用于流式细胞仪分析。
659经下式计算结果
(％NM-D4免疫血清的阳性细胞-％NM-D4免疫前血清的阳性细胞)/(％NM-wt免疫血清的阳性细胞-％NM-wt免疫前血清的阳性细胞)＝X
将具有商X≥10的小鼠血清视作阳性(具有％NM-wt免疫血清的阳性细胞-％NM-wt免疫前血清的阳性细胞≥1)。
660在第28天，13只小鼠中的11只已经显示针对Core-1阳性人类肿瘤细胞系NM-D4的体液免疫应答，如图14所示。
661在体液免疫应答测试2中，分析来自第28天的小鼠血清至Galβ1-3GalNAca-PAA(PAA 48)或Galβ1-3 GlcNAc a-PAA(PAA 43)的结合。
662将96孔平底微孔过滤板用Galβ1-3 GalNAc a-PAA(PAA 48)或Galβ1-3 GlcNAc a-PAA(PAA 43)以在5μg/ml在包被缓冲液(8,4g/l NaHCO 3，3,56g/l NA2CO3，pH＝9,49)中包被，并在4℃下孵育过夜。阻断后，与血清一起孵育进行1,5小时。用过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgM抗体(在PBS 1％BSA中1∶5000)检测结合的小鼠免疫球蛋白。检验用TMB作为底物显影，通过添加2,5N H2SOP4终止反应。
663结果示于图21显示13只小鼠中的5只已经在第28天左右显示Core-1特异性抗体。
664实施例12 Core-1阳性细菌用于诱导细胞免疫应答(体外)的潜力
12.1功能性树突细胞的产生
树突细胞系NemodDC(pNM-DC)已经用作抗原呈递细胞(APC)的来源。pNM-DCs分化成iNM-DC，然后负载有以下细菌菌株的细菌裂解产物(BaLy)：AG6、MU1、52和53。将50μg/ml的每一BaLy与成熟细胞因子一起添加至培养基，使iNM-DC分化成它们的成熟状态(mNM-DC)。
665更具体地，在第一步骤，使pNM-DC(1x105/ml)在NemodDC培养基(70％MEM-alpha，20％ FCS，10％CM5637)中经过7天孵育分化成iNM-DC，所述培养基添加有1000U/ml of GM-CSF，100U/ml IL-4和2,5ng/ml TNF-α。接下来，使1x106/m l未成熟NM-DC(iNM-DC)负载有细菌裂解产物(50μg/ml)、肿瘤细胞裂解产物(1x106裂解的肿瘤细胞用于负载在1x106 NM-DC上)或AGP-和GP-蛋白(20μg/ml)，并通过添加75ng/ml TNF-α使其成熟2天。
666mNM-DC的成熟表型对于成功的T细胞激活是非常重要的，并通过流式细胞仪测试CD1a、CD11c、CD14、CD40、CD35、CD80、CD83、CD86、CD116、HLA-ABC和HLA-DR的表达来测试。仅仅具有符合成熟DCs表型的表型的那些DC用于T细胞激活。
667 12.2激活的针对Core-1的T细胞的产生和使用ELISA检测GM-CSF(细胞免疫应答测试1)和TNF-α(细胞免疫应答测试2)的产生。
用负载有Core-1阳性细菌裂解产物的NM-DC引发T淋巴细胞7-10天后，所得的T细胞(0,7-1x106/ml)用负载有Core-1阳性肿瘤细胞裂解产物(50μg/ml)的mNM-DC(1x105/ml)再刺激。孵育48小时后，收获上清液并检测以用于评价应答于人类Core-1阳性肿瘤细胞系NM-D4、GM-CSF-和TNF-α-BD OptEIATM Kits的细胞因子的产生。
668 96孔板用50μl合适的捕获抗人类(GM-CSF或TNF-α)抗体预包被，所述抗体以1∶250稀释于包被缓冲液中。洗涤和阻断步骤后，将100μl上清液或标准品加至微孔中，并在室温下孵育2小时。为了作出标准曲线，使用浓度0；7,8；15,6；31,2；62,5；125；250pg/ml的重组人类GM-CSF和浓度0；4,7；9,4；18,8；37,5；75；150；300pg/ml的重组人类TNF-α。洗涤后，每孔添加100μl制备的工作检测液(Working Detector solution)，并将板在室温下孵育1小时。在下一步骤中，每孔添加100μl TMB一步法底物试剂(One-StepSubstrate Reagent)。最后孵育30min和添加50μl终止液后，在450nm读出范围(extensions)。
