CN112401221B - 一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法与应用，属于生物材料加工技术领域。本发明以纳米葡糖基衍生物颗粒为原料，利用酶促扩链‑原位组装协同技术得到环境响应型纳米凝胶，具体的，将纳米葡糖基衍生物颗粒配成溶液，再添加供体分子和客体分子，继续添加特异性糖酶制剂，在30‑45℃反应1‑24h后即得目标产物环境响应型纳米凝胶。本发明技术具有反应高效温和、进程安全可控、操作简单环保等特点，实现了绿色制备环境友好型高分子材料，所得纳米凝胶不仅高效负载功能活性物质，还能在肠道实现靶向释放，可以广泛应用在食品、日化、医药等领域。

Description

一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法与应用
技术领域
本发明涉及一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法与应用，属于生物材料加工技术领域。
背景技术
随着现代社会经济的快速发展，环境污染和人类健康两大问题日益突出。一方面，可再生生物质资源和新型燃料能否在传统碳氢燃料枯竭之前得到广泛应用，是全世界范围内亟待解决的重大问题，多年来，以聚合物(聚乙烯，聚丙烯等)为主要成分的废弃塑料对环境造成了重大污染，迫使科学界努力开发和使用环境友好型生物可降解性聚合物，以可持续的方式发展生物经济；另一方面，健康管理意识的增强使得消费者愈来愈关注日常产品的功能性益处，全球功能性市场规模预计将超过2750亿元。在此背景下，通过生物技术开发自然界中来源于植物的可生物降解、可再生的生物质资源，构建具有特定响应性的环境友好型材料，用于设计个性化功能产品成为研究热点。
活性物质控制释放技术是生物材料中发展最迅速、对人类健康贡献最大、应用前景广泛的领域之一。其中，聚合物智能化水凝胶作为载体材料构建的功能因子控制释放体系独具优势，如：在特定的组织器官释放，达到主动靶向的同时可以缓释营养素，实现靶器官对活性成分的高效吸收利用；在保证药物作用的前提下，改变药物在体内的分布，从而减少给药剂量以减轻或避免毒副反应等。但是在食品医药领域的应用要求水凝胶具有较高的生物和血液相容性，对pH和温度的刺激响应性和生物可降解性。目前人工合成的pH响应型水凝胶大多没有生物可降解性，且具有细胞毒性，因而限制了其在食品生物领域的应用。
为了将设计出满足体内输送条件的水凝胶，需要考虑原料的以下四个问题：良好的生物相容性和非毒性；生物可降解性；廉价易得；具有高反应活性的基团以便于改性。因此，基于多肽、蛋白质和多糖等天然高分子基的水凝胶更具优势。现阶段报道的以多糖为原料制备的pH响应型水凝胶主要偏向于纤维素、壳聚糖，而葡糖基纳米凝胶相对较少。此外，以天然高分子为原料制备的pH响应型水凝胶大多复合其他合成有机物，利用交联剂成胶，并需进行细胞毒性实验评估其应用于人体的安全性，而仅以改性淀粉为基质，不加入交联剂来制备智能化凝胶的方法还鲜有报道。基于上述原因，为了拓宽葡糖基纳米凝胶的应用领域并提升附加值，开发一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法是有迫切需求的。
发明内容
本发明的目的是提供一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法与应用，该方法具有反应高效温和、进程安全可控、操作简单环保等特点，实现了绿色制备环境友好型高分子材料，制备得到的产品可以作为基体材料用于食品、生物医药等领域。
本发明的第一个目的是提供一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法，所述方法如下步骤：
(1)称取纳米葡糖基衍生物颗粒配成质量百分浓度2-10％的底物溶液；
(2)再添加纳米葡糖基衍生物颗粒质量4-10倍的供体分子和0.1％-100％的客体分子，混合均匀；
(3)继续添加5-100U/g底物的特异性糖酶制剂，在30-45℃反应1-24h后即得目标产物环境响应型纳米凝胶。
