CN103937778A - 一种固定化脂肪酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种固定化脂肪酶的方法，以氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子作为载体通过共价结合将脂肪酶固定在其表面。具体分为两种方法：一是先利用亲核反应将戊二醛一端醛基与氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子表面的氨基相结合后，再将固定在磁性Fe3O4C纳米粒子表面的戊二醛另一端醛基与脂肪酶的氨基相结合；二是利用丁二酸酐将磁性Fe3O4C纳米粒子表面的氨基转化为羧基，再经物质的量比为1:0.5~2的N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合物活化作用后，利用酰胺化反应在Fe3O4C纳米粒子表面固定脂肪酶。本发明的制备方法简单、温和，脂肪酶固载量多，且固定化脂肪酶酶活和酶活回收率高、稳定性好、可简便地循环再使用，有效降低实际生产成本，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术
脂肪酶是一类应用广泛的酰基水解酶，它能催化酯类的水解、醇解、合成和交换等反应，现已广泛应用于制药、化工、食品加工、污水处理等行业。与传统工业催化剂相比，脂肪酶也存在许多缺陷，如：提取纯化过程繁琐，价格昂贵；对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不稳定；在反应中易失活，反应后不能被回收再利用；脂肪酶中常含有杂蛋白及有色物质，影响反应产物的分离纯化。为了克服脂肪酶的上述不足，人们将游离脂肪酶与不溶性载体联结起来，使之成为固定化脂肪酶，实现了脂肪酶的回收再利用。因此，脂肪酶催化技术的工业化很大程度上取决于脂肪酶的固定化技术的发展。
Fe3O4纳米粒子是一种重要的磁性分离材料，它具有特殊的磁响应性，可借助外磁场从反应体系中快速简便地富集、分离、回收固定化生物酶，甚至能利用外部磁场控制Fe3O4纳米粒子的运动方式和方向，避免传统的搅拌对酶蛋白结构的机械损伤，有利于提高酶制剂的稳定性，在生物工程领域具有极大的应用价值。尽管已有磁性Fe3O4、Fe3O4SiO2、Fe3O4chitosan纳米粒子固定脂肪酶的文献报道（Chem. Asian J., 2013, 8, 1447-1454；J. Mater. Chem., 2012, 22, 8385-8393；Catal. Commun., 2011, 12, 717-720.），但目前文献报道磁性纳米粒子固定脂肪酶的脂肪酶在固定化过程中损失部分催化活性，导致固定化脂肪酶酶活的回收率小于100%，且其固定化制备过程不温和，不能满足工业化生产需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子为载体固定脂肪酶的方法，该方法简单、温和，脂肪酶的固载量多，且固定化脂肪酶酶活高和酶活回收率高、稳定性好、可简便地循环再使用。
本发明固定化脂肪酶的制备方法，使用氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子作为载体，通过共价结合将脂肪酶固定在其表面。
上述方法包括2种具体的实现方式。
方式一：先利用亲核反应将戊二醛一端的醛基与氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子表面的氨基相结合后，再将固定在磁性Fe3O4C纳米粒子表面的戊二醛另一端的醛基与脂肪酶的氨基相结合。
具体包括以下步骤：
1）将氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子加入到戊二醛溶液中，于25~45 ℃条件下反应3~24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
2）将步骤1）所得的产品加入到脂肪酶溶液中，于25~35 ℃条件下反应0.5~3 h，所得产品经磁分离、洗涤即可。
所述的氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子与戊二醛质量比为1:1~5；所述的氨基官能化磁性Fe3O4C纳米粒子与脂肪酶的质量比为1:0.1~0.5。
所述的戊二醛溶液的浓度为10-100 g/L。
方式二：利用羧化试剂将磁性Fe3O4C纳米粒子表面的氨基转化为羧基，再经活化剂的作用后，利用酰胺化反应在Fe3O4C纳米粒子表面固定脂肪酶，所述的羧化剂为丁二酸酐，所述的活化剂为物质的量比为1:0.5~2的N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合物。
具体包括以下步骤:
1）将丁二酸酐溶于甲苯内，再加入氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子，在氮气气氛中于70~100 ℃条件下反应4~24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
2）将N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺溶于二氯甲烷内，将步骤1）所得的产品加入到其中，于25~50 ℃条件下反应2~24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
3）将步骤2）所得的产品加入到脂肪酶溶液中，于25~35 ℃条件下反应0.5~3 h，所得产品经磁分离、洗涤即可。
所述的氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子与丁二酸酐质量比为1:1~5；所述的氨基官能化磁性Fe3O4C纳米粒子与N,N-二环己基碳二亚胺的质量比为1:1~5；所述的氨基官能化磁性Fe3O4C纳米粒子与脂肪酶的质量比为1:0.1~0.5。
本发明提供的固定化脂肪酶的制备方法中，所述的脂肪酶溶液由Sigma或阿拉丁公司购买的来源于皱褶假丝酵母或猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸缓冲溶液配置而成。
