CN110408665B - 一种微带环树枝形淀粉衍生物及其加工方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微带环树枝形淀粉衍生物及其加工方法，属于食品加工技术领域。本发明以淀粉为原料，通过糖链降解分级和糖酶催化转苷技术制备得到微带环树枝形淀粉衍生物，可作为食品活性因子的稳态化载体材料。本发明方法具有绿色环保、加工得率高、成本低等优点，所制备产品具有高分支度、特殊大环状结构和良好水溶性，可应用于天然功能物质稳态化递送和活性保护，涉及营养食品、医药、日用化学品等多个领域。

Description

一种微带环树枝形淀粉衍生物及其加工方法
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种微带环树枝形淀粉衍生物及其加工方法。
背景技术
淀粉作为自然界中仅次于纤维素的第二大可再生性资源，具有价廉易得、可降解性和易衍生化等特点。我国作为农业大国，淀粉资源极为丰富，年总产量已超2720万吨，但90％以上用于生产淀粉糖、糖醇、发酵制品等初级产品，与发达国家还有很大差距，主要反映在产品质量稳定性不及国外的产品、原料利用率低、生产技术不完善，尤其是高附加值产品品质缺乏。
当前，世界各国都十分重视淀粉资源的开发利用研究，淀粉衍生化产品被广泛应用在食品、造纸、纺织、精细化工、医药等领域。鉴于原淀粉半结晶结构的局限性限制了其应用范围和应用效果，全球科技工作者通过各种方法对淀粉的结构修饰与功能调控，例如，物理改性工艺简单、易操作，但物理改性对淀粉改性程度不高，常需要与其它改性手段联用；化学改性淀粉是目前淀粉工业中用量最大的，但其改性成本高且产生的废物对环境存在污染；酶改性的反应条件温和、反应效率高、底物特异性强且绿色环保。
目前，宜瑞安、泰莱、嘉吉、罗盖特、艾维贝等国外主要淀粉深加工大型都开发了抗性淀粉、功能性糖、淀粉载体及活性保护技术并形成了规模化的生产销售；对于国内玉米深加工企业的产品，则多数作为初级配料使用。因此，为了进一步拓展淀粉资源的开发利用，本发明开发了一种新型的微带环树枝形淀粉衍生物。
发明内容
本发明的利用一种多种改性方法复合改性的方式，构建了一种微带环树枝形淀粉衍生物。本发明方法具有绿色环保、加工得率高、成本低等优点，所制备的微带环树枝形淀粉产品具有高分支度、特殊大环状结构和良好水溶性，可应用于天然功能物质稳态化递送和活性保护，涉及营养食品、医药、日用化学品等多个领域。
本发明目的通过如下技术方案实现：一种微带环树枝形淀粉衍生物的加工方法及应用，其特征在于以大宗淀粉为原料，通过糖链降解分级和糖酶催化转苷技术制备得到微带环树枝状淀粉衍生物。
本发明的第一个目的是提供一种微带环树枝形淀粉衍生物的加工方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将脱脂淀粉分散于溶剂中得到淀粉悬浮液，然后加入酸催化剂进行淀粉降解反应；其中淀粉悬浮液的浓度为1g/mL-5g/mL；
(2)将步骤(1)降解后得到的淀粉降解产物溶于缓冲液中，然后加入转苷糖酶制剂；所述转苷糖酶制剂能结合并切断淀粉链中α-1,4-糖苷键并使糖链发生转移形成新环形链结构，主要来源于古生菌、细菌或植物且糖链支化活力/解聚活力>30。
(3)加热灭酶，然后分离得到微带环树枝形淀粉衍生物。
在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂的糖链支化活力是指降低线性淀粉-碘复合物在660nm处吸光率的活力，且是基于转苷糖酶制剂切断α-1,4糖苷键并转移至另一个葡萄糖残基从而形成环形链结构来减少线性淀粉片段的能力，支化活力(U/mL)＝[(线性淀粉-碘复合物在660nm的吸光值-加入酶制剂的线性淀粉-碘复合物在660nm的吸光值)/(线性淀粉-碘复合物在660nm的吸光值)]×100/10×20。糖链解聚活力是指：指淀粉分子量降低的活力，即在糖酶催化最适温度和pH条件下，转苷糖酶制剂作用1g淀粉底物反应8h时将淀粉分子量降至500000Da所需酶的量。具体测试方法：分子量降低活力(U/mL)＝1/[(淀粉分子量降至500000Da所需的酶量/1000)×(1000mg/样品质量)]。其中所述的活力均是在70℃、pH 7.0条件下测定的。