669结果证明在图15A和B中显示以下明显证据：产生Core1阳性细菌裂解产物的T细胞能够通过肿瘤抑制性细胞因子(例如TNF-α和GM-CSF)的产生，识别负载有来自于人类细胞系NM-D4的Core1阳性细胞裂解产物的DC。相反，非常低水平的细胞因子应答于Core1阴性细胞裂解产物而释放。此外，该识别通过使负载裂解产物的NM-DC与Core1特异性抗体一起预孵育而被特异性的抑制。
670 12.3通过激活的针对Core-1的T淋巴细胞(细胞免疫应答测试2)来评价IFNγ的分泌的的ELISPOT检测
ELISpot检测用于评价应答于抗原特异性刺激的IFNγ的分泌。该检测允许量化预敏化T细胞以抗原特异性的方式识别Core1抗原的功能性能力。
671首先通过与负载有细菌裂解产物的DC一起共培养来体外激活T淋巴细胞。7至10天的引发后，收获激活的T细胞，并用负载有Core1阳性(NM-D4)和Core1阴性(NM-wt)的人类肿瘤细胞裂解产物的DC再激发(rechallenge)(T细胞与DC的比为10∶1)。
672ELISpot板的孔用结合在ELISpot板的硝酸纤维素基底的鼠抗人IFNγ抗体(Mabtech-Kit)预包被。将再激发的T细胞转移至孔，在孵育期间释放细胞因子。在各T细胞周围局部释放的IFNγ结合至特异性抗体并因此被其“捕获”。孵育24小时后，除去细胞。将第二抗人IFNγ抗体以1μg/ml的浓度添加至各孔，该生物素化抗体偶联到能够将底物转换成不溶性有色产物的酶。再次洗涤板，添加浓度为1μg/ml的与酶-AP缀合的抗生蛋白链菌素。最后添加沉淀底物BCIP+NBT，孵育该板直到斑点出现在应答T细胞的一侧。使用数字成像系统计数有色斑点并分析。
673结果显示：产生Core1阳性细菌裂解产物的T细胞(AG6和MU1)能够通过肿瘤抑制性细胞因子IFNγ(图16)的产生识别负载有来自于人类细胞系NM-D4的Core1阳性细胞裂解产物的DC。非常低水平的细胞因子应答于Core1阴性细胞裂解产物(R+DC/wt)而释放。此外，Core1阳性细胞裂解产物(R+DC/D4)的识别特异性通过用Core-1特异性抗体Nemod-TF1(R+DC/D4+Ak)阻断细胞因子的释放来证明。
674 12.4细胞免疫应答测试3：T细胞增殖检验
将如上所述用于ELISpot分析的敏化和再刺激的T细胞，在孵育后从ELISpot板转移到96孔板，并使用比色细胞增殖剂(colorimetricCell Proliferation Reagent)WST-1(Roche MolecularBiochemicals)来分析，所述WST-1的四唑盐通过线粒体酶裂解，以便显影(在450nm下读数)染色的量与培养物中代谢活性的细胞数量直接相关。在不存在细胞下的培养基加上wst-1的吸光度为酶联免疫吸附检验阅读器的空白位置。该步骤由以下组成：每孔一步添加10μl WST-增殖试剂(Roche)，在37℃下孵育3小时，然后在450nm下测定。
675在图17中证明的结果显示以下明显的证据：产生Core1阳性细菌裂解产物的T细胞能够通过特异性增殖识别负载有来自于所示人类细胞系NM-D4的Core1阳性细胞裂解产物的DC。此外，该识别通过使负载裂解产物的NM-DC与Core1特异性抗体一起预孵育而被特异性的抑制。
676 12.5细胞免疫应答测试4：用于在负载有细菌裂解产物的DC上的Core-1呈递的免疫荧光测试
为了通过负载有裂解产物的NM-DC分析Core-1的加工和呈递，使用core-1特异性单克隆抗体(Nemod-TF1，NEMOD-TF2)进行免疫荧光分析。在免疫荧光的帮助下，证明了在成熟DC表面上的加工的Core1抗原的呈递。免疫荧光(IF)为通过结合特异性Core-1抗体，然后添加用荧光染料标记的二抗，来使细胞上的特异性抗原(Core1)可视化的技术，所述荧光染料用来识别一抗。
677在第一步中，pNM-DC(1x105/ml)通过在NemodDC培养基(70％MEM-alpha，20％ FCS，10％ CM5637)中孵育7天分化成iNM-DC，所述NemodDC培养基培养基添加有1000U/ml of GM-CSF、100U/mlIL-4和2,5ng/ml TNF-α。接下来，使1x106/ml的未成熟NM-DC(iNM-DC)负载有细菌裂解产物(50μg/ml)、肿瘤细胞裂解产物(1x106裂解的肿瘤细胞有用于负载在1x106NM-DC上)或AGP-和GP-蛋白(20μg/ml)，并且通过添加75ng/ml TNF-α成熟2天。
