JP3929777B2 - 組換えタンパク質をリフォールディングするための凡用的な手順 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に組換えタンパク質の製造のための方法の分野にあり、そして特に、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物発現系の封入体において発現される組換えタンパク質のリフォールディングの分野にある。
【０００２】
「プロテオミクス」として称される、天然の生物学的活性および構造を有する組換えタンパク質の発現は、いくつかの生物についてのゲノム配列決定の完了およびヒトゲノム配列決定の近い完了と供にますます重要になる。プロテオミクスの１つの局面は、商業的適用と同様に、構造的かつ機能的な研究のために大量のタンパク質を発現することである。組換えタンパク質を発現するのに最も安価でかつ最も効率的な方法は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてタンパク質を発現することである。タンパク質は、細胞内に発現されるか、またはペリプラズム空間に分泌されるかのいずれかである。前者では、特にタンパク質が、ジスルフィド結合を有する場合、このそのタンパク質は、しばしば封入体に蓄積される。
【０００３】
しかし、Ｅ．ｃｏｌｉにおける哺乳動物タンパク質の発現における問題の１つは、発現されたタンパク質の多くが、不溶性の封入体を形成することである。この問題は、種々の哺乳動物の発現系または昆虫の発現系を使用することによって回避され得るが、Ｅ．ｃｏｌｉを増殖することは、哺乳動物細胞および昆虫細胞の培養と比較して、より早くかつ安価である。さらに、いくつかのタンパク質は、天然の形態で発現される場合、その宿主に有害であり、従って、不溶性の封入体としての発現が、大量の組換えタンパク質を得るための唯一の方法である。重要なことに、高いレベルの発現は、多くのタンパク質について達成され得る。１リットルの細菌培養物あたり４００〜６００ｍｇの封入体が、通常、達成され得、この方法を使用して、９，７００ｍｇ／Ｌまでが報告されている（Ｊｅｏｎｇ ＫＬ；Ｌｅｅ ＳＹ，１９９９．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３０２７−３２）。封入体は、単なる凍結／溶解および界面活剤での洗浄手順を使用して、９０％以上に容易に精製され得る。
【０００４】
細胞を光学顕微鏡下で観察する場合、封入体は、高密度な細胞質顆粒として見える。代表的には、細胞は、細胞の機械的な破壊によって溶解され、次いで４７００ｇで３０分間遠心分離される。封入体は、低い重力で沈降し、そして多くの他の細胞内タンパク質から分離され得る。さらなる精製は、細胞破壊の際に使用された緩衝液でペレットを洗浄することによってか、または４０〜５０％のグリセロール中で再懸濁されたペレットを遠心分離することによって行なわれ得る。
【０００５】
真核生物の多くの細胞内タンパク質は、ジスルフィド結合を含む。複数のジスルフィド結合を有するタンパク質は、その還元種からフォールディングする間に、非ネイティブのジスルフィド結合を形成し得る。次いで、さらなるフォールディングは、その誤ったジスルフィド結合が、外部のチオールでの還元によってかまたはタンパク質チオールからの攻撃によって切断されない限り、ブロックされる。ジスルフィド含有タンパク質を分泌する真核生物体はまた、適切なジスルフィド結合形成を保証するための機構を有する。封入体としての原核生物における組換えタンパク質の発現の別の短所は、タンパク質がそのネイティブ状態で得られず、そして、代表的には機能的に活性でないことである。種々の方法を使用して、タンパク質を再可溶化しそしてタンパク質をリフォールディングして、活性なタンパク質を再形成していた。ペレット化した組換えタンパク質の溶解は、通常、７Ｍの塩酸グアニジンまたは８Ｍの尿素のような変性剤の使用を必要とする。タンパク質が、変性剤中の置かれている場合、大量の凝集物が、時間と供に増加し続け得る（ＫｅｌｌｅｙおよびＷｉｎｋｌｅｒ，「Ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １２，１〜１９，６項（１９９０））。透析または脱塩カラムによる可溶化封入体からの変性剤の除去は、そのネイティブタンパク質がリフォールディングされるのに必要とする条件下で、そのタンパク質の沈殿を引き起こす。ミスフォールドされたタンパク質溶液はまた、生物学的なアッセイにおいて非常に低い比活性を有する。
【０００６】
封入体としてのＥ．ｃｏｌｉにおける種々のタンパク質の発現およびリフォールディングの多くの報告があるが、タンパク質リフォールディングの誤解のひとつは、固有のリフォールディング方法が、各々の個々のタンパク質のために開発されなければならないということである（ＫｅｌｌｅｙおよびＷｉｎｋｌｅｒ，６項を参照のこと）。別の誤解は、多くの哺乳動物のタンパク質が、封入体からリフォールディングされ得ないということである（総説に関して、Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ，Ｌｉｌｉｅ Ｈ，１９９６．ＦＡＳＥＢ Ｊ １０：４９〜５６；Ｌｉｌｉｅ Ｈ，Ｓｃｈｗａｒｚ Ｅ，Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ，１９９６．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９：４９７〜５０１を参照のこと）。公開された研究は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の封入体のリフォールディングにおける多くの「成功した」話であるので、哺乳動物のタンパク質の何パーセントが、この手順によって精製され得るかについて一般的な考えを得ることは不可能である。
【０００７】
おそらく、文献において報告されたリフォールディングされるタンパク質よりも多くのリフォールディング法がある（総説に関して、Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ，Ｌｉｌｉｅ Ｈ，１９９６．ＦＡＳＥＢ Ｊ １０：４９−５６；Ｌｉｌｉｅ Ｈ，Ｓｃｈｗａｒｚ Ｅ，Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ，１９９６．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９：４９７−５０１；Ｈｕｘｔａｂｌｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １２：３０５−３１４（１９９８）；Ｔｉｃｈｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４：５９−６３（１９９３）を参照のこと）。異なるシャペロン、変性剤およびカオトロピック試薬は、リフォールディングを助けるのに使用される。さらに、ｐＨ、イオン強度、温度、緩衝液処方、および還元剤／酸化剤は、すべてリフォールディングをもたらし得る。プロテオミクスまたは構造ゲノミクスにおける研究に必要とされるような、大量のタンパク質のリフォールディングのためのこれらすべての条件を試験するにはコストがかかる。
【０００８】
従って、組換え系（特にＥ．ｃｏｌｉのような系において封入体を形成する組換え系）において発現されるタンパク質の多くをリフォールディングする単一の簡略化された手順が必要とされる。
【０００９】
従って、本発明の目的は、タンパク質、特に組換えタンパク質、特に細菌宿主における封入体に存在する組換えタンパク質をリフォールディングするための「凡用的な」方法を提供することである。
【００１０】
（発明の要旨）
