CN103819501B - 一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体及其合成方法，涉及水凝胶。所述甲基丙烯基亚磷酰胺单体的分子式为C(38+n1)H(50+2n1)N3O6P，其中，n1为CH2基团的个数，n1=1～3。先制备acrylic-OH2，再制备acylic-DMT，最后在氮气保护下，将acylic-DMT和N,N-二异丙基乙基胺混合后，用二氯甲烷溶解，再加入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应后用硅胶柱层析分离，得甲基丙烯基亚磷酰胺单体。合成原料廉价，步骤简单可行；合成DNA后纯化效率更高，进而可以得到更高的聚合效率；可以根据需要嵌入到DNA序列的任何一个位置。
Description
技术领域
本发明涉及水凝胶，尤其是涉及一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体及其合成方法。
背景技术
水凝胶是一类亲水性的高分子聚合物，能够在水环境下发生溶胀，依靠物理交联或化学交联两种方式生成。凝胶结构能够响应多种环境参数，如温度，pH，离子强度和溶剂组成等，而发生相应的，因而也被称作“智能水凝胶”。智能水凝胶作为一种靶标及外界刺激响应的新型材料，在药物的可控传递、组织工程骨架的构建、微装置的动力源及生物传感器的应用等方面已取得广泛应用。其中DNA交联水凝胶是一种基于碱基之间的互补配对方式将不同单元的核酸序列通过物理或者化学相互作用的方式而组装在一起形成的水凝胶。DNA交联水凝胶的靶标响应范围相当广，从环境因素的变化到自然界存在的物质，包括大分子蛋白，小分子物质等，极大地扩展了水凝胶传感器的应用范围（1、Liu J，Liu H，Kang H，et.al.，Aptamer-incorporated hydrogels for visual detection，controlled drug release,and targeted cancertherapy[J].Anal Bioanal Chem(2012)402:187–194.）。比如，以核酸适体为部分结构单元的DNA水凝胶，通过核酸适体对靶标的响应以及核酸适体高分析灵敏度的放大技术，同时结合水凝胶的便携式检测，比如包裹金纳米粒子形成的可视化检测，结合手持式传感器血糖仪形成的定量即时检测等方式，使得DNA水凝胶在超痕量核酸序列检测、超微量靶标检测等方面大放异彩，向着普及化、便携化、低污染等方向发展。
目前DNA水凝胶形成的交联方式主要分为以下2种，分为物理交联和化学交联。所谓物理交联是指，不同结构单元的DNA分子通过碱基互补配对来实现交联作用，例如通过加入互补配对的DNA短链，可以将带有互补配对粘性末端的Y型DNA自组装单体交联形成水凝胶结构（2、Dongsheng Liu,et.al.,Self-Assembled DNA Hydrogels with Designable Thermal andEnzymatic Responsiveness[J].Adv.Mater.2011,23,1117–1121）；化学交联是更加常见的一类交联方式，即高聚物间以交联剂实现共价偶联，由于化学交联较物理交联的结合力更强，因而得到的水凝胶也更加稳定，如甲叉双丙烯酰胺作为交联剂，在过硫酸铵和四甲基乙二胺存在的条件下，将丙烯酰胺单体交联聚合成为聚丙烯酰胺水凝胶。这类水凝胶由于其以共价键的形式形成较强的结合力，不受到环境的因素，因此具有更大的应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有化学交联DNA水凝胶制备以及纯化难等问题，提供一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体及其合成方法。
所述甲基丙烯基亚磷酰胺单体的分子式为C(38+n1)H(50+2n1)N3O6P，其结构式如下：
其中，n1为CH2基团的个数，n1=1～3。
所述甲基丙烯基亚磷酰胺单体的合成方法，包括以下步骤：
1）将甲基丙烯酸、化合物A、二环己基碳二亚胺（DCC）、1-羟基苯并三氮唑（HOBt）
按摩尔比1∶1∶1.2∶1.2混合后反应，再用硅胶柱层析分离纯化，得acrylic-OH2；
所述化合物A的结构式为：其中，n1=1,2,3；
2）在氮气保护下，将acrylic-OH2、4-二甲氨基吡啶（DMAP）和吡啶混合，得溶液A；将4-4’-二甲氧基三苯基氯甲烷和二氯甲烷混合，得溶液B；在冰水浴的条件下将溶液B加入溶液A中反应后，用水和乙酸乙酯对产物进行萃取，干燥，并用硅胶柱层析得到acylic-DMT，所述acrylic-OH2、4-4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、吡啶和二氯甲烷的摩尔比为1∶1.2∶0.1∶6∶2；
3）在氮气保护下，将acylic-DMT和N,N-二异丙基乙基胺（DIPEA）混合后，用二氯甲烷溶解，再加入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应后用硅胶柱层析分离，得甲基丙烯基亚磷酰胺单体，所述acylic-DMT、2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺、N,N-二异丙基乙基胺（DIPEA）的摩尔比为1∶1.2∶2.8。
在步骤1）中，所述反应的时间可为12～24h。
在步骤2）中，所述反应的时间可为24h；所述水和乙酸乙酯的体积比最好为1∶1。
在步骤3）中，所述反应的温度可为0℃，反应的时间可为4h。
