CN101298610A - 线性聚n-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法 - Google Patents
线性聚n-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101298610A CN101298610A CNA2008100624283A CN200810062428A CN101298610A CN 101298610 A CN101298610 A CN 101298610A CN A2008100624283 A CNA2008100624283 A CN A2008100624283A CN 200810062428 A CN200810062428 A CN 200810062428A CN 101298610 A CN101298610 A CN 101298610A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- renaturation
- isopropyl acrylamide
- lysozyme
- linear poly
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 66
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 title claims description 58
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 title claims description 58
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims abstract description 106
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 43
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 39
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- BEGBSFPALGFMJI-UHFFFAOYSA-N ethene;sodium Chemical group [Na].C=C BEGBSFPALGFMJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 claims description 22
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 22
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 22
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 22
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 20
- VVWRJUBEIPHGQF-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl n-propan-2-yloxycarbonyliminocarbamate Chemical compound CC(C)OC(=O)N=NC(=O)OC(C)C VVWRJUBEIPHGQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 14
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 13
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 claims description 12
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 12
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 12
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 claims description 12
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 12
- 108010066925 sleep-promoting factor B Proteins 0.000 claims description 12
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 11
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 claims description 11
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 claims description 11
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 22
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 19
- 238000010790 dilution Methods 0.000 abstract description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 abstract description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 229940051921 muramidase Drugs 0.000 abstract 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 abstract 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 59
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 229920003141 Eudragit® S 100 Polymers 0.000 description 4
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000003916 Arrestin Human genes 0.000 description 3
- 108090000328 Arrestin Proteins 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011557 critical solution Substances 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 125000003262 carboxylic acid ester group Chemical group [H]C([H])([*:2])OC(=O)C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001002 functional polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000005226 mechanical processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用线性聚N－异丙基丙烯酰胺胶协助溶菌酶体外复性的方法，具体步骤如下：1)自由基聚合法制备线性聚N－异丙基丙烯酰胺；2)线性聚N－异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性。本发明所开发的线性聚N－异丙基丙烯酰胺，作为一种新型的蛋白质体外复性添加剂，可提高复性溶菌酶的处理浓度，降低生产成本，在处理浓度为600μg/mL时，使溶菌酶的活力回收率提高到80％左右，而相同条件下稀释复性的活力回收率仅为10％。该凝胶具有高效、操作方便、工艺简单等优点，因而在蛋白质体外复性领域具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法。
