CN101497675A - 一种pH敏感溶解可逆聚合物、其制备方法及用途 - Google Patents
一种pH敏感溶解可逆聚合物、其制备方法及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101497675A CN101497675A CNA2009100449147A CN200910044914A CN101497675A CN 101497675 A CN101497675 A CN 101497675A CN A2009100449147 A CNA2009100449147 A CN A2009100449147A CN 200910044914 A CN200910044914 A CN 200910044914A CN 101497675 A CN101497675 A CN 101497675A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- formula
- monomeric compound
- polymer
- compound shown
- sensitive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Abstract
本发明涉及一种pH敏感溶解可逆聚合物,粘均分子量为60000~70000,由式(1)、式(2)、式(3)和式(4)所示单体化合物经无规共聚而得到,质量比为9∶4∶5∶1,R1、R2、R3、R4、R5分别选自H或C1~C6的烷基;R6、R7分别选自H或C1~C6的羟烷基,还提供了上述pH敏感溶解可逆聚合物的制备方法,及形成的聚合物-配基复合物,本发明的pH敏感溶解可逆聚合物对pH敏感可逆溶解,通过连接特异性亲和配基,能够用于大分子亲和沉淀,聚合物可以高效回收,大大降低了使用成本,且回收简便,并可以保持生物质活性与稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及溶解可逆聚合物技术领域,更具体地,涉及pH敏感溶解可逆聚合物技术领域,特别是指一种pH敏感溶解可逆聚合物、其制备方法及用途。
背景技术
当环境参数如pH、温度、离子强度和盐度等发生改变,或存在特定离子、有机溶剂以及带相反电荷的聚电解质时,许多大分子聚合物的溶解状态会发生可逆性的改变,这些物质就称之为可逆溶解聚合物。亲和沉淀是在可逆溶解聚合物上连接配基,以专一性地吸附目标蛋白,吸附完成后,改变条件(pH值、温度、离子强度或加入某种试剂),使该聚合物沉淀,与水溶液分离。然后再改变操作条件使目标蛋白从聚合物-配基复合物上洗脱下来,复合物重新溶解循环使用。由于亲和沉淀作用中,目标分子与配基的亲和作用是在水溶性状态下进行,传质阻力小,吸附速度快,因此适合在分离过程的初期使用,有利于减少分离步骤,提高产率,降低成本。然而一般能用于亲和沉淀的可逆溶解聚合物数量很少,且存在着难以回收再利用的问题,增加了分离成本,从而影响了亲和沉淀技术的应用。因此,解决载体循环使用问题成为研究热点。
亲和沉淀的研究中,现在主要是采用亲和配基-可逆溶解聚合物作为蛋白质的亲和沉淀剂。Seusted和Mattiasson在1989年直接用脱乙酰几丁质分离纯化小麦凝集素的基础上将大豆胰酶抑制剂连接到脱乙酰几丁质上,并用来从粗酶制剂中分离纯化了胰蛋白酶(ChemicalEngineering Science,56(2001)5681-5692)。在这之后,又有一些聚合物被用于蛋白质的亲和沉淀。最近Guoqiang等人对Eudragit S和Eudragit L(Eudragit S的成份同Eudragit L相同,但它们所含的异丁烯酸与异丁烯酸甲酯的比例不同)进行了化学修饰,分别连接上了一种芳香族染料(Cibacron blue 3GA),并用其分离纯化了肌肉乳酸脱氢酶和酵母醇脱氢酶(Bioseperation,7(1999)195-205)。大豆胰蛋白酶抑制剂(ST1)与部分水解的聚(N-乙烯己内酰胺)共价结合成为亲和沉淀胰蛋白酶的异双功能试剂,ST1聚合物与胰蛋白酶结合,升高温度即形成沉淀。离心,沉淀物于室温溶解,调pH至2.5,进行第二次沉淀、离心,胰蛋白酶存在于上清液中,而ST1聚合物则沉淀,酶收率为77%,而聚合物的回收率为82%(Biotechnol Techn,6(1992)353)。
