CN105541963A

CN105541963A - 一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法

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Publication number: CN105541963A
Application number: CN201510548394.9A
Authority: CN
Inventors: 沈金灿
Original assignee: Food Inspection & Quarantine Technology Center Of Shenzhen Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Current assignee: Food Inspection & Quarantine Technology Center Of Shenzhen Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2016-05-04

Abstract

一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，涉及一种蛋白质分子的化学修饰方法，其包括：往蛋白质溶液中加入碱后冷却，在0～10℃下，往冷却后的蛋白质溶液中加入烯酰氯乙腈溶液进行反应，纯化反应结束后的混合液得到烯酰化蛋白质。本发明反应条件易于控制，反应程度高，修饰效果显著。特别是采用烯酰氯试剂进行反应，如丙烯酰氯，可以在蛋白质分子上快速修饰不饱和碳碳双键，带有不饱和碳碳双键的物质可进一步用于制备多种具有特定功能的高聚物，应用十分广阔。

Description

一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质分子的化学修饰方法，具体涉及一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法。

背景技术

化学修饰是一种重要的设计蛋白质的手段。迄今为止，已有多种蛋白质被修饰后在临床应用中显示出优良性质，如：物理和热稳定性增强，化学性质变化，对酶降解敏感程度的降低，溶解度的增大，在体内循环半衰期、清除时间的增长，免疫原性和抗原性的降低及毒性的减小等。修饰蛋白在肽类和非肽类药物、免疫学、诊断学和生物催化等诸多领域得到越来越广泛的应用。经过化学修饰及修饰的蛋白质不仅较高的维持蛋白质的生物活性，而且能够有效的克服蛋白质免疫原性和毒性方面的缺点；同时赋予蛋白质一些新的优良性能。蛋白质的化学修饰技术主要是蛋白质的氨基酸残基修饰技术，是通过化学试剂对蛋白质肽链上的特定活性基团衍生化，使部分肽键断裂或引入各种功能基团，包括对氨基酸残基的酰化、去酰胺、磷酸化、糖基化、共价交联、水解以及氧化等。蛋白质肽链上的活性基团主要有氨基、羟基、巯基等，化学修饰的本质是通过新基团的引入而改变蛋白质的化学性质、结构、构象以及净电荷、疏水性等，从而改善其功能性质，如反应特性、溶解性、表面性质、吸水性、凝胶性以及热稳定性等。

一般地说，选择蛋白质修饰剂要综合考虑如下问题：蛋白质的种类和修饰位点，修饰剂对氨基酸残基的专一性如何；期望的修饰度是多少，在给定的操作条件下，反应是否可逆；修饰剂的水解稳定性和反应活性，修饰剂后蛋白质的构象是否基本保持不变；修饰后是否需要进一步分离；是否适合于建立快速、方便、准确的分析方法；修饰剂的合成是否简便经济，修饰剂是否价廉易得等。

目前报道较多的是PEG酰化修饰蛋白质，如姜忠义等在蛋白质的化学修饰研究进展，《现代化工》第21卷第8期报道蛋白质的PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯类的修饰。目前尚未见在蛋白质分子上修饰不饱和碳碳双键；而且目前报道的蛋白质酰化反应条件苛刻，后处理复杂。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种廉价、快速、反应条件易于控制、反应程度高、修饰效果显著的蛋白质修饰方法；本发明的另一目的是首次提供一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，实现在蛋白质分子上修饰不饱和碳碳双键。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其包括：往蛋白质溶液中加入碱后冷却，在0～10℃下，往冷却后的蛋白质溶液中加入烯酰氯乙腈溶液进行反应，纯化反应结束后的混合液得到烯酰化蛋白质。

所述蛋白质溶液中的蛋白质可选自溶菌酶蛋白、牛血清白蛋白等；所述蛋白质溶液的浓度可为1～10000μmol/L。

所述碱可为碳酸盐或叔胺，所述碳酸盐可选自碳酸钠、碳酸钾等中的至少一种；所述叔胺可选自三乙基胺、三甲基胺、N,N-二甲基甲酰胺等中的至少一种；所述碱在混合液中的浓度可为10～100mmol/L。

所述烯酰氯可为丙烯酰氯、甲基丙烯酰氯等；所述烯酰氯与蛋白质的物质的量比可为1～100；所述烯酰氯乙腈溶液中，乙腈的体积为烯酰氯体积的5～20倍；所述往冷却后的蛋白质溶液中加入烯酰氯乙腈溶液，加入之前先将烯酰氯乙腈溶液冷却至0～10℃。