背景技术
基因工程蛋白质产业化过程中往往面临这样一个难题：重组表达产物通常是以没有生物活性的聚集体形式即包涵体存在的。如何使蛋白质高效地重折叠成为具有天然构象和天然活性的蛋白质，是决定该基因工程蛋白质能否产业化和为人类所利用的关键，这就使得对于蛋白质体外复性技术的开发成为近年来的研究热点之一。但由于蛋白质的多样性、结构和折叠过程的复杂性，使得人们不能对一种复性方法进行简单的移植，也很难找到具有普适性而又低成本的高效复性方法。因此实际操作过程中必须针对每种目标蛋白质的特点，对影响复性的各个因素逐一优化，才能最终确定适用于该种蛋白质的复性方法。
至今，蛋白质复性方法中的许多问题依然困扰着我们，如蛋白质活性回收率低、复性起始和终了的蛋白质浓度偏低等。目前出现的一些能够对高浓度蛋白质进行高效复性的方法如色谱复性等，往往因为设备及材料投入成本高而影响了大规模应用；分子伴侣和折叠酶介导的蛋白质复性过程是受体内复性过程的启发，能够在一定程度上提高复性收率，但分子伴侣和折叠酶易失活，一般仅用于复性机理的研究。常规的能够协助蛋白质复性的添加剂如聚乙二醇、L-精氨酸、去污剂和表面活性剂以及人工分子伴侣等，虽然对设备要求不高，但协助复性效果有限。在这种情况下，开发出一种新型、高效、易于分离回收而又低成本的蛋白质体外复性添加剂就显得尤为重要。近年来功能高聚物作为一种新型的协助蛋白质体外复性的添加剂越来越引起人们的重视，其主要优点在于影响复性的参数较少、操作方便、仪器设备简单且生产成本较低。
Roy等(参见Protein Engineering，Design & Selection，2003，16，1153-1157)采用了商品化的聚合物Eudragit S-100来复性α-胰凝乳蛋白酶。该聚合物是pH敏感型聚合物，由甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯以1∶2的摩尔比共聚而成。当溶液pH呈弱酸性时(pH4.8)，Eudragit S-100就从溶液中沉淀出来，而当pH升高到6.0左右时，该聚合物又再次溶解。用Eudragit S-100来复性α-胰凝乳蛋白酶时，复性缓冲液pH8.2，聚合物处于溶解状态，通过它的羧酸酯基与变性α-胰凝乳蛋白酶疏水基团之间的疏水相互作用会阻止蛋白质聚集，从而协助蛋白复性，除了可以提高复性活力回收率之外，Eudragit S-100还大大提高了复性速率，变性α-胰凝乳蛋白酶在10min便可完全恢复酶活力。但该聚合物是pH敏感型的，而不同的蛋白质保持活力的环境pH差异较大，因此，该聚合物所能复性的蛋白质种类很有限。Shimizu等(参见Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2002，18，137-144)采用反相悬浮法合成了Poly(styrene-co-glycidyl metharrylate)(SG)微球，再通过化学反应在微球体表面接枝上巯基或二硫键等功能基团，可以使处于去折叠态疏水基团大量外露的变性目标蛋白质方便地吸附到微球体表面，在抑制蛋白质相互聚集沉淀的同时，随着二硫键的正确配对而缓慢折叠。通过该方法可以使溶菌酶的复性收率在稀释复性的基础上提高40％。但是该法制备步骤较繁琐，且得到的微球仅限于协助含有较多巯基或二硫键的蛋白质体外复性。本课题组曾合成粒状聚N-异丙基丙烯酰胺并考察了其协助溶菌酶复性的效果(参见温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法，发明专利申请号：ZL 2004 1 0073406.9，授权日：2006年8月2日)，该聚合物是一种交联网络状凝胶，在水中可以显著溶胀，但不能溶解，由于粒状凝胶表面会吸附部分蛋白，从而造成蛋白损失。本发明采用的聚N-异丙基丙烯酰胺是一种线性温敏型聚合物，其低临界溶解温度在32℃附近。一方面，线性聚N-异丙基丙烯酰胺具有疏水基团异丙基，可以通过疏水相互作用来协助蛋白质复性；另一方面，聚N-异丙基丙烯酰胺还含有亲水基团酰胺基团，能够在复性液中溶解，分散性优于粒状聚合物凝胶，可以与变性蛋白质更好地接触。线性聚N-异丙基丙烯酰胺疏水作用的强弱可以通过控制温度来方便地调节，以满足不同的目标蛋白的复性要求。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法。
方法的步骤如下：
1)将摩尔浓度比为10∶1～20∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在50～70℃和氮气保护下反应12～24h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复2～3次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重；
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理60～90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.02～0.1mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的质量浓度为变性溶菌酶浓度的0.1～10倍，溶液于20～40℃、100～180rpm摇床中复性12～24h。
所述的N-异丙基丙烯酰胺采用正己烷重结晶。偶氮二异丁腈采用无水乙醇重结晶。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
本发明在制备工艺上采取“乙醇溶液中的自由基聚合法”，制备得到的聚N-异丙基丙烯酰胺为单链线性均聚物，该聚合物具有合适的低临界溶解温度(32℃)，且对温度的响应极为敏感。在协助溶菌酶复性时，去折叠态溶菌酶可以自由而快速地与聚N-异丙基丙烯酰胺侧链上的疏水基团异丙基发生疏水相互作用，从而抑制蛋白质之间的相互聚集，在处理浓度为600μg/mL时，使溶菌酶的活力回收率从稀释复性的10％提高到80％左右。因此，所开发的线性聚N-异丙基丙烯酰胺可以作为蛋白质体外复性的添加剂。本发明的优点在于：1)制备工艺简单，易于控制和放大；2)制备的线性聚N-异丙基丙烯酰胺具有一定的疏水性能，从而可以抑制蛋白质复性过程中的聚集趋势。线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶复性时，可使溶菌酶的比活及活力回收率均比稀释复性有较大的提高；3)该法复性操作简单，对仪器及设备的要求低，可降低生产成本；4)影响复性的参数少，易于操作；5)与粒状聚合物凝胶相比，能够在复性液中溶解，分散均匀，与变性蛋白质接触良好。
附图说明
图1是本发明线性聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)在不同加入量下协助溶菌酶体外复性效果图，图中：初始溶菌酶浓度400μg/mL，复性温度30℃；
图2是本发明线性聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)在不同温度下协助溶菌酶体外复性效果图，图中：溶菌酶复性初始浓度200μg/mL，复性液中PNIPAM浓度为溶菌酶浓度的8倍(w/w)；
