CN103539885A - 一种具有生物特异性识别的温敏性含糖聚合物的制备方法 - Google Patents

一种具有生物特异性识别的温敏性含糖聚合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有生物识别特性的温敏性含糖聚合物的制备方法，包括：（1）将4～12g壬二酸二乙烯酯、4g D-半乳糖与50～100mL的吡啶混合，振荡溶解之后加入枯草芽孢杆菌产的蛋白酶1.2-2.0g，于40～50℃振荡反应1-5天，得到壬二酸半乳糖乙烯酯；（2）将0.2～0.4g上述壬二酸半乳糖乙烯酯与0.15～0.60g的N-乙烯基己内酰胺NVCL混合，然后加入偶氮二异丁氰AIBN和DMF，抽真空，充氮气，自由基聚合反应结束后，纯化得到P（OVNG-co-NVCL）。本发明得到的温敏性含糖聚合物在拥有接近人体温度的相变温度条件下，同时具备良好的生物识别特性。

Description

一种具有生物特异性识别的温敏性含糖聚合物的制备方法
技术领域
本发明属于温敏性聚合物的制备领域，特别涉及一种具有生物特异性识别的温敏性含糖聚合物的制备方法。
背景技术
聚N-乙烯基己内酰胺属于乙烯基化的内酰胺化合物，是一种水溶性的温敏聚合物，其LCST值正好于人体生理温度范围内，它不仅具有离子型水溶性维生素、热敏感性、而且还具有生物相容性。
半乳糖聚合物具有较好的生物相容性，较低的毒性，以及特异性识别特性，还具有支持细胞生长的优势。糖环所带的较多的羟基集团提高了含糖聚合物的水溶性，使其能够在水溶性的环境中很好地溶解，并释放其中的物质。
以上两种聚合物在生物医药和日用化学品等领域的应用越来越显著，近年来制备同时具有较高生物相容性，较低的细胞毒性，同时又具有接近人体温度的相变温度的亲水性聚合物也成为了热门，利用具有双重特性的聚合物进行药物的包埋，缓释等应用也越来越广泛。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有生物特异性识别的温敏性含糖聚合物的制备方法，该方法绿色安全，具有稳定的可重复性。
本发明的一种具有生物识别特性的温敏性含糖聚合物的制备方法，包括：
（1）将4～12g壬二酸二乙烯酯、4g D-半乳糖与50～100mL的吡啶混合，振荡溶解之后加枯草芽孢杆菌产的蛋白酶1.2-2.0g，于40～50℃振荡反应1-5天，得到壬二酸半乳糖乙烯酯；
（2）将0.2～0.4g上述壬二酸半乳糖乙烯酯与0.15～0.60g的N-乙烯基己内酰胺NVCL混合，然后加入偶氮二异丁氰AIBN和DMF，抽真空，充氮气，自由基聚合反应结束后，纯化得到P（OVNG-co-NVCL）。
步骤（1）所述的壬二酸半乳糖乙烯酯是经过柱层层析提纯得到的，洗脱剂为乙酸乙酯。
步骤（2）中所述的自由基聚合反应为于70℃恒温反应8h。
步骤（2）中所述的纯化为重复进行甲醇溶解-乙醚聚沉操作。
步骤（2）中所述的AIBN的加入量为反应底物（壬二酸半乳糖乙烯酯+N-乙烯基己内酰胺）总质量的1%～3%，DMF的用量为1mL。
用pH7.4的PBS缓冲液将上述温敏聚合物材料配成浓度1～3mg/10mL的溶液，在226nm条件下测定P（OVNG-co-NVCL）的相转变温度；
将1mL的P（OVNG-co-NVCL）溶液，1mL的PAN-FITC溶液，100～120mg的CaCl2,1～2mg BSA顺序加入到密封遮光的反应瓶中，于4℃冰箱里进行交联；交联反应结束，将交联反应液转移到透析袋中，室温下，在PBS缓冲液中透析48h，直至透析液无色，荧光显微镜下观察温敏材料的生物识别特性。其中P(OVNG-co-NVCL)的浓度是1～2mg/mL,PAN-FITC的浓度是1～1.5mg/mL，交联反应时间是1h。
本发明制备了一种具有生物特异性识别的温敏性含糖聚合物材料，通过酶促合成和自由基聚合得到具有生物识别特性的温敏性含糖聚合物材料，该材料具有接近于人体体温的相转变温度，同时能与花生凝集素蛋白特异性的识别。
有益效果：
（1）本发明的方法绿色安全，酶促合成可重复性高，自由基聚合操作简单。
（2）本发明的温敏性含糖聚合物材料有接近于人体体温的相转变温度，同时能与花生凝集素蛋白特异性的识别。
附图说明
图1：P（OVNG-co-NVCL）的红外图谱；
图2：P（OVNG-co-NVCL）的相转变温度；
图3：P（OVNG-co-NVCL）与花生凝集素的特异性识别。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明中所述的PBS缓冲液都是指pH7.4的磷酸盐缓冲液。
实施例1
P(OVNG-co-NVCL,OVAG:NVCL=1:1(mol/mol))，具体步骤如下：
取10g壬二酸二乙烯酯，4g D-半乳糖，70mL吡啶，1.5g枯草芽孢杆菌蛋白酶于250mL的反应瓶中，45℃的振荡器中反应3天；得到的壬二酸二乙烯半乳糖酯取4g与1.5gNVCL，0.11g的AIBN于DMF中，充氮气70℃反应8个小时后，产物反复经过甲醇溶解，乙醚聚沉得到P(OVNG-co-NVCL)。
实施例2
P(OVNG-co-NVCL,OVNG:NVCL=1:4(mol/mol))，具体步骤如下：
取10g壬二酸二乙烯酯，4g D-半乳糖，70mL吡啶，1.5g枯草芽孢杆菌蛋白酶于250mL的反应瓶中，45℃的振荡器中反应3天；得到的壬二酸二乙烯半乳糖酯取2g与2.98gNVCL，0.099g的AIBN于DMF中，充氮气70℃反应8个小时后，产物反复经过甲醇溶解，乙醚聚沉得到P(OVNG-co-NVCL)。
实施例3
P(OVNG-co-NVCL,OVNG:NVCL=1:6(mol/mol))，具体步骤如下：
取10g壬二酸二乙烯酯，4g D-半乳糖，70mL吡啶，1.5g枯草芽孢杆菌蛋白酶于250mL的反应瓶中，45℃的振荡器中反应3天；得到的壬二酸二乙烯半乳糖酯取2g与4.47gNVCL，0.13g的AIBN于DMF中，充氮气70℃反应8个小时后，产物反复经过甲醇溶解，乙醚聚沉得到P(OVAN-co-NVCL)。
实施例4
P(OVNG-co-NVCL,OVAG:NVCL=1:8(mol/mol))，具体步骤如下：
取10g壬二酸二乙烯酯，4g D-半乳糖，70mL吡啶，1.5g枯草芽孢杆菌蛋白酶于250mL的反应瓶中，45℃的振荡器中反应3天；得到的壬二酸二乙烯半乳糖酯取2g与5.96NVCL，0.16g的AIBN于DMF中，充氮气70℃反应8个小时后，产物反复经过甲醇溶解，乙醚聚沉得到P(OVNG-co-NVCL)。
实施例5
P(OVNG-co-NVCL)相转变温度的测定，具体步骤如下：
取10mgP(OVNG-co-NVCL)聚合物，溶于pH7.4的PBS缓冲液中，配成1mg/10mL的溶液，于226nm的波长下，测定该聚合物溶液随着温度的变化其透过率的大小，计算出材料的相转变温度。
实施例6
P(OVNG-co-NVCL)与花生凝集素的特异性识别特性的测定，具体步骤如下：
取1.3mg P(OVNG-co-NVCL)溶于1mLPBS中，取1mL浓度为1mg/mL的PAN-FITC，110mgCaCl2，2mgBSA于反应瓶中，避光反应1h，后转移到透析袋中在PBS中透析48小时，观察聚合物材料与花生凝集素的特异性识别特性。