封入体として細菌に発現される種々の非常に異なるタンパク質のリフォールディングにおいて効果的であると実証された凡用的なフォールディング方法が、開発された。溶解され、そして生物学的に活性な形態（ネイティブな構造を有する）にリフォールディングされ得る代表的なタンパク質を、表Ｉに示す。この方法は、封入体に発現されるタンパク質をほどき、次いでリフォールディングする２つの重要な工程を有する。第１の工程は、変性剤の存在下で９、好ましくは１０より高いｐＨまでタンパク質溶液のｐＨを上昇させることである。このタンパク質溶液は、その上昇したｐＨにおいて約２４時間まで維持され得るか、または即座に、その溶液が約８．０のｐＨに達するまで、０．２ｐＨ単位／２４時間の増分において、ｐＨをゆっくりと低下させ得るか、または両方の工程を使用し得る。好ましい実施形態において、精製された封入体を、８Ｍ 尿素、０．１Ｍ トリス、１ｍＭ グリシン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ 還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＭ 酸化型グルタチオン（ＧＳＳＨ）、ｐＨ１０中で溶解する。このタンパク質溶液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）は、５．０である。この溶液を、迅速に２０容量の２０ｍＭのトリス塩基に希釈する。この得られた溶液を、１ＭのＨＣｌでｐＨ９．０に調整し、そしてこの溶液を、４℃で２４時間維持する。ｐＨをｐＨ８．８に調整し、そしてこの溶液を４℃でさらに２４時間維持する。このプロセスを、ｐＨが８．０に調整されるまで繰り返す。２４時間後にｐＨ８．０で、このリフォールディングされたタンパク質を限外濾過によって濃縮し、そして精製のためにゲル濾過カラムにアプライする。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
（組換えタンパク質の発現）
組換えタンパク質は、プラスミド、バクテリオファージのような標準的な発現ベクターまたは裸のＤＮＡでさえをも使用して、代表的には適切な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他のタイプの細菌のような原核生物発現系）において発現され、そのプラスミドまたはその宿主の染色体に組み込まれたＤＮＡから発現される。適切な細菌株は、市販されて得るか、またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．（「ＡＴＣＣ」）から入手され得る。
【００１２】
適切なベクターは、ＡＴＣＣを含む、多くの供給源から入手され得る。これらは、そのＤＮＡが宿主において発現されるのを確実にするためのプロモーターを必要とし、そして他の調節配列を含み得る。ベクターはまた、その組換えタンパク質の精製を容易にするために、検出のための手段（例えば、抗生物質耐性マーカー、緑色蛍光タンパク質タグ、または抗原タグ）を含み得る。
【００１３】
一旦、精製されるべきタンパク質をコードするＤＮＡが、宿主に導入されると、その宿主は、十分な量の組換えタンパク質が得られるまで、適切な条件下で培養される。
【００１４】
（リフォールディング／精製方法）
一旦、タンパク質を最大量で発現させると、このタンパク質は、その細菌の宿主から分離および単離されなければならない。このタンパク質を、一般には、細胞を溶解し（例えば、変性剤中で懸濁して、リゾチームを添加し）、次いで、凍結することによって（例えば、２０ｍｌのＴＮ／１％ＴｒｉｔｏｎＴＭＸ−１００中に細胞を懸濁し、１０ｍｇのリゾチームを添加し、そして−２０℃で一晩凍結することによって））、解凍しそしてＤＮＡａｓｅを添加して、全ての細菌ＤＮＡを分解し、次いで緩衝化溶液中でその得られた沈殿物を洗浄することによって単離する。次いで、この沈殿物を、リフォールディングのために、以下に議論されるような適切な溶液に溶解する。
【００１５】
次いで、この単離されたタンパク質をリフォールディングする。凡用的なリフォールディング方法にいくつかの重大な局面がある。
【００１６】
（ｉ 高ｐＨリフォールディング）
多くの公開された手順は、生理学的なｐＨ（一般には、ｐＨ７．４〜８．０）において還元カオトロピック剤（例えば、８Ｍの尿素）を使用してタンパク質をリフォールディングする。これは、一般に、大量の沈殿物および凝集物を生じて、これが、リフォールディングを不可能にするか、または非常に低収率にする。いくつかのタンパク質は、生理学的なｐＨではリフォールディングが、最初のリフォールディングｐＨが高い場合（少なくともｐＨ９．０であるが、より高いｐＨ（例えば、ｐＨ１０．０）が、所望され得る）にリフォールディングされ得ないことが見出されている。このストラテジーは、最初、ペプシノゲンが、ｐＨ８．０と９．０の間で、可逆的に変性／再生され得るという事実によって示唆された。高いｐＨ（例えば、ｐＨ９．０）において、タンパク質が、いくつかの二次構造をとり得、これが、リフォールディング溶液の酸性度が生物学的なｐＨより低い場合に、そのタンパク質がより効率的にリフォールディングされるのを可能にするということが、推定される。後に、生理学的なｐＨでリフォールディングされ得るタンパク質についてでさえ、高いｐＨでのリフォールディングが、より好収率を生じることが見出された。さらに、高ｐＨリフォールディングは、最初の大量の沈殿を防止するための優れた方法である。
【００１７】
（ｉｉ 非変性カオトロピック剤濃度）
非変性濃度のカオトロピック試薬（例えば、０．５〜１．０Ｍの尿素、塩酸グアニジンおよびＬ−アルギニン）を使用して、リフォールディングを補助し、そしてリフォールディングされたタンパク質を安定化し得ることが、いくつかの研究室において示されている（Ｒｕｄｏｌｐｈら、１９９６，ＦＡＳＥＢ Ｊ １０：４９〜５６）。カオトロピック試薬の好ましい濃度は、０．４Ｍであるが、その濃度は、０〜４Ｍの範囲であり得る。リフォールディング／精製手順における中程度の濃度の尿素は、タンパク質に対する変性効果を有さないことが見出されている。
【００１８】
（ｉｉｉ 還元／酸化試薬）
ジスルフィド結合を含む哺乳動物タンパク質のための封入体は、還元剤の存在下で溶解されることを必要とする。代表的な還元剤としては以下が挙げられる：β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ）；ＤＴＴ（０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ）；還元型グルタチオン（ＧＳＨ）（０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭ）；および酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）（０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭ）。β−メルカプトエタノールは、好ましい還元試薬である。さらに、ジチオトレイトールおよび／または還元型／酸化型グルタチオン（ＧＳＨ、ＧＳＳＧ）はまた、間違ってリフォールディングされた中間体シスルフィド結合の「酸化シャフッリング（ｏｘｉｄｏ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」を容易にするために含まれ得る。
【００１９】
（ｉｖ ｐＨ制御）