在本发明一种实施方式中，所述纳米葡糖基衍生物颗粒提取自玉米、高粱、稻米、大麦、荞麦、鼠耳芥、蓝藻、红藻等谷物籽粒胚乳、藻类组织或通过淀粉酶法仿生合成得到葡糖基颗粒，并利用表面电荷修饰试剂处理后得到的，其中，所述电荷修饰试剂包括醋酸酐、醋酸乙烯酯、正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、丁二酸酐、环氧丙烷、氯乙酸钠等中的一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米葡糖基衍生物颗粒分子量为106～108g/mol，粒径20～100nm，表面电荷-15～-50mV。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米葡糖基衍生物颗粒具体通过以下方法制备得到：将原料加入在磷酸盐缓冲液中浸泡、粉碎、过滤、离心并收集上清液，调节所得上清液pH至4.5-5.0，并置于80-100℃加热处理30-60min，离心收集上清液、醇沉干燥处理，再溶于pH 6.0-7.0的磷酸盐缓冲液并配置成质量分数10-30％的溶液，添加质量百分比3-10％电荷改性试剂，40-50℃恒温反应-8h后醇沉干燥即得纳米葡糖基衍生物颗粒。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的pH 6.0-7.0，浓度为30-50mM。
在本发明一种实施方式中，所述供体分子为蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、极限糊精、葡萄糖-1-磷酸等物质中一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述客体分子包括药物、营养素以及食品等，优选需要靶向释放在肠道的等中的任一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，所述客体分子包括牛血清蛋白、溶菌酶、盐酸二甲双胍、乙酰水杨酸、氯霉素、抗菌剂、植物化合物等活性物质中一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述特异性糖酶制剂包括葡聚糖蔗糖酶、淀粉葡糖苷酶、磷酸化酶中的一种或多种。
本发明的第二个目的是利用上述方法提供一种负载客体分子的环境响应型葡糖基纳米凝胶。
在本发明一种实施方式中，所述环境响应型葡糖基纳米凝胶酶法成胶时间为1-24h，纳米葡糖基衍生物颗粒表面接支扩链尺寸为DP20-70。该纳米凝胶形成大量线性直链并相互交联，由此形成空间三维网络结构，环境响应型葡糖基纳米凝胶对客体分子负载率大于97％。
本发明的第三个目的是提供包含上述环境响应型葡糖基纳米凝胶的食品、药品或日用化学品。
本发明的第四个目的是将环境响应型葡糖基纳米凝胶应用于靶向递送功能材料以及靶向递送领域。
在本发明一种实施方式中，环境响应型葡糖基纳米凝胶具有pH敏感性，在pH 3-10对客体物质的释放率为5-50％；还具有消化酶触敏感性，在模拟肠道中对客体物质的释放率为80-95％。
上述环境响应型葡糖基纳米凝胶可以广泛在食品、医药、日用化学品等领域。
本发明具有以下优点：
1.从谷物、藻类等天然植物提取的纳米级葡糖基粒子，通过简单的电荷修饰制备出纳米葡糖基衍生物颗粒，并以此作为纳米凝胶的骨架，使得纳米凝胶具有生物可降解性和生物相容性，无毒无害。本发明将可再生、可降解的生物质资源转化为了高附加值的纳米凝胶材料，拓宽了多糖的应用领域和途径，提高了其利用价值。
2.通过酶促扩链与原位组装法制备环境响应型葡糖基纳米凝胶，无需引发剂和交联剂，酶法高效温和，进程安全可控，操作简单环保，实现了绿色制备环境友好型生物材料。
3.本发明的环境响应型葡糖基纳米凝胶对客体物质具有良好的靶向传递和定位释放效果，可以用于构建营养素的体内的靶向传递系统，设计功能性食品或控释药品。
附图说明
图1实施例1环境响应型葡糖基纳米凝胶的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但本发明所保护的内容不仅仅局限于下面的实例。
分子量测定：称取待测样品配置成0.2％的溶液后向高效凝胶排阻色谱系统(HPSEC)进样，选用ShodxOhpak SB-805HQ凝胶色谱柱，0.1mol/L硝酸钠溶液为流动相，流速设为0.7mL/min，折光指数设定为dn/dc＝0.138，并利用Astra软件对色谱图中的单个色谱峰计算得到分子量。
粒径和表面电位测定：将待测样品配制成0.1％(w/v)的溶液，25℃下用马尔文Nano ZS测定仪进行粒度分布和表面电位测定。
链长测定：用高效阴离子交换色谱测定待测样品链长分布情况。选用CarboPacPA200离子交换柱，并设定梯度洗脱，其流动相分别是(A)：0.25mol/L的NaOH溶液；(B)1.0mol/L的NaAC溶液；超纯水。洗脱程序设定0-21min：1.8％A流动相，0％B流动相；21-30min：1.8％A流动相，B流动相从5％提升至30％；30-50min：80％A流动相，0％B流动相。
负载率测定：将待测样品用去离子水清洗，所得清洗液通过比色法测定吸光值计算客体分子质量，计算公式如下：负载率(％)＝(反应体系客体分子质量-清洗液中客体分子质量)/纳米凝胶质量×100。
pH敏感性测定：称取50mg待测样品分散于10mL不同pH的缓冲液中，200rpm条件下搅拌释放2h。样品离心后取上清液适当稀释后，参照负载率测定通过比色法测定吸光值计算客体分子释放率。
消化酶促敏感性测定：称取待测样品100mg分散于10mL模拟肠液(pH 5.2，0.1mol/L磷酸盐缓冲液)中，加入猪胰α-淀粉酶和糖化酶，使模拟肠液中含有290U/mLα-淀粉酶，15U/mL糖化酶，37℃恒温，150rpm转速的条件下水解6h，参照负载率测定通过比色法测定吸光值计算客体分子释放率。
葡聚糖蔗糖酶、淀粉葡糖苷酶、磷酸化酶购自Sigma公司；玉米、高粱、稻米、大麦、荞麦、鼠耳芥、蓝藻、红藻等植物原料购自中国农科院。
实施例1
称取100g玉米籽粒并加入300mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0，50mM)浸泡12h，经过粉碎、过滤、离心处理，调节所得上清液pH至4.9并置于100℃加热处理30min，离心收集上清液、醇沉干燥处理；将所得粉末溶于pH 7.0的磷酸盐缓冲液并配置成质量分数10％的溶液，添加质量百分比3％电荷改性试剂氯乙酸，40℃恒温反应4h后醇沉干燥即得玉米源纳米葡糖基衍生物颗粒。经过测定分析可知玉米源衍生物颗粒分子量2.4×107g/mol，平均粒径82nm，表面电荷-35mV。
称取100g红藻组织并加入300mL磷酸盐缓冲液(pH 6.0，30mM)浸泡12h，经过粉碎、过滤、离心处理，调节所得上清液pH至4.5并置于80℃加热处理60min，离心收集上清液、醇沉干燥处理；将所得粉末溶于pH 6.0的磷酸盐缓冲液并配置成质量分数30％的溶液，添加质量百分比5％电荷改性试剂焦磷酸盐，50℃恒温反应6h后醇沉干燥即得红藻源纳米葡糖基衍生物颗粒。经过测定分析可知红藻源衍生物颗粒分子量0.4×107g/mol，平均粒径62nm，表面电荷-28mV。
称取100g大麦籽粒并加入300mL磷酸盐缓冲液(pH 6.0，50mM)浸泡12h，经过粉碎、过滤、离心处理，调节所得上清液pH至5.0并置于100℃加热处理50min，离心收集上清液、醇沉干燥处理；将所得粉末溶于pH 6.0的磷酸盐缓冲液并配置成质量分数20％的溶液，添加质量百分比3％电荷改性试剂环氧丙烷，45℃恒温反应4h后醇沉干燥即得大麦源纳米葡糖基衍生物颗粒。经过测定分析可知大麦源衍生物颗粒分子量3.8×107g/mol，平均粒径73nm，表面电荷-35mV。
实施例2
称取实施例1制备得到的玉米源纳米葡糖基衍生物颗粒配成质量百分浓度6％的均一底物溶液；添加底物质量6倍的葡萄糖-1-磷酸和20％溶菌酶分子混合均匀；继续添加10U/g底物的磷酸化酶，在37℃反应10h后即得目标产物环境响应型纳米凝胶。
经过分析测定可知，纳米葡糖基衍生物颗粒表面接支扩链尺寸为DP 54.4，客体分子的负载率为99.5％，在pH 3-7的范围内，纳米凝胶对客体物质的释放率达35.2％以上，在模拟肠道的实验中，纳米凝胶对客体物质的释放率为87.5％。由此可见，本发明制备得到的环境响应型纳米凝胶在胃肠道释放，且具有消化酶触敏感性，能够在小肠释放绝大部分客体分子，因此，可以用于控释药品或营养素等。
实施例3
称取实施例1制备得到的红藻源纳米葡糖基衍生物颗粒(分子量0.4×107g/mol，平均粒径62nm，表面电荷-28mV)配成质量百分浓度10％的均一底物溶液；添加底物质量10倍的蔗糖和4％盐酸二甲双胍分子混合均匀；继续添加5U/g底物的葡聚糖蔗糖酶，在40℃反应8h后即得目标产物环境响应型纳米凝胶。
经过分析测定可知，纳米葡糖基衍生物颗粒表面接支扩链尺寸为DP 60.1，客体分子的负载率为97.5％，在pH 7-10的范围内，纳米凝胶对客体物质的释放率达48.2％以上，在模拟肠道的实验中，纳米凝胶对客体物质的释放率为94.8％。
实施例4
称取实施例1制备得到的大麦源纳米葡糖基衍生物颗粒(分子量3.8×107g/mol，平均粒径73nm，表面电荷-35mV)配成质量百分浓度8％的均一底物溶液；添加底物质量4倍的麦芽糊精和1％牛血清蛋白分子混合均匀；继续添加60U/g底物的淀粉葡糖苷酶，在38℃反应12h后即得目标产物环境响应型纳米凝胶。
经过分析测定可知，纳米葡糖基衍生物颗粒表面接支扩链尺寸为DP 50.4，客体分子的负载率为99.5％，在pH 6-10的范围内，纳米凝胶对客体物质的释放率为28.6％以上，在模拟肠道的实验中，纳米凝胶对客体物质的释放率为87.9％。
当供体分子为麦芽糖或极限糊精时，或当纳米葡糖基衍生物颗粒分别来自于高粱、稻米、荞麦、鼠耳芥、蓝藻等时，按照上述实施例制备得到的环境响应型纳米凝胶同样具有上述性质，即纳米葡糖基衍生物颗粒表面接支扩链尺寸为DP20-70，对客体分子负载率大于97％，在pH＝3～10的范围内(基于不同电荷修饰条件)，纳米凝胶对客体物质的释放率为5％～50％，在模拟肠道的实验中，纳米凝胶对客体物质的释放率为80％～95％。
对比例1
当实施例2中不添加供体分子时，不能形成水凝胶。
对比例2
当实施例2中无特异性酶制剂进行处理时，不能形成水凝胶
对比例3
参照实施例2，将磷酸化酶用量10U/g底物分别替换为1U/g底物、200U/g底物，制得相应的环境响应型纳米凝胶。所得环境响应型纳米凝胶的性能结果见表1。
表1不同磷酸化酶用量所得环境响应型纳米凝胶
Figure BDA0002762802050000061
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (12)

1.一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）称取纳米葡糖基衍生物颗粒配成质量百分浓度2-10%的底物溶液；
（2）再添加纳米葡糖基衍生物颗粒质量4-10倍的供体分子和0.1%-100%的客体分子，混合均匀；所述供体分子包括蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、极限糊精、葡萄糖-1-磷酸中一种或多种；
（3）继续添加5-100 U/g底物的特异性糖酶制剂，在30-45℃反应1-24 h后即得目标产物环境响应型纳米凝胶；
其中，所述特异性糖酶制剂包括葡聚糖蔗糖酶、淀粉葡糖苷酶、磷酸化酶中的一种或多种；
所述纳米葡糖基衍生物颗粒具体通过以下方法制备得到：将原料加入在磷酸盐缓冲液中浸泡、粉碎、过滤、离心并收集上清液，调节所得上清液pH至4.5-5.0，并置于80-100℃加热处理30-60min，离心收集上清液、醇沉干燥处理，再溶于pH 6.0-7.0的磷酸盐缓冲液并配置成质量分数10-30%的溶液，添加质量百分比3-10%电荷改性试剂，40-50℃恒温反应4或6h后醇沉干燥即得纳米葡糖基衍生物颗粒；
所述原料包括玉米、高粱、稻米、大麦、荞麦、鼠耳芥、蓝藻或红藻；
所述电荷改性试剂是氯乙酸、焦磷酸盐或环氧丙烷。
2.根据权利要求1所述的一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法，其特征在于，所述纳米葡糖基衍生物颗粒的分子量为106~108 g/mol，粒径为20~100 nm，表面电荷-15~-50mV。
3.根据权利要求1所述的一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法，其特征在于，所述客体分子包括药物、营养素以及食品中的任一种或几种。
4.根据权利要求2所述的一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法，其特征在于，所述客体分子包括药物、营养素以及食品中的任一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法，其特征在于，所述客体分子包括牛血清蛋白、溶菌酶、盐酸二甲双胍、乙酰水杨酸、氯霉素中一种或多种。
6.根据权利要求2所述的一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法，其特征在于，所述客体分子包括牛血清蛋白、溶菌酶、盐酸二甲双胍、乙酰水杨酸、氯霉素中一种或多种。
7.权利要求1~6任一所述的一种环境响应型葡糖基纳米凝胶的加工方法制备得到的环境响应型葡糖基纳米凝胶。
8.根据权利要求7所述的环境响应型葡糖基纳米凝胶，其特征在于，纳米葡糖基衍生物颗粒表面接支扩链尺寸为DP20-70。
9.包含权利要求7所述的环境响应型葡糖基纳米凝胶的食品、药品或日用化学品。
10.包含权利要求8所述的环境响应型葡糖基纳米凝胶的食品、药品或日用化学品。
11.权利要求7所述的环境响应型葡糖基纳米凝胶在食品、制备医药领域药物、日用化学品领域中的应用。
12.权利要求8所述的环境响应型葡糖基纳米凝胶在食品、制备医药领域药物、日用化学品领域中的应用。
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