所述反应的时间可为5～30min。

反应结束后将混合液转移至截留分子量为5K或10K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，所得产物即为烯酰化蛋白质。

在一个实施例中，所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其包括：将0.716g溶菌酶蛋白溶解于10mL水中，往溶菌酶蛋白溶液中加入53mg碳酸钠固体使得其最终浓度为50mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取45.2mg的丙烯酰氯，用5倍丙烯酰氯体积量的乙腈稀释配制成丙烯酰氯溶液；将蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往溶菌酶蛋白溶液中逐滴加入丙烯酰氯乙腈溶液进行反应，反应10min后取出混合液；将混合液转移至截留分子量为5K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，得到丙烯酰化溶菌酶蛋白。

在另一个实施例中，所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其包括：将0.716g溶菌酶蛋白10mL水中，往溶菌酶蛋白溶液中加入10.1mg三乙基胺溶液使得其最终浓度为10mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取41.8mg的甲基丙烯酰氯，用10倍甲基丙烯酰氯体积量的乙腈稀释配制成甲基丙烯酰氯溶液；将溶菌酶蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往蛋白溶液中逐滴加入甲基丙烯酰氯乙腈溶液，反应5min后取出混合液；将混合液转移至截留分子量为5K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，得到甲基丙烯酰化溶菌酶蛋白。

在一些实施例中，所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其包括：将1.33g牛血清白蛋白溶于10mL水中，往牛血清白蛋白溶液中加入101mg三乙基胺溶液使得其最终浓度为100mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取36.2mg的丙烯酰氯，用10倍体积量的乙腈稀释配制成丙烯酰氯溶液；将牛血清白蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往溶液中逐滴加入4倍量的丙烯酰氯乙腈溶液，反应15min后取出混合液；将混合液转移至截留分子量为10K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，得到丙烯酰化牛血清白蛋白。

本发明是将酰化化学修饰技术与超滤分离技术相结合，利用蛋白质上的氨基能与酰氯快速反应的特性，实现蛋白质的快速烯酰化，然后将产物通过超滤分离技术进行纯化，制备得到烯酰化蛋白质，该方法具有快速简便、使用范围广、限制条件少、成本低的优点，适用于生物化学与材料化学等相关领域。本发明反应条件易于控制，反应程度高，修饰效果显著。特别是采用烯酰氯试剂进行反应，如丙烯酰氯，可以在蛋白质分子上快速修饰不饱和碳碳双键，带有不饱和碳碳双键的物质可进一步用于制备多种具有特定功能的高聚物，应用十分广阔。

附图说明

图1是实施例1丙烯酰化溶菌酶蛋白的高分辨质谱图。

图2是实施例2甲基丙烯酰化溶菌酶蛋白的高分辨质谱图。

图3是实施例3丙烯酰化牛血清白蛋白的高分辨质谱图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1丙烯酰化溶菌酶蛋白(lysozyme)的制备

将0.716g溶菌酶蛋白溶解于10mL水中，往溶菌酶蛋白溶液中加入53mg碳酸钠固体使得其最终浓度为50mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取45.2mg的丙烯酰氯，用5倍丙烯酰氯体积量的乙腈稀释配制成丙烯酰氯溶液；将蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往溶菌酶蛋白溶液中逐滴加入丙烯酰氯乙腈溶液进行反应，反应10min后取出混合液；将混合液转移至截留分子量为5K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，重复以上步骤3次得到丙烯酰化溶菌酶蛋白；取丙烯酰化溶菌酶蛋白于10μl离心管中，用0.1％的甲酸溶液稀释10倍，采用高分辨质谱进行表征，根据分子量的变化计算蛋白质上所衍生的丙烯酰基团的数量，结果见图1。根据研究结果，在溶菌酶蛋白上衍生了4～10个丙烯酰基团。

