FI78318C - Foerfarande foer framstaellning av kymosin. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av kymosin. Download PDFInfo
- Publication number
- FI78318C FI78318C FI840468A FI840468A FI78318C FI 78318 C FI78318 C FI 78318C FI 840468 A FI840468 A FI 840468A FI 840468 A FI840468 A FI 840468A FI 78318 C FI78318 C FI 78318C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- kymoein
- insoluble
- chymosin
- precursor
- compound
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
i 78318
Menetelmä kyntösiinin valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu menetelmään proteiinin valmistamiseksi käyttäen rekombinantti-DNA-bioteknologiaa. Erityisesti se kohdistuu menetelmään kymosiinin valmistamiseksi sellaisen kymoeiinin esiasteen liukenemattomasta muodosta, joka on tuotettu kymosiinin esiastetta koodaavan geenin sisältävällä vektorilla transformoidulla isäntäorganismilla.
On olemassa lukuisia esimerkkejä kaupallisesti arvokkaista proteiineista, jotka voidaan valmistaa suurissa määrissä viljelemällä isäntäorganismia, joka kykenee ilmaisemaan hetero-logista geneettistä ainesta. Heti, kun proteiini on tuotettu isäntäorganismilla, on tavallisesti välttämätöntä käsitellä isäntäorganismia jollakin tavalla halutun proteiinin aikaansaamiseksi vapaassa muodossa. Joissakin tapauksissa, kuten valmistettaessa interferonia E. colissa lyysi- tai permeabi-lisaatiokäsittely yksistään voi olla riittävä tyydyttävien saantojen aikaansaamiseksi. Joitakin proteiineja tuotetaan kuitenkin isäntäorganismissa liukenemattomien proteiiniaggre-gaattien muodossa, jotka eivät ole herkkiä uutolle lyysi- tai permeabilisaatiokäsittelyllä yksistään. On esitetty, että esimerkiksi E. colissa tuotettu ihmisen insuliinifuusiopro-teiini muodostaa liukenemattomia proteiiniaggregaatteja (katso D.C. Williams et ai., Science, Voi. 215, sivut 687-689). Normaalissa biologisesti aktiivisessa muodossa (tästä lähtien nimitetty natiivimuodoksi) proteiini esiintyy peptidisidok-silla yhtsenliitettyjen aminohappojen ketjuna. Ketju on taittunut termodynaamisesti edulliseen kolmiulotteiseen rakenteeseen, jonka yhdenmukaisuutta suhteellisen heikot atomien väliset voimat, kuten vetysidokset, hydrofobiset vuorovaikutukset ja varausvuorovaikutukset ylläpitävät. Tietty lukumäärä S-S kovalenttisia sidoksia voi muodostaa molekyylien välisiä siltoja polypeptidiketjuesa. Tiettyjen isäntäorganismien tuottamilla liukenemattomilla proteiineilla ei esiinny niiden 2 78318 luonnollisten vastineiden funktionaalista aktiviteettia ja niillä on sen vuoksi yleensä vähän käyttöä kaupallisina tuotteina. Funktionaalisen aktiviteetin puute voi johtua lukuisista tekijöistä, mutta on todennäköistä, että tällaiset transfsormoiduilla isäntäorganismeilla tuotetut proteiinit muodostuvat rakennemuodossa, joka eroaa niiden luonnollisista tiloista. Tällaisten proteiinien muuttunut kolmiulotteinen rakenne ei ainoastaan johda liukenemattomuuteen vaan myös vähentää tai hävittää proteiinin biologisen aktiviteetin. Ei ole mahdollista ennustaa onko määrätyn isäntäorganismin ilmentämä määrätty proteiini liukoinen vai liukenematon.
Julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB-2100737A on selostettu menetelmä proteolyyttisen entsyymikymo-siinin valmistamiseksi. Prosessi käsittää kymosiinin esiasteen jonkin polypeptidin; preprokymosiinin, metioniiniproky-mosiinin tai metioniini-kymosiinin lohkaisemisen, joka voi olla sellaisen isäntäorganismin ilmentämä, joka on transformoitu vektorilla, joka sisältää kyseistä proteiinia koodaavan geenin. Menetelmää sellaisen isäntäorganismin valmistamiseksi, joka on transformoitu vektorilla, jossa on sopiva geeni, on selostettu yksityiskohtaisesti julkiseksi tulleen brittiläisen patenttihakemuksen GB-2100737A selityksessä.