678洗涤成熟和负载抗原的DC，将每50μl 1x106的细胞置于微孔过滤板以用于免疫荧光染色。将3μg/ml在培养基(10％FCS)中稀释的Core-1特异性抗体(Nemod-TF1)与细胞悬浮液在室温下一起孵育1小时。洗涤步骤后，添加50μl以1∶200稀释的第二羊抗鼠IgM、Cy3标记的Ab(Jackson/Dianova)并孵育30min。洗涤步骤后，将20μl细胞悬浮液置于Multitest slide(10孔，Roth)的各孔。用装备有数码相机AxioCam(Zeiss)的Axioplan 2免疫荧光显微镜检查染色的样品。
679图18显示成熟mNM-DC的阳性Core-1特异性染色，和在负载有Core1阴性裂解产物(AG3和NM-wt)的mNM-DC上的阴性免疫荧光，所述成熟mNM-DC已经拥有AG6-和NM-D4-Core1-阳性裂解产物。
680虽然已经按照优选实施方式描述本发明，熟练技术人员将意识到可以形成各种改进、取代、省略和变化，而无需背离其意图。因此，旨在本发明的范围不单独地受以下包括其等同的权利要求范围的限制。因此，很明显对于本发明提出的领域的技术人员，本发明可以包括除了上述特别公开的形式外的不背离本发明意图或基本特征的形式。因此认为如上所述本发明的具体实施方式，在所有方面都是例举性而不是限制性的。本发明的范围受所附的权利要求支持，而不是限制到包含在上述说明书中的实施例。应该理解本文所述的本发明实施方式的各种替代方案可以用于参与本发明。旨在以下权利要求限定本发明的范围，并且由此包括这些权利要求内的方法和装置以及它们的等同方案。
681细胞系
NM-D4(DSM ACC2605)，NM-F9(DSM ACC2606)，ZR-75-1(ATCCCRL-1500)，CAMA-1(ATCC HTB-21)，KG-1(DSM ACC 14)，或A-204(DSM ACC 250).NM-wt或NM-H9(or NM-H9D8 DSM ACC2806).NM-9和NM-D4细胞系已经被Nemod Biotherapeutics GmbH & Co.KG，Robert-Rossle-Strasse 10，13125 Berlin，Germany(即保藏人)保藏在DSMZ，其授权本申请的申请人引用本文所述的保藏的生物材料，并且给予本申请的申请人无保留和不可撤消的允诺，本文所述的保藏的生物材料可以根据欧洲专利公约细则28(1)(d)使公众获得。DSMZ位于Mascheroder Weg 1b，D-38124不伦瑞克(Braunschweig)，德国。按照布达佩斯条约的条款，前述的DSMZ保藏单位是用于专利程序目的的微生物保藏的国际承认机构。
AG6(DSM 18726)，MU1(DSM 18728)和新菌株Escherichia coliLH2(DSM 18727)被柏林(德国)Robert-
-Str.10，13125的Glycotope GmbH，于2006年10月20日保藏在不伦瑞克(Braunschweig)(德国)的“DSMZ-德国微生物和细胞培育采集中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)”。
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申请人在此向有各自规定的那些国家请求：本申请所涉及的保藏的生物材料样品只提供给独立的指定的专家(“专家方案”请求(适用时)，尤其是澳大利亚、加拿大、克罗地亚、丹麦、芬兰、德国、冰岛、挪威、新加坡、西班牙、瑞典、联合王国、欧洲)
对于欧洲，申请人因此请求，如Rule 28(3)EPC中所规定的，保藏的生物材料样品在授予专利权的出版之前或从申请日起20年(如果本申请被驳回或撤回或视为撤回)仅仅通过将样品发放至请求样品的人指定的专家的途径获得(Rule28(4)EPC)。
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Claims (26)
1.用于从微生物混合物中分离包括目的碳水化合物表位的碳水化合物阳性微生物的方法，包括：