实施例2甲基丙烯酰化溶菌酶蛋白(lysozyme)的制备

将0.716g溶菌酶蛋白10mL水中，，往溶菌酶蛋白溶液中加入10.1mg三乙基胺溶液使得其最终浓度为10mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取41.8mg的甲基丙烯酰氯，用10倍甲基丙烯酰氯体积量的乙腈稀释配制成甲基丙烯酰氯溶液；将溶菌酶蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往蛋白溶液中逐滴加入甲基丙烯酰氯乙腈溶液，反应5min后取出混合液；将混合液转移至截留分子量为5K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，重复以上步骤3次得到甲基丙烯酰化溶菌酶蛋白；取甲基丙烯酰化溶菌酶蛋白置于10μl分离心管中纯，用0.1％的甲酸溶液稀释10倍，采用高分辨质谱进行表征，根据分子量的变化计算蛋白质上所衍生的甲基丙烯酰基团的数量，结果见图2。根据研究结果，在溶菌酶蛋白上衍生了2～7个甲基丙烯酰基团。

实施例3丙烯酰化牛血清白蛋白(bovinealbumin)的制备

将1.33g牛血清白蛋白溶于10mL水中，往牛血清白蛋白溶液中加入101mg三乙基胺溶液使得其最终浓度为100mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取36.2mg的丙烯酰氯，用10倍体积量的乙腈稀释配制成丙烯酰氯溶液；将牛血清白蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往溶液中逐滴加入4倍量的丙烯酰氯乙腈溶液，反应15min后取出混合液；将混合液转移至截留分子量为10K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，重复以上步骤3次得到丙烯酰化牛血清白蛋白；取丙烯酰化牛血清白蛋白置于10μl离心管中，用0.1％的甲酸溶液稀释10倍，采用高分辨质谱进行表征，根据分子量的变化计算蛋白质上所衍生的丙烯酰基团的数量，结果见图3。根据研究结果，在牛血清白蛋白上衍生了3～8个丙烯酰基团。

Claims

1.一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于包括：往蛋白质溶液中加入碱后冷却，在0～10℃下，往冷却后的蛋白质溶液中加入烯酰氯乙腈溶液进行反应，纯化反应结束后的混合液得到烯酰化蛋白质。

2.如权利要求1所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于所述蛋白质溶液中的蛋白质选自溶菌酶蛋白、牛血清白蛋白；所述蛋白质溶液的浓度为1～10000μmol/L。

3.如权利要求1所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于所述碱为碳酸盐或叔胺。

4.如权利要求3所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于所述碳酸盐选自碳酸钠、碳酸钾中的至少一种；所述叔胺选自三乙基胺、三甲基胺、N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种；所述碱在混合液中的浓度为10～100mmol/L。

5.如权利要求1所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于所述烯酰氯为丙烯酰氯、甲基丙烯酰氯；所述烯酰氯与蛋白质的物质的量比为1～100。

6.如权利要求1所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于所述往冷却后的蛋白质溶液中加入烯酰氯乙腈溶液，加入之前先将烯酰氯乙腈溶液冷却至0～10℃。

7.如权利要求1～6任一所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于反应结束后将混合液转移至截留分子量为5K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，所得产物即为烯酰化蛋白质。

8.如权利要求1所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于包括：将0.716g溶菌酶蛋白溶解于10mL水中，往溶菌酶蛋白溶液中加入53mg碳酸钠固体使得其最终浓度为50mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取45.2mg的丙烯酰氯，用5倍丙烯酰氯体积量的乙腈稀释配制成丙烯酰氯溶液；将蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往溶菌酶蛋白溶液中逐滴加入丙烯酰氯乙腈溶液进行反应，反应10min后取出混合液；将混合液转移至截留分子量为5K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，得到丙烯酰化溶菌酶蛋白。

9.如权利要求1所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于其包括：将0.716g溶菌酶蛋白10mL水中，，往溶菌酶蛋白溶液中加入10.1mg三乙基胺溶液使得其最终浓度为10mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取41.8mg的甲基丙烯酰氯，用10倍甲基丙烯酰氯体积量的乙腈稀释配制成甲基丙烯酰氯溶液；将溶菌酶蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往蛋白溶液中逐滴加入甲基丙烯酰氯乙腈溶液，反应5min后取出混合液；将混合液转移至截留分子量为5K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，得到甲基丙烯酰化溶菌酶蛋白。

10.如权利要求1所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其特征在于其包括：将1.33g牛血清白蛋白溶于10mL水中，往牛血清白蛋白溶液中加入101mg三乙基胺溶液使得其最终浓度为100mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取36.2mg的丙烯酰氯，用10倍体积量的乙腈稀释配制成丙烯酰氯溶液；将牛血清白蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往溶液中逐滴加入4倍量的丙烯酰氯乙腈溶液，反应15min后取出混合液；将混合液转移至截留分子量为10K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，得到丙烯酰化牛血清白蛋白。