タンパク質溶液を、タンパク質をリフォールディングするのに十分な時間、ｐＨが高い状態に保つことが重要である。これは、好ましくは、２４時間あたり０．２ｐＨ単位増分において、ゆっくりとｐＨを低下することによって達成される。この方法において、このタンパク質溶液を、高いｐＨに、好ましくは、少なくとも９．０以上に、１０に、またはやや好ましくは１１に調整する。このタンパク質は、好ましくは、少なくとも２４時間各ｐＨで維持されるが、同様の効果は、より短い時間（例えば、３、６、９、１２、１８または２０時間、最も好ましくは、少なくとも１２時間）で達成され得る。ｐＨは、酸の添加によってか、またはより低いｐＨへの透析もしくは希釈によって調整され得る。酸の添加が好ましい。
【００２０】
上で議論される４つの条件は、「凡用的な」リフォールディング手順のための基礎的なプロトコールの最も本質的な局面だと考えられる。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解される。
【００２３】
（実施例１：組換えタンパク質をリフォールディングするための好ましい方法）
（Ａ．試薬：）
ＺＢ培地：１０ｇのＮ−Ｚ−アミンＡ，５ｇのＮａＣｌ／Ｌ
ＬＢ培地：１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ／Ｌ、ｐＨ７．５
８Ｍの尿素：８Ｍの尿素、０．１ＭのＴＲＩＳＴＭ、１ｍＭのグリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１０
ＴＮ緩衝液：０．０５ｍＭのＴＲＩＳＴＭ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５。
【００２４】
（Ｂ．組換えタンパク質の発現：）
１．発現プラスミドを、適切な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）株）にトランスフェクトし、そして所望の組換え生物体を選択する、ＺＢ／アンピシリンプレートにプレートすべきである。各構築物由来のシングルコロニーを、１００ｍｌのＺＢ／アンピシリン培地に播種し、そして３７℃で１６時間増殖させる。
【００２５】
２．１ＬのＬＢ／アンピシリンに２０ｍｌの一晩培養した培養物を播種し、そしてＯＤ６００が０．４〜０．６に達するまで３７℃で振盪する。０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、次いで３時間振盪する。
【００２６】
３．遠心分離し、そして２０ｍｌのＴＮ／１％のＴｒｉｔｏｎＴＭＸ−１００中に細胞を再懸濁する。１０ｍｇのリゾチームを加え、そして−２０℃で一晩凍結する。
【００２７】
４．凍結細胞を解凍し、２０μｌの１Ｍ ＭｇＳＯ４、１００μｇのＤＮＡａｓｅを加え、細菌のＤＮＡを完全に溶解するまで攪拌する。
【００２８】
５．２５０ｍｌのＴＮ／１％のＴｒｉｔｏｎを加え、そして２〜４時間攪拌する。遠心分離し、そしてもう１度Ｔｒｉｔｏｎ洗浄を繰り返す。
【００２９】
６．１０ｍｌの８Ｍ尿素溶液中にペレットを溶解し、１００ｍＭになるようにβ−メルカプトエタノールを添加する。この溶液を限外濾過し得、次いでリフォールディングの準備が整う。
【００３０】
（Ｃ．リフォールディングおよび精製：）
封入体を含む溶液のＯＤ２８０を、８Ｍの尿素溶液を使用して５．０に調節する。最終溶液は、以下の還元剤を含む：
１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール
１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）
１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）
０．１ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）
この溶液の最終ｐＨは、１０．０である。
【００３１】
１．上記の溶液を、迅速に２０容量の２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ塩基に希釈し、ｐＨを９．０に調節し、次いでゆっくりと１ＭのＨＣｌを使用して８．０に調節する（ｐＨが８．０になるまで、２４時間で８．８に、次いで２４時間で８．６に、などにｐＨを調節することによって）。あるいは、このタンパク質を、透析を使用してリフォールディングし得る。８Ｍの尿素溶液のＯＤ２８０を、０．５に調節し、そして２０容量のＴＲＩＳＴＭ塩基に対して透析する。この溶液のｐＨを、再度ゆっくりと８．０に調節する。
【００３２】
２．次いで、リフォールディングされた物質を、限外濾過によって濃縮し、そしてゲル濾過によって分離する（例えば、２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ、ＨＣｌ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で平衡化されたＳＥＰＨＡＣＲＹＬＴＭＳ−３００カラムにおいて）。
【００３３】
３．Ｓ−３００の画分を、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて泳動することによって確認し得る。誤ってリフォールディングされたタンパク質は、非常に高分子量で泳動するが、リフォールディングされたタンパク質は正常な分子量で泳動する。
【００３４】
４．Ｓ−３００カラムからのリフォールディングピークを、２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ−ＨＣｌ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−ＳＴＭのためのＨＥＰＥＳ緩衝液）、０．４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で平衡化されるＦＰＬＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−ＱＴＭカラム、またはＲｅｓｏｕｒｃｅ−ＳＴＭカラムを使用してさらに精製し得る。この酵素を、ＮａＣｌの直線勾配を使用してカラムから溶出する。表Ｉは、直接的にか、または封入体としてリフォールディングされた全てのタンパク質を列挙する。
【００３５】
（実施例２：メマプシン２（ｍｅｍａｐｓｉｎ２）の発現およびリフォールディング）
プロ−メマプシン２をＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＴ１１ａベクターのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この得られたベクターは、Ａｌａ−８ｐからＡｌａ３２６までの配列を有するプロ−メマプシン２を発現する。２つの発現ベクター（ｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ１（本明細書中で以後、Ｔ１）およびｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ２（本明細書中で以後、Ｔ２））を構築した。両方のベクターにおいて、発現した組換えタンパク質のＮ末端の１５残基は、発現ベクター由来である。プロ−メマプシン２残基は、残基Ａｌａ−１６で始まる。この２つの組換えプロ−メマプシン２ｓは、Ｃ末端の長さが異なる。クローンＴ１は、Ｔｈｒ−４５４で終わり、そしてクローンＴ２はＡｌａ−４１９で終わる。Ｔ１構築物は、Ｔ２構築物由来のＣ−末端伸長を含むが、推定される膜貫通ドメイは全く発現しない。
【００３６】
このＴ１発現ベクターおよびＴ２発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）に別々にトランスフェクした。トランスフェクト細菌の培養、組換えタンパク質の合成のための誘導ならびに組換えタンパク質を含む封入体の回収および洗浄のための手順は、本質的に、Ｌｉｎら、１９９４ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１４，１９５〜２２４に記載される通りである。基本的には、封入体を、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１ＭのＴｒｉｓＴＭ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中の０．１５ＭのＮａＣｌで洗浄して、不溶性タンパク質を、８Ｍの尿素、０．０５Ｍのシクロヘキシルアミノプロペンスルホン酸、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、１ｍＭのグリシンおよび１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），ｐＨ１０．５を含む溶液に溶解して、約５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にする。この溶液を２０容量の迅速に攪拌した２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基に滴下する。希釈溶液のｐＨを、１ＭのＨＣｌを使用して９．０に再調節し、そして４℃で２４時間維持する。次いで、ｐＨを１ＭのＨＣｌを使用して８．８に調節し、そして４℃で再度２４時間維持する。このプロセスを、ｐＨが、８．０に調節されるまで繰り返す。
【００３７】
この３つの異なるリフォールディング法は、良好な結果を生じた。
【００３８】
（ｉ 急速希釈法）
ＯＤ２８０ｎｍ＝５を有する、８Ｍの尿素／１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＨ）中のプロ−メマプシン２を、迅速に２０容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基に希釈した。この溶液を、ゆっくりと１ＭのＨＣｌを使用してｐＨ８に調節した。次いで、リフォールディング溶液を、精製に進める前に、４℃で２４〜４８時間維持した。
【００３９】
（ｉｉ 逆透析法）
等量の２０ｍＭのＴｒｉｓＴＭ、０．５ｍＭの酸化型グルタチオン／１．２５ｍＭの還元型グルタチオン，ｐＨ９．０を、ＯＤ２８０ｎｍ＝５を有する、８Ｍの尿素／１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール中の迅速に攪拌したプロ−メマプシン２に加える。このプロセスを、１時間の間隔でさらに３回繰り返す。次いで、この得られた溶液を、最終尿素濃度が０．４Ｍとなるような十分な容量の２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ塩基に対して透析する。次いで、この溶液のｐＨを、１ＭのＨＣｌを使用して８．０にゆっくりと調節する。
【００４０】
（ｉｉｉ リフォールディングのための好ましい方法）
封入体を、８Ｍの尿素、０．１ＭのＴＲＩＳＴＭ、１ｍＭのグリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ１０．０に溶解する。封入体のＯＤ２８０を、β−メルカプトエタノールを含まない８Ｍの尿素溶液を使用して５．０に調節する。最終の溶液は、以下の還元剤を含む：１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭの還元型グルタチオン、および０．１Ｍの酸化型グルタチオン。溶液の最終ｐＨは、１０．０である。
【００４１】
上記の溶液を、迅速に２０容量の２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ塩基に希釈し、ｐＨを９．０に調製し、そして得られた溶液を４℃で１６時間維持する。この溶液を、再度６時間で室温に平衡化し、そしてｐＨを８．５に調節する。この溶液を１８時間で再度４℃に戻す。
【００４２】
この溶液を、６時間で室温に再度平衡化し、そしてｐＨを８．０に調節する。この溶液を４〜７日で再び４℃に戻す。
【００４３】
（組換えプロ−メマプシン２−Ｔ１の精製）
リフォールディングされた物質を、限外濾過によって濃縮し、２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭＨＣｌ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で平衡化されたＳＥＰＨＡＣＲＹＬＴＭＳ−３００カラムで分離する。Ｓ−３００カラムからのリフォールディングピーク（第２のピーク）を、２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ−ＨＣｌ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で平衡化される、ＦＰＬＣ ＲＥＳＯＵＲＣＥ−ＱＴＭカラムを使用してさらに精製し得る。この酵素を、ＮａＣｌの直線勾配を使用してカラムから溶出する。Ｓ−３００からのリフォールディングピークをまた、さらなる精製の前に活性化し得る。活性化のために、この画分を、等量の０．２Ｍの酢酸ナトリウム、７０％のグリセロール、ｐＨ４．０と混合する。この混合物を、２２℃で１８時間インキュベートし、次いで、２０容量の２０ｍＭのＢｉｓ−ＴＲＩＳＴＭ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ６．０に対して２回透析する。次いで、この透析された物質を、２０のＢｉｓ−ＴＲＩＳＴＭ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ６．０で平衡化したＦＰＬＣ ＲＥＳＯＵＲＣＥ−ＱＴＭカラムでさらに精製する。この酵素を、ＮａＣｌの直線勾配を使用して溶出する。
【００４４】
これらの方法の改変およびバリエーションは、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
（発明の背景）
本発明は、一般に組換えタンパク質の製造のための方法の分野にあり、そして特に、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物発現系の封入体において発現される組換えタンパク質のリフォールディングの分野にある。
【０００２】
「プロテオミクス」として称される、天然の生物学的活性および構造を有する組換えタンパク質の発現は、いくつかの生物についてのゲノム配列決定の完了およびヒトゲノム配列決定の近い完了と供にますます重要になる。プロテオミクスの１つの局面は、商業的適用と同様に、構造的かつ機能的な研究のために大量のタンパク質を発現することである。組換えタンパク質を発現するのに最も安価でかつ最も効率的な方法は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてタンパク質を発現することである。タンパク質は、細胞内に発現されるか、またはペリプラズム空間に分泌されるかのいずれかである。前者では、特にタンパク質が、ジスルフィド結合を有する場合、このそのタンパク質は、しばしば封入体に蓄積される。
【０００３】
しかし、Ｅ．ｃｏｌｉにおける哺乳動物タンパク質の発現における問題の１つは、発現されたタンパク質の多くが、不溶性の封入体を形成することである。この問題は、種々の哺乳動物の発現系または昆虫の発現系を使用することによって回避され得るが、Ｅ．ｃｏｌｉを増殖することは、哺乳動物細胞および昆虫細胞の培養と比較して、より早くかつ安価である。さらに、いくつかのタンパク質は、天然の形態で発現される場合、その宿主に有害であり、従って、不溶性の封入体としての発現が、大量の組換えタンパク質を得るための唯一の方法である。重要なことに、高いレベルの発現は、多くのタンパク質について達成され得る。１リットルの細菌培養物あたり４００〜６００ｍｇの封入体が、通常、達成され得、この方法を使用して、９，７００ｍｇ／Ｌまでが報告されている（Ｊｅｏｎｇ ＫＬ；Ｌｅｅ ＳＹ，１９９９．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３０２７−３２）。封入体は、単なる凍結／溶解および界面活剤での洗浄手順を使用して、９０％以上に容易に精製され得る。
【０００４】
細胞を光学顕微鏡下で観察する場合、封入体は、高密度な細胞質顆粒として見える。代表的には、細胞は、細胞の機械的な破壊によって溶解され、次いで４７００ｇで３０分間遠心分離される。封入体は、低い重力で沈降し、そして多くの他の細胞内タンパク質から分離され得る。さらなる精製は、細胞破壊の際に使用された緩衝液でペレットを洗浄することによってか、または４０〜５０％のグリセロール中で再懸濁されたペレットを遠心分離することによって行なわれ得る。
【０００５】
真核生物の多くの細胞内タンパク質は、ジスルフィド結合を含む。複数のジスルフィド結合を有するタンパク質は、その還元種からフォールディングする間に、非ネイティブのジスルフィド結合を形成し得る。次いで、さらなるフォールディングは、その誤ったジスルフィド結合が、外部のチオールでの還元によってかまたはタンパク質チオールからの攻撃によって切断されない限り、ブロックされる。ジスルフィド含有タンパク質を分泌する真核生物体はまた、適切なジスルフィド結合形成を保証するための機構を有する。封入体としての原核生物における組換えタンパク質の発現の別の短所は、タンパク質がそのネイティブ状態で得られず、そして、代表的には機能的に活性でないことである。種々の方法を使用して、タンパク質を再可溶化しそしてタンパク質をリフォールディングして、活性なタンパク質を再形成していた。ペレット化した組換えタンパク質の溶解は、通常、７Ｍの塩酸グアニジンまたは８Ｍの尿素のような変性剤の使用を必要とする。タンパク質が、変性剤中の置かれている場合、大量の凝集物が、時間と供に増加し続け得る（ＫｅｌｌｅｙおよびＷｉｎｋｌｅｒ，「Ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １２，１〜１９，６項（１９９０））。透析または脱塩カラムによる可溶化封入体からの変性剤の除去は、そのネイティブタンパク質がリフォールディングされるのに必要とする条件下で、そのタンパク質の沈殿を引き起こす。ミスフォールドされたタンパク質溶液はまた、生物学的なアッセイにおいて非常に低い比活性を有する。
【０００６】
封入体としてのＥ．ｃｏｌｉにおける種々のタンパク質の発現およびリフォールディングの多くの報告があるが、タンパク質リフォールディングの誤解のひとつは、固有のリフォールディング方法が、各々の個々のタンパク質のために開発されなければならないということである（ＫｅｌｌｅｙおよびＷｉｎｋｌｅｒ，６項を参照のこと）。別の誤解は、多くの哺乳動物のタンパク質が、封入体からリフォールディングされ得ないということである（総説に関して、Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ，Ｌｉｌｉｅ Ｈ，１９９６．ＦＡＳＥＢ Ｊ １０：４９〜５６；Ｌｉｌｉｅ Ｈ，Ｓｃｈｗａｒｚ Ｅ，Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ，１９９６．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９：４９７〜５０１を参照のこと）。公開された研究は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の封入体のリフォールディングにおける多くの「成功した」話であるので、哺乳動物のタンパク質の何パーセントが、この手順によって精製され得るかについて一般的な考えを得ることは不可能である。
【０００７】
おそらく、文献において報告されたリフォールディングされるタンパク質よりも多くのリフォールディング法がある（総説に関して、Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ，Ｌｉｌｉｅ Ｈ，１９９６．ＦＡＳＥＢ Ｊ １０：４９−５６；Ｌｉｌｉｅ Ｈ，Ｓｃｈｗａｒｚ Ｅ，Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ，１９９６．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９：４９７−５０１；Ｈｕｘｔａｂｌｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １２：３０５−３１４（１９９８）；Ｔｉｃｈｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４：５９−６３（１９９３）を参照のこと）。異なるシャペロン、変性剤およびカオトロピック試薬は、リフォールディングを助けるのに使用される。さらに、ｐＨ、イオン強度、温度、緩衝液処方、および還元剤／酸化剤は、すべてリフォールディングをもたらし得る。プロテオミクスまたは構造ゲノミクスにおける研究に必要とされるような、大量のタンパク質のリフォールディングのためのこれらすべての条件を試験するにはコストがかかる。
【０００８】
従って、組換え系（特にＥ．ｃｏｌｉのような系において封入体を形成する組換え系）において発現されるタンパク質の多くをリフォールディングする単一の簡略化された手順が必要とされる。
【０００９】
従って、本発明の目的は、タンパク質、特に組換えタンパク質、特に細菌宿主における封入体に存在する組換えタンパク質をリフォールディングするための「凡用的な」方法を提供することである。
【００１０】
（発明の要旨）
封入体として細菌に発現される種々の非常に異なるタンパク質のリフォールディングにおいて効果的であると実証された凡用的なフォールディング方法が、開発された。溶解され、そして生物学的に活性な形態（ネイティブな構造を有する）にリフォールディングされ得る代表的なタンパク質を、表Ｉに示す。この方法は、封入体に発現されるタンパク質をほどき、次いでリフォールディングする２つの重要な工程を有する。第１の工程は、変性剤の存在下で９、好ましくは１０より高いｐＨまでタンパク質溶液のｐＨを上昇させることである。このタンパク質溶液は、その上昇したｐＨにおいて約２４時間まで維持され得るか、または即座に、その溶液が約８．０のｐＨに達するまで、０．２ｐＨ単位／２４時間の増分において、ｐＨをゆっくりと低下させ得るか、または両方の工程を使用し得る。好ましい実施形態において、精製された封入体を、８Ｍ 尿素、０．１Ｍ トリス、１ｍＭ グリシン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ 還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＭ 酸化型グルタチオン（ＧＳＳＨ）、ｐＨ１０中で溶解する。このタンパク質溶液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）は、５．０である。この溶液を、迅速に２０容量の２０ｍＭのトリス塩基に希釈する。この得られた溶液を、１ＭのＨＣｌでｐＨ９．０に調整し、そしてこの溶液を、４℃で２４時間維持する。ｐＨをｐＨ８．８に調整し、そしてこの溶液を４℃でさらに２４時間維持する。このプロセスを、ｐＨが８．０に調整されるまで繰り返す。２４時間後にｐＨ８．０で、このリフォールディングされたタンパク質を限外濾過によって濃縮し、そして精製のためにゲル濾過カラムにアプライする。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
（組換えタンパク質の発現）