(a)使对目的碳水化合物表位特异的碳水化合物结合分子与微生物混合物接触，和
(b)从所述混合物中分离至少一种结合至所述碳水化合物结合分子的微生物，
(c)任选地通过测试分离的微生物特异地结合至所述碳水化合物结合分子来测试分离的微生物为碳水化合物阳性微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
(d)通过所述微生物和/或其片段和/或裂解产物在体内或在体外测试有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答和/或体液免疫应答的诱导。
3.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(d)中包括通过所述碳水化合物阳性微生物和/或其片段和/或裂解产物，测试有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性细胞免疫应答的诱导，以在优选至少一个动物或人中和/或在体外，用于激活CD4阳性Th1型T细胞和/或以用于激活细胞毒性CD8阳性T细胞。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中在步骤(d)中细胞免疫应答的测试包括
i.)使至少一种树突细胞负载有在步骤(a)至(c)中鉴定出的碳水化合物阳性细胞；
ii.)使合适量的负载有所述碳水化合物阳性微生物的所述至少一种树突细胞与合适量的免疫细胞接触，所述免疫细胞能够被树突细胞激活或抑制；
iii.)培养以允许所述免疫细胞与所述负载的树突细胞相互作用；
iv.)添加合适量的抗原呈递细胞(APC)，所述抗原呈递细胞负载有合适量的至少一种携带与碳水化合物阳性微生物相同碳水化合物表位的第二化合物，其中所述第二化合物不同于所述第一碳水化合物阳性微生物；
v.)培养以再刺激所述免疫细胞
vi.)确定是否发生免疫细胞的再刺激。
5.根据权利要求4所述的方法，其中至少部分负载有合适量所述第二化合物的APCs在识别所述目的碳水化合物表位的碳水化合物结合分子的存在下与免疫细胞接触。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中通过确定以下确定再刺激：
-免疫细胞的分泌产物，例如干扰素α、干扰素γ或GM-CSF，如果所述免疫细胞被(再)刺激则分泌其；和/或
-免疫细胞的增殖。
7.根据权利要求2至6任一项所述的方法，其中细胞免疫应答测试选自以下：
(i)细胞免疫应答测试1，其中在步骤(d(vi))中免疫细胞的再刺激通过测定GM-CSF分泌来确定；
(ii)细胞免疫应答测试2，其中在步骤(d(vi))中再刺激的淋巴细胞的量/程度通过测定INFγ和/或TNFα分泌的量来确定；
(iii)细胞免疫应答测试3，其中在步骤(d(vi))中再刺激的淋巴细胞的量/程度通过测定增殖和/或增殖诱导来确定；
(iv)细胞免疫应答测试4，其针对目的碳水化合物表位，包括：
(a)使负载有合适量以下的合适量的树突细胞、或包括至少一种树突细胞的细胞混合物与合适量的至少一种碳水化合物结合分子一起接触：
(i)碳水化合物阳性微生物，其裂解产物或片段；
(ii)包括这些的制剂，
(iii)本发明的保健食品、或药物组合物，或
(iv)携带或包括碳水化合物表位的分子，
(v)包括碳水化合物表位携带分子的混合物，
(vi)对碳水化合物表位呈阳性或包括碳水化合物表位的细胞、其裂解产物或片段。
(b)测试所述碳水化合物结合分子至树突细胞、或细胞混合物的结合。
(v)细胞免疫应答测试5，其针对目的碳水化合物表位，包括：
a)使合适量的靶细胞与针对碳水化合物表位的至少一种免疫细胞或包括针对目的碳水化合物表位的至少一种免疫细胞的细胞混合物一起孵育，所述靶细胞来自包括目的碳水化合物表位的细胞系，所述目的碳水化合物表位用合适量的标记标记，和
b)通过确定标记的释放测定靶细胞的裂解，由此针对碳水化合物表位的阳性细胞免疫应答显示：包括碳水化合物表位的细胞的裂解比碳水化合物表位阴性细胞的裂解显著更高，和/或其显示：与针对碳水化合物表位的免疫细胞一起孵育的包括碳水化合物表位的细胞的裂解，比与不针对碳水化合物表位的相应的对照免疫细胞一起孵育的包括碳水化合物表位的细胞的裂解显著更高。