图3是在不同溶菌酶初始浓度下，本发明线性聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)协助溶菌酶体外复性与溶菌酶稀释复性效果比较图，图中：复性液中PNIPAM浓度为溶菌酶浓度的8倍(w/w)，复性温度30℃。
具体实施方式
本发明采用线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性。步骤包括线性聚N-异丙基丙烯酰胺的制备和线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性过程。为实现该过程，首先，将N-异丙基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈分别用正己烷和无水乙醇重结晶；然后在无水乙醇溶液中，由偶氮二异丁腈引发自由基聚合反应。反应结束后，减压蒸发除去大部分乙醇。所得产物用丙酮溶解，溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，此即为线性聚N-异丙基丙烯酰胺，重复该产物溶解和沉淀步骤，以除去未反应的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈。将制得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺置于真空干燥器中干燥至恒重；其次线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性，将溶菌酶溶于变性缓冲液中，获得无活性的去折叠态的溶菌酶溶液，再将变性溶菌酶溶液按照不同的稀释倍数加入到不同体积的复性缓冲液中，复性液中含有相应浓度的线性聚N-异丙基丙烯酰胺，将溶液充分混匀，进行复性实验。本发明所采用的复性方法中，N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈的摩尔浓度比为10∶1～20∶1，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，反应溶剂无水乙醇，反应温度50～70℃，氮气保护下反应12～24h，产物溶解和沉淀重复2～3次。变性液浓度为10mg/mL，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理60～90min。复性液中变性溶菌酶溶液的加入量为0.02～0.1mL，复性体系的终体积为1mL，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的加入量为溶菌酶浓度的0.1～10倍(w/w)，复性温度为20～40℃，摇床转速为100～180rpm，复性时间为12～24h。
N-异丙基丙烯酰胺(99％，聚合级，Beigium公司)，偶氮二异丁腈购自上海四维化工有限公司；鸡蛋清溶菌酶，还原型谷胱甘肽，氧化型谷胱甘肽，二硫苏糖醇，购于美国BBI公司；溶菌酶底物微球菌Micrococcus lysodeikticusATCC4698购于美国Sigma公司；乙二胺四乙酸钠，三(羟甲基)氨基甲烷购自上海生工生物工程公司；考马斯亮蓝G-250购自上海化学试剂公司，其它试剂均为市售分析纯。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5；复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。溶菌酶比活测定采用标准的F.I.P.法，溶菌酶的浓度采用考马斯亮蓝法测定，溶菌酶的活力回收率为复性后溶液中溶菌酶的活力与变性前溶菌酶活力之比。
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
1)将摩尔浓度比为10∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在60℃和氮气保护下反应12h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为Mn＝20.4kDa，重均分子量为Mw＝30.8kDa，多分散性＝1.51。
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.04mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓度的0.1倍(w/w)，溶液于30℃、120rpm摇床中复性16h，结果如图1所示。复性后溶菌酶活力回收率达56.2％。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
实施例2
1)将摩尔浓度比为10∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在60℃和氮气保护下反应12h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为Mn＝20.4kDa，重均分子量为Mw＝30.8kDa，多分散性＝1.51。
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理60min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.04mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓度的8倍(w/w)，溶液于30℃、120rpm摇床中复性16h，结果如图1所示。复性后溶菌酶活力回收率达82.7％。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
实施例3
1)将摩尔浓度比为10∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在60℃和氮气保护下反应12h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为Mn＝20.4kDa，重均分子量为Mw＝30.8kDa，多分散性＝1.51。
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理60min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.04mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓度的10倍(w/w)，溶液于30℃、120rpm摇床中复性16h，结果如图1所示。复性后溶菌酶活力回收率达75.4％。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
实施例4
1)将摩尔浓度比为20∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在50℃和氮气保护下反应24h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为Mn＝14.1kDa，重均分子量为Mw＝25.0kDa，多分散性＝1.77。
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.02mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓度的8倍(w/w)，溶液于20℃、100rpm摇床中复性24h，结果如图2所示。复性后溶菌酶活力回收率达87.1％。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
实施例5
1)将摩尔浓度比为20∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在50℃和氮气保护下反应24h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为Mn＝14.1kDa，重均分子量为Mw＝25.0kDa，多分散性＝1.77。
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.02mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓度的8倍(w/w)，溶液于37℃、100rpm摇床中复性24h，结果如图2所示。复性后溶菌酶活力回收率达89.5％。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
实施例6
1)将摩尔浓度比为20∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在70℃和氮气保护下反应24h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复2次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为Mn＝8.84kDa，重均分子量为Mw＝22.9kDa，多分散性＝2.59。
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理60min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.02mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓度的8倍(w/w)，溶液于30℃、180rpm摇床中复性24h，结果如图3所示。复性后溶菌酶活力回收率达94.1％，而相同条件下未用线性聚N-异丙基丙烯酰胺的复性即稀释复性仅能得到44.5％的活力回收率。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
实施例7
1)将摩尔浓度比为20∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在70℃和氮气保护下反应24h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复2次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为Mn＝8.84kDa，重均分子量为Mw＝22.9kDa，多分散性＝2.59。
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.06mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓度的8倍(w/w)，溶液于30℃、180rpm摇床中复性24h，结果如图3所示。复性后溶菌酶活力回收率达79.8％，而相同条件下未用线性聚N-异丙基丙烯酰胺的复性即稀释复性仅能得到11.9％的活力回收率。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
实施例8
1)将摩尔浓度比为20∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在70℃和氮气保护下反应24h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复2次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为Mn＝8.84kDa，重均分子量为Mw＝22.9kDa，多分散性＝2.59。
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.08mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓度的8倍(w/w)，溶液于30℃、180rpm摇床中复性24h，结果如图3所示。复性后溶菌酶活力回收率达9.4％，而相同条件下未用线性聚N-异丙基丙烯酰胺的复性即稀释复性仅能得到0.6％的活力回收率。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
Claims (5)
1.一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于方法的步骤如下：
1)将摩尔浓度比为10∶1～20∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在50～70℃和氮气保护下反应12～24h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复2～3次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重；
2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理60～90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.02～0.1mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的质量浓度为变性溶菌酶浓度的0.1～10倍，溶液于20～40℃、100～180rpm摇床中复性12～24h。
2.根据权利要求1所述的一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于所述的N-异丙基丙烯酰胺采用正己烷重结晶。
3.根据权利要求1所述的一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于所述的偶氮二异丁腈采用无水乙醇重结晶。
4.根据权利要求1所述的一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于所述的变性缓冲液为含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。
5.根据权利要求1所述的一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于所述的复性缓冲液为含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和1mmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100624283A CN101298610A (zh) | 2008-06-06 | 2008-06-06 | 线性聚n-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100624283A CN101298610A (zh) | 2008-06-06 | 2008-06-06 | 线性聚n-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101298610A true CN101298610A (zh) | 2008-11-05 |
Family
ID=40078568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2008100624283A Pending CN101298610A (zh) | 2008-06-06 | 2008-06-06 | 线性聚n-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101298610A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011017835A1 (en) * | 2009-08-11 | 2011-02-17 | Nanjing University | Preparation method of protein or peptide nanoparticles for in vivo drug delivery by unfolding and refolding |
| CN102675505A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-09-19 | 温州医学院 | 结构可控型丙烯酸类共聚物的合成方法及其在促碱性蛋白体外复性中的应用 |
| CN103202812A (zh) * | 2010-08-09 | 2013-07-17 | 南京大学 | 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法 |
| CN103202813A (zh) * | 2010-08-09 | 2013-07-17 | 南京大学 | 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法 |
| CN103694339A (zh) * | 2013-12-04 | 2014-04-02 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种甘精胰岛素前体的复性方法 |
-
2008
- 2008-06-06 CN CNA2008100624283A patent/CN101298610A/zh active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011017835A1 (en) * | 2009-08-11 | 2011-02-17 | Nanjing University | Preparation method of protein or peptide nanoparticles for in vivo drug delivery by unfolding and refolding |
| CN102048695A (zh) * | 2009-08-11 | 2011-05-11 | 南京大学 | 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法 |
| CN102048695B (zh) * | 2009-08-11 | 2014-07-02 | 南京大学 | 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法 |
| CN103202812A (zh) * | 2010-08-09 | 2013-07-17 | 南京大学 | 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法 |
| CN103202813A (zh) * | 2010-08-09 | 2013-07-17 | 南京大学 | 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法 |
| CN103202813B (zh) * | 2010-08-09 | 2015-09-30 | 南京大学 | 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法 |
| CN103202812B (zh) * | 2010-08-09 | 2015-10-28 | 南京大学 | 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法 |
| CN102675505A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-09-19 | 温州医学院 | 结构可控型丙烯酸类共聚物的合成方法及其在促碱性蛋白体外复性中的应用 |
| CN103694339A (zh) * | 2013-12-04 | 2014-04-02 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种甘精胰岛素前体的复性方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hilbrig et al. | Protein purification by affinity precipitation | |
| CN101298610A (zh) | 线性聚n-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法 | |
| CN102575244B (zh) | 抗生物素蛋白与生物素衍生物的解离方法以及解离剂 | |
| FI78318C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av kymosin. | |
| CN108384767A (zh) | 转氨酶突变体及其应用 | |
| JP4811620B2 (ja) | タンパク質の迅速な脱水 | |
| CN104804202A (zh) | 一种水凝胶的制备方法 | |
| CN102858845A (zh) | 水凝胶前体制剂及其制备方法 | |
| CN110193007B (zh) | 一种pH响应型水凝胶的制备方法及其应用 | |
| CN109576256B (zh) | 一种磁性dna水凝胶封装双酶的方法 | |
| CN114181989A (zh) | 一种制备多功能性大豆肽粉的高转化率酶解法 | |
| CN112401221B (zh) | 一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法与应用 | |
| EP0302284A2 (en) | Stabilized enzymes | |
| CN101363018B (zh) | 粒状聚(n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法 | |
| Yang et al. | Mono-sized microspheres modified with poly (ethylenimine) facilitate the refolding of like-charged lysozyme | |
| CN112006019A (zh) | 一种埃洛石基纳米载药材料的制备方法 | |
| Santos et al. | Functionalized activated carbon as support for trypsin immobilization and its application in casein hydrolysis | |
| CN101353654A (zh) | 一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法 | |
| CN1254488C (zh) | 基于水溶性多糖的纳米粒子的高效制备方法 | |
| CN110189882A (zh) | 一种具有蛋白印迹的二氧化碳气体刺激响应磁性纳米材料及其制备方法 | |
| Moustafa et al. | Preparation of porous polymeric structures for enzyme immobilization | |
| CN1267548C (zh) | 温敏型聚n－异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法 | |
| CN106008750B (zh) | 一种低分子量壳聚糖的制备方法 | |
| CN102120823B (zh) | 水溶性玉米朊的合成及在药物制剂中的运用 | |
| CN101664029B (zh) | 一种农药环保剂型专用分散剂及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081105 |