本发明提供的固定化脂肪酶的制备方法中，所述的氨基功能化的磁性Fe3O4C纳米粒子由下列方法所合成：
称取2 mmol乙酰丙酮铁加入到60 mL聚乙二醇200中，在氮气气氛中于270 ℃反应3 h后，自然冷却至室温，加入4 mmol葡萄糖，超声5 min，获得混合溶液；将上述混合溶液转移到热压反应釜中，加入1 mL氨水（NH3质量百分含量，28%）后，旋紧热压反应釜，于240 ℃反应24 h；待反应结束后，自然冷却到室温，所得沉淀经磁分离、洗涤、干燥后得氨基功能化的磁性Fe3O4C纳米粒子。
本发明有益效果：
1. 利用氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子固定脂肪酶的制备方法简单，条件温和，经济环保；
2. 磁性Fe3O4C纳米粒子在固定化过程中能稳定脂肪酶的活性结构，因而所得到磁性Fe3O4C纳米粒子固定化脂肪酶的酶活高，且固定化脂肪酶酶活回收率达到134%~172%；
3. 磁性Fe3O4C纳米粒子表面有丰富的氨基，可固载大量脂肪酶，因而脂肪酶的固载量高；
4．脂肪酶通过共价结合固定在磁性Fe3O4C纳米粒子表面，因而固定化脂肪酶的稳定性好，且可循环使用次数多，循环使用10次后，固定化脂肪酶的酶活仍然能保持50%以上；
5．固定化脂肪酶具有磁响应性，可借助外磁场从反应体系中快速简便地富集、分离、回收固定化脂肪酶，可有效降低实际生产成本，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为氨基功能化的磁性Fe3O4C纳米粒子的高分辨透射电子显微镜检测图；(a)为原始图，（b）为局部放大图；
图2为固定化脂肪酶与游离脂肪酶的热稳定性图。在图2中，横坐标为时间Time (h)，纵坐标为相对活性Relative activity (%)；固定化脂肪酶和游离脂肪酶均在45 ℃环境中保持相同时间（0~10 h）；
图3为固定化脂肪酶的循环使用效果图。在图3中，横坐标为循环次数Number of cycles，纵坐标为相对活性Relative activity (%)。
具体实施例
下面结合具体详细实施例对本发明采用的固定化方法及其所带来的效果做进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于此。
本发明提供的固定化脂肪酶的制备方法中，所述的氨基功能化的磁性Fe3O4C纳米粒子由下列方法所合成：
称取2 mmol乙酰丙酮铁加入到60 mL聚乙二醇200中，在氮气气氛中于270 ℃反应3 h后，自然冷却至室温，加入4 mmol葡萄糖，超声5 min，获得混合溶液；将上述混合溶液转移到热压反应釜中，加入1 mL氨水（NH3质量百分含量，28%）后，旋紧热压反应釜，于240 ℃反应24 h；待反应结束后，自然冷却到室温，所得沉淀经磁分离、洗涤、干燥后得氨基功能化的磁性Fe3O4C纳米粒子，图1为所制得氨基功能化的磁性Fe3O4C纳米粒子的高分辨透射电子显微镜检测图。
实施例1
步骤1. 将来源于皱褶假丝酵母的的冻干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸缓冲溶液配制为1 mg/mL的脂肪酶溶液，至于4 ℃冰箱中保存备用；
步骤2.称取100 mg氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子，加入到5 ml 100g/L的戊二醛溶液中，于45 ℃条件下反应3 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
步骤3. 取10 mL步骤1所配置的脂肪酶溶液，将步骤2所得的产品加入到其中，于25 ℃条件下反应3 h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得所述固定化脂肪酶。
检测所述产品中脂肪酶在磁性Fe3O4C纳米粒子上的固载量为192.7 mg/g；所述的固定化脂肪酶的酶活为1895.6 U/g；所述的固定化脂肪酶的酶活回收率为164%；在45℃条件下放置10 h后，如图2所示，所述的固定化脂肪酶的活性仍能保持71.5%，是游离脂肪酶的2.3倍；如图3所示，所述的固定化脂肪酶循环使用10次后，磁性Fe3O4C纳米粒子固定脂肪酶的活性仍能保持50.1%。
实施例2
步骤1. 将来源于猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸缓冲溶液配制为1 mg/mL的脂肪酶溶液，至于4 ℃冰箱中保存备用；
步骤2.称取100 mg氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子，加入10 ml 10g/L的戊二醛溶液中，于25 ℃条件下反应24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
步骤3. 取50 mL步骤1所配置的脂肪酶溶液，将步骤2所得的产品加入到其中，于35 ℃条件下反应0.5 h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得所述固定化脂肪酶。
检测所述产品中胰脂肪酶在磁性Fe3O4C纳米粒子上的固载量为68.3 mg/g；所述的固定化脂肪酶的酶活为3839 U/g；所述的固定化脂肪酶的酶活回收率为172%；所述的固定化脂肪酶循环使用8次后，磁性Fe3O4C纳米粒子固定脂肪酶的活性仍能保持62.8%。
实施例3、
步骤1. 将来源于皱褶假丝酵母的的冻干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸缓冲溶液配制为1 mg/mL的脂肪酶溶液，至于4 ℃冰箱中保存备用；
步骤2. 将1000 mg丁二酸酐溶于100 mL甲苯中，称取200 mg磁性Fe3O4C纳米粒子，在氮气气氛中于70 ℃条件下反应24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
步骤3. 将1000 mg N,N-二环己基碳二亚胺、279 mg N-羟基丁二酰亚胺溶于5 ml二氯甲烷中，将步骤2所得的产品加入到其中，于25 ℃条件下反应24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