溶解可逆聚合物的应用及其研究尽管已取得了许多成就,但此项技术还没有得到广泛重视。可逆溶解聚合物的回收条件必须与有利于生物分子稳定性及活性的保持,且需价格低廉,易于得到。另外,回收聚合物还存在回收率不高导致其循环使用的次数大大降低。因此,研发用于亲和沉淀生物分子、既能保持生物大分子的稳定性及活性,又可循环使用的聚合物成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足,提供一种pH敏感溶解可逆聚合物、其制备方法及用途,该pH敏感溶解可逆聚合物对pH敏感可逆溶解,通过连接特异性亲和配基,能够用于大分子亲和沉淀,聚合物可以高效回收,大大降低了使用成本,且回收简便,并可以保持生物质活性与稳定性。
为了实现上述目的,在本发明的第一方面,提供了一种pH敏感溶解可逆聚合物,其特点是,所述pH敏感溶解可逆聚合物的粘均分子量为60000~70000,由式(1)所示单体化合物、式(2)所示单体化合物、式(3)所示单体化合物和式(4)所示单体化合物经无规共聚而得到,其中所述式(1)所示单体化合物、所述式(2)所示单体化合物、所述式(3)所示单体化合物和所述式(4)所示单体化合物的质量比为8~9:4:5~8:1,
其中,R1、R2、R3、R4、R5分别选自H或C1~C6的烷基;R6、R7分别选自H或C1~C6的羟烷基。
较佳地,所述R1、所述R2、所述R3、所述R4、所述R5分别选自H或C1~C3的烷基;所述R6、所述R7分别选自H或C1~C3的羟烷基。
更佳地,所述R1、所述R2、所述R3、所述R4、所述R5为甲基;所述R6为H;所述R7为羟甲基。
较佳地,所述式(1)所示单体化合物、所述式(2)所示单体化合物、所述式(3)所示单体化合物和所述式(4)所示单体化合物的质量比为8:4:8:1或9:4:5:1。
在本发明的第二方面,提供了一种制备上述的pH敏感溶解可逆聚合物的方法,其特点是,将所述式(1)所示单体化合物、所述式(2)所示单体化合物、所述式(3)所示单体化合物和所述式(4)所示单体化合物按质量比为8~9:4:5~8:1加入无水乙醇中,以偶氮二异丁腈为引发剂,在惰性气体存在下,于50℃~80℃进行聚合反应得到所述pH敏感溶解可逆聚合物。
较佳地,所述惰性气体为氮气。
较佳地,还包括步骤:分别用无水乙醇和丙酮洗涤所述pH敏感溶解可逆聚合物,然后真空干燥,干燥后用pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解,调节等电点沉淀,干燥,得到所述pH敏感溶解可逆聚合物的纯品。无水乙醇用于洗涤去除未反应完的单体,丙酮用于洗涤去除丙烯酸的均聚物。
在本发明的第三方面,提供了一种聚合物-配基复合物,其特点是,由上述的或上述方法制备的pH敏感溶解可逆聚合物经环氧氯丙烷活化后与对氨基苯甲脒(式(5)所示化合物)共价结合而成,或者上述的或上述方法制备的pH敏感溶解可逆聚合物与CibacronBlue F3GA(式(6)所示化合物)直接共价结合而成。
较佳地,在40℃,氢氧化钠水溶液中,加入所述环氧氯丙烷和所述pH敏感溶解可逆聚合物反应使所述pH敏感溶解可逆聚合物上的羟基活化,活化后用氢氧化钠调节pH至11,加入所述对氨基苯甲脒,于80℃,反应完全,得到所述配基-聚合物复合物。更佳地,氢氧化钠水溶液为2mol/L NaOH,调节pH时用1N NaOH调节。
较佳地,将所述pH敏感溶解可逆聚合物溶于水中,加入所述Cibacron Blue F3GA,置于40℃水浴摇床,加入氯化钠,1小时后加入碳酸钠,振荡反应完全,得到所述配基-聚合物复合物。更佳地,氯化钠是2%Nacl,碳酸钠是30mg/ml的Na2CO3。
在本发明的第四方面,提供了上述的聚合物-配基复合物在亲和沉淀分离生物大分子中的应用。
在本发明中:式(1)所示单体化合物、式(2)所示单体化合物、式(3)所示单体化合物、式(5)所示单体化合物和式(6)所示单体化合物为市售品;式(4)所示单体化合物是由丙烯酰胺与多聚甲醛反应制得。
本发明的有益效果具体为:本发明的设计并合成的pH敏感溶解可逆聚合物为pH敏感可逆溶解,在活化状态下与对氨基苯甲脒共价结合,未经活化时与Cibacron Blue F3GA共价结合,可用于亲和沉淀分离生物大分子,可再生回收(回收率高达95%以上),大大降低了使用成本;其通过调节pH至等电点(约为6.50)来进行回收,回收操作简便,与现有用于亲和沉淀分离系统的聚合物相比,本发明所述的共聚物分离生物大分子,既能保持生物大分子的稳定性及生物活性,又可实现循环使用。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容,下面结合具体实施例作进一步说明。
实施例1 pH敏感溶解可逆聚合物制备