8.根据权利要求2至7任一项所述的方法，其中在选自以下的体液免疫应答测试中测试有效的针对所述碳水化合物表位的碳水化合物特异性体液免疫应答的诱导：
a)针对碳水化合物表位的体液免疫应答测试1，包括：在ELISA中测试血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体至携带碳水化 合物表位的化合物的结合，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：抗体至所述携带碳水化合物表位的化合物的结合比至无碳 水化合物表位的所述化合物或至在破坏碳水化合物表位的酶处理或化学处理之后的所述化合物(例如蛋白质或肽)的结合显著更高；
(b)针对碳水化合物表位的体液免疫应答测试2，包括：在ELISA中，测试血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体至偶联到聚丙烯酰胺(PAA缀合物)的碳水化合物结构的结合，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：抗体至包括该碳水化合物表位的PAA-缀合物的结合比至破坏该碳水化合物表位的酶处理或化学处理之后的相同PAA-缀合物显著更高，和/或抗体至包括该碳水化合物表位的PAA-缀合物的结合比至不包括该碳水化合物表位的PAA-缀合物更高，优选二者；
(c)针对碳水化合物表位的体液免疫应答测试3，包括：在流式细胞仪测试中，测试血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体至包括该碳水化合物表位的细胞和至不包括该碳水化合物表位的细胞的结合，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：抗体至包括该碳水化合物表位的细胞的结合比至对于该碳水化合物表位呈阴性的细胞的结合显著更高；
(d)针对碳水化合物表位的体液免疫应答测试(体液免疫应答测 试4)，包括：在免疫荧光测试中，测试血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体至包括该碳水化合物表位的细胞和至对于该碳水化合物表位呈阴性的细胞的结合，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：抗体至包括该碳水化合物表位的细胞的结合比至不包括该碳水化合物表位的细胞和/或至在破坏该碳水化合物表位的酶处理或化学处理之后的包括该碳水化合物表位的细胞的结合显著更高
(e)针对碳水化合物表位的体液免疫应答测试5，包括：
i将用合适量的标记标记的合适量的包括碳水化合物表位的细胞与合适量的血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体以及合适量的补体一起孵育
ii在a)的孵育之后通过确定所述标记的释放测定细胞的裂解，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：包括该碳水化合物表位的细胞比不包括该碳水化合物表位的细胞的裂解显著更高，和/或显示：包括该碳水化合物表位的细胞的裂解比不用补体的裂解和/或比不用抗体的裂解和/或比使用不结合到包括该碳水化合物表位的细胞或较少结合到其的抗体时的裂解更高；
(f)针对碳水化合物表位的体液免疫应答测试6，包括：
i将用合适量的标记标记的合适量的包括碳水化合物表位的细胞和/或用合适量的标记标记的不包括碳水化合物表位的细胞与合适量的血清中的抗体、或获自血清、血浆或粪便的抗体以及合适量的至少一种免疫效应细胞或包括免疫效应细胞的细胞混合物或外周血单核细胞一起孵育
ii在a)的孵育之后通过确定标记的释放测定细胞的裂解，由此针对碳水化合物表位的阳性体液免疫应答显示：包括该碳水化合物表位的细胞的裂解比碳水化合物表位阴性细胞、比不使用抗体的裂解和/或比使用不结合到包括该碳水化合物表位的细胞或较少结合到其的抗体时的裂解更高。
9.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中
(i)碳水化合物表位选自：TF，Core-1，Tn，唾液酸化-Tn，唾液酸化-TF，Globo-H，Lewis-Y，唾液酸化-Lewis-A，唾液酸化-Lewis-X，聚唾液酸，Lewis-X，GM2，GD2，GD3，9-O-乙酰基GD3，GD3L，岩藻糖基GM1，岩藻糖基GM1，Lewis-A，Lewis-B，sLac，唾液酸化1型链，CA 19-9抗原，CA 72-4抗原和CA-50抗原，和
