CN110283813A - β-葡萄糖苷酶的固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物酶的固定化技术领域，具体涉及一种β‑葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：制备纳米碳化硅载体；将β‑葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β‑葡萄糖苷酶；将所述固定化β‑葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅@β‑葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体。本发明提高了β‑葡萄糖苷酶的活性，并解决β‑葡萄糖苷酶重复利用率低及酶活保留率低的技术难题。

Description

β-葡萄糖苷酶的固定化方法
技术领域
本发明属于生物酶的固定化技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，主要作用于β-(1,4)糖苷键，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶还能够作用于糖基原子团与芳香基或烃基之间的糖苷键,使相应的糖苷类化合物降解，生成配基和葡萄糖。β-葡萄糖苷酶的另一主要应用是用于降解纤维素，通过破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖。此外，在食品开发上，其作为特殊的风味酶应用在果汁、茶汁、果酒等制备上，能起到较好的增香效果。
纳米碳化硅是由微小尺度的金刚石晶粒组成的，尺度在(1～100)纳米以内。纳米碳化硅保留了金刚石在力学方面的优异性能，同时，纳米尺度所带来的较大的比表面积和高表面活性能等特点；此外，纳米碳化硅高表面活性，松装密度低，具有极好的力学，热学，电学和化学性能，因此在生物固载材料方面具有较好的发展前景。
磁性纳米材料在光、电、热、磁、敏感特性等方面表现优异的性能，已被广泛应用于磁流体、催化剂、生物工程和生物医学和环境保护等领域。其中，Fe3O4磁性纳米粒子具有超顺磁性、小尺寸效应、表面效应、量子隧道效应等优良特性，同时，Fe3O4磁性材料粒径小且分布窄、磁性优良、表面性能稳定和生物相容性好。
固定化β-葡萄糖苷酶的性质主要取决于所使用固定化载体材料和固定化方法。吸附法固定化酶的结合不牢，条件变化时酶易脱落；交联法形成的固定化酶颗粒太细，不利于操作使用。共价法在固定时形成共价键，发生的化学反应可能会导致酶部分失去活性，并且成本较高；包埋法仅适用于小分子底物和产物的酶，而且由于底物和产物扩散受阻，酶的反应速率可能受到影响。
为了解决上述问题，本发明结合纳米碳化硅与Fe3O4磁性纳米磁性材料作为酶的固定化材料，提供了一种新的β-葡萄糖苷酶的固定化方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其提高β- 葡萄糖苷酶的活性并解决β-葡萄糖苷酶重复利用率低及酶活保留率低的技术难题。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
制备纳米碳化硅载体；
将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β- 葡萄糖苷酶；
将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅@β- 葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体。
本发明提供的固定化方法，操作简单，制备耗时短，对酶的活性影响小，增强了酶的生化性质。
优选的是，所述制备纳米碳化硅载体包括以下步骤：
在纳米碳化硅原料中，加入双氧水，恒温下搅拌、离心、洗涤至中性、干燥后，得到羟基化的纳米碳化硅原料；
将所述羟基化的纳米碳化硅溶解在醋酸钠溶液中后，超声分散30-150min 后，再与戊二醛溶液混合，震荡、洗涤、干燥后，完成对羟基化的纳米碳化硅的活化，得到纳米碳化硅载体。
纳米碳化硅是小颗粒物质，分散开有利于发生化学反应，另外对所述纳米碳化硅进行羟基化是对纳米碳化硅进行活化，活化后增加的羟基基团才能和戊二醛进行连接；
优选的是，将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶的具体步骤包括：
将所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液(由于游离β- 葡萄糖苷酶的最适pH为4.8，所以醋酸钠缓冲液的pH选择4.8)，超声分散后加入β-葡萄糖苷酶，混合后震荡40-120min，再加入交联剂的水溶液，室温震荡1～5小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶。
再次分散所述纳米碳化硅载体，是因为它作为酶的载体，如果不分散开，那么固定化的时候会聚集成一大块，影响固定化β-葡萄糖苷酶。
优选的是，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为 1:0.2～0.8，所述β-葡萄糖苷酶与所述交联剂的质量比1:0.002～0.06；
优选的是，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.5，所述β-葡萄糖苷酶与所述交联剂的质量比1:0.01～0.04；
优选的是，所述交联剂的水溶液的质量分数为50％，所得混合液中交联剂的质量分数为0.5％～3％。
所述交联剂的用量太少，固定化效率太低，如果交联剂的用量太大，容易过度交联从而降低酶活性，本发明中交联剂的用量保证了纳米碳化硅@β- 葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体的质量。
优选的是，将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体具体包括：
将所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入 Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡30～60分钟，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体。
本发明采用酶交联与纳米材料的自组装技术，当β-葡萄糖苷酶与纳米碳化硅载体形成的聚合体的尺寸远大于磁性四氧化三铁纳米颗粒时，可以通过物理共混法将其赋予磁性，自组装形成纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4纳米颗粒的复合体。
优选的是，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为 1:0.1～0.8，所述Fe3O4纳米颗粒的的粒径为20～80nm。