組換えタンパク質は、プラスミド、バクテリオファージのような標準的な発現ベクターまたは裸のＤＮＡでさえをも使用して、代表的には適切な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他のタイプの細菌のような原核生物発現系）において発現され、そのプラスミドまたはその宿主の染色体に組み込まれたＤＮＡから発現される。適切な細菌株は、市販されて得るか、またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．（「ＡＴＣＣ」）から入手され得る。
【００１２】
適切なベクターは、ＡＴＣＣを含む、多くの供給源から入手され得る。これらは、そのＤＮＡが宿主において発現されるのを確実にするためのプロモーターを必要とし、そして他の調節配列を含み得る。ベクターはまた、その組換えタンパク質の精製を容易にするために、検出のための手段（例えば、抗生物質耐性マーカー、緑色蛍光タンパク質タグ、または抗原タグ）を含み得る。
【００１３】
一旦、精製されるべきタンパク質をコードするＤＮＡが、宿主に導入されると、その宿主は、十分な量の組換えタンパク質が得られるまで、適切な条件下で培養される。
【００１４】
（リフォールディング／精製方法）
一旦、タンパク質を最大量で発現させると、このタンパク質は、その細菌の宿主から分離および単離されなければならない。このタンパク質を、一般には、細胞を溶解し（例えば、変性剤中で懸濁して、リゾチームを添加し）、次いで、凍結することによって（例えば、２０ｍｌのＴＮ／１％ＴｒｉｔｏｎＴＭＸ−１００中に細胞を懸濁し、１０ｍｇのリゾチームを添加し、そして−２０℃で一晩凍結することによって））、解凍しそしてＤＮＡａｓｅを添加して、全ての細菌ＤＮＡを分解し、次いで緩衝化溶液中でその得られた沈殿物を洗浄することによって単離する。次いで、この沈殿物を、リフォールディングのために、以下に議論されるような適切な溶液に溶解する。
【００１５】
次いで、この単離されたタンパク質をリフォールディングする。凡用的なリフォールディング方法にいくつかの重大な局面がある。
【００１６】
（ｉ 高ｐＨリフォールディング）
多くの公開された手順は、生理学的なｐＨ（一般には、ｐＨ７．４〜８．０）において還元カオトロピック剤（例えば、８Ｍの尿素）を使用してタンパク質をリフォールディングする。これは、一般に、大量の沈殿物および凝集物を生じて、これが、リフォールディングを不可能にするか、または非常に低収率にする。いくつかのタンパク質は、生理学的なｐＨではリフォールディングが、最初のリフォールディングｐＨが高い場合（少なくともｐＨ９．０であるが、より高いｐＨ（例えば、ｐＨ１０．０）が、所望され得る）にリフォールディングされ得ないことが見出されている。このストラテジーは、最初、ペプシノゲンが、ｐＨ８．０と９．０の間で、可逆的に変性／再生され得るという事実によって示唆された。高いｐＨ（例えば、ｐＨ９．０）において、タンパク質が、いくつかの二次構造をとり得、これが、リフォールディング溶液の酸性度が生物学的なｐＨより低い場合に、そのタンパク質がより効率的にリフォールディングされるのを可能にするということが、推定される。後に、生理学的なｐＨでリフォールディングされ得るタンパク質についてでさえ、高いｐＨでのリフォールディングが、より好収率を生じることが見出された。さらに、高ｐＨリフォールディングは、最初の大量の沈殿を防止するための優れた方法である。
【００１７】
（ｉｉ 非変性カオトロピック剤濃度）
非変性濃度のカオトロピック試薬（例えば、０．５〜１．０Ｍの尿素、塩酸グアニジンおよびＬ−アルギニン）を使用して、リフォールディングを補助し、そしてリフォールディングされたタンパク質を安定化し得ることが、いくつかの研究室において示されている（Ｒｕｄｏｌｐｈら、１９９６，ＦＡＳＥＢ Ｊ １０：４９〜５６）。カオトロピック試薬の好ましい濃度は、０．４Ｍであるが、その濃度は、０〜４Ｍの範囲であり得る。リフォールディング／精製手順における中程度の濃度の尿素は、タンパク質に対する変性効果を有さないことが見出されている。
【００１８】
（ｉｉｉ 還元／酸化試薬）
ジスルフィド結合を含む哺乳動物タンパク質のための封入体は、還元剤の存在下で溶解されることを必要とする。代表的な還元剤としては以下が挙げられる：β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ）；ＤＴＴ（０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ）；還元型グルタチオン（ＧＳＨ）（０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭ）；および酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）（０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭ）。β−メルカプトエタノールは、好ましい還元試薬である。さらに、ジチオトレイトールおよび／または還元型／酸化型グルタチオン（ＧＳＨ、ＧＳＳＧ）はまた、間違ってリフォールディングされた中間体シスルフィド結合の「酸化シャフッリング（ｏｘｉｄｏ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」を容易にするために含まれ得る。
【００１９】
（ｉｖ ｐＨ制御）
タンパク質溶液を、タンパク質をリフォールディングするのに十分な時間、ｐＨが高い状態に保つことが重要である。これは、好ましくは、２４時間あたり０．２ｐＨ単位増分において、ゆっくりとｐＨを低下することによって達成される。この方法において、このタンパク質溶液を、高いｐＨに、好ましくは、少なくとも９．０以上に、１０に、またはやや好ましくは１１に調整する。このタンパク質は、好ましくは、少なくとも２４時間各ｐＨで維持されるが、同様の効果は、より短い時間（例えば、３、６、９、１２、１８または２０時間、最も好ましくは、少なくとも１２時間）で達成され得る。ｐＨは、酸の添加によってか、またはより低いｐＨへの透析もしくは希釈によって調整され得る。酸の添加が好ましい。
【００２０】
上で議論される４つの条件は、「凡用的な」リフォールディング手順のための基礎的なプロトコールの最も本質的な局面だと考えられる。
【００２１】
【表１】
【表２】
【００２３】
（実施例１：組換えタンパク質をリフォールディングするための好ましい方法）
（Ａ．試薬：）
ＺＢ培地：１０ｇのＮ−Ｚ−アミンＡ，５ｇのＮａＣｌ／Ｌ
ＬＢ培地：１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ／Ｌ、ｐＨ７．５
８Ｍの尿素：８Ｍの尿素、０．１ＭのＴＲＩＳＴＭ、１ｍＭのグリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１０
ＴＮ緩衝液：０．０５ｍＭのＴＲＩＳＴＭ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５。
【００２４】
（Ｂ．組換えタンパク質の発現：）
１．発現プラスミドを、適切な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）株）にトランスフェクトし、そして所望の組換え生物体を選択する、ＺＢ／アンピシリンプレートにプレートすべきである。各構築物由来のシングルコロニーを、１００ｍｌのＺＢ／アンピシリン培地に播種し、そして３７℃で１６時間増殖させる。
【００２５】
２．１ＬのＬＢ／アンピシリンに２０ｍｌの一晩培養した培養物を播種し、そしてＯＤ６００が０．４〜０．６に達するまで３７℃で振盪する。０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、次いで３時間振盪する。
【００２６】
３．遠心分離し、そして２０ｍｌのＴＮ／１％のＴｒｉｔｏｎＴＭＸ−１００中に細胞を再懸濁する。１０ｍｇのリゾチームを加え、そして−２０℃で一晩凍結する。
【００２７】
４．凍結細胞を解凍し、２０μｌの１Ｍ ＭｇＳＯ４、１００μｇのＤＮＡａｓｅを加え、細菌のＤＮＡを完全に溶解するまで攪拌する。
【００２８】
５．２５０ｍｌのＴＮ／１％のＴｒｉｔｏｎを加え、そして２〜４時間攪拌する。遠心分離し、そしてもう１度Ｔｒｉｔｏｎ洗浄を繰り返す。
【００２９】
６．１０ｍｌの８Ｍ尿素溶液中にペレットを溶解し、１００ｍＭになるようにβ−メルカプトエタノールを添加する。この溶液を限外濾過し得、次いでリフォールディングの準備が整う。
【００３０】
（Ｃ．リフォールディングおよび精製：）
封入体を含む溶液のＯＤ２８０を、８Ｍの尿素溶液を使用して５．０に調節する。最終溶液は、以下の還元剤を含む：
１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール
１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）
１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）
０．１ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）
この溶液の最終ｐＨは、１０．０である。
【００３１】
１．上記の溶液を、迅速に２０容量の２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ塩基に希釈し、ｐＨを９．０に調節し、次いでゆっくりと１ＭのＨＣｌを使用して８．０に調節する（ｐＨが８．０になるまで、２４時間で８．８に、次いで２４時間で８．６に、などにｐＨを調節することによって）。あるいは、このタンパク質を、透析を使用してリフォールディングし得る。８Ｍの尿素溶液のＯＤ２８０を、０．５に調節し、そして２０容量のＴＲＩＳＴＭ塩基に対して透析する。この溶液のｐＨを、再度ゆっくりと８．０に調節する。
【００３２】
２．次いで、リフォールディングされた物質を、限外濾過によって濃縮し、そしてゲル濾過によって分離する（例えば、２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ、ＨＣｌ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で平衡化されたＳＥＰＨＡＣＲＹＬＴＭＳ−３００カラムにおいて）。
【００３３】
３．Ｓ−３００の画分を、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて泳動することによって確認し得る。誤ってリフォールディングされたタンパク質は、非常に高分子量で泳動するが、リフォールディングされたタンパク質は正常な分子量で泳動する。
【００３４】
４．Ｓ−３００カラムからのリフォールディングピークを、２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ−ＨＣｌ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−ＳＴＭのためのＨＥＰＥＳ緩衝液）、０．４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で平衡化されるＦＰＬＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−ＱＴＭカラム、またはＲｅｓｏｕｒｃｅ−ＳＴＭカラムを使用してさらに精製し得る。この酵素を、ＮａＣｌの直線勾配を使用してカラムから溶出する。表Ｉは、直接的にか、または封入体としてリフォールディングされた全てのタンパク質を列挙する。
【００３５】
（実施例２：メマプシン２（ｍｅｍａｐｓｉｎ２）の発現およびリフォールディング）
プロ−メマプシン２をＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＴ１１ａベクターのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この得られたベクターは、Ａｌａ−８ｐからＡｌａ３２６までの配列を有するプロ−メマプシン２を発現する。２つの発現ベクター（ｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ１（本明細書中で以後、Ｔ１）およびｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ２（本明細書中で以後、Ｔ２））を構築した。両方のベクターにおいて、発現した組換えタンパク質のＮ末端の１５残基は、発現ベクター由来である。プロ−メマプシン２残基は、残基Ａｌａ−１６で始まる。この２つの組換えプロ−メマプシン２ｓは、Ｃ末端の長さが異なる。クローンＴ１は、Ｔｈｒ−４５４で終わり、そしてクローンＴ２はＡｌａ−４１９で終わる。Ｔ１構築物は、Ｔ２構築物由来のＣ−末端伸長を含むが、推定される膜貫通ドメイは全く発現しない。
【００３６】
このＴ１発現ベクターおよびＴ２発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）に別々にトランスフェクした。トランスフェクト細菌の培養、組換えタンパク質の合成のための誘導ならびに組換えタンパク質を含む封入体の回収および洗浄のための手順は、本質的に、Ｌｉｎら、１９９４ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１４，１９５〜２２４に記載される通りである。基本的には、封入体を、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１ＭのＴｒｉｓＴＭ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中の０．１５ＭのＮａＣｌで洗浄して、不溶性タンパク質を、８Ｍの尿素、０．０５Ｍのシクロヘキシルアミノプロペンスルホン酸、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、１ｍＭのグリシンおよび１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），ｐＨ１０．５を含む溶液に溶解して、約５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にする。この溶液を２０容量の迅速に攪拌した２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基に滴下する。希釈溶液のｐＨを、１ＭのＨＣｌを使用して９．０に再調節し、そして４℃で２４時間維持する。次いで、ｐＨを１ＭのＨＣｌを使用して８．８に調節し、そして４℃で再度２４時間維持する。このプロセスを、ｐＨが、８．０に調節されるまで繰り返す。
【００３７】
この３つの異なるリフォールディング法は、良好な結果を生じた。
【００３８】
（ｉ 急速希釈法）
ＯＤ２８０ｎｍ＝５を有する、８Ｍの尿素／１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＨ）中のプロ−メマプシン２を、迅速に２０容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基に希釈した。この溶液を、ゆっくりと１ＭのＨＣｌを使用してｐＨ８に調節した。次いで、リフォールディング溶液を、精製に進める前に、４℃で２４〜４８時間維持した。
【００３９】
（ｉｉ 逆透析法）
等量の２０ｍＭのＴｒｉｓＴＭ、０．５ｍＭの酸化型グルタチオン／１．２５ｍＭの還元型グルタチオン，ｐＨ９．０を、ＯＤ２８０ｎｍ＝５を有する、８Ｍの尿素／１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール中の迅速に攪拌したプロ−メマプシン２に加える。このプロセスを、１時間の間隔でさらに３回繰り返す。次いで、この得られた溶液を、最終尿素濃度が０．４Ｍとなるような十分な容量の２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ塩基に対して透析する。次いで、この溶液のｐＨを、１ＭのＨＣｌを使用して８．０にゆっくりと調節する。
【００４０】
（ｉｉｉ リフォールディングのための好ましい方法）
封入体を、８Ｍの尿素、０．１ＭのＴＲＩＳＴＭ、１ｍＭのグリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ１０．０に溶解する。封入体のＯＤ２８０を、β−メルカプトエタノールを含まない８Ｍの尿素溶液を使用して５．０に調節する。最終の溶液は、以下の還元剤を含む：１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭの還元型グルタチオン、および０．１Ｍの酸化型グルタチオン。溶液の最終ｐＨは、１０．０である。
【００４１】
上記の溶液を、迅速に２０容量の２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ塩基に希釈し、ｐＨを９．０に調製し、そして得られた溶液を４℃で１６時間維持する。この溶液を、再度６時間で室温に平衡化し、そしてｐＨを８．５に調節する。この溶液を１８時間で再度４℃に戻す。
【００４２】
この溶液を、６時間で室温に再度平衡化し、そしてｐＨを８．０に調節する。この溶液を４〜７日で再び４℃に戻す。
【００４３】
（組換えプロ−メマプシン２−Ｔ１の精製）
リフォールディングされた物質を、限外濾過によって濃縮し、２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭＨＣｌ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で平衡化されたＳＥＰＨＡＣＲＹＬＴＭＳ−３００カラムで分離する。Ｓ−３００カラムからのリフォールディングピーク（第２のピーク）を、２０ｍＭのＴＲＩＳＴＭ−ＨＣｌ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で平衡化される、ＦＰＬＣ ＲＥＳＯＵＲＣＥ−ＱＴＭカラムを使用してさらに精製し得る。この酵素を、ＮａＣｌの直線勾配を使用してカラムから溶出する。Ｓ−３００からのリフォールディングピークをまた、さらなる精製の前に活性化し得る。活性化のために、この画分を、等量の０．２Ｍの酢酸ナトリウム、７０％のグリセロール、ｐＨ４．０と混合する。この混合物を、２２℃で１８時間インキュベートし、次いで、２０容量の２０ｍＭのＢｉｓ−ＴＲＩＳＴＭ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ６．０に対して２回透析する。次いで、この透析された物質を、２０のＢｉｓ−ＴＲＩＳＴＭ、０．４Ｍの尿素、ｐＨ６．０で平衡化したＦＰＬＣ ＲＥＳＯＵＲＣＥ−ＱＴＭカラムでさらに精製する。この酵素を、ＮａＣｌの直線勾配を使用して溶出する。
【００４４】
これらの方法の改変およびバリエーションは、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
Claims (18)
- 組換えタンパク質をリフォールディングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
１つ以上のカオトロピック剤および還元剤の存在下で、９．０以上のｐＨで該タンパク質を維持する工程であって、ここで、該１つ以上のカオトロピック剤は、変性効果を有さない濃度で、かつ、０．４〜４Ｍの尿素、０．４〜４Ｍの塩酸グアニジン、０．４〜４ＭのＬ−アルギニンからなる群より選択される、工程；ならびに、
該タンパク質の少なくとも一部が、該タンパク質に特徴的な生物学的な活性および構造を定性的に示すように、少なくとも２４時間の期間にわたり徐々にｐＨ８．０まで溶液のｐＨを低下させて、該タンパク質の少なくとも一部の再生を誘導する工程、
を包含する、方法。 - 前記ｐＨが、２４時間あたり０．２ｐＨ単位に相当する増分において低下する、請求項１に記載の方法。
- 前記タンパク質を、９．０より高いｐＨで少なくとも２４時間の期間にわたり維持する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ｐＨが、酸の添加によって低下する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ｐＨが、より低いｐＨの溶液への希釈または透析によって増分が低下する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記還元剤が、β−メルカプトエタノール、ＤＴＴ、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記カオトロピック剤および還元剤が、０．４Ｍと１．０Ｍの間の尿素、０．１ｍＭ〜１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０． １ｍＭ〜１００ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの還元型グルタチオン、および０．１ｍＭ〜１０ｍＭの酸化型グルタチオンからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質を、最初に細菌の封入体から抽出する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項８に記載の方法。
- 前記封入体を、９．０と１０．０との間の最終ｐＨで溶解する、請求項８または９に記載の方法。
- 前記タンパク質を、１０．０より高いｐＨにおいて維持される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質を、１１．０より高いｐＨにおいて維持される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質を、１２．０より高いｐＨにおいて維持される、請求項１〜１２に記載の方法。
- 前記ｐＨが、少なくとも３６時間の期間にわたり低下する、請求項１〜１３に記載の方法。
- 前記溶液のｐＨを、より高いｐＨではより急速に低下させ、そして、前記タンパク質の生理学的ｐＨ範囲付近ではより緩徐に低下させる、請求項１〜１４に記載の方法。
- 不活性なタンパク質種、または誤ってフォールディングされたタンパク質種から、生物学的な活性を示すタンパク質種を分離するさらなる工程を包含する、請求項１〜１５に記載の方法。
- 前記封入体は、８Ｍ尿素、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、１ｍＭグリシン、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ還元型グルタチオン、０．１ｍＭ酸化型グルタチオン、ｐＨ１０．０中に溶解される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記溶液の２８０ｎｍでの吸光度を５．０に調節する工程；および２０容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ中に該溶液を迅速に希釈し、その後、該溶液の該ｐＨを減少させる工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
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