Kymosiinin valmistusmenetelmään liittyvässä työssä on havaittu, että erilaisilla käytetyillä isäntäorganismeilla tuotetut kymosiinin esiasteproteiinit eivät syntyneet niiden natiivi-muodossa. Erityisesti E. colilla valmistettu metioniini-prokymosiini syntyy melkein kokonaisuudessaan liukenemattomana aggregaattina ja noin 75 X Saccharomyces cerevisiaessa tuotetusta metioniini-prokymosiinista syntyy liukenemattomassa muodossa.
Sellaisen natiivimuodossa olevan kymosiinin esiasteen valmistamiseksi, joka voidaan lohkaista aktiivisen natiivin ky-mosiinin muodostamiseksi, tulee isäntäorganismilla tuotetut
II
7831 8 proteiinit liuottaa ja muuntaa natiivimuotoonea ennenkuin proteiinipuhdietukeen ja -lohkaieun standardimenetelmiä voidaan soveltaa.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti on nyt aikaansaatu menetelmä kymosiinin valmistamiseksi, jossa kymosiinin esiasteen liukenematon muoto valmistetaan sellaisella isäntäorganismil-la, joka on transformoitu vektorilla, joka sisältää kymosii-nin esiastetta koodaavan geenin, jolloin kymosiinin esiasteen liukenematon muoto liuotetaan kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi, ennen kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon lohkaisemista kymosiinin muodostami-seks i .
Isäntäorganismilla tuotettu kymosiinin esiasteen liukenematon muoto on edullisesti preprokymosiini tai fuusioproteiini, joka sisältää preprokymosiinin, prokymosiinin tai kymosiinin aminohapposekvenssin, esimerkiksi metioniini-prokymosiini tai metioniini-kymosiini. Kymosiinin esiaste on edullisesti me-tioniini-prokymosiini. Isäntäorganismi voi olla isäntäorga-nismi tai isäntäorganismin jälkeläinen, joka on transformoitu (käyttäen julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB-2100737A selostettua tekniikkaa) vektorilla, joka sisältää kymosiinin esiastetta koodaavaa heterologieta geneettistä ainesta. Isäntäorganismi voi olla hiiva, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae tai bakteeri, esimerkiksi E. coli, B. eubtilis, B. stearothermophilue tai Pseudomonas. Edullisia isäntäorganismeja ovat Saccharomyces cerevisiae tai E. coli.
Erityisen edullinen ilmentämisjärjestelmä käsittää E. colin transformoituna vektorilla, joka sisältää kymosiinin esiastetta, metioniini-prokymosiinia, koodaavan geenin,
Sanalla "liukenematon" tarkoitetaan tässä yhteydessä muotoa, joka olennaisesti neutraaleissa olosuhteissa (esimerkiksi pH-alueella 5,5-6,5) on olennaisesti liukenematon tai liukenemattomaksi tekevässä yhteydessä sellaisen liukenemattoman aineen kanssa, jota syntyy isäntäorganismisolujen lyysissä.
« 78318
Liukenematon tuote syntyy joko isäntäorganismin solujen sisällä liukenemattomien suhteellisen euurimolekyylipainoisten aggregaattien muodossa tai voi yksinkertaisesti olla liittynyt liukenemattomaan solukalvoainekseen.
Kymosiinin esiasteen natiivimuodon aikaansaamiseksi on isän-täorganismi1la valmistetun liukenemattoman tuotteen rakenne-muotoa muutettava. Tämä voidaan tehdä denaturoimalla liukenematon proteiini. Denaturoinnin vaikutuksesta ne heikot atomien väliset voimat katoavat, jotka pitävät proteiinia sen kolmiulotteisessa muodossa, aiheuttaen proteiinin aukeamisen. Proteiinin vierekkäisten atomien väliset kovalenttiset sidokset pysyvät koskemattomina, S-S-sidokset mukaanluettuna, jotka säilyttävät proteiinin kolmiulotteisen rakenteen jossakin määrin. Proteiinin denaturoitu olotila on vähemmän tiivis ja on yleensä katalyyttisesti inaktiivinen. Denaturoitu olotila liukenee kuitenkin tavallisesti käytettyyn denaturointiliuok-seen. Denaturoivan aineen poistaminen liuotetusta proteiinista johtaa proteiinin uudestaan poimuttumiseen proteiinin termodynaamisesti edullisen natiiviolotilan aikaansaamiseksi. Denaturointia seuraa biologisen aktiivisuuden ilmestyminen.
Esillä olevan keksinnön erään edullisen piirteen mukaisesti liuottaminen käsittää kymosiinin esiasteen liukenemattoman muodon palautuvan denaturoinnin ja kymosiinin esiasteen antamisen sen jälkeen renaturoitua aikaansaaden siten kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon.
Kymosiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan edullisesti vesiliuoksessa, joka sisältää ureaa vähintään 7M pitoisuudessa ja sitten kymosiinin esiaste renaturoidaan alentamalla ureapitoisuus liuoksessa sen pitoisuuden alapuolelle, joka denaturoi tehokkaasti kymosiinin esiasteen, kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi.
Kun liukenematon kymosiinin esiaste käsitellään urealla, liukenematon esiaste liukenee täydellisesti. Proteiinin molekyy- 5 7831 8 lien väliset dieulfidisidokset säilyvät kuitenkin Ja toimivat jälkeenpäin uudestaanpoimuttumisytiminä. Kun urea poistetaan, esimerkiksi dialyysillä, palautuu proteiini termodynaamisesti pysyvään rakennemuotoon, joka kymosiinin esiasteiden ollessa kysymyksessä on sellainen rakennemuoto, joka voidaan muuntaa aktiiviseksi kymosiiniksi julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB-2100737A selostetuilla menetelmillä. Renaturoiduilla proteiineilla on natiiviproteiinien liukoisuusominaisuudet.
Eräässä suositussa lisäsuoritusmuodosea denaturoidaan kymosiinin esiasteen liukenematon muoto vesiliuoksessa, joka sisältää guanidiinihydrokloridia vähintään 6M pitoisuudessa ja sitten kymosiinin esiaste renaturoidaan alentamalla guanidii-nihydrokloridin pitoisuus liuoksessa alle kymosiinin esiasteen denaturoimiseksi tehokkaan koneentraation kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi.
Guanidiinihydrokloridin käytön fysikaalinen vaikutus on sama kuin yllä on selostettu urealle.
Eräässä edullisessa lisäsuoritusmuodosea kymosiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan emäksisessä vesiliuoksessa pH-alueella 9-11,5 ja sitten kymosiinin esiaste renaturoidaan alentamalla liuoksen pH sen pH-arvon alapuolelle, joka denaturoi tehokkaasti kymosiinin esiasteen, kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi.
Emäksisen vesiliuoksen pH on edullisesti 10-11. Kaikkein edullisin on emäksinen vesiliuos, jonka pH on 10,5-10,9, edullisesti noin 10,7.
Liukenemattoman kymosiinin esiasteen uutteen käsittely emäksisellä liuoksella yllä selostetulla tavalla ei johda kymosiinin esiasteen täydelliseen liukenemiseen. Koska liukenematonta ainesta, kuten solujätettä, on läsnä kaikkina aikoina, monet massansiirtovaikutukset ovat tärkeitä. On havaittu, et- e 7831 8 tä monivaiheuutto emäksellä on tehokkaampaa kuin yksinkertainen uutto jopa käytettäessä hyvin suuria uuttotilavuuksia. Tällä on myöskin se etu, että se aika, jonka liuotettu kymo-siinin esiaste on kosketuksissa emäksen kanssa tulee mahdollisimman lyhyeksi. Tämä on tärkeää, koska on olemassa viitteitä siitä, että prokymosiini hitaasti kadottaa aktiivisuuttaan emäksisissä liuoksissa. Keksinnön tässä suoritusmuodossa kymosiinin esiasteen liukenematon muoto on sen vuoksi edullisesti läsnä yhdessä isäntäorganismista peräisin olevien hajoamistuotteiden kanssa, jotka ovat liukenemattomia vesiliuokseen ja jolloin suoritetaan yksi tai useampi denaturoidun kymosiinin esiasteen uutto. Kyseessä olevien aineiden suhteellisen alhaiset hinnat huomioon ottaen on alkaliliuotustekniikka hyvin kiinnostava kaupallisen hyödyntämisen kannalta.
Liuotusmenetelmä voimakkaasti denaturoivaan aineeseen kuten guanidiinihydrokloridiin tai ureaan ja liuotusmenetelmä käyttäen emästä liuottavat kumpikin prosentuaalisesti huomattavia määriä liukenematonta kymosiinin esiastetta, jota esiintyy isäntäorganismien uutteissa. Kumpikaan ei kuitenkaan ole kvantitatiivinen natiivin kymosiinin esiasteen talteenoton suhteen. Syitä tähän ei ole selvästi määritelty ja ne ovat luultavasti erilaiset molemmille liuotustyypeille. Näyttää siltä, että guanidiinihydrokloridi liuottaa kaiken läsnä olevan aineksen kun taas ainoastaan osa muuttuu proteiineiksi, jotka kykenevät aktivoitumaan kymosiiniksi. Emäskäsittely ei ehkä mahdollista täydellistä renaturointia kymosiinin esiasteen natiivimuodon muodostamiseksi, mutta lisäksi se ei liuota kaikkea kymosiinin esiasteen liukenematonta muotoa. On havaittu, että yhdistelemällä nämä molemmat menetelmät, voidaan aikaansaada voimakkaasti parantunut kymosiinin esiasteen talteenotto sen natiivimuodossa.