在上述比例的范围内得到的复合体最适pH值变大，即趋近于弱酸性，最适温度得到了提升，热稳定性更好；复合体的固定化颗粒的粒径更大，易于离心分离且可以借助磁性分离。
优选的是，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4的质量比为1:0.5，所述Fe3O4纳米颗粒的粒径为20nm。
优选的是，所述交联剂选择戊二醛。
本发明的有益效果
1、本发明提供的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其提高了β-葡萄糖苷酶的固载量、耐酸碱性、热稳定性及储存稳定性，尤其是催化活性均有所提升；
2、本发明提供的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其提高了β-葡萄糖苷酶的活性，并解决β-葡萄糖苷酶重复利用率低及酶活保留率低的技术难题；
3、本发明提供的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其操作步骤简单，制备耗时短，对酶的活性影响小，增强了酶的生化性质；
4、本发明提供的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其复合体用于水解水杨苷和纤维二糖，加快其水解速率；
5、本发明提供的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其降低了β-葡萄糖苷酶的使用成本，扩大了β-葡萄糖苷酶的应用范围。
附图说明
图1是本发明所述纳米碳化硅载体FTIR红外监测光谱图；
图2是本发明所述纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体透射电镜图；
图3是本发明70℃时游离的β-葡萄糖苷酶与纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶 @Fe3O4复合体的热稳定性的对比图；
图4是磁性分离纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体反应体系效果图；
图5是本发明所述纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体重复使用后的相对酶活性示意图；
图6是本发明所述的纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体的水解速率对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它组合的存在或添加。
为了有效提高β-葡萄糖苷酶稳定性和使用寿命，初步实现降低β-葡萄糖苷酶的使用成本，本发明结合纳米碳化硅与Fe3O4磁性纳米磁性材料作为酶的固定化材料，提供了一种新的β-葡萄糖苷酶偶联共价法与交联法并自组装磁性材料的固定化技术。
本发明使用的β-葡萄糖苷酶的来源没有具体限制，以下实施例中涉及上的β-葡萄糖苷酶来源与杏仁油。
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
S01制备纳米碳化硅载体包括：在纳米碳化硅原料中，加入双氧水，在恒温下搅拌、离心、洗涤至中性、干燥后，得到羟基化的纳米碳化硅；
对羟基化的纳米碳化硅进行活化，将所述羟基化的纳米碳化硅溶解在醋酸钠溶液中后，超声分散30-150min后，与质量分数为5％戊二醛溶液混合，震荡、洗涤、干燥后，完成对羟基化的纳米碳化硅的活化，得到纳米碳化硅载体，留存备用。
S02将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶包括：将所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后，加入β-葡萄糖苷酶，混合后震荡40-120min，再加入交联剂的水溶液(质量分数为50％)，所得混合液中交联剂的质量分数为 0.5％～3％，将所述混合液室温震荡1～5小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
其中，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.2～0.8，所述β-葡萄糖苷酶与所述交联剂的质量比1:0.002～0.06；
其中，所述交联剂选择戊二醛作为交联剂。
S03将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅 @β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体包括：将所述固定化β-葡萄糖苷酶(具体质量根据β-葡萄糖苷酶的固定化效率来进行计算，M固定化β-葡萄糖苷酶＝(M纳米碳化硅载体+Mβ-葡萄糖苷酶)*固定化效率)分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入粒径为 20～80nm的Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡30～60分钟，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤磁性分离，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体。
其中，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.1～0.8。
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但是本发明的保护范围不仅限于下述的实施例。
实施例1
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
S01制备纳米碳化硅载体包括：称取0.5g的纳米碳化硅粉末(平均粒径 40纳米)原料中，加入80mL浓度为30％的双氧水，磁力搅拌、105℃恒温反应4h、9000rpm离心10min，并用蒸馏水反复洗涤至中性后，在80℃条件下，真空干燥12h后，得到羟基化的纳米碳化硅粉末；采用傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)对纳米碳化硅原料和羟基化的纳米碳化硅粉末进行检测，如图1所示：
纳米碳化硅原料仅含少量羧基羟基等基团，本发明以纳米碳化硅作为固定化材料，需要活化出足够的基团用于连接β-葡萄糖苷酶，所以本发明对样品进行活化(即羟基化)，活化出足够的羟基连接双功能试剂戊二醛。
取0.5g的所述羟基化的纳米碳化硅粉末溶解在pH为4.8的醋酸钠缓冲溶液中后，超声分散60min后连接戊二醛(最终的质量分数为5％)，震荡5h、 9000rpm离心10min，洗涤、然后将沉淀物进行真空干燥后，得到纳米碳化硅载体，留存备用。