(ii)碳水化合物结合分子选自凝集素、选择素，和/或抗体，和/或从其衍生的分子，其结合至TF，Core-1，Tn，唾液酸化-Tn，唾液酸化-TF，Globo-H，Lewis-Y，唾液酸化-Lewis-A，唾液酸化-Lewis-X，聚唾液酸，Lewis-X，GM2，GD2，GD3，9-O-乙酰基GD3，GD3L，岩藻糖基GM1，岩藻糖基GM1，Lewis-A，Lewis B，sLac，唾液酸化1型链，CA 19-9抗原，CA 72-4抗原和CA-50抗原，或结合至包括任何这些碳水化合物表位或其部分的碳水化合物结构。
10.细胞免疫应答测试，包括：
a)使至少一种树突细胞负载第一碳水化合物阳性化合物，其中所述碳水化合物阳性化合物携带目的碳水化合物表位；
b)使合适量的负载有所述碳水化合物阳性化合物的所述至少一种树突细胞与合适量的免疫细胞接触，所述免疫细胞能够被树突细胞激活或抑制；
c)培养以允许所述免疫细胞与所述负载的树突细胞相互作用；
d)添加合适量的抗原呈递细胞(APC)，其中所述抗原呈递细胞负载有合适量的至少一种第二化合物，所述第二化合物携带与所述第一化合物相同的碳水化合物表位，其中所述第二化合物不同于所述第一碳水化合物阳性化合物；
e)培养以再刺激所述免疫细胞；
f)确定是否发生免疫细胞的再刺激。
11.根据权利要求10所述的方法，其中使至少部分负载有合适量的所述第二化合物的APC s，在识别所述目的碳水化合物的碳水化合物结合分子的存在下，与免疫细胞接触。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中通过确定以下确定再刺激：
-免疫细胞的分泌产物，例如干扰素α、干扰素γ或GM-CSF，如果所述免疫细胞被(再)刺激则分泌其，和/或
-免疫细胞的增殖。
13.用于产生针对目的碳水化合物表位的功能性树突细胞的方法，包括：使合适量的树突细胞或树突细胞的混合物或包括至少一种树突细胞的细胞混合物，与合适量的权利要求任一项所定义的碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物、和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞，在合适的条件下接触合适的时间，以产生针对所述碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的功能性树突细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述树突细胞为人类起源。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述碳水化合物表位不是双极性(dipolar)表位。
16.用于产生针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系的方法，其包括：
(a)使权利要求13至15至少之一的合适量的至少一种功能性树突细胞，与合适量的至少一种T细胞或T细胞的混合物或包括至少一种T细胞的细胞混合物接触，使所述T细胞或T细胞的混合物与所述负载的功能性树突细胞一起培养，以激活或引发针对所述碳水化合物抗原的T细胞，和
(b)用合适量的抗原呈递细胞(APC)、优选至少一种功能性树突细胞再刺激所述T细胞，所述功能性树突细胞负载有携带所述碳水化合物表位的人类或动物细胞或分子。
17.根据以上权利要求任意一项所述方法产生的功能性树突细胞、激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系，其中所述激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞。
18.包括目的碳水化合物表位的碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物，其被至少一种特异性识别所述目的碳水化合物表位的碳水化合物结合分子识别，由此所述微生物、所述片段或所述裂解产物诱导有效的针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的碳水化合物特异性细胞免疫应答。
19.根据权利要求1至9至少之一所述方法获得的碳水化合物阳性微生物。
20.选自保健食品和药物组合物的制剂，包括至少一种权利要求18或19所定义的碳水化合物阳性微生物。
21.权利要求20所述的制剂，其中
(a)所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答包括针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的CD4阳性Th1型T细胞的激活和/或CD8阳性细胞毒性T细胞的激活，和
(b)碳水化合物表位选自：TF，Core-1，Tn，唾液酸化-Tn，唾液酸化-TF，Globo-H，Lewis-Y，唾液酸化-Lewis-A，唾液酸化-Lewis-X，聚唾液酸，Lewis-X，GM2，GD2，GD3，9-O-乙酰基GD3，GD3L，岩藻糖基GM1，岩藻糖基GM1，Lewis-A，Lewis B，sLac，唾液酸化1型链，CA 19-9抗原，CA 72-4抗原和CA-50抗原，和
(c)碳水化合物结合分子选自凝集素、选择素，和/或抗体，和/或从其衍生的分子，其结合至TF，Core-1，Tn，唾液酸化-Tn，唾液酸化-TF，Globo-H，Lewis-Y，唾液酸化-Lewis-A，唾液酸化-Lewis-X，聚唾液酸，Lewis-X，GM2，GD2，GD3，9-O-乙酰基GD3，GD3L，岩藻糖基GM1，岩藻糖基GM1，Lewis-A，Lewis B，sLac，唾液酸化1型链，CA 19-9抗原，CA 72-4抗原和CA-50抗原，或结合至包括任何这些碳水化合物表位或其部分的碳水化合物结构。
22.根据权利要求20或21所述的制剂，其中所述有效的碳水化合物特异性细胞免疫应答包括针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的CD4阳性Th1型T细胞的激活和CD8阳性细胞毒性T细胞的激活。
23.用于针对碳水化合物表位免疫或接种人类或动物的方法，所述碳水化合物表位在来自人类或动物细胞的分子上呈递，其包括：
i)给药人类或动物以有效量的针对目的碳水化合物表位的以上权利要求任一项所述的功能性树突细胞、激活的T细胞、T细胞克隆或T细胞系或细胞混合物，通过所述细胞在人类或动物中诱导针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的免疫应答(引发)，和
ii)通过给药有效量的包括至少一种碳水化合物阳性微生物和/或其片段或裂解产物的制剂来增强该免疫应答，所述碳水化合物阳性微生物被至少一种碳水化合物结合分子识别，所述碳水化合物结合分子特异性地识别在来自人类或动物细胞的分子上呈递的碳水化合物表位，由此所述微生物、所述片段或所述裂解产物或所述包括这些的制剂诱导有效的针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的碳水化合物特异性细胞免疫应答。
24.用于在至少一个动物或人类中诱导或增强有效的针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的碳水化合物特异性细胞免疫应答和/或特异性体液免疫应答的方法，包括在人类或动物中给药有效量的以上权利要求任一项所述的制剂。
25.用于预防和/或治疗碳水化合物表位阳性肿瘤和/或疾病的方法，包括给药合适量的以上权利要求任一项所述的针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的制剂、碳水化合物阳性微生物或其裂解产物或片段、功能性树突细胞、或激活的T细胞、T细胞系或T细胞克隆，给人类或动物。
26.通过以上权利要求任一项所述方法分离或鉴定的碳水化合物阳性微生物或其片段或裂解产物在制备用于预防和/或治疗与所述碳水化合物表位相关的疾病的药物或保健食品上的用途，由此所述微生物和/或其片段和/或裂解产物，在至少一个动物或人类中诱导有效的针对碳水化合物表位和/或包括所述碳水化合物表位的碳水化合物结构、碳水化合物缀合物或哺乳动物细胞的碳水化合物特异性细胞和/或体液免疫应答。
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