Esillä olevan keksinnön erään lisäsuoritusmuodon mukaisesti kymosiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan vesiliuoksessa, saatu liuos laimennetaan 10-50 tilavuuteen emäksistä vesiliuosta, jonka pH on 9-11,5 ja kymosiinin esiaste
II
7 78318 renaturoid&an alentamalla liuoksen pH pH-arvon alle, joka denaturoi tehokkaasti kymosiinin esiasteen, kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi.
Denaturoitua kymosiinin esiastetta sisältävä liuos laimennetaan edullisesti emäksiseen vesiliuokseen, jonka pH on 10-11 ja edullisesti emäksiseen vesiliuokseen, jonka pH on 10,5-10,9, edullisesti noin 10,7.
Laimennus tuo mukanaan fysikaalisen erotuselementin denaturoitujen molekyylien välille, ennen kuin renaturointi suoritetaan, esimerkiksi neutralisoimalla emäksinen denaturointi-liuos. Denaturoitujen molekyylien laimennus ja siitä johtuva fysikaalinen erotus näyttää edesauttavan niiden denaturointia. Välittömästi yllä selostettu solubilisointiprosessi johtaa talteenottoon, joka metioniini-prokymosiinin kysymyksessä ollen on yli 30 % verrattuna esimerkiksi 10-20 X:iin myös yllä selostetuille monivaiheisille emäsuutoille.
Yllä selostetussa yhdistetyssä liuotusprosessissa kymosiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan edullisesti vesiliuoksessa, joka sisältää ureaa ainakin 7M pitoisuudessa tai liuoksessa, joka sisältää guanidiinihydrokloridia pitoisuudessa ainakin 6M.
Esillä olevaa keksintöä sovelletaan edullisesti sellaisen liukenemattoman metioniini-prokymosiinin liuottamiseen, joka on aikaansaatu isäntäorganismilla, joka on transformoitu vektorilla, joka sisältää metioniini-prokymosiinia koodaavan geenin. Isäntäorganismi on edullisesti E. coli.
Menetelmä isäntäorganismikoodauksen aikaansaamiseksi lukuisille kymosiinin esiasteille, metioniini-prokymosiini mukaanluettuna, on yksityiskohtaisesti selostettu julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB2100737A. Julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB-2100737A on lisäksi yksityiskohtia, joissa selostetaan aktiivisen kymosii- β 7831 8 nin valmistusta kymosiinin esiasteesta, joka on valmistettu natiivimuodossaan esillä olevan keksinnön 1iuotusmenetelmällä.
Joitakin suoritusmuotoja esillä olevasta keksinnöstä selostetaan alla yksityiskohtaisesti esimerkkien avulla.
Esimerkki 1
Suoritettiin koe, jossa vektorilla pCT70 transformoiduilla E. co1i-solui1la tuotetun liukenemattoman metioniini-prokymo-siinin liuotus aikaansaatiin käyttäen ureaa tai guanidiini-hydrokloridia denaturoivana aineena. Transformoidun E. coli-solulinjan valmistusta on selostettu yksityiskohtaiesti julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB-2100737A.