S02将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶包括：将12mg所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后，加入6mgβ-葡萄糖苷酶，混合震荡30min后加入戊二醛，使其质量分数为2％，将所述混合液室温震荡5小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
其中，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.5；
S03将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅 @β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体包括：将16.56mg所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入8mg粒径为20nm的Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡50min，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤磁性分离，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体；利用透射电镜对纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体进行检测，如图2所示：通过10nm与200nm分辨率下的扫描图片，能清楚看到酶聚合于复合体外侧，表明成功合成纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体。
对所述复合体进行固定化效率和相对酶活性检测，所得β-葡萄糖苷酶的固定化效率为92％、相对活性为98％。；其中，对于相对酶活性测定，就是测定不同条件下酶的活性，且以百分数表示：将游离β-葡萄糖苷酶作为对照，其活性表示为100％，测定固定化后相同质量β-葡萄糖苷酶的活性，与游离酶活性的比值是相对活性；对于固定化效率测定，即固定化酶的蛋白质量/用于固定化的蛋白质量(通过BCA蛋白试剂盒测定)即可。由于计算公式为现有技术，本发明就不多做公式说明。
其中，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.48。
实施例2
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
S01制备纳米碳化硅载体包括：称取0.5g的纳米碳化硅粉末(平均粒径 40纳米)原料中，加入80mL浓度为30％的双氧水，磁力搅拌、105℃恒温反应4h、9000rpm离心10min，并用蒸馏水反复洗涤至中性后，在80℃条件下，真空干燥12h后，得到羟基化的纳米碳化硅粉末；采用傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)对纳米碳化硅原料和羟基化的纳米碳化硅粉末进行检测，如图1所示：详见实施例1对图1的说明；
对羟基化的纳米碳化硅进行活化，取0.5g的所述羟基化的纳米碳化硅粉末溶解在pH为4.8的醋酸钠缓冲溶液中后，超声分散50min后，与质量分数为5％戊二醛溶液混合，震荡5h、9000rpm离心10min，洗涤、然后将沉淀物进行真空干燥后，得到纳米碳化硅载体，留存备用。
S02将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶包括：将10mg所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后，加入6mgβ-葡萄糖苷酶，混合震荡30min后加入戊二醛，使其质量分数为2％，将所述混合液室温震荡4小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
其中，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.6；
S03将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅 @β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体包括：将14mg所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入10mg粒径为20nm的Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡50min，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤磁性分离，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体；
对所述复合体进行固定化效率和相对酶活性检测，所得β-葡萄糖苷酶的固定化效率为88％、相对活性为93％。
其中，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.71；
实施例3
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
S01制备纳米碳化硅载体包括：称取0.5g的纳米碳化硅粉末(平均粒径 40纳米)原料中，加入80mL浓度为30％的双氧水，磁力搅拌、105℃恒温反应4h、9000rpm离心10min，并用蒸馏水反复洗涤至中性后，在80℃条件下，真空干燥12h后，得到羟基化的纳米碳化硅粉末；采用傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)对纳米碳化硅原料和羟基化的纳米碳化硅粉末进行检测，图1解释见实施例1中对图1的解释；
对羟基化的纳米碳化硅进行活化，取0.5g的所述羟基化的纳米碳化硅粉末溶解在pH为4.8的醋酸钠缓冲溶液中后，超声分散30min后，与质量分数为5％戊二醛溶液混合，震荡5h、9000rpm离心10min，洗涤、然后将沉淀物进行真空干燥后，得到纳米碳化硅载体，留存备用。
S02将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶包括：将10mg所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后，加入4mgβ-葡萄糖苷酶，混合震荡30min后加入戊二醛，使其质量分数为1％，将所述混合液室温震荡3小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
其中，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.4；
S03将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅 @β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体包括：将10.5mg所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入7mg粒径为80nm的Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡30min，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤磁性分离，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体；
同理，所得β-葡萄糖苷酶的固定化效率为75％、相对活性为88％。
其中，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.67。
实施例4
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
S01制备纳米碳化硅载体包括：称取0.5g的纳米碳化硅粉末(平均粒径 40纳米)原料中，加入80mL浓度为30％的双氧水，磁力搅拌、105℃恒温反应4h、9000rpm离心10min，并用蒸馏水反复洗涤至中性后，在80℃条件下，真空干燥12h后，得到羟基化的纳米碳化硅粉末；采用傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)对纳米碳化硅原料和羟基化的纳米碳化硅粉末进行检测；
对羟基化的纳米碳化硅进行活化，取0.5g的所述羟基化的纳米碳化硅粉末溶解在pH为4.8的醋酸钠缓冲溶液中后，超声分散50min后，与质量分数为5％戊二醛溶液混合，震荡5h、9000rpm离心10min，洗涤、然后将沉淀物进行真空干燥后，得到纳米碳化硅载体，留存备用。
S02将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶包括：将8mg所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后，加入3mgβ-葡萄糖苷酶，混合震荡30min后加入戊二醛，使其质量分数为1.5％，将所述混合液室温震荡4小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
其中，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.375；
S03将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅 @β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体包括：将9.35mg所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入5mg粒径为60nm的Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡60min，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤磁性分离，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体；
同理，所得β-葡萄糖苷酶的固定化效率为85％、相对活性为95％。
其中，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.53。
实施例5
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
S01制备纳米碳化硅载体包括：称取0.5g的纳米碳化硅粉末(平均粒径 40纳米)原料中，加入80mL浓度为30％的双氧水，磁力搅拌、105℃恒温反应4h、9000rpm离心10min，并用蒸馏水反复洗涤至中性后，在80℃条件下，真空干燥12h后，得到羟基化的纳米碳化硅粉末；采用傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)对纳米碳化硅原料和羟基化的纳米碳化硅粉末进行检测，如图1所示：
对羟基化的纳米碳化硅进行活化，取0.5g的所述羟基化的纳米碳化硅粉末溶解在pH为4.8的醋酸钠缓冲溶液中后，超声分散50min后，与质量分数为5％戊二醛溶液混合，震荡5h、9000rpm离心10min，洗涤、然后将沉淀物进行真空干燥后，得到纳米碳化硅载体，留存备用。
S02将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶包括：将12mg所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后，加入8mgβ-葡萄糖苷酶，混合震荡45min后加入戊二醛，使其质量分数为3％，将所述混合液室温震荡4小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
其中，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.67；
S03将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅 @β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体包括：将19mg所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入9mg粒径为40nm的Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡60min，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤磁性分离，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体；其中，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.47；
对所述复合体进行固定化效率和相对酶活性检测，所得β-葡萄糖苷酶的固定化效率为95％、相对活性为80％。
实施例6
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
S01制备纳米碳化硅载体包括：称取0.5g的纳米碳化硅粉末(平均粒径 40纳米)原料中，加入80mL浓度为30％的双氧水，磁力搅拌、105℃恒温反应4h、9000rpm离心10min，并用蒸馏水反复洗涤至中性后，在80℃条件下，真空干燥12h后，得到羟基化的纳米碳化硅粉末；采用傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)对纳米碳化硅原料和羟基化的纳米碳化硅粉末进行检测，如图1所示；
对羟基化的纳米碳化硅进行活化，取0.5g的所述羟基化的纳米碳化硅粉末溶解在pH为4.8的醋酸钠缓冲溶液中后，超声分散50min后，与质量分数为5％戊二醛溶液混合，震荡5h、9000rpm离心10min，洗涤、然后将沉淀物进行真空干燥后，得到纳米碳化硅载体，留存备用。
S02将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶包括：将15mg所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后，加入11mgβ-葡萄糖苷酶，混合震荡45min后加入戊二醛，使其质量分数为1％，将所述混合液室温震荡4小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
其中，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.73；
S03将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅 @β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体包括：将20.8mg所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入10mg粒径为50nm的Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡60min，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤磁性分离，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体；
其中，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.48；
对所述复合体进行固定化效率和相对酶活性检测，所得β-葡萄糖苷酶的固定化效率为80％、相对活性为84％。
实施例7
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
S01制备纳米碳化硅载体包括：称取0.5g的纳米碳化硅粉末(平均粒径 40纳米)原料中，加入80mL浓度为30％的双氧水，磁力搅拌、105℃恒温反应4h、9000rpm离心10min，并用蒸馏水反复洗涤至中性后，在80℃条件下，真空干燥12h后，得到羟基化的纳米碳化硅粉末；采用傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)对纳米碳化硅原料和羟基化的纳米碳化硅粉末进行检测，如图1所示：
对羟基化的纳米碳化硅进行活化，取0.5g的所述羟基化的纳米碳化硅粉末溶解在pH为4.8的醋酸钠缓冲溶液中后，超声分散50min后，与质量分数为5％戊二醛溶液混合，震荡5h、9000rpm离心10min，洗涤、然后将沉淀物进行真空干燥后，得到纳米碳化硅载体，留存备用。
S02将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶包括：将8mg所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后，加入2mgβ-葡萄糖苷酶，混合震荡45min后加入戊二醛，使其质量分数为2.5％，将所述混合液室温震荡4小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
其中，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.25；
S03将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅 @β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体包括：将9.5mg所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入3mg粒径为30nm的Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡60min，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤磁性分离，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体；其中，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.32。
所得β-葡萄糖苷酶的固定化效率为95％、相对活性为85％。
实施例8
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，包括以下步骤：
S01制备纳米碳化硅载体包括：称取0.5g的纳米碳化硅粉末(平均粒径 40纳米)原料中，加入80mL浓度为30％的双氧水，磁力搅拌、105℃恒温反应4h、9000rpm离心10min，并用蒸馏水反复洗涤至中性后，在80℃条件下，真空干燥12h后，得到羟基化的纳米碳化硅粉末；采用傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)对纳米碳化硅原料和羟基化的纳米碳化硅粉末进行检测，如图1所示：
对羟基化的纳米碳化硅进行活化，取0.5g的所述羟基化的纳米碳化硅粉末溶解在pH为4.8的醋酸钠缓冲溶液中后，超声分散50min后，与质量分数为5％戊二醛溶液混合，震荡5h、9000rpm离心10min，洗涤、然后将沉淀物进行真空干燥后，得到纳米碳化硅载体，留存备用。
S02将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶包括：将9mg所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后，加入4mgβ-葡萄糖苷酶，混合震荡45min后加入戊二醛，使其质量分数为0.5％，将所述混合液室温震荡4小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
其中，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.45；
S03将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体包括：将9.1mg所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入5mg粒径为70nm的Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡60min，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤磁性分离，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体；其中，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.55。
所得β-葡萄糖苷酶的固定化效率为70％、相对活性为78％。
试验数据如下表1所示：
表1
为说明本发明中β-葡萄糖苷酶的特性，发明人对实施例1得到的纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体(以下简称固定化β-葡萄糖苷酶)进行测试，具体方法如下：
1、动力学参数的测定
将固定化β-葡萄糖苷酶在60℃，pH5.5，底物浓度均为0.5～50mM条件下反应，分别测量米氏常数Km和最大反应速度Vmax。实验测得固定化β- 葡萄糖苷酶对水杨苷与纤维二糖的水解反应都符合米氏方程，其动力学参数如下：以水杨苷为底物时，Km为7.85mM，Vmax为6.89mM/min；以纤维二糖为底物时，Km为1.58mM，Vmax为8.43mM/min。米氏常数表明，固定化β-葡萄糖苷酶对纤维二糖比水杨苷有更高的亲和性。同时，固定化β-葡萄糖苷酶具有比文献报道游离β-葡萄糖苷酶更高的催化活性。
2、热稳定性测定
将游离β-葡萄糖苷酶与固定化β-葡萄糖苷酶放置在70℃，pH＝4.8的醋酸钠缓冲液，每隔半小时测定酶活性。
由图3可知，游离酶在1小时之内几乎失去全部活性，固定化β-葡萄糖苷酶2小时相对酶活性为78％，3小时后仍然保留52％的活性。
3、重复利用率测定
将固定化β-葡萄糖苷酶在60℃，pH＝4.8的醋酸钠缓冲液中与4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pnpg)反应5分钟，磁性分离后取上清液测量酶活性 (见图4)。完成一次酶促反应后，将分离所得固定化β-葡萄糖苷酶再次与新加入的pnpg反应。此过程重复6次。固定化β-葡萄糖苷酶在6次连续反应之后保持了87％的活性(见图5)，保持了较高的催化活性。
4、水解速度测定
将等量游离β-葡萄糖苷酶和固定化β-葡萄糖苷酶分别与纤维二糖反应5 小时(60℃)。由图6可知，固定化β-葡萄糖苷酶在1小时内使纤维二糖的水解率达到了90％以上，而游离β-葡萄糖苷酶完全水解纤维二糖历时4小时。说明采用本发明方法制得固定化β-葡萄糖苷酶对水解纤维二糖具有更好的高效性和实用性。
本发明提供的所述修饰β-葡萄糖苷酶稳定性提高，水解水杨苷和纤维二糖的速率快，回收率高，回收速度快且具有重复使用性。该固定化方法操作简易，酶活性和稳定性均有所提高，降低β-葡萄糖苷酶的工业化使用成本，使β-葡萄糖苷酶在生物能源、食品保健和饲料行业都有广阔的应用前景。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims (10)

1.一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备纳米碳化硅载体；
将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶；
将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体。
2.如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，所述制备纳米碳化硅载体包括以下步骤：
在纳米碳化硅原料中，加入双氧水，恒温下搅拌、离心、洗涤至中性、干燥后，得到羟基化的纳米碳化硅；
将所述羟基化的纳米碳化硅溶解在醋酸钠溶液中后，超声分散30-150min后，再与戊二醛溶液混合，震荡、洗涤、干燥后，完成对羟基化的纳米碳化硅的活化，得到纳米碳化硅载体。
3.如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，将β-葡萄糖苷酶、所述纳米碳化硅载体与交联剂混合后，得到固定化β-葡萄糖苷酶的具体步骤包括：
将所述纳米碳化硅载体溶解于pH为4.8的醋酸钠缓冲液中，超声分散后加入β-葡萄糖苷酶，混合后震荡40-120min，再加入交联剂的水溶液，室温震荡1～5小时，离心洗涤，得到固定化β-葡萄糖苷酶。
4.如权利要求3所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.2～0.8，所述β-葡萄糖苷酶与所述交联剂的质量比1:0.002～0.06。
5.如权利要求4所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，所述纳米碳化硅载体与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.5，所述β-葡萄糖苷酶与所述交联剂的质量比1:0.01～0.04。
6.如权利要求3至5中任意一项所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，所述交联剂的水溶液的质量分数为50％，所得混合液中交联剂的质量分数为0.5％～3％。
7.如权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，将所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒混合，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体具体包括：
将所述固定化β-葡萄糖苷酶分散于pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入Fe3O4纳米颗粒后，常温震荡30～60分钟，完成固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的自组装，洗涤，得到纳米碳化硅@β-葡萄糖苷酶@Fe3O4复合体。
8.如权利要求7所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4纳米颗粒的质量比为1:0.1～0.8，所述Fe3O4纳米颗粒的的粒径为20～80nm。
9.如权利要求8所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，所述固定化β-葡萄糖苷酶与Fe3O4的质量比为1:0.5，所述Fe3O4纳米颗粒的粒径为20nm。
10.如权利要求1至8中任意一项所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于，所述交联剂选择戊二醛。
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