CN101270352B - 一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括：(1)利用Fe2+和Fe3+的氯化物溶液和NaOH溶液进行沉淀反应，制得Fe3O4颗粒；(2)将壳聚糖溶解在醋酸溶液中形成均一透明的胶体溶液，再与Fe3O4颗粒混合搅拌，得到磁性纳米颗粒；(3)将磁性纳米颗粒加入到β-葡萄糖苷酶溶液中，经戊二醛溶液吸附—交联得到壳聚磁性纳米颗粒固定化酶；(4)分别在固定化β-葡萄糖苷酶和游离β-葡萄糖苷酶溶液中加入柠檬酸缓冲溶液，调温度后进行反应，测定其酶活性。该方法快速、简便、廉价，所得产品具有形状均一、比表面积大及酶活力回收率高等特点。
Description
技术领域
本发明属制备固定化酶技术领域，具体涉及一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法。
背景技术
纳米超微粒子通常指粒径在1～100nm的超微粒子，当物质的颗粒尺寸进入纳米量级时，便具有了不寻常的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等，导致了纳米材料独特的光、电、热、磁、力学和化学性质，使纳米材料在新型能源材料、尘态环境材料、高性能电子材料以及新型稀土材料等领域发挥着不可替代的作用。随着纳米磁性材料在各个领域的广泛应用，作为一种重要的磁性材料—纳米Fe3O4的研究和开发已经受到了普遍关注。纳米Fe3O4以其显著的磁效应、表面效应等，在磁流体、生物医药材料、信息材料等领域具有广阔的应用前景。目前球磨法、沉淀法及水解法等方法的制备工艺已经相对成熟，基本可以应用于产业化生产。
β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，也称纤维二糖酶，能够水解结合于非还原性末端的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。在食品工业中，β-葡萄糖苷酶能增加酒类和果汁产品中的风味物质含量及水解蔬菜食品中的主要色素—花色素苷；在饮料工业中，能够水解释放茶叶饮料中糖苷类香气成分；在纤维素糖化过程中，β-葡萄糖苷酶能够将纤维二糖和纤维寡糖水解生成葡萄糖。但是β-葡萄糖苷酶价格昂贵，且使用寿命和贮存期短，因而在实际生产应用中受到限制。采用固定化技术将β-葡萄糖苷酶固定在载体上反复使用，可以达到简化工艺、降低成本的目的。纳米Fe3O4具有生物降解性、无毒性、惰性、抗菌性、对重金属的螯合作用、凝胶成型性质、亲水性以及对蛋白显著的亲和性等特性，常用作固定化酶的载体。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，该方法快速简便、成本低，经磁性纳米颗粒固定化的β-葡萄糖苷酶对温度、pH值和洗涤剂表现出了较好的稳定性和活性。
本发明的一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括：
(1)将0.1～1M的Fe2+和Fe3+的氯化物溶液以1∶2～2∶3的体积比混合后，用1～6M的NaOH溶液在80-90℃，pH 8～10下高速搅拌进行沉淀反应制得大小8～10nm的Fe3O4颗粒；
(2)将1～2g壳聚糖溶解在100～200mL质量分数为10～30％的醋酸溶液中，形成了均一透明的胶体溶液，再将制备的Fe3O4颗粒加入，搅拌20～30min，得到磁性纳米颗粒，用蒸馏水反复洗涤至中性，烘干待用；
(3)将制得的磁性纳米颗粒加入到β-葡萄糖苷酶溶液中，经戊二醛溶液吸附—交联得到壳聚磁性纳米颗粒固定化酶；
(4)分别在0.1～0.5g固定化β-葡萄糖苷酶和游离β-葡萄糖苷酶溶液中加入0.1～0.5MpH＝3.0～9.0的缓冲溶液，20℃～80℃调温度后进行反应，每隔一周测定其酶活性。
步骤(1)所述的Fe2+和Fe3+的氯化物溶液浓度为0.2～0.5M，NaOH溶液浓度为3～5M。
步骤(2)所述的醋酸溶液质量分数为15～25％。
步骤(3)所述是采用体积分数为25％的戊二醛溶液将β-葡萄糖苷酶溶液交联在磁性纳米颗粒上的。
步骤(3)所述的β-葡萄糖苷酶溶液的总酶活为5～10IU。
步骤(4)所述的缓冲溶液是pH＝4.0～8.0的柠檬酸缓冲溶液。
步骤(4)所述的反应温度是30℃～70℃，反应时间为10～20分钟。
步骤(4)所述的每隔一周测定其酶活性是指测定其残余酶活力，残余酶活力以初始酶活力的相对百分数表示。
有益效果
(1)本发明操作简单快速，成本低，耗时较少；
(2)所得产品形状均一，比表面积大，酶活力回收率高；
(3)用磁性纳米颗粒固定的β-葡萄糖苷酶能够反复利用，且酶活力回收率高。
附图说明
图1为固定化β-葡萄糖苷酶溶液反应温度曲线；
图2为固定化β-葡萄糖苷酶溶液的储存稳定性曲线；
图3为固定化β-葡萄糖苷酶溶液反应pH的曲线；
图4为游离β-葡萄糖苷酶溶液反应温度曲线；
图5为游离β-葡萄糖苷酶溶液的储存稳定性曲线；
图6为游离β-葡萄糖苷酶溶液反应pH的曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将0.1MFe2+和Fe3+的氯化物溶液以1∶2的比例混合后，用4M的NaOH在80℃pH＝10.0下高速搅拌进行沉淀反应，然后将沉淀洗涤、过滤、干燥制得大小为8～10nm的Fe3O4颗粒，在这种化学共沉淀法制备纳米Fe3O4粒子的过程中，由于所采用分散体系的化学特性不同，将对磁性粒子的性能产生一定影响。
(2)将1g壳聚糖溶解在100mL质量分数为10％的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液。
(3)将上述制备的Fe3O4颗粒倒入壳聚糖溶液中，搅拌20min，用蒸馏水反复洗涤至中性，烘干待用。
(4)称取上述制得的绝干磁性纳米颗粒0.1g，向其中加入1mL β-葡萄糖苷酶溶液和25％的戊二醛溶液，于4℃、150r/min下吸附10h得到壳聚磁性纳米颗粒固定化酶。
(5)分别在固定化β-葡萄糖苷酶溶液和游离β-葡萄糖苷酶溶液中加入0.1M pH＝5.0的柠檬酸缓冲溶液0.9mL，分别在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃下反应10分钟，并测定酶的活力。
实施例2
(1)将Fe2+和Fe3+的氯化物溶液以1∶2的比例混合后，用过量的NaOH在一定温度和pH值下高速搅拌进行沉淀反应，然后将沉淀洗涤、过滤、干燥制得大小为8～10nm的Fe3O4颗粒。
(2)将1g壳聚糖溶解在100mL质量分数为10％的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液。
(3)将上述制备的Fe3O4颗粒倒入壳聚糖溶液中，搅拌20min，用蒸馏水反复洗涤至中性，烘干待用。
(4)分别在固定化β-葡萄糖苷酶溶液和游离β-葡萄糖苷酶溶液中分别加入pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的0.1M柠檬酸缓冲溶液，于45℃下反应10分钟，并测定酶的活力。
实施例3
(1)将Fe2+和Fe3+的氯化物溶液以1∶2的比例混合后，用过量的NaOH在一定温度和pH值下高速搅拌进行沉淀反应，然后将沉淀洗涤、过滤、干燥制得大小为8～10nm的Fe3O4颗粒。
(2)将1g壳聚糖溶解在100mL质量分数为10％的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液。
(3)将上述制备的Fe3O4颗粒倒入壳聚糖溶液中，搅拌20min，用蒸馏水反复洗涤至中性，烘干待用。
(4)分别在固定化β-葡萄糖苷酶溶液和游离β-葡萄糖苷酶溶液中加入0.1M pH＝5.0的柠檬酸缓冲溶液，于45℃下反应10分钟，每隔一周测定其酶活性。
实施例4
以对硝基苯基-β-D-葡萄糖溶液为底物的紫外分光光度法酶活的表征，具体步骤如下：
游离酶活力的测定：将β-葡萄糖苷酶溶解在0.1M柠檬酸缓冲溶液中，取0.1mL稀释的酶液与0.9mL浓度为5mmol/L对硝基苯基-β-D-葡萄糖溶液混合后，于45℃下保温10min。立即加入1mol/L的Na2CO3溶液2mL终止反应，加入10mL的蒸馏水摇匀，在400nm下测定吸光度。根据对硝基苯酚的标准曲线求得反应所生成的对硝基苯酚的量。以0.1mL蒸馏水代替酶液作空白对照。
固定酶活力的测定：用0.1mL蒸馏水与0.1g固定化β-葡萄糖苷酶的混合溶液代替在游离酶活力测定中的0.1mL稀释的酶液，其余与上述步骤相同。
固定化β-葡萄糖苷酶和游离β-葡萄糖苷酶酶活测定结果见图1～6。
Claims (8)
1.一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括：
(1)将0.1～1M的Fe2+和Fe3+的氯化物溶液以1∶2～2∶3的体积比混合后，用1～6M的NaOH溶液在80-90℃，pH 8～10下高速搅拌进行沉淀反应制得大小8～10nm的Fe3O4颗粒；
(2)将1～2g壳聚糖溶解在100～200mL质量分数为10～30％的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液，再将制备的Fe3O4颗粒加入，搅拌20～30min，得到磁性纳米颗粒，用蒸馏水反复洗涤至中性，烘干待用；
(3)将制得的磁性纳米颗粒加入到β-葡萄糖苷酶溶液中，经戊二醛溶液吸附-交联得到壳聚磁性纳米颗粒固定化酶；
(4)分别在0.1～0.5g固定化β-葡萄糖苷酶和游离β-葡萄糖苷酶溶液中加入0.1～0.5MpH＝3.0～9.0的缓冲溶液，20℃～80℃调温度后进行反应，每隔一周测定其酶活性。
2.根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的Fe2+和Fe3+的氯化物溶液浓度为0.2～0.5M，NaOH溶液浓度为3～5M。
3.根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的醋酸溶液质量分数为15～25％。
4.根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述交联是采用体积分数为25％的戊二醛溶液将β-葡萄糖苷酶溶液交联在磁性纳米颗粒上。
5.根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的β-葡萄糖苷酶溶液的总酶活为5～10IU。
6.根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的缓冲溶液是pH＝4.0～8.0的柠檬酸缓冲溶液。
7.根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的反应温度是30℃～70℃，反应时间为10～20分钟。
8.根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的每隔一周测定其酶活性是指测定其残余酶活力，残余酶活力以初始酶活力的相对百分数表示。
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