CN1904042A - 辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法，属于酶的化学修饰领域。本发明公开了一种具有核壳结构的纳米高分子生物催化颗粒，核心是辣根过氧化物酶，外壳是交联的高分子材料，核壳之间有化学键连接，具有生物催化氧化活性高、热稳定性强、耐有机溶剂性能强的特点，在免疫测定、有机合成、生物修复等领域具有广泛的应用前景。本发明还公开了上述颗粒的制备方法，即先在辣根过氧化物酶表面通过酶修饰剂引入碳碳双键基团，然后以含有碳碳双键的烯基单体为原料，通过自由基聚合得到。该方法具有简单温和、粒径纳米尺度高度可控、易于工业实施放大的特点。

Description

辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种核心为辣根过氧化物酶的纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法，属于酶的化学修饰领域。

背景技术

辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，简称HRP)是目前最重要、应用最为广泛的过氧化物酶，它可以在过氧化氢等的存在下高效催化各类酚类或芳香胺类等具有还原性物质的氧化，是生物氧化过程的关键酶制剂。因为辣根过氧化物酶反应条件温和、活性高、来源容易、成本较低，在包括有机合成、生物转化、相关酶检测、发光检测、免疫测定、废水处理、临床化学、环境化学和食品工业等领域有着广泛的用途。但天然辣根过氧化物酶的稳定性包括热稳定性、有机相稳定性、储存稳定性，是主要的限制性因素，难以满足实际应用的需求。在37℃，辣根过氧化物酶活性的半衰期为10小时左右，在65℃，其活性的半衰期仅为5分钟左右，而在一些强极性的有机溶剂和水溶液的混合体系中，其稳定性甚至更差。因此为了进一步开拓辣根过氧化物酶的应用水平，采取工程手段提高辣根过氧化物酶的稳定性具有重要意义。

化学修饰方法因其成本低、方法简便，在生物酶的改造中得到了广泛的应用。在辣根过氧化物酶的改造中，化学修饰方法与添加剂、生物定向进化等方法相比具有明显优势。添加剂方法需要的添加剂加入量高，同时对实际体系会引入新的杂质和干扰，应用较少；而生物定向进化的方法，由于稳定性提高效果有限、无法解决工程辣根过氧化物酶大量廉价生产的问题，也没有得到广泛的重视；而目前的小分子化学修饰方法由于稳定性效果提高仍然不能够令人满意。因此开发一种具有高稳定性、高生物催化活性、易于实施、粒径可控的辣根过氧化物酶的纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法具有广阔的市场和重大的价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种辣根过氧化物酶的纳米高分子生物催化颗粒，以解决现有的辣根过氧化物酶热稳定差、耐有机溶剂能力低的问题，对于进一步开拓辣根过氧化物酶的应用水平具有重要意义。

本发明的另一目的是提供一种辣根过氧化物酶的纳米高分子生物催化颗粒的制备方法，以解决现有辣根过氧化物酶小分子化学修饰稳定性效果提高不大和固定化辣根过氧化物酶粒径大引入较高的传质阻力的问题。采用该制备方法可以实现酶与外核交联的高分子为共价连接，辣根过氧化物酶热稳定性和有机溶剂稳定性改善显著。

本发明的方案如下：

本发明提供了一种辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒，该颗粒具有辣根过氧化物酶生物催化活性，为核壳结构，核心为辣根过氧化物酶，外壳为交联的高分子材料，核壳之间有化学键连接；该颗粒以下列物质为原料，通过自由基聚合制备得到；

辣根过氧化物酶：以重量计为10份，

酶修饰剂：以重量计为2～40份，

烯基单体：以重量计为20～200份，

引发剂：以重量计为0.5～20份。

本发明还提供了一种制备辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒的自由基聚合制备方法，该方法以辣根过氧化物酶、酶修饰剂、烯基单体和引发剂为原料，其中各成分的含量为：

辣根过氧化物酶：以重量计为10份，

酶修饰剂：以重量计为2～40份，

烯基单体：以重量计为5～100份，

引发剂：以重量计为0.5～20份；

具体工艺步骤如下：

1)将上述配比的辣根过氧化物酶与酶修饰剂加入pH在7～10之间的缓冲溶液中，在4～35℃条件下反应0.5～6小时；

2)将步骤1)得到的混合物加入到有机溶剂水溶液中，加入上述配比的烯基单体重量的10～50％；

3)加入上述配比的引发剂，在10～35℃下反应0.5～2小时；

4)加入剩下的烯基单体，在10～35℃下继续反应1～6小时；

5)产物经过透析后，冻干得到核心为辣根过氧化物酶，外壳为交联的高分子材料，核壳之间有化学键连接的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒。

在本发明中，所述的烯基单体是至少一种单烯基单体和至少一种多烯基单体类物质的混合物。所述单烯基单体可以选自丙烯酰胺、丙烯酸钠、甲基丙烯酸钠、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯中的一种或几种的混合物。所述多烯基单体可以选自N，N’-甲叉双丙烯酰胺、顺丁二烯、三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一种或几种的混合物。

在本发明中，所述的酶修饰剂是分子结构中至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与辣根过氧化物酶的氨基酸发生反应形成化学键接的物质。所述酶修饰剂可以选自丙烯酸琥珀酰亚胺酯、丙烯酰氯、衣康酸酐一种或几种的混合物。

在本发明中，所述的引发剂是在10～35℃条件下，具有20～35kcal/mol解离能并能产生自由基导致烯基单体聚合的过硫酸盐类物质或过氧化物类物质。所述引发剂可以选自过硫酸钾、过硫酸胺、过氧化氢的一种或几种与亚铁盐、亚硫酸盐、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、哌啶、N-甲基吗啉一种或几种组成的复合引发体系。

在本发明中，所述缓冲溶液为磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、硼酸、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或几种的水溶液。

在本发明中，所述的有机溶剂水溶液是含有二甲基亚砜、甲醇、二氧六环、乙腈、乙醇、丙酮中的一种或几种有机溶剂的水溶液，其中，有机溶剂的重量百分比在0.5～8％范围内。

本发明所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒具有较高的生物催化氧化活性，由于酶与外核高分子为共价连接，外壳的高分子不会出现脱落的问题，对辣根过氧化物酶的物理化学性质的改善更显著。交联的高分子外壳大大强化了辣根过氧化物酶的结构，从而有效的阻止了高温下的辣根过氧化物酶的结构热振动导致的失活问题，和以往的小分子化学修饰相比，对辣根过氧化物酶的稳定效果更好。同时亲水性的外壳可以有效的为极性有机溶剂水溶液中辣根过氧化物酶保存结构必需水，这些结构必需水有效的保证了辣根过氧化物酶的活性。并且由于粒径处于纳米范围、壳层薄至几个到几十纳米，因此对底物传质无明显的影响。综上所述，本发明所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒具有活性高、热稳定性强、耐有机溶剂能力强、粒径小、比表面积高、无传质扩散阻力特点。这种纳米高分子生物催化颗粒形式的辣根过氧化物酶作为一种高性能的纳米酶制剂，在纳米科学和生物催化领域具有广泛的应用前景。

本发明所述制备方法的核心在于制备过程如何保持辣根过氧化物酶的活性，同时又能够提供较高的制备收率。因此本发明在辣根过氧化物酶表面通过酶修饰剂引入碳碳双键基团阶段和自由基聚合阶段使用了温度控制，保证制备温度发生在4-35℃，可以尽量避免辣根过氧化物酶在制备过程中的失活问题，制备过程几乎不会引起辣根过氧化物酶的失活，因此辣根过氧化物酶的活性丧失少；同时为了保证在较低的制备温度下自由基聚合可以得到较高的收率，使用了复合引发体系，为了保证自由基聚合主要发生在酶表面，使用了有机溶剂水溶液作为自由基聚合环境，保证自由基聚合主要发生在酶表面。同时该制备方法可以制备100纳米以下尺度的制备辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒，避免了以往的酶固定化过程中高的传质阻力，方法简便、易于工业实施和放大。

附图说明

图1为利用高分辨率透射电镜观察本发明所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒形态图。

图2为本发明所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒酶和天然辣根过氧化物酶的热稳定性对比图。

图3为本发明所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒酶和天然辣根过氧化物酶在三种有机溶剂15％的水溶液中，60℃下的稳定性对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法予以进一步的说明，但不限制本发明。实施例中用于化学修饰的辣根过氧化物酶来源于商品酶或来自于植物辣根的提取物。

实施例1：原料为辣根过氧化物酶以重量计为10份，酶修饰剂为丙烯酸琥珀酰亚胺酯以重量计为2份，烯基单体为20份丙烯酰胺和5份甲叉双丙烯酰胺的混合物，合计25份，引发剂为2份过硫酸胺和3份N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的混合物，合计5份。

将上述辣根过氧化物酶与酶修饰剂加入pH为9的100mM硼酸缓冲溶液中，在25℃条件下反应1小时，用水透析除去修饰剂和硼酸盐。将得到的混合物加入到2％的二甲基亚砜水溶液中，加入上述烯基单体量的50％，温度保持为25℃，磁力搅拌，加入上述引发剂，反应0.5小时，加入剩余的烯基单体，温度保持为25℃，继续反应2小时，然后利用去离子水透析24小时，冻干即可得到辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒。该颗粒具有辣根过氧化物酶生物催化活性，为核壳结构，核心为辣根过氧化物酶，外壳为交联的高分子材料，核壳之间有化学键连接。本领域的技术人员可以理解，所述的辣根过氧化物酶生物催化活性是指在过氧化物存在条件下氧化具有还原性的物质的能力。

以四甲基连苯胺作为底物测量纳米高分子生物催化颗粒的生物催化活性总收率为95％。聚合反应收率为92％。

利用高分辨率透射电镜观察上述辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒的形态，结果如图1所示，平均粒径为18nm，粒径分布较为均匀。10分钟不同温度下残余活性如图2，其热稳定性和天然辣根过氧化物酶的热稳定性对比从42℃提高到70℃，大约提高28℃。其和天然辣根过氧化物酶的在三种有机溶剂15％的水溶液中的60℃下稳定性对比结果如图3所示，天然辣根过氧化物酶在60℃，10分钟条件下几乎完全丧失活性，而辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒在三种不同的有机溶剂水溶液中仍保持了80％左右的活性。

实施例2：原料为辣根过氧化物酶以重量计为10份，酶修饰剂为丙烯酰氯以重量计为20份，烯基单体为60份丙烯酰胺和15份甲叉双丙烯酰胺的混合物，合计75份，引发剂为5份过硫酸胺和10份N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的混合物，合计15份。

将上述辣根过氧化物酶与酶修饰剂加入pH为7的100mM磷酸钠缓冲溶液中，在4℃条件下反应2小时，用水透析除去修饰剂和磷酸盐。将得到的混合物加入到5％的乙腈水溶液中，加入烯基单体量的20％，温度保持为25℃，磁力搅拌，加入引发剂，反应0.5小时，加入剩余的烯基单体，温度保持为25℃，继续反应3小时，然后利用去离子水透析24小时，冻干即可得到辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒。以四甲基连苯胺作为底物测量纳米高分子生物催化颗粒的生物催化活性总收率为93％，聚合反应收率为90％，而产物粒径为35～40nm。

实施例3：将实施例1中的烯基单体改为20份丙烯酸钠和5份甲叉双丙烯酰胺的混合物，引发剂的量增加为10份的过硫酸胺和10份的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺引发剂的混合物，其余配方和步骤与实施例1相同，此时得到产物的活性收率、稳定性、聚合反应收率与实施例1相当，而产物粒径为14～18nm。

实施例4：将实施例1中的烯基单体改为40份丙烯酸羟乙酯和10份甲叉双丙烯酰胺，自由基聚合反应温度为35℃，第一次加入烯基单体量为30％，引发剂为10份的过硫酸钾和5份的亚硫酸氢钠，其余配方和步骤与实施例1相同，此时得到产物活性收率为91％，产物的稳定性、聚合反应收率与实施例1相当，而产物粒径为20～25nm。

实施例5：将实施例2中的酶修饰剂改为10份衣康酸酐，烯基单体为80份的丙烯酰胺和20份的三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯的混合物，自由基反应溶液为6％的二氧六环，反应温度为35℃，引发剂为10份的过硫酸钾和5份的亚硫酸氢钠的混合物，其余配方和步骤与实施例2相同，此时得到产物的稳定性、活性收率与聚合反应收率与实施例2相当，而产物粒径为45～55nm。

实施例6：将实施例1中的烯基单体改为40份丙烯酸钠、40份丙烯酰胺和20份甲叉双丙烯酰胺的混合物，自由基聚合反应温度为10℃，两步聚合反应时间分别为1小时和5小时，其余配方和步骤与实施例2相同，此时得到产物的稳定性、活性收率、聚合反应收率与实施例2相当，而产物粒径为35～45nm。

比较例1：制备方法同实施例1，但不加入甲叉双丙烯酰胺，其余配方和步骤与实施例1相同，产物聚合收率只有65％，产物稳定性与实施例1相比很差。

比较例2：制备方法同实施例2，但将单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺一次性加入，得到产物粒径不规则，产物聚合收率较低。

比较例3：制备方法同实施例1，但自由基聚合在45℃下进行，此时得到产物的活性收率仅45％。

本发明可用其它的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含有和范围内的任何改变，都应当认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (10)

1、辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒，其特征在于：具有辣根过氧化物酶生物催化活性的核壳结构的纳米颗粒，核心为辣根过氧化物酶，外壳为交联的高分子材料，核壳之间有化学键连接；该颗粒以下列物质为原料，通过自由基聚合制备得到；

辣根过氧化物酶：以重量计为10份，

酶修饰剂：以重量计为2～40份，

烯基单体：以重量计为20～200份，

引发剂：以重量计为0.5～20份。

2、按照权利要求1所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒，其特征在于：所述的烯基单体是至少一种单烯基单体和至少一种多烯基单体类物质的混合物。

3、按照权利要求1所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒，其特征在于：所述的酶修饰剂是分子结构中至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与辣根过氧化物酶的氨基酸发生反应形成化学键接的物质。

4、按照权利要求1所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒，其特征在于：所述的引发剂是在10～35℃条件下，具有20～35kcal/mol解离能并能产生自由基导致烯基单体聚合的过硫酸盐类物质或过氧化物类物质。

5、权利要求1所述的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒的自由基聚合制备方法，其特征在于：该方法以辣根过氧化物酶、酶修饰剂、烯基单体和引发剂为原料，其中各成分的含量为：

辣根过氧化物酶：以重量计为10份，

酶修饰剂：以重量计为2～40份，

烯基单体：以重量计为5～100份，

引发剂：以重量计为0.5～20份；

具体工艺步骤如下：

1)将上述配比的辣根过氧化物酶与酶修饰剂加入pH在7～10之间的缓冲溶液中，在4～35℃条件下反应0.5～6小时；

2)将步骤1)得到的混合物加入到有机溶剂水溶液中，加入上述配比的烯基单体重量的10～50％；

3)加入上述配比的引发剂，在10～35℃下反应0.5～2小时；

4)加入剩下的烯基单体，在10～35℃下继续反应1～6小时；

5)产物经过透析后，冻干得到核心为辣根过氧化物酶，外壳为交联的高分子材料，核壳之间有化学键连接的辣根过氧化物酶纳米高分子生物催化颗粒。

6、按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的烯基单体是至少一种单烯基单体和至少一种多烯基单体类物质的混合物。

7、按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的酶修饰剂是分子结构中至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与辣根过氧化物酶的氨基酸发生反应形成化学键接的物质。

8、按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的引发剂是在10～35℃条件下，具有20～35kcal/mol解离能并能产生自由基导致烯基单体聚合的过硫酸盐类物质或过氧化物类物质。

9、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、硼酸、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或几种的水溶液。

10、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂水溶液是含有二甲基亚砜、甲醇、二氧六环、乙腈、乙醇、丙酮中的一种或几种有机溶剂的水溶液，其中，有机溶剂的重量百分比在0.5～8％范围内。

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