所述甲基丙烯基亚磷酰胺单体的合成路线如下：
本发明中所合成的分离纯化效率更高的DNA水凝胶材料功能化单体，由于带有DMT基团，即三苯基甲烷，其具有较大的疏水性基团，使得修饰有水凝胶功能化单体的DNA在高效液相色谱分离纯化的过程，出峰时间与其他DNA碎片峰相差较远，能够得到纯度更高的带有甲基丙烯基的DNA单链，较高纯度的DNA单链在自由基聚合的过程中可以得到更高聚合效率以及更纯的聚合产物。也正是由于带有DMT基团，该单体不仅能够在核酸的5’末端进行修饰，而且能够插入到核酸链中的任何一个位置，与正常的核酸序列化学合成没有区别，有效的解决了合成难，分离难，聚合难等关键问题。
本发明具有以下优点：
1、合成原料廉价，步骤简单可行；
2、合成DNA后纯化效率更高，进而可以得到更高的聚合效率；
3、可以根据需要嵌入到DNA序列的任何一个位置。
附图说明
图1为甲基丙烯基亚磷酰胺单体的1H NMR谱图。
图2为甲基丙烯基亚磷酰胺单体的31P NMR谱图。在图2中，147ppm为phosphoramidite的特征峰。
图3为甲基丙烯基亚磷酰胺单体的ESI-MS质谱分析图。在图3中，理论分子量为740.87([M+Na]+)，实际分子量为741.8([M+Na]+)、719.8（[M+H]+)。
图4为核酸序列strand A的分子量分析谱图。在图4中，用Madli-TOF-MS技术对strandA序列的分子量进行分析，理论分子量为5199，实际分子量为5170，说明甲基丙烯基亚磷酰胺单体成功修饰到DNA上。
图5为自由基聚合之后线性DNA聚合物，用琼脂糖凝胶电泳分析，其中最左边为DNAladder，最大分子量为10000bp，第二和第三个孔均为DNA聚合物，可以看出聚合后DNA的分子量远远高于10000bp。
具体实施方式
实施例1甲基丙烯基亚磷酰胺单体的合成。步骤如下：
步骤一：合成中间产物2，路线如下所示：
在一圆底烧瓶中加入甲基丙烯酸(176mg,2mmol)，6-Amino-2-hydroxymethyl Hexan-1-ol(294mg,2mmol),DCC(542.4mg,2.4mmol),HOBt(324mg,2.4mmol),10mL溶剂，在氮气保护下，室温下反应24h，结束后，用二氧化硅柱子分离纯化，核磁和质谱表征。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.67(s,1H),5.32(s,1H),3.78(q,2H),3.67(q,2H),3.35(q,4H),1.96(s,3H),1.70(m,1H),1.56(m,2H),1.37(m,4H).ESI-MS Calculated for C11H21NO3Na:238.29([M+Na]+),Found:238.7。
步骤二：合成中间产物3，合成路线如下：
在一圆底烧瓶中加入2(270mg,1.17mmol)，4-二甲氨基吡啶(14m g,0.117mmol),7mL吡啶，在氮气保护下。同时在氮气保护下将4-4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(476mg,1.404mmol)溶解于2.34mL二氯甲烷中，并将溶液在冰浴下滴加入上述溶液中，然后室温下反应24h，结束后，向反应体系中加入水，然后用乙酸乙酯萃取三遍，用二氧化硅柱子分离纯化，核磁和质谱表征。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.42-6.85(m,13H),5.65(s,1H),5.32(s,1H),3.82(s,6H),3.70-3.64(m,2H),3.29-3.10(m,4H),1.97(s,3H),1.81(m,1H),1.51(m,2H),1.34(m,4H).ESI-MS Calculated for C32H39NO5Na:540.66([M+Na]+),Found:541.3。
步骤三：合成产物4，路线如下：
在一圆底烧瓶中加入3(320.7m g,0.62mmol)，在氮气保护下加入5mL二氯甲烷。在冰浴下滴加入N,N-二异丙基乙基胺和2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，冰浴中反应2h，用二氧化硅柱子分离纯化，核磁和质谱表征，如图1～3。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.41-6.81(m,13H),5.63(s,1H),5.30(s,1H),3.79(s,6H),3.72-3.55(m,6H),3.25-3.07(m,4H),2.54(m,2H),1.95(s,3H),1.86(m,1H),1.49(m,2H),1.26(m,2H),1.17(d,6H),1.12(d,6H).31P NMR(202MHz,CDCl3)δ147ppm.ESI-MS Calculated for C41H56N3O6PNa:740.87([M+Na]+),Found:741.8。
实施例2甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化。