在本发明的一种实施方式中，所述脱脂淀粉包括经脱脂处理的玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、稻米淀粉、小麦淀粉中的任意一种，或者普通淀粉、蜡质淀粉中任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述脱脂处理包括利用乙醇、环己烷等有机溶剂抽提淀粉中的脂质成分。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中酸催化剂的pH为2.5-4.0。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中酸催化剂包括磷酸、硼酸、有机磺酸、盐酸盐、硫酸盐中任意一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中淀粉降解反应是在20-60°下反应30-120min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)具体包括：每10-25g经过脱脂淀粉悬浮于6-10mL无水乙醇，然后添加10-100mL酸催化剂溶液，在20-60℃反应30-120min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中酸催化剂溶液的添加量与淀粉悬浮液的体积比为(10-100)：(6-10)。
在本发明的一种实施方式中，所述酸催化剂溶液是指酸催化剂的水溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)还包括：降解反应结束后中和pH值、分级沉淀、洗涤干燥，得到淀粉降解产物。
在本发明的一种实施方式中，所述转苷糖酶制剂包括：利用古生菌或细菌活化培养、发酵产酶所得的微生物源转苷糖酶制剂，或者利用谷物籽粒胚乳提取获得的植物源转苷糖酶制；所述转苷糖酶制剂的糖链支化活力与解聚活力比值大于30；
在本发明的一种实施方式中，所述古生菌或细菌活化培养的方法包括如下步骤：在无菌条件下，取甘油管保存的菌液，接种到灭菌后的种子LB培养基中培养；所述发酵产酶包如下步骤：活化后，接种于发酵LB培养基中，恒温摇床培养至菌体浓度OD 600＝0.6，10000rpm离心15min，弃上清收集菌体，冻干粉碎等步骤得到酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物源包括：嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus ATCC 7953、极端嗜热菌Calditerricolayamamurae UTM801CGMCC6185、极端嗜热球菌Streptococcus thermophilus ATCC 14485、嗜热栖热菌ThermusthermophilesATCC33923、嗜热古细菌Aeropyrumpernix K1(可购自日本工业技术院)。
在本发明的一种实施方式中，所述植物源转苷糖酶制剂的制备包括如下步骤：称取灌浆期的谷物籽粒，加入缓冲液，经过匀浆、过滤、离心获得粗酶液，再经过离子交换柱和凝胶色谱分离纯化，收集活性成分后冻干处理得到酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉降解产物溶于缓冲液后配制成质量浓度为2％-30％的溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中是将淀粉降解产物的缓冲液加热至60-80℃，再加入转苷糖酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中转苷糖酶制剂的添加量为：每10-25g脱脂淀粉添加600-1000U转苷糖酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中加入转苷糖酶制剂后，保温反应8-16h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：
(1)每称取10-25g经过脱脂处理的淀粉悬浮于6-10mL无水乙醇，继续添加10-100mL酸催化剂溶液后在20-60℃反应30-120min，反应结束后中和pH值、分级沉淀、洗涤干燥；
(2)将淀粉降解产物溶于50-100mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)配成质量浓度为2％-30％的溶液，置于70℃水浴加热30-60min后，然后加入600-1000U转苷糖酶制剂并保温反应8-16h；
(3)加热灭酶活、离心处理，将所获得上清液进行真空干燥处理，即得目标产物。
本发明的第二个目的是利用上述方法提供一种微带环树枝形淀粉衍生物。
在本发明的一种实施方式中，所诉微带环树枝形淀粉衍生物中的环状结构尺寸DP19-50，α-1,6糖苷键比例5.0-7.0％，分子量为3000-9000Da。
本发明的有益的技术效果在于：
1)本发明方法步骤简便，易于操作，反应条件可控，成本相对较低，而且采用本发明生产工艺，能够实现对淀粉原料的完全利用，原子经济性好，基本无副产物生成，对环境基本无污染。所得微带环树枝形淀粉衍生物的分子量为3000-9000Da，其中环状结构尺寸DP19-50，α-1,6糖苷键比例5.0-7.0％(α-1,6糖苷键比例较高，代表支化程度较好)，得率为6.0-20.0％。
2)本发明所制备的微带环树枝形淀粉衍生物具有高分支度、特殊大环状结构和良好水溶性，粒径范围窄，属于纳米级载体材料，可以对功能性脂质、类胡萝卜化合物、类黄酮化合物等脂溶性功能物质的稳态化递送和活性保护具有重要作用。
3)本发明充分利用我国资源丰富的淀粉来设计微带环树枝形淀粉衍生物加工方法，创制出不同应用性能的产品，增加淀粉附加值，扩大淀粉的应用领域，满足了应用行业对淀粉结构和性能的要求。本发明制备的产品可应用于食品、医药、日用化学品等多个领域，市场前景十分看好，经济效益广阔。
附图说明
图1微带环树枝形淀粉衍生物MALDI-TOF-MS质谱图；
图2微带环树枝形淀粉衍生物的环状结构三维构象；
图3微带环树枝形淀粉衍生物的环状结构构型。
具体实施方式
下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但本发明所保护的内容不仅仅局限于下面的实例。
粒径测定：将待测样品配制成0.1％(w/v)的溶液，25℃下用马尔文Nano ZS测定仪进行粒度分布测定。
溶解度测定方法：准确称取20mg包合物溶于1mL去离子水中，室温避光平衡12h，4℃离心(3000rpm，5min)去除不溶物。取0.2mL离心液，加入4倍体积的无水乙醇后，旋涡振荡15min，离心(10000rpm，5min)分离萃取植物化学物组分和淀粉。取上清通过紫外分光光谱仪测定吸光值，代入标准曲线方程计算可得到溶解度。
负载率计算方法：参照溶解度测定方法得到的可溶性植物化学物含量(W)、溶解性淀粉质量(M)，负载率计算公式如下：负载率(％)＝W/M×100。
CaCO2细胞膜渗透性测定方法：细胞膜渗透性为在Caco-2细胞内和隔离腔下层基底部分的植物化学物与起初添加到细胞上层的植物化学物的质量百分比，并使用Millicell-ERS电子伏特计测量细胞单层培养腔里外的跨上皮电阻值，从而监测上皮细胞之间的紧密程度，确定细胞单层的完整性。
转苷糖酶制剂的制备：
A.植物源转苷糖酶制剂：采用生长期的谷物籽粒胚乳提取获得，称取灌浆期的谷物籽粒100g，加入300mL磷酸盐缓冲液(pH 7.2，50mM)，经过匀浆、过滤、离心获得粗酶液，再经过离子交换柱和凝胶色谱分离纯化，收集活性成分后冻干处理得到酶制剂。其中植物谷物籽粒胚乳包括：稻米籽粒胚乳、小麦籽粒胚乳、玉米籽粒胚乳、高粱籽粒胚乳等。
B.微生物源转苷糖酶制剂：采用从自然界中筛选获得古生菌或细菌经过活化培养、发酵产酶等步骤，其中菌种活化：在无菌条件下，取甘油管保存的菌液200μL，接种到灭菌后的装有100mL种子LB培养基的250mL锥形瓶中，37℃培养12h。发酵培养：在无菌条件下，按照2％(v/v)的接种量，接种于装有100mL发酵LB培养基的250mL锥形瓶中。接种后放置37℃恒温摇床培养至菌体浓度OD600＝0.6，10000rpm离心15min，弃上清收集菌体，冻干粉碎等步骤得到酶制剂。微生物包括：嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilusATCC7953、极端嗜热菌Calditerricolayamamurae UTM801CGMCC 6185、极端嗜热球菌Streptococcus thermophilus ATCC 14485、嗜热栖热菌ThermusthermophilesATCC33923、嗜热古细菌Aeropyrumpernix K1(可购自日本工业技术院)。
实施例1
称取25g经过脱脂处理的蜡质玉米淀粉悬浮于10mL无水乙醇，继续添加100mL硼酸催化剂溶液(pH2.5)后在40℃反应120min，反应结束后中和pH值、分级沉淀、洗涤干燥；
将所得的淀粉降解产物溶于100mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)配成质量浓度为2％的溶液，置于70℃水浴加热30min后，然后加入600U稻米源转苷糖酶制剂(糖链支化活力/解聚活力＝52)并保温反应16h加热灭酶活、离心处理，将所获得上清液进行真空干燥处理，即得微带环树枝形淀粉目标产物。
所得微带环树枝形淀粉衍生物平均分子量为4200Da，其中环状结构平均DP 21，α-1,6糖苷键比例6.0％，得率为12.7％。
实施例2
称取20g经脱脂处理的蜡质稻米淀粉悬浮于8mL无水乙醇，继续添加80mL盐酸盐溶液(pH4.0)后在50℃反应90min，反应结束后中和pH值、分级沉淀、洗涤干燥；
将所得的淀粉降解产物溶于75mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)配成质量浓度为15％的溶液，置于70℃水浴加热40min后，然后加入800U嗜热脂肪芽孢杆菌源转苷糖酶制剂(糖链支化活力/解聚活力＝31)并保温反应12h；加热灭酶活、离心处理，将所获得上清液进行真空干燥处理，即得目标产物。
所得微带环树枝形淀粉衍生物分子量为3500Da，其中环状结构平均DP 20，α-1,6糖苷键比例5.2％，得率为9.7％。
实施例3
称取25g经过脱脂处理的马铃薯淀粉悬浮于6mL无水乙醇，继续添加60mL磷酸催化剂溶液(pH 3.0)后在60℃反应60min，反应结束后中和pH值、分级沉淀、洗涤干燥；
将所得的淀粉降解产物溶于50mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)配成质量浓度为10％的溶液，置于70℃水浴加热35min后，然后加入700U嗜热栖热菌源转苷糖酶制剂(糖链支化活力/解聚活力＝75)并保温反应10h；加热灭酶活、离心处理，将所获得上清液进行真空干燥处理，即得目标产物。其中嗜热栖热菌源为嗜热栖热菌Thermus thermophiles CGMCC6186。
所得微带环树枝形淀粉衍生物平均分子量为7850Da，其中环状结构平均DP 35，α-1,6糖苷键比例6.6％，得率为18.1％。
实施例4物质作为载体的应用
将实施例1-3所得环化树枝状淀粉分别溶解于纯净水，配成质量百分比浓度0.5mg/mL的溶液；将β-胡萝卜素溶解于无水乙醇配成配成质量百分比浓度0.2mg/mL；按照5:1比例将β-胡萝卜素溶液添加到主体环化树枝状淀粉溶液，置于在40℃水浴中并以转速4000rpm搅拌2h，然后在15000rpm均质1min；置于超声波作用装置中，控制功率为200W，在0℃下处理12min；离心处理，将所获得上清液进行真空干燥处理，分别获得相应的β-胡萝卜素-环化树枝状淀粉包合物。
所得β-胡萝卜素-环化树枝状淀粉包合物的结果见表1。
表1不同环化树枝状淀粉制备的β-胡萝卜素-环化树枝状淀粉包合物性能结果
Figure BDA0002150273080000061
所述未包合是指纯β-胡萝卜素。
对比实施例1
参考实施例1，将转苷糖酶制剂替换为4-α-糖基转移酶，其他条件不变，制备得到淀粉产物。
所得淀粉衍生物平均分子量为37500Da，其中α-1,6糖苷键比例4.2％，无环化结构。
对比实施例2
将20mg麦芽六糖和200mg葡萄糖-1-1磷酸盐溶解于100nM包含5mM磷酸腺苷和20UD-醇的柠檬酸缓冲液(pH7.0)中，加入1mg酸化酶，温度30℃反应2h。离心反应液，上清液100℃处理5分钟，离心去除变性酶蛋白。上清液加入50U葡糖淀粉酶,沉淀物包含30mg仅含有a-1,4-葡苷键的环状葡聚糖，所得环状葡聚糖是不含α-1,6糖苷键、无树枝状的环状结构。
本文所描述的具体实施案例仅作为对本发明精神和部分实验做举例说明。本发明所述领域的技术人员可以对所描述的具体实施案例做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (5)

1.一种微带环树枝形淀粉衍生物的加工方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将脱脂淀粉分散于溶剂中得到淀粉悬浮液，然后加入酸催化剂进行淀粉降解反应；其中淀粉悬浮液的浓度为1g/mL-5g/mL；所述酸催化剂的pH为2.5-4.0；
(2)将步骤(1)降解后得到的淀粉降解产物溶于缓冲液中，然后加入转苷糖酶制剂；所述转苷糖酶制剂选自：嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus ATCC 7953源转苷糖酶制剂、嗜热栖热菌Thermus thermophiles ATCC 33923源转苷糖酶制剂或者稻米源转苷糖酶制剂；所述转苷糖酶制剂的糖链支化活力与解聚活力比值大于30；
(3)加热灭酶，然后分离得到微带环树枝形淀粉衍生物；
所述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus ATCC 7953源转苷糖酶制剂，或者嗜热栖热菌Thermus thermophiles ATCC 33923源转苷糖酶制剂的制备方法包括如下步骤：在无菌条件下，取甘油管保存的嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilusATCC 7953或者嗜热栖热菌Thermus thermophiles ATCC 33923的菌液，接种到灭菌后的种子LB培养基中培养活化；活化后，接种于发酵LB培养基中，恒温摇床培养至菌体浓度OD600＝0.6，10000rpm离心15min，弃上清收集菌体，冻干粉碎得到酶制剂；
所述稻米源转苷糖酶制剂的制备包括如下步骤：称取灌浆期的稻米籽粒，加入缓冲液，经过匀浆、过滤、离心获得粗酶液，再经过离子交换柱和凝胶色谱分离纯化，收集活性成分后冻干处理得到酶制剂；
所述步骤(2)中转苷糖酶制剂的添加量为：每10-25g脱脂淀粉添加600-1000U转苷糖酶制剂；
所述步骤(2)中是将淀粉降解产物的缓冲液加热至60-80℃，再加入转苷糖酶制剂，加入转苷糖酶制剂后保温反应8-16h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中酸催化剂溶液的添加量与淀粉悬浮液的体积比为(10-100)：(6-10)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体包括：每10-25g脱脂淀粉悬浮于6-10mL无水乙醇，然后添加10-100mL酸催化剂溶液，在20-60℃下反应30-120min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中淀粉降解产物溶于缓冲液后配制成质量浓度为2％-30％的溶液。
5.权利要求1-4任一所述方法制备的微带环树枝形淀粉衍生物，所述微带环树枝形淀粉衍生物中的环状结构尺寸DP 19-50，α-1,6糖苷键比例5.0-7.0％，分子量为3000-9000Da。
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