在具塞三角烧瓶中加入4ml甲基丙烯酸、2ml甲基丙烯酸甲酯、4ml甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(以上三种单体均购自上海凌峰化学试剂有限公司,化学纯)和0.5g羟甲基丙烯酰胺(自己合成),在50ml无水乙醇中充分溶解,0.05gAIBN(上海试四赫维化工有限公司、偶氮二异丁腈化学纯)作为引发剂,充氮气10~15分钟,以充分去除氧气。塞子封住三角烧瓶口,60℃水浴摇床,250rpm转速下,反应24小时,反应方程式如下所示。反应结束,产物直接沉淀在三角瓶底部,沉淀物经无水乙醇洗涤三次,再经过真空干燥至恒重,得到最终产物。聚合反应得率为75~78%。其粘均分子量为6.97×104。
实施例2 聚合物-配基复合物制备
将一定量实施例1制备的pH敏感溶解可逆聚合物溶于水中,40℃水浴摇床,2mol/LNaOH存在条件下,加入环氧氯丙烷(上海凌峰化学试剂有限公司、环氧氯丙烷、分析纯)和pH敏感溶解可逆聚合物反应2小时使聚合物上的羟基活化,活化后用1N NaOH调节pH至11,加入p-amino benzamidine(对-氨基苯甲脒)(Sigma、分析纯),80℃,反应24h,调节pH使聚合物-配基复合物沉淀,即得到可应用于亲和沉淀、不同配基密度的亲和沉淀大分子。配基密度为24.59~71.08μmol/g。调节pH至等电点6.50±0.02离心收集沉淀计算所得到的配基-聚合物的回收率分别为:96.3%、96.5%、96.2%。理论上可以使用50次以上。
实施例3 胰蛋白酶亲和沉淀实例
以胰蛋白酶为目标蛋白,将1g粗胰酶粉末溶于100ml pH7.3PBS中,磁力搅拌30min,4℃,9000rpm离心15min,以上清液作为待纯化的样品。加入一定量的实施例2制备的聚合物-配基复合物,即亲和沉淀剂,150rpm,25℃,吸附2h,调节溶液pH至聚合物等电点6.50±0.02使聚合物-胰蛋白酶复合物沉淀出来,测上清液的蛋白含量和酶活力,胰蛋白酶的吸附率达到90%以上,用含有1M NaCl的1M甲酸溶液洗脱,洗脱率也高达90%,纯化后胰蛋白酶活回收率超过80%,纯化因子30多倍。SDS-PAGE电泳结果显示为单一条带,表明粗胰酶粉中的胰蛋白酶经亲和沉淀后,得到了高度纯化。
实施例4 聚合物-配基复合物制备
将一定量聚合物溶于水中,加入3.0mg/ml的Cibacron Blue F3GA(Sigma,分析纯),置于40℃水浴摇床,加入2%NaCl,1小时后加入30mg/ml的Na2CO3,振荡反应24小时,用去离子水及20%乙醇洗至无染料,配基密度为34.82umol/g。调节pH至等电点6.50±0.02离心收集沉淀计算所得到的配基-聚合物的回收率分别为:96.8%、97.3%、96.8%。理论上可以使用50次以上。
实施例5 溶菌酶亲和沉淀实例
以溶菌酶为目标蛋白,将其溶于水中,初始浓度为0.5mg/ml,在20℃、pH7.5条件下反应2小时,调节溶液pH至聚合物等电点6.50±0.02使聚合物-溶菌酶复合物沉淀出来,吸附率可超过90%,在0.5M KSCN(中国医药(集团)上海化学试剂公司、硫氰化钾、分析纯)、pH8.0洗脱条件下,洗脱率超过90%。从蛋清中直接用亲和沉淀分离溶菌酶,亦可获得电泳纯的产品。
综上所述,本发明的pH敏感溶解可逆聚合物对pH敏感可逆溶解,通过连接特异性亲和配基,能够用于大分子亲和沉淀,聚合物可以高效回收,大大降低了使用成本,且回收简便,并可以保持生物质活性与稳定性。
需要说明的是,在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围,这些等价形式同样落在本发明的范围内。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的pH敏感溶解可逆聚合物,其特征在于,所述R1、所述R2、所述R3、所述R4、所述R5分别选自H或C1~C3的烷基;所述R6、所述R7分别选自H或C1~C3的羟烷基。
3.根据权利要求2所述的pH敏感溶解可逆聚合物,其特征在于,所述R1、所述R2、所述R3、所述R4、所述R5为甲基;所述R6为H;所述R7为羟甲基。
4.根据权利要求1所述的pH敏感溶解可逆聚合物,其特征在于,所述式(1)所示单体化合物、所述式(2)所示单体化合物、所述式(3)所示单体化合物和所述式(4)所示单体化合物的质量比为8:4:8:1或9:4:5:1。
5.一种制备权利要求1所述的pH敏感溶解可逆聚合物的方法,其特征在于,将所述式(1)所示单体化合物、所述式(2)所示单体化合物、所述式(3)所示单体化合物和所述式(4)所示单体化合物按质量比为8~9:4:5~8:1加入无水乙醇中,以偶氮二异丁腈为引发剂,在惰性气体存在下,于50℃~80℃进行聚合反应得到所述pH敏感溶解可逆聚合物。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,还包括步骤:分别用无水乙醇和丙酮洗涤所述pH敏感溶解可逆聚合物,然后真空干燥,干燥后用pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解,调节等电点沉淀,干燥,得到所述pH敏感溶解可逆聚合物的纯品。