步骤4. 取20 mL步骤1所配置的脂肪酶溶液，将步骤3所得的产品加入到其中，于25 ℃条件下反应3 h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得所述固定化脂肪酶。
检测所述产品中脂肪酶在磁性Fe3O4C纳米粒子上的固载量为163.2 mg/g；所述的固定化脂肪酶的酶活为1446 U/g；所述的固定化脂肪酶的酶活回收率为134%；所述的固定化脂肪酶循环使用8次后，磁性Fe3O4C纳米粒子固定脂肪酶的活性仍能保持61.8%。
实施例4、
步骤1来源于猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸缓冲溶液配制为1 mg/mL的脂肪酶溶液，至于4 ℃冰箱中保存备用；
步骤2. 将200 mg丁二酸酐溶于100 mL甲苯中，称取200 mg磁性Fe3O4C纳米粒子，在氮气气氛中于100 ℃条件下反应4 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
步骤3. 将200 mg N,N-二环己基碳二亚胺和223 mg N-羟基丁二酰亚胺溶于5 ml二氯甲烷中，将步骤3所得的产品加入到其中，于50 ℃条件下反应2 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
步骤4. 取100 mL步骤1所配置的脂肪酶溶液，将步骤3所得的产品加入到其中，于35 ℃条件下反应0.5 h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得所述固定化脂肪酶。
检测所述产品中胰脂肪酶在磁性Fe3O4C纳米粒子上的固载量为95 mg/g；所述的固定化脂肪酶的酶活为3312 U/g；所述的固定化脂肪酶的酶活回收率为169%；所述的固定化脂肪酶循环使用10次后，磁性Fe3O4C纳米粒子固定脂肪酶的活性仍能保持52.3%。
Claims (8)
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，使用氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子作为载体，通过共价结合将脂肪酶固定在其表面。
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述的通过共价结合将脂肪酶固定在氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子表面的具体方法为：先利用亲核反应将戊二醛一端的醛基与氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子表面的氨基相结合后，再将固定在磁性Fe3O4C纳米粒子表面的戊二醛另一端的醛基与脂肪酶的氨基相结合。
3.根据权利要求2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）将氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子加入到戊二醛溶液中，于25~45 ℃条件下反应3~24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
2）将步骤1）所得的产品加入到脂肪酶溶液中，于25~35 ℃条件下反应0.5~3 h，所得产品经磁分离、洗涤即可。
4.根据权利要求3所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述的氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子与戊二醛质量比为1:1~5，所述的氨基官能化磁性Fe3O4C纳米粒子与脂肪酶的质量比为1:0.1~0.5。
5.根据权利要求3所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述的戊二醛溶液的浓度为10-100 g/L。
6.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述的通过共价结合将脂肪酶固定在氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子表面的具体方法为：利用羧化试剂将氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子表面的氨基转化为羧基，再经活化剂的作用后，利用酰胺化反应在Fe3O4C纳米粒子表面固定脂肪酶，所述的羧化试剂为丁二酸酐，所述的活化剂为物质的量比为1:0.5~2的N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合物。
7.根据权利要求6所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1）将丁二酸酐溶于甲苯内，再加入氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子，在氮气气氛中于70~100 ℃条件下反应4~24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
2）将N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺溶于二氯甲烷内，将步骤1）所得的产品加入到其中，于25~50 ℃条件下反应2~24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
3）将步骤2）所得的产品加入到脂肪酶溶液中，于25~35 ℃条件下反应0.5~3 h，所得产品经磁分离、洗涤即可。
8.根据权利要求7所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的氨基官能化的磁性Fe3O4C纳米粒子与丁二酸酐质量比为1:1~5，所述的氨基官能化磁性Fe3O4C纳米粒子与N,N-二环己基碳二亚胺的质量比为1:1~5；所述的氨基官能化磁性Fe3O4C纳米粒子与脂肪酶的质量比为1:0.1~0.5。
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