以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成DNA序列strand A，最后在5′端修饰甲基丙烯基亚磷酰胺单体。具体合成的序列如下：5’-X AAA ATC ACA GAT GAG T-3’，其中x为产物4。合成结束后，将上述CPG转移至2ml洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.4mL甲胺∶氨水=1∶1的溶液，在65℃下氨解30min，将DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清。向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱进行酒精沉淀。酒精沉淀完毕后，在14,000rpm的转速下离心10min弃上清。将得到的粗产物溶解在0.1mol/L的醋酸三乙胺（TEAA）中，使用反相高效液相色谱仪进行纯化。将通过反相-HPLC纯化后的产品进行真空干燥，溶于超纯水后使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度，根据DNA的消光系数计算出其相应的物质的量和浓度值。定量后真空浓缩，并用MADLI-TOF表征其分子量，如图4。
实施例3线状高分子DNA聚合物的制备。
将分离纯化后的strand A溶解于超纯水中，配制成DNA水溶液。分别配制10%的过硫酸铵和5%的N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED），即0.05g过硫酸铵溶解至0.5ml超纯水和25μlTEMED溶解至0.5ml超纯水。将终浓度为1mM DNA与终浓度4%的丙烯酰胺配成混合液，放入真空干燥器中抽真空除气10min。加入终浓度1.4%的新鲜配制的引发剂（过硫酸铵）和加速剂（TEMED），混匀后将反应体系置于真空干燥器中，室温条件下抽真空反应15min，得到strand A的线状高分子DNA聚合物。
实施例4线状高分子DNA聚合物的电泳分析。
取0.9g琼脂糖粉末溶解于1×TAE缓冲液中，微波加热2min，加入3uL核酸染料Genefinder，然后倒入琼脂糖凝胶板中，放置30min，将样品用移液器加入到凝胶孔中，至于电泳槽中，加上100V电压30min后，用凝胶成像仪成像拍照。其中1×TAE缓冲液配制如下：称量242g三羟基甲胺和37.2g二水合乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）置于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。加入57.1ml的醋酸，充分搅拌。加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。凝胶成像仪分析如图5所示，其中最左边为DNAladder，最大分子量为10000bp，第二和第三个孔分别为实施例5中聚合的线性高分子DNA聚合物。
Claims (7)
1.一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体，其特征在于其分子式为C(38+n1)H(50+2n1)N3O6P，其结构式如下：
其中，n1为CH2基团的个数，n1＝1～3。
2.如权利要求1所述一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将甲基丙烯酸、化合物A、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑按摩尔比1∶1∶1.2∶1.2混合后反应，再用硅胶柱层析分离纯化，得acrylic-OH2；所述化合物A的结构式为：其中，n1＝1,2,3；
2)在氮气保护下，将acrylic-OH2、4-二甲氨基吡啶和吡啶混合，得溶液A；将4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷和二氯甲烷混合，得溶液B；在冰水浴的条件下将溶液B加入溶液A中反应后，用水和乙酸乙酯对产物进行萃取，干燥，并用硅胶柱层析得到acylic-DMT，所述acrylic-OH2、4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、4-二甲氨基吡啶、吡啶和二氯甲烷的摩尔比为1∶1.2∶0.1∶6∶2；
3)在氮气保护下，将acylic-DMT和N,N-二异丙基乙基胺混合后，用二氯甲烷溶解，再加入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应后用硅胶柱层析分离，得甲基丙烯基亚磷酰胺单体，所述acylic-DMT、2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺、N,N-二异丙基乙基胺的摩尔比为1∶1.2∶2.8。
3.如权利要求2所述一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体的合成方法，其特征在于在步骤1)中，所述反应的时间为12～24h。
4.如权利要求2所述一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体的合成方法，其特征在于在步骤2)中，所述反应的时间为24h。
5.如权利要求2所述一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体的合成方法，其特征在于在步骤2)中，所述水和乙酸乙酯的体积比为1∶1。
6.如权利要求2所述一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体的合成方法，其特征在于在步骤3)中，所述反应的温度为0℃，反应的时间为4h。
7.如权利要求1所述一种甲基丙烯基亚磷酰胺单体的合成路线如下：
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