Claims (6)

1.一种具有生物识别特性的温敏性含糖聚合物的制备方法，包括：
（1）将4～12g壬二酸二乙烯酯、4gD-半乳糖与50～100mL的吡啶混合，振荡溶解之后加入枯草芽孢杆菌产的蛋白酶1.2-2.0g，于40～50℃振荡反应1-5天，得到壬二酸半乳糖乙烯酯；
（2）将0.2～0.4g上述壬二酸半乳糖乙烯酯与0.15～0.60g的N-乙烯基己内酰胺NVCL混合，然后加入偶氮二异丁氰AIBN和DMF，抽真空，充氮气，自由基聚合反应结束后，纯化得到P（OVNG-co-NVCL）。
2.根据权利要求1所述的一种具有生物识别特性的温敏性含糖聚合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的壬二酸半乳糖乙烯酯是经过柱层层析提纯得到的。
3.根据权利要求2所述的一种具有生物识别特性的温敏性含糖聚合物的制备方法，其特征在于：所述的柱层层析提纯中所用的洗脱剂为乙酸乙酯。
4.根据权利要求1所述的一种具有生物识别特性的温敏性含糖聚合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的自由基聚合反应为于70℃恒温反应8h。
5.根据权利要求1所述的一种具有生物识别特性的温敏性含糖聚合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的纯化为重复进行甲醇溶解-乙醚聚沉操作。
6.根据权利要求1所述的一种具有生物识别特性的温敏性含糖聚合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的AIBN的加入量为反应底物总质量的1%～3%，DMF的用量为1mL。
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