Pakastettuja E. coli/pCT70-soluja, joita oli kasvatettu keinotekoisissa olosuhteissa, suspendoitiin niiden painoon nähden kolminkertaiseen määrään 0,05 M tris-HCl pH8, 1 mM EDTA, 0,233 M NaCl, 10 *:sta glyseriinia (tilavuus/tilavuus), jossa o oli 130 /ug/ml lysotsyymiä ja suspensiota inkuboitiin 4 C:ssa 20 min. Natriumdeokeikolaattia lisättiin loppukonsentraatioon 0,05 % ja 10 /ug DNAaasia 1 (naudan haimasta) lisättiin per o gramma E. co1i-lähtöäinetta. Liuosta inkuboitiin 15 C:ssa 30 min, jona aikana liuoksen viskositeetti oli merkittävästi kohonnut. Lisättiin yhtä suuri tilavuus liuosta, jossa oli 0,01 M tris pH 8, 0,1 mM EDTA, 5 X glyseriiniä ja uutetta o sentrifugoitiin 45 min 4 C:ssa ja 10 000 x g. Tässä vaiheessa käytännöllisesti katsoen kaikki metioniini-prokymosiinituote oli pellettifraktiossa, oletettavasti johtuen aggregoitumi- sesta tai sitoutumisesta solujätteeseen. Pellettejä pestiin 50 tilavuudessa 0,01 M trie HC1, pH 8, 0,1 M NaCl, 1 mM o EDTA 4 C:ssa. Lisäsentrifugoinnin jäIkeen,kuten yllä, hylättiin päällä oleva liuos ja pelletti liuotettiin nopeasti huoneen lämpötilassa puskuriin, jossa oli joko 8 M ureaa tai 6 M guanidiinihydrok1oridia, 0,05 M trie 9 78318 HCl pH 8, 1 mM EDTA ja 0,1- M NaCl. Se dialysoitiin senjälkeen yon yli 4°C:ssa 200 tilavuudella 0,01 M tris. HCl pH 8, 1 mM EDTA 0,1 M NaCl ja 10 % glyseriiniä. Muodostui raskas sakka, (liukenemattomia E. coli-proteiineja) joka poistettiin sentrifugoimalla, jolloin saatiin natiivin metioniini-pro-kymosiiniproteiinin liuos. Liukoinen metioniini-prokymosiini oli muodossa, joka voitiin katalyyttisesti muuntaa aktiiviseksi kymosiiniksi happokäsittelyllä/neutralisoimalla, saman-lailla kuin on selostettu julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB2100737A.
Esimerkki 2
Suoritettiin koe, jossa vektorilla pCT70 transformoiduilla E-coli-soluilla tuotetun liukenemattoman metioniini-prokymo-siinin solubilisointi aikaansaatiin käyttäen emäksistä de-naturointia. Transformoidun E. coli-solulinjan valmistus on selostettu yksityiskohtaisesti julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemukssa GB2100737A.
Pakastettuja E. coli/pCT 70-soluja, jotka oli kasvatettu keinotekoisissa olosuhteissa, suspendoitiin niiden painoon nähden kolminkertaiseen määrään 0,05 M tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, jossa oli 23 ^ug/ml PilSF ja 130 ^ug/ml lysotsyymiä ja suspensiota inkuboitiin 4°C:ssa 20 min. Natriumdeoksikolaattia lisättiin loppukonsentraatioon 0,5 S ja 10 ^ug DNAsia 1 (naudan haimasta) lisättiin grammaa kohti E. coli-lähtöainetta. Liuosta inkuboitiin 15°C:ssa 30 min, jona aikana liuoksen viskositeetti merkittivästi kohosi.
Yllä selostetulla tavalla saatua uutetta sentrifugoitiin 45 min 4°C:ssa ja 10 000 x g. Tässä vaiheessa käytännöllisesti katsoen kaikki metioniini-prokymosiinituote oli pellet-tifraktiossa liukenemattomassa muodossa, oletettavasti johtuen aggregoitumisesta tai sitoutumisesta solujätteeseen. Pellettejä pestiin kolminkertaisella tilavuudella 0,01 M tris-HCl pH 8, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA 4°C:ssa. Lisäsentri-fugoinnin jälkeen kuten yllä, hylättiin päällä oleva liuos ja pelletti uudelleensuspendoitiin kolminkertaiseen tilavuuteen 10 7831 8 alkaliuuttopuskuria: 0,05 M K2 ΗΡΟ^ , 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, pH 10,7 ja suspensio säädettiin pH-arvoon 10,7 natrium-hydroksidilla. Suspension annettiin seistä vähintään 1 h (ja jopa 16 h) 4°C:ssa, päällä olevan nesteen pH säädettiin arvoon 8,0 lisäämällä väkevää HCliää ja sentrifugoitiin kuten yllä. Metioniini-prokymosiiniä, joka edustaa olennaista osaa pelletissä alunperin läsnä olevasta metioniini-prokymo-siinista, havaittiin esiintyvän päällä olevassa nesteessä liukoisessa muodossa, joka voitiin muuntaa katalyyttisesti aktiiviseksi kymoksiiniksi happokäsittely/neutralisointiaktivointi-käsittelyllä, pääasiallisesti kuten on selostettu julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB2100737A.
Lisäksi havaittiin, että ensimmäisen emäsuuton jälkeen jääneen jätteen uudelleenuutto vapauttaa yhtä suuren määrän prokymosiiniä. Emäsuutto voidaan toistaa kaiken kaikkiaan 4-5 kertaa, jolloin vapautuu suurin piirtein yhtä suuria määriä prokymosiiniä joka uutossa.
Esimerkki 3
Suoritettiin koe, jossa vektorilla pCT70 transformoiduilla E. coli-soluilla valmistetun metioniini-prokymosiinin solu-bilisointi aikaansaatiin käyttäen denaturointia guanidiini-hydrokloridillä, jota seurasi laimennus alkaliliuokseen. Transformoidun soluiinjän valmistusta on selostettu yksityiskohtaisesti julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB2100737A.
Liukenematonta metioniini-prokymosiiniä sisältävä E. coli/ pCT70-solujätettä valmistettiin ja pestiin kuten on selostettu yllä olevassa esimerkissä 1 ja sitä seuraavat toimenpiteet suoritettiin huoneen lämpötilassa. Solujäte liuotettiin 3-5-kertaiseen tilavuuteen puskuria lopulliseen kon-sentraatioon 6 M guanidiinia HCl/0,05 M Tris pH 8, ImM EDTA, 0,1 m NaCl ja annettiin seistä 30 min - 2 h. Seos laimennettiin 10-50 tilavuuteen yllä olevaa puskuria pH-arvossa 10,7 ilman guanidiini-HCl:ää. Laimennus suoritettiin lisäämällä näytettä hitaasti sekoitettuun laimennusaineeseen
II
11 7831 8 10-30 min sisällä. Laimennettu seos säädettiin uudestaan pH-arvoon 10,7 lisäämällä 1 M NaOH ja annettiin seistä 10 min - 2 h. Sen jälkeen pH säädettiin arvoon S lisäämällä 1 N HCl ja seoksen annettiin seistä vielä 30 min ennen sentrifugointia kuten yllä, saostuneiden proteiinien poistamiseksi. Näin muodostunut päällä oleva neste sisälsi liukoista metioniini-prokymosiinia, joka voitiin muuntaa kata-lyyttisesti aktiiviseksi kymosiiniksi happokäsittelyllä ja neutralisoimalla ja puhdistettiin, kuten on selostettu julkiseksi tulleessa brittiläisessä patenttihakemuksessa GB2100737A. Hyvin samantapaisessa kokeessa käytettiin 8M ureapuskuria yllä selostetun 6M guanidiini HCl-puskurin sijasta. Tulokset olivat samat kuin yllä on selostettu.
Claims (9)
- 7831 8 12
- 1. Menetelmä kymosiinin valmistamiseksi, jolloin kymo-siinin esiasteen liukenematon muoto tuotetaan E. colilla, joka on transformoitu vektorilla, jossa on kymosiinin esiastetta koodaava geeni, tunnettu siitä, että kymosiinin esiasteen liukenematon muoto liuotetaan kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi ennen kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon lohkaisemista kymosiinin aikaansaami-seks i.
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuottaminen käsittää kymosiinin esiasteen liukenemattoman muodon palautuvan denaturoinnin, minkä jälkeen ky-mosiinin esiasteen annetaan renaturoitua, kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi tällä tavoin.
- 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymosiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan vesiliuoksessa, joka sisältää ureaa vähintään 7M pitoisuudessa, ja sitten kymosiinin esiaste renaturoidaan alentamalla urean pitoisuus liuoksessa pitoisuuden alapuolelle, joka denaturoi tehokkaasti kymosiinin esiasteen, kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi.
- 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymosiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan vesiliuoksessa, jossa on guanidiinihydrokloridia vähintään 6M koneentraatiosea ja kymosiinin esiaste renaturoidaan jälkeenpäin alentamalla guanidiinihydrokloridin konsent-raatiota liuoksessa pitoisuuden alapuolelle, joka denaturoi tehokkaasti kymosiinin esiasteen, kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi.
- 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymosiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan emäksisessä vesiliuoksessa pH-arvossa 9-11,5 ja kymo-siinin esiaste renaturoidaan jälkeenpäin alentamalla liuoksen pH pH-arvon alapuolelle, joka denaturoi tehokkaasti kymosiinin II 13 7831 8 esiasteen, kymoeiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi .
- 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymosiinin esiasteen liukenematon muoto on läsnä yhdessä isäntäorganismista peräisin olevan hajoamistuotteen kanssa, joka on liukenematon vesiliuokseen ja että suoritetaan yksi tai useampi denaturoidun kymoeiinin esiasteen uutto.
- 7, Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymoeiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan vesiliuoksessa, saatu liuos laimennetaan 10-50 tilavuuteen emäksistä vesiliuosta pH-arvossa 9-11,5 ja kymoeiinin esiaste renaturoidaan alentamalla liuoksen pH pH-arvon alapuolelle, joka denaturoi tehokkaasti kymoeiinin esiasteen, kymosiinin esiasteen liukoisen natiivimuodon aikaansaamiseksi. Θ. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymoeiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan vesiliuoksessa, joka sisältää ureaa konsentraatiossa, joka on vähintään 7M.
- 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymosiinin esiasteen liukenematon muoto denaturoidaan vesiliuoksessa, joka sisältää vähintään 6 M guanidii-nihydrokloridia. 14 7831 8
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA404600 | 1982-06-07 | ||
| CA404600 | 1982-06-07 | ||
| GB8308234 | 1983-03-25 | ||
| GB838308234A GB8308234D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Recovery of products produced by host organisms |
| PCT/GB1983/000152 WO1983004418A1 (en) | 1982-06-07 | 1983-06-07 | A process for the preparation of chymosin |
| GB8300152 | 1983-06-07 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI840468A0 FI840468A0 (fi) | 1984-02-06 |
| FI840468A FI840468A (fi) | 1984-02-06 |
| FI78318B FI78318B (fi) | 1989-03-31 |
| FI78318C true FI78318C (fi) | 1989-07-10 |
Family
ID=25669713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI840468A FI78318C (fi) | 1982-06-07 | 1984-02-06 | Foerfarande foer framstaellning av kymosin. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0112849B1 (fi) |
| JP (1) | JPS59500996A (fi) |
| AU (1) | AU553017B2 (fi) |
| DE (1) | DE3373676D1 (fi) |
| DK (1) | DK49984A (fi) |
| FI (1) | FI78318C (fi) |
| GB (1) | GB2129810B (fi) |
| IE (1) | IE55163B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ204477A (fi) |
| WO (1) | WO1983004418A1 (fi) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4663285A (en) * | 1981-01-06 | 1987-05-05 | The Public Health Laboratory Service Board | Chimeric plasmids |
| US4961938A (en) * | 1982-12-22 | 1990-10-09 | Genentech, Inc. | Preparation of cheese with rennin from recombinant microbial cells |
| IE56372B1 (en) * | 1982-12-22 | 1991-07-03 | Genentech Inc | Microbially produced rennet methods for its production and plasmids used for its production |
| US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4620948A (en) * | 1982-12-22 | 1986-11-04 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4599197A (en) * | 1982-12-22 | 1986-07-08 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4518526A (en) * | 1982-12-22 | 1985-05-21 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| JPS59162879A (ja) * | 1982-12-22 | 1984-09-13 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 微生物により産生されるレンネツト、その産生及び再活性化方法並びにそれを使用するチ−ズの製造方法 |
| JPH06102034B2 (ja) * | 1983-03-25 | 1994-12-14 | セルテク リミテツド | タンパク質の生産方法 |
| EP0268743B1 (en) | 1983-03-25 | 1994-06-15 | Celltech Limited | A process for the production of a protein |
| US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
| US4935354A (en) * | 1983-07-14 | 1990-06-19 | Genentech, Inc. | Rennin from recombinant microbial cells for preparation of cheese |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US4721673A (en) * | 1983-09-01 | 1988-01-26 | Genex Corporation | Recovery and activation process for microbially produced calf prochymosin |
| IL74094A0 (en) * | 1984-01-23 | 1985-04-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Highly solubilised protein and production thereof |
| US5082775A (en) * | 1984-05-11 | 1992-01-21 | Berlex Laboratories, Inc. | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents |
| GB8414354D0 (en) * | 1984-06-05 | 1984-07-11 | Biogen Nv | Purifying protein |
| ES8800957A1 (es) * | 1985-02-22 | 1987-12-01 | Monsanto Co | Un metodo para la solubilizacion y renaturalizacion de proteina somatotropina |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| DE3611817A1 (de) * | 1986-04-08 | 1987-10-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur renaturierung von proteinen |
| US4705848A (en) * | 1986-06-02 | 1987-11-10 | International Minerals & Chemical Corp. | Isolation of bioactive, monomeric growth hormone |
| JPH02504383A (ja) | 1987-05-15 | 1990-12-13 | ボード オブ リージェンツ ザ ユニヴァーシティ オブ テキサス システム | 改良されたセラミック組成物及びその使用方法 |
| AU2257488A (en) * | 1987-07-29 | 1989-03-01 | Schering Biotech Corporation | Purification of human interleukin-4 expressed in escherichia coli |
| US5637566A (en) * | 1988-08-24 | 1997-06-10 | Southern Cross Biotech Pty. Ltd. | Method of improving carcass quality by administering growth hormone |
| US5064943A (en) * | 1988-12-16 | 1991-11-12 | American Cyanamid Company | Method for solubilization and naturation of somatotropin |
| AUPO005496A0 (en) * | 1996-05-24 | 1996-06-13 | Bresagen Limited | An interleukin-5 antagonist |
| US6465616B1 (en) | 1994-04-08 | 2002-10-15 | Bresagen Limited | Interleukin-5 antagonist |
| AU723413B2 (en) * | 1996-05-24 | 2000-08-24 | Bresagen Limited | An interleukin-5 antagonist |
| AU2093100A (en) * | 1999-01-25 | 2000-08-07 | Novozymes A/S | Recovery of a protein at high ph |
| DE10309691B4 (de) | 2003-02-28 | 2018-10-04 | Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V. | Gewinnung von löslichen Proteinen aus der Biomasse rekombinanter Mikroorganismen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4350764A (en) * | 1980-03-10 | 1982-09-21 | The Regents Of The University Of California | Microbiological synthesis of beta endorphin |
| IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
-
1983
- 1983-06-07 DE DE8383901829T patent/DE3373676D1/de not_active Expired
- 1983-06-07 IE IE134183A patent/IE55163B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-06-07 WO PCT/GB1983/000152 patent/WO1983004418A1/en active IP Right Grant
- 1983-06-07 GB GB08401585A patent/GB2129810B/en not_active Expired
- 1983-06-07 AU AU16073/83A patent/AU553017B2/en not_active Ceased
- 1983-06-07 NZ NZ20447783A patent/NZ204477A/en unknown
- 1983-06-07 JP JP50190083A patent/JPS59500996A/ja active Granted
- 1983-06-07 EP EP83901829A patent/EP0112849B1/en not_active Expired
-
1984
- 1984-02-03 DK DK49984A patent/DK49984A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-02-06 FI FI840468A patent/FI78318C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI840468A0 (fi) | 1984-02-06 |
| JPH0472508B2 (fi) | 1992-11-18 |
| NZ204477A (en) | 1986-09-10 |
| JPS59500996A (ja) | 1984-06-07 |
| EP0112849A1 (en) | 1984-07-11 |
| AU553017B2 (en) | 1986-06-26 |
| WO1983004418A1 (en) | 1983-12-22 |
| DK49984D0 (da) | 1984-02-03 |
| DE3373676D1 (en) | 1987-10-22 |
| GB8401585D0 (en) | 1984-02-22 |
| GB2129810A (en) | 1984-05-23 |
| FI78318B (fi) | 1989-03-31 |
| GB2129810B (en) | 1985-09-18 |
| FI840468A (fi) | 1984-02-06 |
| DK49984A (da) | 1984-02-03 |
| IE831341L (en) | 1983-12-07 |
| AU1607383A (en) | 1983-12-30 |
| IE55163B1 (en) | 1990-06-20 |
| EP0112849B1 (en) | 1987-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI78318C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av kymosin. | |
| EP0122080B1 (en) | A process for the production of a protein | |
| Marston et al. | [20] Solubilization of protein aggregates | |
| AU549721B2 (en) | Process for recovering human ifn-beta from a transformed microorganism | |
| US4766224A (en) | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies | |
| JP3929777B2 (ja) | 組換えタンパク質をリフォールディングするための凡用的な手順 | |
| JPS63280093A (ja) | 核酸の単離方法 | |
| JPH0336516B2 (fi) | ||
| US5340926A (en) | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate | |
| US5332805A (en) | Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate | |
| US5008377A (en) | Production of proteins in active forms | |
| EP0248618A2 (en) | Isolation of bioactive, monomeric growth hormone | |
| JPS62503143A (ja) | 形質転換した微生物からのソマトトロピンの精製 | |
| US5082775A (en) | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents | |
| CA1289492C (en) | Process for the production of chymosin | |
| NZ226998A (en) | Preparation of a peptide or protein by enzymatic hydrolysis of fusion protein | |
| CA1212053A (en) | Process for the production of a protein | |
| Ono et al. | Nonaggregating refolding of ribonuclease A using reverse micellar dialysis | |
| EP0268743B1 (en) | A process for the production of a protein | |
| EP0183776B2 (en) | A process for isolating and activating a substantially insoluble polypeptide using non-ionic detergents. | |
| Biedermann et al. | Release of periplasmic enzymes from Escherichia coli using tangential flow filtration | |
| DE3486319T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Proteins. | |
| NO166725B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av chymosin. | |
| Chang et al. | Separation of α-amylase by reversed micellar extraction effect of solvent type and cosolvent concentration on the transfer process | |
| MXPA01001168A (en) | Process for the preparation of active somatotropin from inclusion bodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: CHR. HANSEN A/S |
|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: CHR. HANSEN A/S |
|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: CHR. HANSEN A/S |