CN101353654A - 一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法 - Google Patents
一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101353654A CN101353654A CNA200810222877XA CN200810222877A CN101353654A CN 101353654 A CN101353654 A CN 101353654A CN A200810222877X A CNA200810222877X A CN A200810222877XA CN 200810222877 A CN200810222877 A CN 200810222877A CN 101353654 A CN101353654 A CN 101353654A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipase
- gel particle
- reaction
- activity
- aqueous solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Abstract
本发明公开了一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法。本发明所提供的脂肪酶凝胶颗粒由核心和核壳组成,所述核心为脂肪酶,所述核壳为由乙烯基单体聚合而成的高分子材料,所述核心和核壳之间通过化学键连接。本发明的脂肪酶凝胶颗粒具有活性高、热稳定性强、耐有机溶剂能力强、粒径小、比表面积高、无传质扩散阻力等特点。这种脂肪酶凝胶颗粒作为一种高性能的纳米酶制剂,将在纳米科学和生物技术等领域具有广阔的应用前景。本发明的制备脂肪酶凝胶颗粒的方法具有反应条件简单温和、制成的凝胶颗粒粒径可控制和易于工业实施放大的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法。
背景技术
脂肪酶(lipase)是目前最重要、应用最为广泛的水解酶,可以水解含有酯键的物质,同时也可以在有机相中催化合成酯类物质。脂肪酶反应条件温和、活性高、来源容易、成本较低,在有机合成、食品工业、洗涤剂工业、能源工业、生物转化、生物医药、生物传感器等领域均有广泛的用途。天然脂肪酶的稳定性包括热稳定性、有机相活性和有机相稳定性,是脂肪酶的主要限制性因素,难以满足实际应用的需求。50℃时,大多数脂肪酶活性的半衰期只有30分钟左右,在一些强极性的有机溶剂和水溶液组成的混合体系中,其稳定性更差。因此,采用化学手段、生物工程手段来提高脂肪酶的稳定性对拓展脂肪酶在各方面的应用具有重要的意义。
化学修饰方法成本低、方法简单,近年来在酶分子的改造中得到了广泛应用。目前,化学添加剂方法、固定化方法、基因工程等方法均能够提高酶分子的稳定性,但是,添加剂方法需要加入大量的添加剂,会给反应体系带来新的杂质和干扰;传统的固定化方法会引入较高的传质阻力,带来酶催化活性的显著下降;而基因工程方法较为复杂、成本较高、对稳定性提高的效果有限、无法解决大量廉价生产的问题。因此开发一种具有高稳定性、高生物催化活性、易于实施、粒径可控制的脂肪酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒具有重大的应用价值,可以解决现有的脂肪酶热稳定性差、耐有机溶剂能力低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法。
本发明所提供的脂肪酶凝胶颗粒具有脂肪酶的生物催化活性,以脂肪酶、酶修饰剂、乙烯基单体和引发剂为原料,通过自由基聚合制备得到。
本发明的脂肪酶凝胶颗粒由核心和核壳组成,所述核心由脂肪酶组成,所述核壳由高分子组成,所述高分子由乙烯基单体聚合而成,所述核心和核壳之间通过酶修饰剂连接,所述酶修饰剂为至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与所述脂肪酶反应形成化学键的物质。所述酶修饰剂优选为丙烯酸琥珀酰亚胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴、衣康酸酯和衣康酸酐中的至少一种。所述脂肪酶凝胶颗粒的核心的粒径为5-10nm,优选为5-7nm;所述脂肪酶凝胶颗粒的粒径为10-80nm,优选为25-50nm。
上述脂肪酶凝胶颗粒的制备方法包括以下步骤:
1)将脂肪酶与酶修饰剂加入到pH为4-9.4的缓冲液中,0-50℃条件下反应0.5-6小时,将反应液进行透析,以去除酶修饰剂;
2)将上述步骤1)透析后的溶液加入到有机溶剂的水溶液中,然后再加入乙烯基单体和引发剂,0-50℃下反应0.5-6小时,得到脂肪酶凝胶颗粒。
上述方法中,所述步骤1)中的反应温度为4-30℃,反应时间为4-6h;所述步骤2)中的反应温度为0-50℃,反应时间为0.5-2h。
上述方法中,所述酶修饰剂为至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与所述脂肪酶反应形成化学键的物质,优选为丙烯酸琥珀酰亚胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴、衣康酸酯和衣康酸酐中的至少一种。
所述乙烯基单体为可通过自由基聚合反应形成聚合物的物质,优选为丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、N,N’-甲叉双丙烯酰胺、顺丁二烯和三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的至少一种。
所述引发剂为0-50℃条件下,能够引发产生自由基并使所述乙烯基单体发生自由基聚合的热引发或氧化还原引发物质,优选为由过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化氢、叔丁基过氧化氢和过氧化苯二甲酰中的至少一种与亚铁盐、亚硫酸盐、N,N’-二甲基苯胺、氨水、N,N’-二甲基-对甲苯胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、哌啶和N-甲基吗啉中的至少一种组成的复合引发剂。
上述方法中,所述步骤1)中,加入的脂肪酶的重量份数为:10份,所述步骤1)中,加入的酶修饰剂的重量份数为2-40份,所述步骤2)中,加入的乙烯基单体的重量份数为20-200份,所述步骤3)中,加入的引发剂的重量份数为0.5-20份。
上述方法中,所述步骤1)中的缓冲液为由乙酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸钠、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾中的至少一种与其相应的酸组成的水溶液。
所述步骤2)中的有机溶剂水溶液为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、二氧六环、乙腈、乙醇和丙酮中的至少一种有机溶剂的水溶液。所述有机溶剂的水溶液中,所述有机溶剂的质量百分含量为0.5-10%。
本发明所提供的脂肪酶纳米凝胶颗粒具有较高的生物催化活性,由于脂肪酶与外壳高分子之间共价连接,能够显著强化脂肪酶的结构,从而有效阻止了高温下脂肪酶的结构振动而导致的失活问题;同时外壳连接的亲水性高分子材料层可以有效的保持脂肪酶分子表面的结构必需水,这些结构必需水的有效保持显著改善了脂肪酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒在极性有机溶剂水溶液中的活性和稳定性;并且由于脂肪酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒的粒径处于纳米范围、外壳连接的高分子材料层薄至几个到几十纳米,因此对酶催化反应的底物传质物无明显的影响。
本发明所述的脂肪酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒具有活性高、热稳定性强、耐有机溶剂能力强、粒径小、比表面积高、无传质扩散阻力等特点。这种纳米高分子材料生物催化凝胶颗粒形式的脂肪酶作为一种高性能的纳米酶制剂,在纳米科学和生物技术领域具有广泛的应用前景。本发明的方法具有反应条件简单温和、粒径尺度可控、易于工业实施放大的特点。
附图说明
图1为脂肪酶凝胶颗粒的透射电镜图
图2为脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶的热稳定性对比图
图3为脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶在甲醇水溶液中的稳定性对比图
图4为脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶在二甲基甲酰胺水溶液中的稳定性对比图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的脂肪酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒及其制备方法予以进一步说明,但不限制本发明。实施例中用于化学修饰的脂肪酶来源于商品酶、动物提取物或微生物提取物。
实施例1、脂肪酶凝胶颗粒的制备、活性检测和稳定性检测
1、脂肪酶凝胶颗粒的制备
1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司,美国,皱褶假丝酵母脂肪酶)与2g丙烯酸琥珀酰亚胺酯(酶修饰剂,购自Sigma公司,美国)加入到200mL pH为4的100mM乙酸缓冲液(24.5mg三水合乙酸钠和49mg乙酸溶解于200mL水)中,20℃条件下反应6小时,将反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯;
2)将上述步骤1)的去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯的反应液加入到200mL 2%(质量百分含量)二甲基亚砜的有机溶剂水溶液中,然后再在反应液中加入20g丙烯酰胺(乙烯基单体),以及由4g过硫酸铵和6gN,N,N’,N’-四甲基乙二胺组成的引发剂,30℃条件下反应2小时;
3)将上述步骤2)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,冻干得到29g脂肪酶凝胶颗粒。
2、脂肪酶凝胶颗粒的活性检测和结构表征
以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物测定上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率,同时采用体积排阻色谱法检测脂肪酶凝胶颗粒的聚合反应收率。生物催化活性总收率的计算方法为:相同蛋白浓度下,脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性与天然酶的生物催化活性的比值;聚合反应收率计算方法为:包埋入凝胶颗粒的脂肪酶含量与加入反应液中的脂肪酶总量的比值。
实验设三次重复,结果表明,上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率为95%,聚合反应收率为98%。
利用高分辨透射电镜观察上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的形态,结果如图1所示。结果表明,采用上述方法获得的脂肪酶凝胶颗粒为核壳结构,核心为脂肪酶,其粒径为7nm,外壳为高分子材料,核壳之间采用化学键连接。有80%的脂肪酶凝胶颗粒的粒径为25nm,脂肪酶凝胶颗粒的平均粒径为30nm,且粒径分布较为均匀。
3、脂肪酶凝胶颗粒的稳定性检测
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,皱褶假丝酵母脂肪酶)分别溶于20mL水中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,皱褶假丝酵母脂肪酶)水溶液和脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在50℃条件下加热,每隔45分钟、90分钟、120分钟、240分钟和480分钟分别取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果如图2所示。结果表明,50℃条件下,天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,皱褶假丝酵母脂肪酶)的酶活半衰期为30分钟,而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在相同条件下,500分钟内仍然保持了98%的催化活性。
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,皱褶假丝酵母脂肪酶)分别溶于20mL体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的甲醇和体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的二甲基甲酰胺中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,皱褶假丝酵母脂肪酶)和0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在40℃条件下加热12小时后,取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果如图3和图4所示。结果表明,天然脂肪酶随着甲醇浓度和二甲基甲酰胺浓度的增加发生显著的失活,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中,天然脂肪酶的活性低于初始活性的20%,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中天然脂肪酶的活性也仅为初始活性的20%左右。而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒的有机溶剂稳定性得到了很大提高,从图3和图4中可以发现,上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-30%(体积百分含量)的甲醇溶液基本保持了初始活性,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中也能保持大约80%的活性;上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-20%(体积百分含量)的二甲基甲酰胺溶液基本保持了初始活性,在30%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中能保持大约60%的活性,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中也能保持大约50%的活性。
实施例2、脂肪酶凝胶颗粒的制备、活性检测和稳定性检测
1、脂肪酶凝胶颗粒的制备
1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司,美国,黑曲霉脂肪酶)与40g丙烯酸琥珀酰亚胺酯(酶修饰剂,购自Sigma公司,美国)加入到200mL pH为9.4的100mM乙酸缓冲液(127.5mg三水合乙酸钠和3.6mg乙酸溶解于200mL水)中,30℃条件下反应4小时,将反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯;
2)将上述步骤1)的去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯的反应液加入到200mL 5%(质量百分含量)二甲基亚砜的有机溶剂水溶液中,然后再在反应液中加入200g丙烯酰胺(乙烯基单体),以及由4g过硫酸铵和6g N,N,N’,N’-四甲基乙二胺组成的引发剂,30℃条件下反应2小时;
3)将上述步骤3)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,冻干得到207g脂肪酶凝胶颗粒。
2、脂肪酶凝胶颗粒的活性检测和结构表征
以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物测定上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率,同时采用体积排阻色谱检测脂肪酶凝胶颗粒的聚合反应收率。生物催化活性总收率和聚合反应收率的计算方法同实施例1。
实验设三次重复,结果表明,上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率为85%,聚合反应收率为99%。
利用高分辨透射电镜观察上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的形态,结果表明,采用上述方法获得的脂肪酶凝胶颗粒为核壳结构,核心为脂肪酶,其粒径为5nm,外壳为高分子材料,核壳之间采用化学键连接。有70%的脂肪酶凝胶颗粒的粒径为40nm,脂肪酶凝胶颗粒的平均粒径为40nm,且粒径分布较为均匀。
3、脂肪酶凝胶颗粒的稳定性检测
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,黑曲霉脂肪酶)分别溶于20mL水中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,黑曲霉脂肪酶)水溶液和脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在50℃条件下加热,每隔45分钟、90分钟、120分钟、240分钟和480分钟分别取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,50℃条件下,天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,黑曲霉脂肪酶)的酶活半衰期为60分钟,而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在相同条件下,500分钟内仍然保持了97%的催化活性。
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,黑曲霉脂肪酶)分别溶于20mL体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的甲醇和体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的二甲基甲酰胺中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,黑曲霉脂肪酶)和0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在40℃条件下加热12小时后,取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,天然脂肪酶随着甲醇浓度和二甲基甲酰胺浓度的增加发生显著的失活,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中,天然脂肪酶的活性低于初始活性的25%,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中天然脂肪酶的活性也仅为初始活性的25%左右。而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒的有机溶剂稳定性得到了很大提高,上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-30%(体积百分含量)的甲醇溶液基本保持了初始活性,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中也能保持大约85%的活性;上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-20%(体积百分含量)的二甲基甲酰胺溶液基本保持了初始活性,在30%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中能保持大约65%的活性,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中也能保持大约55%的活性。
实施例3、脂肪酶凝胶颗粒的制备、活性检测和稳定性检测
1、脂肪酶凝胶颗粒的制备
1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司,美国,米曲霉脂肪酶)与2g丙烯酸琥珀酰亚胺酯(酶修饰剂,购自Sigma公司,美国)加入到200mL pH为4的100mM乙酸缓冲液(24.5mg三水合乙酸钠和49mg乙酸溶解于200mL水)中,30℃条件下反应5小时,将反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯;
2)将上述步骤1)的去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯的反应液加入到200mL 2%(质量百分含量)二甲基亚砜的有机溶剂水溶液中,然后再在反应液中加入由20g丙烯酰胺和0.2g N,N’-甲叉双丙烯酰胺组成的乙烯基单体,以及4g过硫酸钾作为引发剂,50℃条件下反应0.5小时;
3)将上述步骤2)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,冻干得到29g脂肪酶凝胶颗粒。
2、脂肪酶凝胶颗粒的活性检测和结构表征
以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物测定上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率,同时采用体积排阻色谱检测脂肪酶凝胶颗粒的聚合反应收率。生物催化活性总收率和聚合反应收率的计算方法同实施例1。
实验设三次重复,结果表明,上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率为95%,聚合反应收率为89%。
利用高分辨透射电镜观察上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的形态,结果表明,采用上述方法获得的脂肪酶凝胶颗粒为核壳结构,核心为脂肪酶,其粒径为6nm,外壳为高分子材料,核壳之间采用化学键连接。有70%的脂肪酶凝胶颗粒的粒径为20nm,脂肪酶凝胶颗粒的平均粒径为25nm,且粒径分布较为均匀。
3、脂肪酶凝胶颗粒的稳定性检测
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,米曲霉脂肪酶)分别溶于20mL水中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,米曲霉脂肪酶)水溶液和脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在50℃条件下加热,每隔45分钟、90分钟、120分钟、240分钟和480分钟分别取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,50℃条件下,天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,米曲霉脂肪酶)的酶活半衰期为50分钟,而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在相同条件下,500分钟内仍然保持了90%的催化活性。
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,米曲霉脂肪酶)分别溶于20mL体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的甲醇和体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的二甲基甲酰胺中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,米曲霉脂肪酶)和0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在40℃条件下加热12小时后,取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,天然脂肪酶随着甲醇浓度和二甲基甲酰胺浓度的增加发生显著的失活,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中,天然脂肪酶的活性低于初始活性的10%,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中天然脂肪酶的活性也仅为初始活性的15%左右。而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒的有机溶剂稳定性得到了很大提高,上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-30%(体积百分含量)的甲醇溶液保持了90%以上活性,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中也能保持大约70%的活性;上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-20%(体积百分含量)的二甲基甲酰胺溶液基本保持了初始活性,在30%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中能保持大约70%的活性,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中也能保持大约40%的活性。
实施例4、脂肪酶凝胶颗粒的制备、活性检测和稳定性检测
1、脂肪酶凝胶颗粒的制备
1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司,美国,南极假丝酵母脂肪酶)与2g丙烯酸琥珀酰亚胺酯(酶修饰剂,购自Sigma公司,美国)加入到200mL pH为4的100mM乙酸缓冲液(24.5mg三水合乙酸钠和49mg乙酸溶解于200mL水)中,30℃条件下反应6小时,将反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯;
2)将上述步骤1)的去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯的反应液加入到200mL 2%(质量百分含量)二甲基亚砜的有机溶剂水溶液中,然后再在反应液中加入由50g丙烯酰胺和0.5g N,N’-甲叉双丙烯酰胺组成的乙烯基单体,以及由4g过硫酸铵和6gN,N,N’,N’-四甲基乙二胺组成的引发剂,30℃条件下反应2小时;
3)将上述步骤2)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,冻干得到45g脂肪酶凝胶颗粒。
2、脂肪酶凝胶颗粒的活性检测和结构表征
以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物测定上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率,同时采用体积排阻色谱检测脂肪酶凝胶颗粒的聚合反应收率。生物催化活性总收率和聚合反应收率的计算方法同实施例1。
实验设三次重复,结果表明,上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率为82%,聚合反应收率为70%。
利用高分辨透射电镜观察上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的形态,结果表明,采用上述方法获得的脂肪酶凝胶颗粒为核壳结构,核心为脂肪酶,其粒径为6nm,外壳为高分子材料,核壳之间采用化学键连接。有70%的脂肪酶凝胶颗粒的粒径为50nm,脂肪酶凝胶颗粒的平均粒径为50nm,且粒径分布较为均匀。
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,南极假丝酵母脂肪酶)分别溶于20mL水中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,南极假丝酵母脂肪酶)水溶液和脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在50℃条件下加热,每隔45分钟、90分钟、120分钟、240分钟和480分钟分别取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,50℃条件下,天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,南极假丝酵母脂肪酶)的酶活半衰期为65分钟,而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在相同条件下,500分钟内仍然保持了90%的催化活性。
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,南极假丝酵母脂肪酶)分别溶于20mL体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的甲醇和体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的二甲基甲酰胺中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,南极假丝酵母脂肪酶)和0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在40℃条件下加热12小时后,取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,天然脂肪酶随着甲醇浓度和二甲基甲酰胺浓度的增加发生显著的失活,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中,天然脂肪酶的活性低于初始活性的10%,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中天然脂肪酶的活性也仅为初始活性的10%左右。而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒的有机溶剂稳定性得到了很大提高,上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-30%(体积百分含量)的甲醇溶液基本保持了初始活性,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中也能保持大约85%的活性;上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-20%(体积百分含量)的二甲基甲酰胺溶液基本保持了初始活性,在30%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中能保持大约65%的活性,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中也能保持大约40%的活性。
实施例5、脂肪酶凝胶颗粒的制备、活性检测和稳定性检测
1、脂肪酶凝胶颗粒的制备
1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司,美国,爪哇毛霉脂肪酶)与30g丙烯酰溴(酶修饰剂,购自Sigma公司,美国)加入到200mL pH为9.4的100mM乙酸缓冲液(127.5mg三水合乙酸钠和3.6mg乙酸溶解于200mL水)中,4℃条件下反应6小时,将反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,去除丙烯酰溴;
2)将上述步骤1)的去除丙烯酰溴的反应液加入到200mL 5%(质量百分含量)二甲基亚砜的有机溶剂水溶液中,然后再在反应液中加入200g丙烯酰胺(乙烯基单体),以及由4g过硫酸铵和6gN,N,N’,N’-四甲基乙二胺组成的引发剂,40℃条件下反应1小时;
3)将上述步骤2)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,冻干得到189g脂肪酶凝胶颗粒。
2、脂肪酶凝胶颗粒的活性检测和结构表征
以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物测定上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率,同时采用体积排阻色谱检测脂肪酶凝胶颗粒的聚合反应收率。生物催化活性总收率和聚合反应收率的计算方法同实施例1。
实验设三次重复,结果表明,上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率为85%,聚合反应收率为99%。
利用高分辨透射电镜观察上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的形态,结果表明,采用上述方法获得的脂肪酶凝胶颗粒为核壳结构,核心为脂肪酶,其粒径为5nm,外壳为高分子材料,核壳之间采用化学键连接。有70%的脂肪酶凝胶颗粒的粒径为35nm,脂肪酶凝胶颗粒的平均粒径为40nm,且粒径分布较为均匀。
3、脂肪酶凝胶颗粒的稳定性检测
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,爪哇毛霉脂肪酶)分别溶于20mL水中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,爪哇毛霉脂肪酶)水溶液和脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在50℃条件下加热,每隔45分钟、90分钟、120分钟、240分钟和480分钟分别取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,50℃条件下,天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,爪哇毛霉脂肪酶)的酶活半衰期为40分钟,而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在相同条件下,500分钟内仍然保持了93%的催化活性。
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,爪哇毛霉脂肪酶)分别溶于20mL体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的甲醇和体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的二甲基甲酰胺中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,爪哇毛霉脂肪酶)和0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在40℃条件下加热12小时后,取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,天然脂肪酶随着甲醇浓度和二甲基甲酰胺浓度的增加发生显著的失活,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中,天然脂肪酶的活性低于初始活性的20%,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中天然脂肪酶的活性也仅为初始活性的20%左右。而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒的有机溶剂稳定性得到了很大提高,上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-30%(体积百分含量)的甲醇溶液基本保持了初始活性,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中也能保持大约80%的活性;上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-20%(体积百分含量)的二甲基甲酰胺溶液基本保持了初始活性,在30%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中能保持大约60%的活性,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中也能保持大约50%的活性。
实施例6、脂肪酶凝胶颗粒的制备、活性检测和稳定性检测
1、脂肪酶凝胶颗粒的制备
1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司,美国,人体胰腺脂肪酶)与30g衣康酸酐(酶修饰剂,购自Sigma公司,美国)加入到200mL pH为9.4的100mM乙酸缓冲液(127.5mg三水合乙酸钠和3.6mg乙酸溶解于200mL水)中,30℃条件下反应6小时,将反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,去除衣康酸酐;
2)将上述步骤1)的去除衣康酸酐的反应液加入到200mL 5%(质量百分含量)二氧六环的有机溶剂水溶液中,然后再在反应液中加入由100g丙烯酰胺和10g丙烯酸钠组成的乙烯基单体,以及由4g过硫酸铵和6g N,N,N’,N’-四甲基乙二胺组成的引发剂,10℃条件下反应2小时;
3)将上述步骤2)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,冻干得到99g脂肪酶凝胶颗粒。
2、脂肪酶凝胶颗粒的活性检测和结构表征
以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物测定上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率,同时采用体积排阻色谱检测脂肪酶凝胶颗粒的聚合反应收率。生物催化活性总收率和聚合反应收率的计算方法同实施例1。
实验设三次重复,结果表明,上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率为85%,聚合反应收率为99%。
利用高分辨透射电镜观察上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的形态,结果表明,采用上述方法获得的脂肪酶凝胶颗粒为核壳结构,核心为脂肪酶,其粒径为7nm,外壳为高分子材料,核壳之间采用化学键连接。有75%的脂肪酶凝胶颗粒的粒径为55nm,脂肪酶凝胶颗粒的平均粒径为50nm,且粒径分布较为均匀。
3、脂肪酶凝胶颗粒的稳定性检测
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,人体胰腺脂肪酶)分别溶于20mL水中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,人体胰腺脂肪酶)水溶液和脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在50℃条件下加热,每隔45分钟、90分钟、120分钟、240分钟和480分钟分别取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,50℃条件下,天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,人体胰腺脂肪酶)的酶活半衰期为20分钟,而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在相同条件下,500分钟内仍然保持了88%的催化活性。
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,人体胰腺脂肪酶)分别溶于20mL体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的甲醇和体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的二甲基甲酰胺中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,人体胰腺脂肪酶)和0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在40℃条件下加热12小时后,取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,天然脂肪酶随着甲醇浓度和二甲基甲酰胺浓度的增加发生显著的失活,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中,天然脂肪酶的活性低于初始活性的20%,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中天然脂肪酶的活性也仅为初始活性的20%左右。而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒的有机溶剂稳定性得到了很大提高,上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-30%(体积百分含量)的甲醇溶液基本保持了初始活性,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中也能保持大约80%的活性;上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-20%(体积百分含量)的二甲基甲酰胺溶液基本保持了初始活性,在30%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中能保持大约50%的活性,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中也能保持大约50%的活性。
实施例7、脂肪酶凝胶颗粒的制备、活性检测和稳定性检测
1、脂肪酶凝胶颗粒的制备
1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司,美国,猪胰腺脂肪酶)与40g丙烯酸琥珀酰亚胺酯(酶修饰剂,购自Sigma公司,美国)加入到200mL pH为9.4的100mM乙酸缓冲液(127.5mg三水合乙酸钠和3.6mg乙酸溶解于200mL水)中,30℃条件下反应6小时,将反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯;
2)将上述步骤1)的去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯的反应液加入到200mL 5%(质量百分含量)二甲基亚砜的有机溶剂水溶液中,然后再在反应液中加入由100g丙烯酰胺和10g丙烯酸钠组成的乙烯基单体,以及由4g过硫酸铵和6g N,N,N’,N’-四甲基乙二胺组成的引发剂,0℃条件下反应2小时;
3)将上述步骤2)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,冻干得到109g脂肪酶凝胶颗粒。
2、脂肪酶凝胶颗粒的活性检测和结构表征
以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物测定上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率,同时采用体积排阻色谱检测脂肪酶凝胶颗粒的聚合反应收率。生物催化活性总收率和聚合反应收率的计算方法同实施例1。
实验设三次重复,结果表明,上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率为85%,聚合反应收率为99%。
利用高分辨透射电镜观察上述获得的脂肪酶凝胶颗粒的形态,结果表明,采用上述方法获得的脂肪酶凝胶颗粒为核壳结构,核心为脂肪酶,其粒径为7nm,外壳为高分子材料,核壳之间采用化学键连接。有80%的脂肪酶凝胶颗粒的粒径为35nm,脂肪酶凝胶颗粒的平均粒径为40nm,且粒径分布较为均匀。
3、脂肪酶凝胶颗粒的稳定性检测
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,猪胰腺脂肪酶)分别溶于20mL水中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,猪胰腺脂肪酶)水溶液和脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在50℃条件下加热,每隔45分钟、90分钟、120分钟、240分钟和480分钟分别取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,50℃条件下,天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,猪胰腺脂肪酶)的酶活半衰期为55分钟,而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在相同条件下,500分钟内仍然保持了90%的催化活性。
将2mg上述步骤1获得的脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,猪胰腺脂肪酶)分别溶于20mL体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的甲醇和体积百分含量分别为10%、20%30%和40%的二甲基甲酰胺中,制成浓度为0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液和天然脂肪酶的水溶液。将上述0.1mg/mL的天然脂肪酶(购自Sigma公司,美国,猪胰腺脂肪酶)和0.1mg/mL的脂肪酶凝胶颗粒的水溶液在40℃条件下加热12小时后,取出酶样并以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司,美国)作为底物,测定剩余酶的活性。实验设三次重复,结果表明,天然脂肪酶随着甲醇浓度和二甲基甲酰胺浓度的增加发生显著的失活,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中,天然脂肪酶的活性低于初始活性的10%,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中天然脂肪酶的活性也仅为初始活性的10%左右。而上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒的有机溶剂稳定性得到了很大提高,上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-30%(体积百分含量)的甲醇溶液保持了初始活性的75%,在40%(体积百分含量)甲醇溶液中也能保持大约60%的活性;上述步骤1制备的脂肪酶凝胶颗粒在10-20%(体积百分含量)的二甲基甲酰胺溶液基本保持了初始活性,在30%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中能保持大约60%的活性,在40%(体积百分含量)二甲基甲酰胺溶液中也能保持大约50%的活性。
对比例1、
1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司,美国,皱褶假丝酵母脂肪酶)加入到200mL pH为4的100mM乙酸缓冲液(24.5mg三水合乙酸钠和49mg乙酸溶解于200mL水)中,30℃条件下反应6小时;
2)将上述步骤1)的反应液加入到200mL 2%(质量百分含量)二甲基亚砜的有机溶剂水溶液中,然后再在反应液中加入20g丙烯酰胺(乙烯基单体),以及由4g过硫酸铵和6g N,N,N’,N’-四甲基乙二胺组成的引发剂,30℃条件下反应2小时;
3)将上述步骤2)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,冻干,进行检测。
结果没有得到脂肪酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒。
对比例2、
1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司,美国,皱褶假丝酵母脂肪酶)与40g丙烯酸琥珀酰亚胺酯(酶修饰剂,购自Sigma公司,美国)加入到200mL pH为4的100mM乙酸缓冲液(24.5mg三水合乙酸钠和49mg乙酸溶解于200mL水)中,30℃条件下反应6小时,将反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯;
2)将上述步骤1)的反应液加入到200mL 2%(质量百分含量)二甲基亚砜的有机溶剂水溶液中,然后再在反应液中加入由20g丙烯酰胺和10g N,N’-甲叉双丙烯酰胺组成的乙烯基单体,以及5g过硫酸铵作为引发剂,30℃条件下反应2小时;
3)将上述步骤2)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中,在水中透析24小时,每隔6小时换水一次,冻干,进行检测。
结果反应体系发生凝胶化,没有形成脂肪酶凝胶颗粒。
Claims (12)
1、一种脂肪酶凝胶颗粒,它由核心和核壳组成,所述核心由脂肪酶组成,所述核壳由高分子组成,所述高分子由乙烯基单体聚合而成,所述核心和核壳之间通过酶修饰剂连接,所述酶修饰剂为至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与所述脂肪酶反应形成化学键的物质。
2、根据权利要求1所述的脂肪酶凝胶颗粒,其特征在于:所述酶修饰剂为丙烯酸琥珀酰亚胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴、衣康酸酯和衣康酸酐中的至少一种。
3、根据权利要求1或2所述的脂肪酶凝胶颗粒,其特征在于:所述脂肪酶凝胶颗粒的核心的粒径为5-10nm,优选为5-7nm;所述脂肪酶凝胶颗粒的粒径为10-80nm,优选为25-50nm。
4、一种制备脂肪酶凝胶颗粒的方法,包括以下步骤:
1)将脂肪酶与酶修饰剂加入到pH为4-9.4的缓冲液中,0-50℃条件下反应0.5-6小时,将反应液进行透析,以去除酶修饰剂;
2)将上述步骤1)透析后的溶液加入到有机溶剂的水溶液中,然后再加入乙烯基单体以及引发剂,0-50℃下反应0.5-6小时,得到脂肪酶凝胶颗粒。
5、根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中的反应温度为4-30℃,反应时间为4-6h;所述步骤2)中的反应温度为0-50℃,反应时间为0.5-2h。
6、根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述酶修饰剂为至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与所述脂肪酶反应形成化学键的物质,优选为丙烯酸琥珀酰亚胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴、衣康酸酯和衣康酸酐中的至少一种。
7、根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述乙烯基单体为可通过自由基聚合反应形成聚合物的物质,优选为丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸钠、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、N,N’-甲叉双丙烯酰胺、顺丁二烯和三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的至少一种。
8、根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述引发剂为0-50℃条件下,能够引发产生自由基并使所述乙烯基单体发生自由基聚合的热引发或氧化还原引发物质,优选为由过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化氢、叔丁基过氧化氢和过氧化苯二甲酰中的至少一种与亚铁盐、亚硫酸盐、N,N’-二甲基苯胺、氨水、N,N’-二甲基-对甲苯胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、哌啶和N-甲基吗啉中的至少一种组成的复合引发剂。
9、根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,加入的脂肪酶的重量份数为:10份,加入的酶修饰剂的重量份数为2-40份,所述步骤2)中,加入的乙烯基单体的重量份数为20-200份,所述步骤3)中,加入的引发剂的重量份数为0.5-20份。
10、根据权利要求4-9中任一所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中的缓冲液为由乙酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸钠、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾中的至少一种与其相应的酸组成的水溶液。
11、根据权利要求4-9中任一所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中的有机溶剂水溶液为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、二氧六环、乙腈、乙醇和丙酮中的至少一种有机溶剂的水溶液。
12、根据权利要求11所述的方法,其特征在于:所述有机溶剂的水溶液中,所述有机溶剂的质量百分含量为0.5-10%。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200810222877XA CN101353654B (zh) | 2008-09-24 | 2008-09-24 | 一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200810222877XA CN101353654B (zh) | 2008-09-24 | 2008-09-24 | 一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101353654A true CN101353654A (zh) | 2009-01-28 |
CN101353654B CN101353654B (zh) | 2010-12-22 |
Family
ID=40306677
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200810222877XA Active CN101353654B (zh) | 2008-09-24 | 2008-09-24 | 一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101353654B (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101838640A (zh) * | 2010-04-13 | 2010-09-22 | 浙江大学 | 一种酶的单分子包埋方法 |
CN102229923A (zh) * | 2011-04-27 | 2011-11-02 | 清华大学 | 一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法 |
CN102604925A (zh) * | 2012-03-16 | 2012-07-25 | 清华大学 | 一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法 |
CN103451174A (zh) * | 2013-09-22 | 2013-12-18 | 清华大学 | 一种酶-高分子结合物及其制备方法与应用 |
CN109251944A (zh) * | 2018-08-28 | 2019-01-22 | 江苏大学 | 一种超临界co2工艺下固定化酶催化制备糖酯的方法 |
-
2008
- 2008-09-24 CN CN200810222877XA patent/CN101353654B/zh active Active
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101838640A (zh) * | 2010-04-13 | 2010-09-22 | 浙江大学 | 一种酶的单分子包埋方法 |
CN101838640B (zh) * | 2010-04-13 | 2012-05-02 | 浙江大学 | 一种酶的单分子包埋方法 |
CN102229923A (zh) * | 2011-04-27 | 2011-11-02 | 清华大学 | 一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法 |
CN102604925A (zh) * | 2012-03-16 | 2012-07-25 | 清华大学 | 一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法 |
CN102604925B (zh) * | 2012-03-16 | 2014-04-02 | 清华大学 | 一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法 |
CN103451174A (zh) * | 2013-09-22 | 2013-12-18 | 清华大学 | 一种酶-高分子结合物及其制备方法与应用 |
CN109251944A (zh) * | 2018-08-28 | 2019-01-22 | 江苏大学 | 一种超临界co2工艺下固定化酶催化制备糖酯的方法 |
CN109251944B (zh) * | 2018-08-28 | 2022-03-22 | 江苏大学 | 一种超临界co2工艺下固定化酶催化制备糖酯的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101353654B (zh) | 2010-12-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101353654B (zh) | 一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法 | |
Gill et al. | Hydrolysis of inulin by immobilized thermostable extracellular exoinulinase from Aspergillus fumigatus | |
Jiang et al. | Immobilization of dehydrogenase onto epoxy-functionalized nanoparticles for synthesis of (R)-mandelic acid | |
Ullah et al. | Metabolic engineering of synthetic cell-free systems: strategies and applications | |
CN108384767A (zh) | 转氨酶突变体及其应用 | |
Han et al. | Recyclable soluble–insoluble upper critical solution temperature-type poly (methacrylamide-co-acrylic acid)–cellulase biocatalyst for hydrolysis of cellulose into glucose | |
Liu et al. | Covalent immobilization of Kluyveromyces fragilis β-galactosidase on magnetic nanosized epoxy support for synthesis of galacto-oligosaccharide | |
Zhou et al. | Improved enzymatic activity by oriented immobilization on graphene oxide with tunable surface heterogeneity | |
Sneha et al. | Enzyme immobilization methods and applications in the food industry | |
CN104099317A (zh) | 一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法 | |
CN107022542B (zh) | 海藻酸钠接枝衍生环糊精固定化细胞及其应用 | |
Zhuang et al. | Using concanavalinA as a spacer for immobilization of E. coli onto magnetic nanoparticles | |
CN103756992B (zh) | 一种巧克力微杆菌磁性细胞及其制备方法和应用 | |
CN109576256B (zh) | 一种磁性dna水凝胶封装双酶的方法 | |
CN102559648B (zh) | 一种以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶及其制备方法和应用 | |
CN107164358A (zh) | 一种多巴胺及其衍生物快速交联表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法及其应用 | |
Narisetty et al. | An overview of cellulase immobilization strategies for biofuel production | |
CN100417724C (zh) | 碳酸酐酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法 | |
Zhang et al. | Lipase immobilization on magnetic microspheres via spacer arms: Effect of steric hindrance on the activity | |
Anwar et al. | Smart chemistry and applied perceptions of enzyme-coupled nano-engineered assemblies to meet future biocatalytic challenges | |
CN106582810A (zh) | 一种石墨烯固定酶催化剂的制备方法 | |
He et al. | Anemone-inspired enzymatic film for cellulose heterogeneous catalysis | |
CN103937778A (zh) | 一种固定化脂肪酶的制备方法 | |
Tan et al. | Lipase-polydopamine magnetic hydrogel microspheres for the synthesis of octenyl succinic anhydride starch | |
CN104861115A (zh) | 一种阴离子型葡聚糖絮凝剂的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |