CN101838640B - 一种酶的单分子包埋方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶的单分子包埋方法。该方法首先将酶修饰剂N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丙烯酰氯或衣康酸酐与酶分子上的氨基反应，使单个酶分子接上双键，然后使双键与交联剂反应将单个酶分子包埋其中。本发明的每个包埋颗粒中心只含单个酶分子，酶分子外层的网格结构往往制成纳米级厚，这使单分子包埋的酶具有比表面积大、扩散传质阻力低、催化活力高、稳定性好等特性，而且具有工艺简便，条件温和，酶活收率高和适用环境范围广等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶的单分子包埋方法。
背景技术
酶是生物体内至关重要的一种生物催化剂，它的高效专一、反应条件温和、绿色环保等优点使酶从人类文明诞生之初就吸引了人们的注意。然而由于酶的蛋白质本质，它的生物结构极易受环境影响而发生改变或破坏，所以酶的稳定性差，易失活，应用范围往往仅限于水溶液，不能适应大部分的工业应用，故目前应用的酶往往都是进行过固定化的。
自从上世纪70年代开始，酶的固定化已成为酶工程中一大重要研究领域，并得到了广泛的实际应用。固定化是运用可靠的方法将酶稳定的连接到可溶或不溶性的载体上，从而很好的解决了酶的稳定性差，不易重复利用、成本高等缺点，使越来越多的酶应用于制药、农业、环境等领域。
酶的固定化通常可以采用四种方法：吸附法，包埋法、共价法和交联法。其中包埋法是比较常用的一种方法，其基本原理是单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格中。故包埋法通用性强、负载量大、便于与其他方法协同使用。但此法制备的固定化酶往往外壳较厚，酶不易与底物接触；包埋材料未与酶交联导致酶构象易变，稳定性较差，而单分子包埋法可解决这些问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶的单分子包埋方法，它所提供的酶的单分子包埋颗粒具有比表面积大、扩散传质阻力低、催化活力高、稳定性好等优点。
本发明采用的技术方案如下：
该方法首先将酶修饰剂N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丙烯酰氯或衣康酸酐与酶分子上的氨基反应，使单个酶分子接上双键，然后使双键与交联剂反应将单个酶分子包埋其中。
该方法的具体步骤如下：
①将酶粉溶解在缓冲溶液中配制成浓度为2g/L～20g/L的酶液备用，将酶修饰剂溶于有机溶剂中备用，浓度为100g/L～500g/L；
②将酶液与酶修饰剂置于20～40℃水浴中振荡反应1～5h，使单个酶分子接上双键，并用缓冲溶液透析12～48h除去未反应的小分子；
③将交联剂与上述步骤②得到的修饰后酶液混合，然后加入引发剂，20～60℃下反应3～8h，整个过程需N2保护，然后研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分子包埋颗粒；
④上述步骤②中的酶液体积为10ml，则加入的酶修饰剂体积为0.1ml～10ml，步骤③中加入的交联剂总质量为2g～6.2g，引发剂为质量浓度5％的过硫酸铵0.1ml～0.8ml和N，N，N′，N′-四甲基二乙胺0.01ml～0.05ml或质量浓度4％的过硫酸钾0.5ml～1ml和亚硫酸氢钠0.1g～0.3g。
所述的酶为辣根过氧化物酶、蛋白酶或葡糖氧化酶。
所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
所述的酶修饰剂为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丙烯酰氯或衣康酸酐。
所述的有机溶剂为二甲基亚砜、氯仿、丙酮或二甲基甲酰胺。
所述的交联剂为二缩三乙二醇二甲基丙烯酸酯、三缩四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和一些分子结构至少含有2个乙二醇片段及碳-碳双键的化合物，或上述交联剂中的任意一种与丙烯酰胺、N，N-双甲基亚丙烯酰胺、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一种组成的复合交联剂。
本发明具有的有益效果：
本发明所提供的包埋颗粒中心只含单个酶分子，使酶分子与底物的接触几率达到最高；酶分子外层的网格结构往往制成纳米级厚，传质阻力降到最低；酶外层的交联材料与酶分子上的氨基共价连接，强化稳定了酶分子的构象。这些特性使单分子包埋的酶具有催化活力高、稳定性强、比表面积大、传质阻力小、耐有机溶剂能力强等其它方法所不具有的优点。该方法具工艺简便，条件温和，酶活收率高和适用环境范围广等优点
具体实施方式
实施例1：
首先，称取辣根过氧化物酶粉(或以上的任何一种酶粉，以下相同)溶解在磷酸盐缓冲溶液中配制成2g/L的酶液备用，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶于二甲基亚砜中配制成100g/L的NAS液备用。然后，将10ml辣根过氧化物酶液与0.1ml NAS液混匀，置于30℃恒温水浴中振荡反应3h，使酶分子接上双键，再用缓冲溶液透析12h除去未反应的小分子。将3ml聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯、50mg丙烯酰胺加入修饰后的上述酶液之中，通N210min，待气流稳定后，再加入引发剂质量浓度5％的过硫酸铵0.3ml、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺0.015ml引发反应，35℃下反应4h。然后经研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分子包埋颗粒。测得酶的活性收率为94％，聚合反应收率为98％。在4℃储存30天后，酶的活性保持原有活性的96.8％。
实施例2：
首先，称取辣根过氧化物酶粉溶解在磷酸盐缓冲溶液中配制成10g/L的酶液备用，将丙烯酰氯溶于氯仿中配制成500g/L的丙烯酰氯液备用。将10ml辣根过氧化物酶液与1ml丙烯酰氯液混匀，20℃下振荡反应5h，使酶分子接上双键，再用缓冲溶液透析24h除去未反应的小分子。将4ml三缩四乙二醇二甲基丙烯酸酯加入修饰后的上述酶液之中，通N210min，待气流稳定后，再加入引发剂质量浓度5％的过硫酸铵0.1ml、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺0.05ml引发反应，35℃下反应3h。然后经研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分子包埋颗粒。测得酶的活性收率为85％，聚合反应收率为92％。在4℃储存30天后，酶的活性保持原有活性的91％。
实施例3：
首先，称取胰凝乳蛋白酶粉溶解在硼酸缓冲溶液中配制成20g/L的酶液备用，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中配制成300g/L的NAS液备用。将10ml胰凝乳蛋白酶液与10ml NAS液混匀，30℃下振荡反应3h，使酶分子接上双键，再用缓冲溶液透析48h除去未反应的小分子。将6ml聚乙二醇200二丙烯酸酯、200mg三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯加入修饰后的上述酶液之中，通N210min，待气流稳定后，再加入引发剂质量浓度4％的过硫酸钾1ml、亚硫酸氢钠0.1g引发反应，20℃下反应8h。然后经研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分子包埋颗粒。测得酶的活性收率为82％，聚合反应收率为95％。在4℃储存30天后，酶的活性保持原有活性的89％。
实施例4：
首先，称取胰凝乳蛋白酶粉溶解在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中配制成2g/L的酶液备用，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中配制成100g/L的NAS液备用。将10ml胰凝乳蛋白酶液与2ml NAS液混匀，30℃下振荡反应4h，使酶分子接上双键，再用缓冲溶液透析48h除去未反应的小分子。将4ml聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯加入修饰后的上述酶液之中，通N210min，待气流稳定后，再加入引发剂质量浓度4％的过硫酸钾0.5ml、亚硫酸氢钠0.3g引发反应，35℃下反应5h。然后经研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分子包埋颗粒。测得酶的活性收率为98％，聚合反应收率为91％。在4℃储存30天后，酶的活性保持原有活性的90％。
实施例5：
首先，称取葡糖氧化酶粉溶解在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中配制成5g/L的酶液备用，将衣康酸酐溶于二甲基亚砜中配制成100g/L的衣康酸酐液备用。将10ml葡糖氧化酶液与5ml衣康酸酐液混匀，40℃下振荡反应1h，使酶分子接上双键，再用缓冲溶液透析24h除去未反应的小分子。将2ml二缩三乙二醇二甲基丙烯酸酯、100mg N，N-双甲基亚丙烯酰胺加入修饰后的上述酶液之中，通N210min，待气流稳定后，再加入引发剂质量浓度5％的过硫酸铵0.8ml、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺0.01ml引发反应，60℃下反应3h。然后经研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分子包埋颗粒。测得酶的活性收率为68％，聚合反应收率为97％。在4℃储存30天后，酶的活性保持原有活性的79％。
Claims (3)
1.一种酶的单分子包埋方法，该方法首先将酶修饰剂N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丙烯酰氯或衣康酸酐与酶分子上的氨基反应，使单个酶分子接上双键，然后使双键与交联剂反应将单个酶分子包埋其中；其特征在于该方法的具体步骤如下：
①将酶粉溶解在缓冲溶液中配制成浓度为2g/L～20g/L的酶液备用，将酶修饰剂溶于有机溶剂中备用，浓度为100g/L～500g/L；
②将酶液与酶修饰剂置于20～40℃水浴中振荡反应1～5h，使单个酶分子接上双键，并用缓冲溶液透析12～48h除去未反应的小分子；
③将交联剂与上述步骤②得到的修饰后酶液混合，然后加入引发剂，20～60℃下反应3～8h，整个过程需N2保护，然后研磨、清洗、过滤及冻干制成酶的单分子包埋颗粒；
④上述步骤②中的酶液体积为10ml，则加入的酶修饰剂体积为0.1ml～10ml，步骤③中加入的交联剂总质量为2g～6.2g，引发剂为质量浓度5％的过硫酸铵0.1ml～0.8ml和N，N，N′，N′-四甲基二乙胺0.01ml～0.05ml或引发剂为质量浓度4％的过硫酸钾0.5ml～1ml和亚硫酸氢钠0.1g～0.3g；
所述的酶为辣根过氧化物酶、蛋白酶或葡糖氧化酶；
所述的交联剂为二缩三乙二醇二甲基丙烯酸酯、三缩四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，或上述交联剂中的任意一种与丙烯酰胺、N，N-双甲基亚丙烯酰胺、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一种组成的复合交联剂。
2.根据权利要求1所述的一种酶的单分子包埋方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种酶的单分子包埋方法，其特征在于：所述的有机溶剂为二甲基亚砜、氯仿、丙酮或二甲基甲酰胺。
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