7.一种聚合物-配基复合物,其特征在于,由权利要求1~3任一所述的或权利要求4~6任一所述的方法制备的pH敏感溶解可逆聚合物经环氧氯丙烷活化后与对氨基苯甲脒共价结合而成,或者由权利要求1~3任一所述的或权利要求4~6任一所述的方法制备的pH敏感溶解可逆聚合物与Cibacron Blue F3GA直接共价结合而成。
8.根据权利要求7所述的聚合物-配基复合物,其特征在于,在40℃,氢氧化钠水溶液中,加入所述环氧氯丙烷和所述pH敏感溶解可逆聚合物反应使所述pH敏感溶解可逆聚合物上的羟基活化,活化后用氢氧化钠调节pH至11,加入所述对氨基苯甲脒,于80℃,反应完全,得到所述配基-聚合物复合物。
9.根据权利要求7所述的聚合物-配基复合物,其特征在于,将所述pH敏感溶解可逆聚合物溶于水中,加入所述Cibacron Blue F3GA,置于40℃水浴摇床,加入氯化钠,1小时后加入碳酸钠,振荡反应完全,得到所述配基-聚合物复合物。
10.权利要求7~9任一所述的聚合物-配基复合物在亲和沉淀分离生物大分子中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009100449147A CN101497675B (zh) | 2009-01-06 | 2009-01-06 | 一种pH敏感溶解可逆聚合物、其制备方法及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009100449147A CN101497675B (zh) | 2009-01-06 | 2009-01-06 | 一种pH敏感溶解可逆聚合物、其制备方法及用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101497675A true CN101497675A (zh) | 2009-08-05 |
CN101497675B CN101497675B (zh) | 2011-05-18 |
Family
ID=40944959
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2009100449147A Expired - Fee Related CN101497675B (zh) | 2009-01-06 | 2009-01-06 | 一种pH敏感溶解可逆聚合物、其制备方法及用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101497675B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103113509A (zh) * | 2013-01-30 | 2013-05-22 | 华东理工大学 | 以l-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物 |
CN103554305A (zh) * | 2013-10-14 | 2014-02-05 | 南昌市浩然生物医药有限公司 | 一种亲和沉淀介质的合成方法及其制备依诺肝素钠的应用 |
CN104725563B (zh) * | 2013-12-19 | 2017-04-12 | 中国科学院金属研究所 | 一种具有智能pH值控制释放的缓蚀剂凝胶微球及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1324060C (zh) * | 2005-04-28 | 2007-07-04 | 华东理工大学 | 一种用于两水相体系的ph敏感型可再生两性离子聚合物及其制备方法 |
CN100395271C (zh) * | 2006-07-14 | 2008-06-18 | 华东理工大学 | 离子交换型溶解可逆光敏聚合物 |
-
2009
- 2009-01-06 CN CN2009100449147A patent/CN101497675B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103113509A (zh) * | 2013-01-30 | 2013-05-22 | 华东理工大学 | 以l-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物 |
CN103113509B (zh) * | 2013-01-30 | 2016-05-04 | 华东理工大学 | 以l-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物 |
CN103554305A (zh) * | 2013-10-14 | 2014-02-05 | 南昌市浩然生物医药有限公司 | 一种亲和沉淀介质的合成方法及其制备依诺肝素钠的应用 |
CN104725563B (zh) * | 2013-12-19 | 2017-04-12 | 中国科学院金属研究所 | 一种具有智能pH值控制释放的缓蚀剂凝胶微球及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101497675B (zh) | 2011-05-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20210088650A (ko) | 공융 용매 및 리그닌 추출에서의 이의 응용 | |
CN101357325B (zh) | 一种含偕胺肟基和羧基的球形纤维素螯合吸附剂及其制备方法 | |
CN101497675B (zh) | 一种pH敏感溶解可逆聚合物、其制备方法及用途 | |
CN101724097B (zh) | 壳聚糖与金属铜离子配合物蛋白质印迹聚合物及其制法 | |
Fujii et al. | Application of reversibly soluble polymers in bioprocessing | |
CN102161729A (zh) | 水溶性多糖与疏水性单体形成纳米粒子的制备方法 | |
CN103030817A (zh) | 改性木质素磺酸钠及其作为水泥助磨剂的应用 | |
CN103613756A (zh) | 一种蛋白诱导制备手性聚苯胺的方法 | |
CN102675663A (zh) | 一种可生物降解的复合高吸水性树脂的制备方法 | |
CN104099383A (zh) | (s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物制备方法 | |
Cai et al. | Using temperature-responsive zwitterionic surfactant to enhance the enzymatic hydrolysis of lignocelluloses and recover cellulase by cooling | |
CN108484984B (zh) | 一种高强度纤维素基复合薄膜的制备方法 | |
CN101863785A (zh) | 甜菜碱盐酸盐的环保制备方法 | |
CN109485872A (zh) | 一种具有pH响应性的木质素磁性纳米颗粒及其制备方法和在纤维素酶回收中的应用 | |
CN105646722A (zh) | 一种胺化纳米纤维素晶体及其制备方法 | |
CN102875721A (zh) | 可形成偏酸性两水相体系的两种pH响应再生型聚合物及其制备方法与应用 | |
CN103113509A (zh) | 以l-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物 | |
CN109182308B (zh) | 一种利用pH响应型木质素基聚醚回收纤维素酶的方法 | |
CN110129307A (zh) | 固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用 | |
CN1314721C (zh) | 一种用于亲和沉淀分离系统的可再生聚合物及其制备方法 | |
CN101298610A (zh) | 线性聚n-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法 | |
CN102154256A (zh) | 一种无载体固定化脂肪酶及其制备方法 | |
Nguyen et al. | The development and application of a new affinity partitioning system for enzyme isolation and purification | |
CN109111549B (zh) | 一种高性能接枝淀粉制备方法 | |
CN110339183B (zh) | 一种纤维素基水难溶或微溶性药物缓释微球的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110518 Termination date: 20210106 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |