JP2004345958A - 蛋白質リフォールド装置および蛋白質リフォールド装置の使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】蛋白質リフォールド装置及び蛋白質リフォールド装置の使用方法に関し、蛋白質のリフォールド処理を人手によらずに、種々の蛋白質について、効率的かつ正確に行うことができる蛋白質リフォールド装置及び蛋白質リフォールド装置の使用方法を提供することである。
【解決手段】本発明は、リフォールド対象の蛋白質を含有する蛋白質溶液を収容可能な１または２以上の容器を載置して、所定の閉じた搬送経路に沿って該容器を搬送する搬送部と、前記搬送経路に設けられ、前記容器内の蛋白質溶液の光学的性質を測定する光学測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを調節するための試薬を含む複数種類の試薬を各々供給可能とする試薬供給部とを有するように構成する。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、リフォールド対象の蛋白質を含有する蛋白質溶液を収容可能な１または２以上の容器を載置して、所定の閉じた搬送経路に沿って該容器を搬送する搬送部と、前記搬送経路に設けられ、前記容器内の蛋白質溶液の光学的性質を測定する光学測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを調節するための試薬を含む複数種類の試薬を各々供給可能とする試薬供給部とを有するように構成する。
【選択図】図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、自動蛋白質リフォールド装置および自動蛋白質リフォールド装置の使用方法に関する。本発明は、組換え蛋白質の製造の分野、特に、Ｅ． ｃｏｌｉ（大腸菌）原核生物発現系の封入体に発現された組換え蛋白質のリフォールド（本来の働きを失っている不活性型凝集蛋白質の間違った構造を解きほぐし、正しい立体構造に巻き戻すこと）の分野で用いられる。
【０００２】
「プロテオミクス」と呼ばれる、天然型の生物活性および構造をもった組換え蛋白質の発現は、いくつかの有機体及びヒトに対するゲノム解析の完成とともに重要性が増大している。プロテオミクスの１つの側面は、商業的な応用とともに、構造および機能研究のための大量の蛋白質を発現することである。組換え蛋白質を安価で効率的に発現する方法は、大腸菌内に蛋白質を発現することである。
蛋白質は菌体内に発現されるか、またはペリプラズム空間に隠れる。前者の場合には、前記蛋白質は、特にその蛋白質がジスルフィド結合を持つ場合にはしばしば封入体に沈積する。
【０００３】
しかしながら、大腸菌内に、哺乳類の蛋白質を発現する場合の１の問題点は、発現された蛋白質の大部分が、不溶性の封入体を形成することである。この問題点は、種々の哺乳類または昆虫の発現系を使用することにより、回避されるが、大腸菌を培養することは、哺乳類および昆虫の培養に比較してより早くかつより安価である。さらに、ある蛋白質は、その天然型に発現される場合に、そのホストに対して毒であるため、このような不溶性の封入体としての発現は、大量の組換え蛋白質を得る唯一の方法である。重要なことは、高いレベルの発現が、大部分の蛋白質に対して達成できることである。細菌培養のリットル当り４００から６００ｍｇの封入体は、日常的に達成され、この方法を使用して９７００ｍｇ／Ｌまでが報告されている（非特許文献１）。封入体は、簡単な凍結／融解および界面活性剤洗浄法によって、容易に９０％以上に精製される。
【０００４】
封入体は、その細胞が光学顕微鏡下で観測すると、高密度のカイコ細胞質微粒のように見える。典型的には、その細胞は、前記細胞の機械的破裂により分解し、４７００ｇで、３０分間の間の遠心分離を行う。封入体は、低い遠心力で沈降し、多数の他の細胞内蛋白質から分離することができる。さらに、前記細胞破裂の間に用いたバッファ液によって、前記ペレット状のものを洗浄し、または、４０から５０％のグリセロール内に再懸濁したペレットを遠心分離することによってさらなる精製がされる。
【０００５】
真核生物の菌体外の多数の蛋白質は、ジスルフィド結合を含有する。多重ジスルフィド結合を有する蛋白質は、変形された構造からの折りたたみ（フォールディングｆｏｌｄｉｎｇ）の間に、非天然型ジスルフィド結合を形成するかも知れない。
さらに、もし、正しくないジスルフィド結合が、外部のチオールの削減または蛋白質のチオールからの攻撃によって硬く結合しなのであれば、折りたたみは、それから妨げられる。封入体としての原核生物における組換え蛋白質の発現の明らかな不利益は、蛋白質はその天然型内では得られず、かつ典型的には機能的に活性化していないということである。
【０００６】
【従来の技術】
従来、前記蛋白質を分解しかつ活性化蛋白質を改質するようにそれらをリフォールドする多数の方法があった。ペレット状の組換え蛋白質の溶解は、通常７Ｍ（モル濃度）の塩酸化グアニジンまたは８Ｍの尿素のような変性剤を必要とする。
蛋白質の凝集の量は、もし、蛋白質が、変性剤中に残ったままにしておくならば、増加する（非特許文献２）。透析または脱塩カラムによる前記可溶化した封入体からの変性剤の除去は、前記蛋白質を、天然型蛋白質がリフォールドされるのに必要な条件の下で沈澱させる。誤って折りたたまれた蛋白質溶液は、生物的検査においては、非常に低い特異的な活性をもつ。
【０００７】
封入体として、大腸菌内の種々の蛋白質の発現および折りたたみについての多数の報告があるけれども、蛋白質の折りたたみにおける誤解の１つは、唯一のリフォールド法は各個々の蛋白質ごとに開発しなければならいということである（非特許文献２）。他の誤解は、哺乳類の蛋白質の大部分は、封入体からリフォールドすることができないということである（非特許文献３、非特許文献４）。公開された仕事は、大部分、大腸菌からの封入体をリフォールドする「サクセス」物語であるので、この工程を使用した場合に、精製された哺乳類蛋白質についての割合がどの程度であるかの一般的な思想を得ることは不可能である。
【０００８】
文献（非特許文献３、非特許文献４） 内に報告されたリフォールド蛋白質より多数のリフォールドする方法がある。種々のシャペロン、活性化剤およびカオトロピック剤が、リフォールディングを補助するために使用されている。加えて、ｐＨ，イオン化強度、温度、バッファ組成、および還元／酸化試薬が、全てリフォールドに影響を与えることができる。プロテオミクスまたは構造ゲノミクスにおける研究で要求されるような、大量の蛋白質をリフォールドするためにこれらの条件を全て試験することは、負担が大きいであろう。
【０００９】
組換え系、特に、大腸菌のような系において封入体を形成する系において、発現した大部分の蛋白質をリフォールドするための単一の簡単な手順が必要である。このような手順として、本出願の発明者によって、蛋白質、特に、組換え蛋白質、さらに言えば、細菌のホスト内において存在する組換え蛋白質をリフォールドするための方法が提供されている（特許文献１）。
【００１０】
該方法は、折りたたみの対象となる封入体に発現した蛋白質を解きほぐす工程と、生物学的活性型の正しい立体構造に巻き戻す工程という２つの主要な工程からなっている。第１の工程は、変性剤の存在下で、蛋白質溶液のｐＨを、９以上に、好ましくは１０にまで上昇させることである。該蛋白質溶液は、約２４時間までの期間の間、その高められたｐＨにされるか、または、直ちにゆっくりと下降するｐＨ、２４時間当り約０．２ｐＨの減少分で、前記溶液が約８．０のｐＨに達するまで、または、両方の工程が用いられる。好ましくは、精製された封入体は、８Ｍの尿素、０．１Ｍのトリス（２−ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１， ３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌはｐＨ８前後で非常に強い緩衝作用があり、緩衝液として頻用される）、１ｍＭ グリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１０ｍＭ βメルカプトエタノール、１０ｍＭ のジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ の 還元化グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＨの、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）でｐＨ１０の場合に、分解される。
前記蛋白質溶液の２８０ｎｍの波長の光に対する吸収度（ＯＤ２８０）は、５．０である。
この溶液は、２０ｍＭトリスを主成分とする体積の２０倍にまで、急速に希釈化される。その結果としての溶液は、１ＭのＨＣｌをもったｐＨ９．０に調節される。２４時間の間４℃に維持される。該ｐＨはｐＨ８．８に調節され、該溶液は、もう２４時間の間４℃に維持される。この工程は、前記ｐＨが、８．０に調節されるまで繰り返される。ｐＨ８．０で、２４時間経過した後、リフォールドされた蛋白質は、限外濾過によって濃縮化され、精製のためにゲル濾過カラムが適用される。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｊｅｏｎｇ ＫＬ； Ｌｅｅ ＳＹ 著 １９９９． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：３０２７−３２
【非特許文献２】
Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｗｉｎｋｅｒ著 「大腸菌中で生産された真核的蛋白質の折りたたみ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １２， １−１９ ａｔ ｐ．６ （１９９０）
【非特許文献３】
Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ．， Ｌｉｌｉｅ Ｈ．著， １９９６， ＦＡＳＥＢＪ １０：４９−５６
【非特許文献４】
Ｌｉｌｉｅ Ｈ．， Ｓｃｈｗａｒｚ Ｅ， Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ．著 １９９８． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９；４９７−５０１
【特許文献１】
国際公開ＷＯ０１／５５１７４ Ａ２
【非特許文献５】
Ｌｉｎ等著１９９４ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｕｍｏｌｏｇｙ ２１４， １９５−２２４
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、以上説明したように、発現された蛋白質をリフォールドするには、一旦発現された蛋白質を解きほぐし、解きほぐした蛋白質を再度巻き上げる必要がある。そのためには、該蛋白質の溶液について、長時間にわたり、微妙なｐＨの調節を繰り返す必要があった。
【００１３】
そのため、人手によって、この作業を行おうとすると、操作者が、長時間に渡って作業状況を監視して、緩衝液を含む各種試薬を、溶液のｐＨを測定しながら、その測定したｐＨに応じて定まる種類と量を適切な時間に添加してｐＨの調節を行う必要があり、操作者に大きな負担を強いていた。
【００１４】
特に、大量または多種類の蛋白質についてリフォールド処理を行う場合には、同一処理の機械的繰り返しが必要となり、または、多種類の蛋白質についてリフォールド処理を行う場合の条件の相違、特に試薬等の種類、量、割合の相違のために操作者の負担は急激に増加するために、効率的かつ迅速な処理を行うことができないという問題点を有していた。
【００１５】
これらの作業を、人手で行うために、その処理に高い信頼性を与えることができないおそれがあるとともに、操作者が長時間処理にかかわるために、人件費等によりその製造費用が高くなるおそれがあるという問題点を有していた。
【００１６】
そこで、本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、その第１の目的は、蛋白質、特に、組換え蛋白質、さらに言えば、細菌のホスト内において封入体に存在する組換え蛋白質のリフォールド処理を、人手によらずに、自動的に行うことができるリフォールド装置およびリフォールド装置の使用方法を提供することである。
【００１７】
その第２の目的は、大量または多種類の蛋白質を、簡単な制御により、効率的に、迅速かつ安価にリフォールド処理を行うことができる蛋白質リフォールド装置および蛋白質リフォールド装置の使用方法を提供することである。
【００１８】
その第３の目的は、正確かつ精密に試薬等を供給するようにして蛋白質のリフォールド処理を進めることができる信頼性の高い蛋白質リフォールド装置および蛋白質リフォールド装置の使用方法を提供することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
以上の技術的課題を解決するために、第１の発明は、リフォールド対象の蛋白質を含有する蛋白質溶液を収容可能な１または２以上の容器を載置して、所定の閉じた搬送経路に沿って該容器を搬送する搬送部と、前記搬送経路に設けられ、前記容器内の蛋白質溶液の光学的性質を測定する光学測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを調節するための試薬を含む複数種類の試薬を各々供給可能とする試薬供給部とを有するとともに、前記試薬供給部は、前記光学測定部の測定結果、前記ｐＨ測定部の測定結果および予め定めたｐＨパターンに基づいて蛋白質溶液のｐＨの調節を行うことによって蛋白質のリフォールドを行う蛋白質リフォールド装置である。
【００２０】
ここで、「光学的性質」とは、光学的な種々の性質をいい、例えば、各種の光（赤外線、遠赤外線、可視光等）の入射光に対する透過光、反射光若しくは散乱光の性質、または分光的な性質等をいう。例えば、入射光に対する透過光の性質として、光学的密度（濁度）がある。該光学的密度は、溶液中の溶質の光を吸収する度合いを表す値であって、溶質の光の吸収率の逆数の対数である。すなわち、ｌｏｇ（Ｉ０／Ｉ）をいう。ここで、Ｉ０およびＩは、溶媒だけを通過した光および同じ厚さの溶液層を通過した光の強さを表す。濁度が大きくなれば、凝集した蛋白質が解きほぐされて、溶液中に懸濁する量が増大していることを意味する。
【００２１】
従って、本発明では、蛋白質の解きほぐされの程度の測定結果を取り入れて、ｐＨの調節を行うことにより、リフォールド処理を進めていくことになる。
【００２２】
「ｐＨを調節するための複数種類の試薬」としては、ｐＨを一定に保つための緩衝剤、酸性化試薬またはアルカリ性化試薬を少なくとも有し、これらに属する試薬を、単独にまたは組み合わせて適当な量混合することによって、ｐＨを調節する。
【００２３】
ｐＨのパターンは、リフォールドの対象となる蛋白質に応じて定められる。そのパターンの一般的な傾向としては、リフォールドの第１段階としての凝集した蛋白質を解きほぐすために、蛋白質溶液を、１以上のカオトロピック試薬および還元試薬の存在の下でｐＨで、９．０以上に維持し、第２段階として、解きほぐした蛋白質を３次元構造に巻き上げるために、該溶液のｐＨを次第に、所定時間以上の時間で、ｐＨ８．０にまで減少させて、該蛋白質が、質的に、生物学的活性化および該蛋白質に特有の構造を表すように、該蛋白質の少なくとも一部の再生を誘導する。「所定時間」は、該処理が行われる温度に依存する。該温度は、該リフォールド装置に設けられ、前記搬送される容器内を所定温度に保つように加熱または冷却する恒温手段によって設定される。例えば、該所定温度を４℃に設定すると、所定時間は、２４時間となり、該温度を１６℃に設定すると、所定時間は２時間となる。本発明によれば、恒温手段の温度を変えることによって、処理に必要な時間を、従ってｐＨパターンを種々に定めることができる。すなわち、処理時間を増減させることができる。また、このｐＨの減少は、例えば、該所定時間毎に０．２ｐＨずつ減少させる。また、前記ｐＨの９．０以上の維持は、例えば、該所定時間以上行われる。
【００２４】
前記ｐＨの減少は、酸を加えることによって行う。前記カオトロピック試薬および変性試薬は、０．５及び１．０Ｍ 尿素、０．１ｍＭから１００ｍＭのβメルカプトエタノール、０．１ｍＭから１０ｍＭの酸化グルタチオンのいずれかから選択されたものである。
【００２５】
「蛋白質」には、組換え蛋白質、さらには、細菌の封入体から抽出された蛋白質をも含む。該細菌には、大腸菌を含む。該封入体は、ｐＨが９と１０との間で溶解される。
【００２６】
「閉じた搬送経路に沿って搬送する」ので、１の容器について、光学的性質およびｐＨを測定しながら、ｐＨの調節を繰り返して、リフォールド処理を行うことができる。ｐＨ測定部は、例えば、容器に挿抜可能に設けた電極と、該電極を洗浄する洗浄部と、前記容器と前記洗浄部との間を移動可能とする移動部とを有するように構成する。
【００２７】
第２の発明は、前記試薬供給部は、前記光学測定部および前記ｐＨ測定部の下流側に設けられた蛋白質リフォールド装置である。
【００２８】
好ましくは、これらの光学測定部、ｐＨ測定部および試薬供給部は、搬送経路に沿って、この順序またはｐＨ測定部、光学測定部、試薬供給部の順序で、隣接するように設ける。
【００２９】
第３の発明は、前記試薬供給部、または、それよりも下流側の搬送経路に、前記容器の収容物を攪拌させる攪拌部を設けた蛋白質リフォールド装置である。
【００３０】
第４の発明は、前記搬送経路には、前記容器に収容されている蛋白質液体の一部の所定量を吸引して、該当する容器に移送するための吸引移送部を設けた蛋白質リフォールド装置である。
【００３１】
第５の発明は、前記試薬供給部は、少なくとも３個の試薬吐出口を有し、各試薬吐出口からは少なくとも酸性試薬、アルカリ性試薬、およびバッファ用試薬のいずれかを独立に吐出可能に設けた蛋白質リフォールド装置である。
【００３２】
第６の発明は、前記攪拌部は、前記搬送経路において、前記容器を軸まわりに回転することによって、該容器内に収容されている液体の攪拌を行う蛋白質リフォールド装置である。
【００３３】
第７の発明は、前記容器は、ボトル状に形成され、該容器の内部に、容器の内壁から軸線方向に向かって突出する攪拌用突出部を設けた蛋白質リフォールド装置である。
【００３４】
第８の発明は、前記攪拌用突出部は、前記容器の内底部より一定高さ以上に設けられた蛋白質リフォールド装置である。
【００３５】
第９の発明は、リフォールド対象の蛋白質を含有する蛋白質溶液を収容可能な１または２以上の容器を載置する所定の閉じた搬送経路に沿って該容器を搬送する搬送工程と、前記搬送経路において、前記容器内の蛋白質溶液の光学的性質を測定する光学測定工程と、該搬送経路において、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定工程と、該搬送経路において、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを調節する試薬を含む複数種類の試薬を供給する試薬供給工程とを有するとともに、前記試薬供給工程は、前記光学測定工程の測定結果、前記ｐＨ測定工程の測定結果および予め定めたｐＨパターンに基づいて、前記蛋白質溶液のｐＨの調節を行う蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００３６】
第１０の発明は、前記ｐＨ測定工程は、前記光学測定工程の後に実行され、前記試薬供給工程は、前記ｐＨ測定工程の後に実行される蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００３７】
第１１の発明は、前記試薬供給工程において、または、該工程の後で、搬送経路において、前記容器の収容物を攪拌させる攪拌工程を設けた蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００３８】
第１２の発明は、前記搬送経路において前記容器に収容されている液体の一部の所定量を吸引して、該当する容器に移送する吸引移送工程を有する蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００３９】
第１３の発明は、前記試薬供給工程は、少なくとも３本の試薬吐出口から、少なくとも酸性試薬、アルカリ性試薬、およびバッファ用試薬のいずれかを吐出可能とする蛋白質リフォールド装置である。
【００４０】
第１４の発明は、前記攪拌工程は、前記搬送経路において、前記容器を軸まわりに回転することによって、該容器内に収容されている液体の攪拌を行う蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００４１】
第１５の発明は、前記攪拌工程は、ボトル状に形成された容器の内部に、容器の内壁から軸線方向に向かって突出する攪拌用突出部を設けた容器を回転させることによって行う蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００４２】
第１６の発明は、前記攪拌工程は、前記攪拌用突出部が前記容器の内底部より一定高さ以上に設けられた容器を回転する蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置１０を、図面に基づいて説明する。本実施の形態の説明は、特に指定のない限り、本発明を制限するものと解釈してはならない。
【００４４】
図１は、実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置１０の斜視図を示すものである。
該蛋白質リフォールド装置１０は、フレーム１１を有し、該フレーム１１の上側には、目的蛋白質のリフォールド作業を行う各種装置を有する作業基板１２が設けられ、該作業基板１２の下側の該フレーム１１の内側には図示しない各種機構部、恒温手段に相当する空調部（ペルチェ素子およびファンからなる）および後述する搬送部であるコンベイヤーの駆動回路等を有している。
【００４５】
前記作業基板１２には、処理の対象となる蛋白質を含有する蛋白質溶液１３が収容された１または複数（この例では、最大で９６本）の前記容器に相当するボトル１４を載置して、所定の搬送経路１５に沿って搬送するコンベイヤー（搬送部）１６が設けられている。該ボトル１４は、収容されている蛋白質溶液の濁度等の光学的性質を測定するために透明の素材、例えば、ガラス、または、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル等の樹脂で形成するのが好ましい。該コンベイヤー１６は、前記ボトル１４を、前記搬送経路１５に沿って一斉に図中矢印の方向に搬送する。
【００４６】
該搬送経路１５は閉路を形成し、その閉路の一部は、該搬送経路１５が蛇行するように配置された蛇行領域１７を有し、該搬送経路１５の全体は上側に断熱用蓋板１８が載置されている。該搬送経路１５のうちの大部分を占める該蛇行領域１７を前記恒温手段によって所定温度に設定することによって、前記ボトル１４が該蛇行領域１７を搬送される間に前記ボトル１４に対するインキュベーションが行われることになる。前記蛇行領域１７を除く前記搬送経路１５の非蛇行領域においては、上流側から、前記ボトル１４内に収容された蛋白質溶液１３の濁度を光学的性質として測定する濁度測定位置１９、該ボトル１４内に収容され蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定位置２０、該ボトル１４内の蛋白質溶液のｐＨを調節するために複数種類の所定試薬を分注可能とするとともに、該ボトル１４内に収容されている蛋白質溶液を攪拌する試薬供給攪拌位置２１と、該ボトル１４に収容されている蛋白質溶液の所定量を吸引して移送し、対応する容器内に吐出する吸引移送位置２２とが配置されている。これらの位置２０、２１、２２においては、前記断熱用蓋板１８には、上側から前記位置における前記ボトル１４内の蛋白質溶液１３に到達可能となるような孔が設けられている。
【００４７】
前記濁度測定位置１９には、前記搬送経路１５の両側壁２３に穿設された２つの貫通孔２４が設けられ、該貫通孔２４を通るように、該搬送経路１５を挟むように設けた図示しない照射部と、受光部２５が設けられている。前記照射部からの光のうち前記貫通孔２４を通り、前記受光部２５に達する光は、前記ボトル１４の下側を通る。濁度は、該受光部２５が受光した光の強度と前記照射部の光の強度の比に基づいて算出される。
【００４８】
前記ｐＨ測定位置２０においては、後述するように、ｐＨ測定用電極２６が設けられている。該ｐＨ測定用電極２６は、電極用Ｚ軸駆動装置２７および電極用Ｘ軸駆動装置２８によって、図中示すＺ軸およびＸ軸方向に移動可能である。
【００４９】
前記試薬供給攪拌位置２１には、前記ボトル１４内に収容された蛋白質溶液１３のｐＨを調節するために必要な種々の試薬（この例では１２種類）を供給するために１２本のノズル２９が設けられたマルチノズルヘッド３０を有し、各ノズル２９はチューブを介して前記フレーム１１の内部に設けられた図示しない前記各試薬を収容するタンクと連通している。
【００５０】
さらに、該試薬供給攪拌位置２１に位置した前記ボトル１４内に収容された蛋白質溶液１３を該ボトル１４を回転させることによって、該ボトル１４と、該ボトル１４内に収容されている蛋白質溶液１３との間に生ずる角速度の相違と前記凸部の存在により、該蛋白質溶液１３を攪拌するための攪拌部３１が設けられている。
【００５１】
前記吸引移送位置２２には、該位置２２に存在する前記ボトル１４内に収容されている液体を所定量吸引して移送し、所定のマイクロプレート３２の所定ウェルに吐出するための自動分注機３３が設けられている。該自動分注機３３は、該自動分注機３３のノズル３４にピペットチップ（図示せず）を着脱自在に装着して使用するものである。該ピペットチップは、各ボトル１４に対応した位置のチップラック３５に収容され、各ボトル１４に応じて、該当するピペットチップと交換して、吸引移送処理を行うようにしている。これによって、前記ボトル１４相互間のクロスコンタミネーションを防止することができる。
【００５２】
該自動分注機３３は、分注用Ｚ軸駆動装置３６によってＺ軸方向に駆動され、分注用Ｘ軸駆動装置３７によってＸ軸方向に駆動される。なお、Ｙ軸方向については、前記マイクロプレート３２およびチップラック３５をマイクロプレート等用Ｙ軸駆動装置３８によってＹ軸方向に移動させることによって、前記分注機３３は、前記マイクロプレート３２等に対して相対的に移動可能としている。
【００５３】
図１において、符号３９は、前記自動分注機３３のノズル３４または該ノズル３４に装着されたピペットチップが、前記チップラック３５に収容された各ピペットチップに到達し、またはマイクロプレート３２の各ウェルに到達可能となるように設けた前記断熱用蓋板１８に設けた開口部４０の開閉を行う自動ドアである。
【００５４】
図２は、前記ボトル１４を詳細に示すものである。
同図に示すように、該ボトル１４は、首部４１と、胴部４２とからなり、該首部４１には、図示しない蓋部と螺合するように螺子山４３が設けられている。胴部４２の外側面の一部は陥没し、該ボトル１４の半径方向に沿って内方に突出する縦長の凸部４４が、底部４５より所定高さ位置から所定長さ設けられている。
該凸部４４が前記攪拌用突出部に相当する。なお、前記凸部４４を前記底部４５から所定高さだけ高い位置に設けているのは、前記濁度を測定する際に、該凸部４４によって、光の進行を妨げないようにして、正確な濁度の測定を行うためである。
さらに、該ボトル１４は、該ボトル１４の容積を表示する目盛り４６を設けている。
【００５５】
図３は、前記コンベイヤー１６の主要部を詳細に示すものである。該コンベイヤー１６は、前記搬送経路１５の下側中央に沿って配置されたチェーン４７と、前記ボトル１４がその間に載置して搬送可能となる間隔、例えば、該ボトル１４の外径よりやや大きい程度の間隔で、前記ボトル１４の高さより低い搬送用ロッド４８が垂直方向に突出して設けられている。
【００５６】
図４は、前記ｐＨ測定位置２０に設けられた前記ボトル１４に収容された蛋白質溶液１３のｐＨの測定行うｐＨ測定装置４９である。該ｐＨ測定装置４９は、前述したように、前記ボトル１４内に挿入可能に設けられた前記ｐＨ測定用電極２６と、該電極２６をＺ軸方向に移動させる前記電極用Ｚ軸駆動装置２７と、該電極２６をＸ軸方向に移動させる前記電極用Ｘ軸駆動装置２８と、該電極２６を洗浄して再生させる電極洗浄部５０とを有している。前記電極用Ｚ軸駆動装置２８は、モータ５１と、該モータ５１によって、回転駆動され、前記電極用Ｘ軸駆動装置２８によって、Ｘ軸方向に沿って移動可能に保持されるＺ軸方向に沿って設けられたボールねじ５２と、該ボールねじ５２と螺合し、前記ボールねじ５２の回転によって、上下方向に移動可能であるとともに、前記電極２６が取り付けられたナット部５３とを有する。
【００５７】
また、前記電極用Ｘ軸駆動装置２８は、モータ５４と、該モータ５４によって回転駆動されるＸ軸方向に沿って設けられたボールねじ５５とを有する。前記電極洗浄部５０は、軸方向に沿って前記電極２６が挿入可能な洗浄用容器５６と、該洗浄用容器５６内において、挿入された前記電極２６に向かって洗浄液を噴射することができるスプレイ５７と、該スプレイ５７に前記洗浄液を供給するためのチューブ５８と、前記容器５６内にたまった液体を排出する排出部５９とを有する。
【００５８】
本実施の形態に係るｐＨ測定部によれば、電極を洗浄しながら用いるので、人手を介することなくかつクロスコンタミネーションなしに、正確に、そのｐＨを測定することができる。
【００５９】
図５（ａ）は、前記ｐＨ攪拌位置２１に設けられた攪拌部３１の側面図であり、同図（ｂ）は、その平面図を示す。
該攪拌部３１は、モータ６０と、カップリング６１を介して該モータ６０によって回転駆動されるシャフト６２と、該シャフト６２の回転によって回転するローラ６３と、該ローラ６３によって、その側面と接触して回転駆動される前記ボトル１４と、前記ローラ６３により該ボトル１４を回転させる際に、該ボトル１４のがたつきやゆれを防止するために該ボトル１４を押さえるためのアイドラーローラ６４と、該アイドラーローラ６４を前記ボトル１４に押し付けるために該ボトル１４の半径方向に移動させるアクチュエータ６５と、該アクチュエータ６５を駆動するソレノイド６６とを有する。なお、符号６７は、該ボトル１４上の接触領域である。
【００６０】
図６は、本実施の形態に係る前記蛋白質リフォールド装置１０の一部を取り出して示す斜視図である。
前記マイクロプレート等用Ｙ軸駆動装置３８は、モータ６８と、案内用スクリュー６９とを有する。図中、符号７０は、自動ドア開閉用のスプリング付ソレノイドであり、符号７１は、前記マイクロプレート等用Ｙ軸駆動装置３８により駆動される、前記マイクロプレート３２およびチップラック３５を搬送するキャリッジである。
【００６１】
図７は、本実施の形態に係る前記蛋白質リフォールド装置１０の概略平面図である。
なお、図示されていないが、前記光学測定部の測定結果、ｐＨ測定部の測定結果、およびｐＨパターンに基づく前記試薬供給部による、供給すべき試薬の種類および量を算出するため、または、恒温手段および搬送部の温度や速度の設定、進行および停止の指示については、ＣＰＵやメモリを有する演算処理装置，表示装置、キーボード、スイッチ、マウス、通信手段等の入力装置、プリンタ、メモリ等の出力装置からなる情報処理装置を有している。
【００６２】
続いて、本実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置１０を使用する場合について説明する。
【００６３】
一旦、蛋白質の最大量が発現されると、細菌のホストから分離され精製される。該蛋白質は、一般的に、細胞を溶解することによって、例えば、界面活性剤中に懸濁させ、リゾチームを加え、それから凍結することによって（例えば、ＴＮ／１％ トリトン（登録商標）Ｘ−１００の２０ｍｌ中に細胞を懸濁させ、１０ｍｇのリゾチームを加え、それから−２０℃で凍結することによって）、融解しかつＤＮＡエースを加えて細菌のＤＮＡの全てを解体するために加え、それから、緩衝剤で処理された溶液中で生成した沈殿物を洗浄することによって、一般的に抽出される。沈殿物は、それから、リフォールド処理のために、後述するような適当な溶液中で溶解され、前記ボトル１４に収容され、前記蛋白質リフォールド装置１０の搬送経路１５上に載置される。
【００６４】
ここで、該蛋白質リフォールド装置１０の試薬供給部が従うべきｐＨパターンおよび、試薬供給部から供給されるべき試薬について説明する。
大部分の従来の方法では、通常ｐＨ７．４から８．０のような生理的なｐＨにおいて、還元したカオトロピック塩（８Ｍの尿素のような）を用いて、通常、蛋白質をリフォールドする。これは、通常、大量の沈殿または凝集を生み出し、リフォールドを不可能または低い生産性に留める。しかし、最初のリフォールドのｐＨが高い（少なくとも、ｐＨが９．０、但し、ｐＨが１０のようなより高い物が望ましい）場合には、リフォールドが可能である。この方法は、ペプシノゲンが、ｐＨ８．０〜９．０において、可逆的に変性しまた復元するという事実によって最初に示唆された。
【００６５】
高いｐＨ（９．０のような）においては、蛋白質はいくつかの第２の構造を得て、リフォールド溶液の活性度が、生物学的ｐＨに低下したときに、より効率的にリフォールドすることができることが仮定されている。後ほど、生理学的なｐＨで蛋白質がリフォールドされる蛋白質でさえ、高いｐＨでより効率的に生産される。加えて、高いｐＨのリフォールド処理は、最初の大量の沈殿を防止するすばらしい方法である。本装置１０においても、前記パターンとして、この高いｐＨを維持するようにリフォールド処理を行う。
【００６６】
前記試薬供給部から供給されるべき試薬としては、０．５から１．０Ｍの尿素、塩酸化グアニジン、およびＬ−アルギニンのようなカオトロピック塩の非変性濃度がある。これらは、リフォールド処理を助け、リフォールドされた蛋白質を活性化するために役に立つからである（非特許文献３）。そのカオトロピック試薬の濃度の範囲は、０〜４Ｍであるが、好ましくは、０．４Ｍである。リフォールド／精製工程における尿素の濃度は、蛋白質上で変性効果をもたない。
また、前記試薬供給部から供給されるべき試薬として、還元／酸化試薬がある。
【００６７】
ジスルフィド結合を有する哺乳類の蛋白質封入体は還元試薬の存在中で溶解される必要がある。代表的な還元試薬は、β―メルッカプトエタノールを、０．１ｍＭから１００ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ、ＤＤＴを０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ、還元グルタチオン（ＧＳＨ）を、０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭ、および酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を、０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭ含有する。βメルカプトエタノールは、好ましい還元試薬である。加えて、ジチオトレイトールおよび／または還元／酸化グルタチオン（ＧＳＨ、ＧＳＳＧ）は、誤って折りたたまれた中間ジスルフィド結合の「オシド−シャッフリング」を容易化するために含ませることができる。
【００６８】
さらに、前記パターンとして、蛋白質のリフォールド処理を行うのに十分に長い時間、蛋白質溶液のｐＨを高い状態にしておくことが重要である。これは、好ましくは、ｐＨをゆっくりと、２４時間で０．２ｐＨの減少分で、下げることによって達成する。この方法では、前記蛋白質溶液は、高いｐＨ、好ましくは、少なくとも９．０以上に、または１０若しくは好ましくは１１未満にまで調節される。前記蛋白質は、好ましくは、少なくとも２４時間の間各ｐＨで維持される。同等な効果は、温度を調節することにより、より短い時間、例えば、２， ３， ６， ９， １２， １８または２０時間で達成されることができる。ｐＨは、前記ボトル１４に前記マルチノズルにより、酸等を加えることによって行われる。
【００６９】
次に、より具体的に組換え蛋白質のリフォールド処理の２つの実施例について説明する。
【００７０】
（１）第１の実施例
前段階として、組換え蛋白質の発現を行う。
発現プラスミドが、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）鎖のような適当なホストに導入され、ＺＢ／アンピシリンプレート上に置く。このことは、好ましい組換え有機体を選択する。各構造物から単一のコロニーが、１００ｍｌのＺＢ／アンピシリン媒体に植えつけられ、３７℃で１６時間成長する。
【００７１】
ＬＢ／アンピシリンの１リットル中に１晩の培養物の２０ｍｌを植え付け、３７℃で、波長６００の光の濁度が０．４〜０．６に達するまで攪拌し、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ加え、３時間攪拌する。
【００７２】
遠心分離し、細胞をＴＮ／１％トリトン（登録商標）Ｘ−１００の２０ｍｌに細胞を再懸濁する。１０ｍｇのリソチームを加え、−２０℃で一晩凍結する。
【００７３】
凍結された細胞を融解し、２０μｌの１ＭのＭｇＳＯ４，１００μｇ ＤＮＡエースを加え、細菌のＤＮＡが完全に溶解するまで攪拌する。
【００７４】
２５０ｍｌのＴＮ／１％のトリトンを加え、２から４時間の間攪拌し、遠心分離およびトリトンの洗浄をさらにもう一度繰り返す。８Ｍの尿素溶液の１０ｍｌに前記ペレットを溶解し、βメルカプトエタノールを１００ｍＭまで加え、その溶液が遠心分離されてリフォールドの準備ができる。
【００７５】
該溶液を前記ボトル１４内に収容して、前記蛋白質リフォールド装置１０の前記搬送経路１５上に載置する。
【００７６】
該ボトル１４が前記搬送経路１５上で図中左回りに間歇的に搬送され、前記濁度測定位置１９において、該ボトル１４の下側に波長２８０の光を前記照射部７２より照射し、前記受光部２５で受光することによって、濁度を算出し、８Ｍの尿素溶液に対して目標の５．０となるか否かを測定する。
【００７７】
該濁度が５．０になるまでは、再び該ボトル１４に対してｐＨ調節が繰り返される。該ボトル１４が、前記ｐＨ測定位置２０に到達すると、前記電極２６が、前記電極用Ｘ軸駆動装置２８によって移動し、前記ｐＨ測定位置２０の真上にまで到達する。次に、前記電極用Ｚ軸駆動装置２７によって、該電極２６を前記ボトル１４内の蛋白質容液１３内に挿入して、該溶液内の水素イオン濃度を測定する。測定後は、該電極２６を上昇させ、前記Ｘ軸方向に移動させて、該電極２６を洗浄用容器５６内に挿入し、前記スプレイ５７を用いて洗浄液を噴射し、電極２６を洗浄し、その廃液を排出部５９を介して排出する。該ｐＨは最終的に、１０．０になるまで、該ボトル１４に対してｐＨ調節のための試薬の供給が繰り返されることになる。
【００７８】
該ボトル１４が、試薬供給攪拌位置２１にまで達すると、該位置２１に設けたマルチノズルヘッド３０の各ノズル２９を介して、ｐＨ調節用試薬が該ボトル１４内に供給されることになる。該マルチノズルヘッド３０からは、例えば、次の還元試薬、１０ｍＭ βメルカプトエタノール、１０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭの還元化グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）のうち、前記濁度測定結果及び前記ｐＨ測定結果に基づいて、選択された試薬の所定量が各々供給されることになる。なお、該試薬供給攪拌位置２１において、前記試薬の供給が行われる際に、該ボトル１４は、前記攪拌部３１によって、該位置２１で、前記ボトル１４の軸まわりに回転が加えられることになる。すなわち、前記ローラ６３を前記モータ６０からの回転力をカップリング６１およびシャフト６２を介して伝達して回転させ、該ボトル１４の外側面を回転させるその際、前記アクチュエータ６５によって、アイドラーローラ６４を該ボトル１４に押さえつけて、該ボトル１４のがたつきを防止する。
【００７９】
該ボトル１４が回転すると、該ボトル１４内に設けた凸部４４が前記ボトル１４内の溶液を効果的に攪拌する。
【００８０】
最終的な溶液のｐＨは１０．０となるように、前記マルチノズルからの試薬によって調節される。
【００８１】
次に、前記ボトル１４が前記吸引移送位置２２に達すると、前記自動分注機３３のノズル３４が、前記Ｘ軸駆動装置３７によって、前記自動ドア３９が開いた前記開口部４０の該当するＸ座標の位置にまで移動する。同時に、前記キャリッジ７１のＹ軸方向の移動によって、チップラック３５の該ボトル１４に対応する未使用のピペットチップが保持されている位置の真上に前記開口部４０を介して前記ノズル３４が位置するようにする。次に分注用Ｚ軸駆動装置３６によって、該ノズル３４を下降して、該ノズル３４に前記ピペットチップを装着させる。次に該ピペットチップを装着したノズル３４を上昇させた後、前記吸引移送位置２２にまで前記Ｘ軸駆動装置３７によって移動させ、該ピペットチップを下降させて前記ボトル１４内に挿入し、所定量、例えば２５μｌずつの微小量の蛋白質溶液を吸引し、再び、前記開口部４０の該当するＸ座標位置にまで移動する。同時に、前記キャリッジ７１のＹ軸方向の移動によって、前記マイクロプレート３２の該ボトル１４に対応するウェルの位置の真上に、前記開口部４０を介して前記ノズル３４が位置するようにし、次に該ピペットチップを下降して、収容している前記溶液を対応するウェル内に吐出する。
【００８２】
該溶液を吐出した後、該ピペットチップを装着したノズル３４は、該ピペットチップを前記チップラック３５の使用済みのピペットチップを収容する領域の対応する位置に該ピペットチップを収容するために、前記開口部４０の該当するＸ座標に位置し、前記キャリッジ７１のＹ軸方向の移動により、該当するチップラック３５の収容位置の真上にまで、前記開口部４０を介して位置させ、該ピペットチップを、前記ノズル３４からこそぎ落とすようにして自動的に脱着する。
【００８３】
このようにして、前記ボトル１４が、該吸引移送位置２２を通過するたびに、所定量ずつ溶液を前記マイクロプレート３２の各ウェルに収容し、該蛋白質リフォールド装置１０による処理の流れを監視するために利用される。
【００８４】
該ボトル１４が前記吸引移送位置２２を通過した後は、該搬送経路１５の搬送経路１５の大部分の長さをもつ蛇行領域１７を、長い時間滞在しながら搬送されることになる。この蛇行領域１７を通過する間にインキュベーションが行われることになる。前記ボトル１４がこの搬送経路１５を一周する時間は、例えば、２時間であったり、２４時間であったり、リフォールドの対象となる蛋白質に応じて定められる。
【００８５】
このようにして、前記目標の濁度および目標のｐＨ値に前記蛋白質溶液が達成すると、再び、該ボトル１４を前記搬送経路１５に従って搬送させ、前記試薬供給攪拌位置２１において、前記ノズル２９の１つから２０ｍＭのトリス（登録商標）を供給し、該トリスを主成分とする体積の２０倍にまで急速に希釈化される。さらに、ｐＨが９．０となるように１ＭのＨＣｌを前記ノズル２９の１つから供給することによって、１周の間に前記ｐＨが最終的に８．８となるように調設され、さらに、次の周で、ｐＨが８．６になるようにｐＨが調節され、最終的には、ｐＨが８．０になるまで調節される。
【００８６】
なお、該装置によってリフォールドされた蛋白質は、それから、限外透析によって濃縮化され、ゲル透析によって分離される。ゲル透析は、例えば、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）、Ｓ−３００カラムであって、２０ｍＭ トリス（登録商標）、ＨＣｌ，０．４Ｍ尿素、ｐＨ８．０によって平衡化されている。前記Ｓ−３００留分は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを駆動することによって検査される。うまくリフォールドされなかった蛋白質は、大変高い分子量になり、折りたたまれた蛋白質は、通常の分子量になる。
【００８７】
Ｓ−３００カラムからリフォールドされたピークは、さらに。ＦＰＬＣ Ｒｅｓｏｕｃｅ−Ｑ（登録商標）またはＲｅｓｏｕｃｅ−Ｓ（登録商標）カラムによって精製することができる。これらは、２０ｍＭトリス（登録商標）−ＨＣｌ（Ｒｅｓｏｕｃｅ−Ｓ（登録商標）のためのＨＥＰＥＳバッファ）、０．４ Ｍ 尿素、ｐＨ８．０によって、平衡化されている。
【００８８】
（２） 第２の実施例
メマプシン２（ｍｅｍａｐｓｉｎ ２）の発現およびリフォールド処理
プロ−メマプシン２は、ＰＣＲで増幅され、ｐＥＴ１１ａベクターの ＢａｍＨＩサイトにクローン化される。その生成されたベクターは、Ａｌａ−８ｐ からＡｌａ−３２６の塩基配列をもつプロ−メマプシン２を発現する。２つの発現ベクター、ｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ一（以後「Ｔ１」という）およびｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ２（以後「Ｔ２」という）が構成される。両方のベクターにおいて、発現された組換え蛋白質の前記Ｎ末端１５残基は、前記発現ベクターから導かれる。プロ−メマプシン２残基は、残基Ａｌａ−１６から始まる。２つの組換えプロ−メマプシン２ は種々のＣ末端長をもっている。Ｔｈｒ−４５４でＴ１末端をクローン化し、Ａｌａ−４１９で、Ｔ２末端をクローン化する。前記Ｔ１構造は、前記Ｔ２構造からのＣ末端の伸びを有するが、予測された膜間領域のいずれをも表現していない。
【００８９】
Ｔ１およびＴ２の発現ベクターは、別々に大腸菌株、ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入される。導入された細菌の培養のための処理、組換え蛋白質の合成のための導入および、組換え蛋白質を含有する封入体の回収および洗浄については、例えば非特許文献５を参照のこと。基本的には、封入体は、０．１Ｍ トリス（登録商標）ＨＣｌ，ｐＨ７．４中での１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００および０．１５Ｍ ＮａＣｌで洗浄され、不溶性の蛋白質は、８Ｍ 尿素、０．０５Ｍ シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭ 還元化グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ ｍＭ の酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）および１ｍＭグリシン、および１ｍＭ のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のＰｈ１０．５を含む溶液中に溶解されて、約５ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度になる。この溶液は、主として２０ｍＭのトリスの体積の２０倍に急速に攪拌して滴下するように加えられる。希釈化された溶液のｐＨは、１ＭのＨＣｌによって、９．０に再調節され、４℃で、２４時間の間再び保たれる。このプロセスは、ｐＨが８．０になるまで繰り返される。
【００９０】
封入体が、８Ｍの尿素、０．１Ｍトリス（登録商標）、１ｍＭのグリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのβメルカプトエタノール、ｐＨ１０．０に溶解される。
【００９１】
該溶液を前記ボトル１４内に収容し、前記蛋白質リフォールド装置１０の前記搬送経路１５上に載置し、前述したように、該搬送経路１５上を、図１中に示すように左回りに搬送する。該ボトル１４内の封入体の波長２８０の光に対する濁度は、前記試薬供給攪拌位置２１において、前記マルチノズルヘッド３０のノズル２９から、β―メルカプトエタノールなしの８Ｍ尿素により、５．０に調節されるように、前記蛋白質リフォールド装置１０を用いて前述したようにして、該試薬の供給が濁度を測定しながら繰り返される。最終的な溶液は、前記試薬供給攪拌位置２１のマルチノズルヘッド３０の各ノズル２９から次の還元試薬を供給する。
すなわち、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭｐＨの還元化グルタチオン、および０．１ｍＭの酸化グルタチオンであり、最終的な溶液のｐＨは、１０．０である。
【００９２】
このようにして得られた前記ボトル１４内の蛋白質溶液は、急速に、２０Ｍｍ トリス（登録商標）の主要成分の２０倍の体積にまで希釈化し、そのｐＨは、９．０になるように前記蛋白質リフォールド装置１０によって、調節され、その生成された溶液は１６時間の間、４℃に維持される。該溶液は、６時間で室温で平衡状態にし、該ｐＨは、８．５に調節され、該溶液は、再び１８時間の間に４℃に戻す。該溶液は、再び、６時間で平衡状態にし、そのｐＨは８．０に調節され、その溶液は、再び４から７日で、４℃に戻す。このリフォールド処理については、実施例１で説明したように該装置１０を用いて行われる。
【００９３】
該装置１０によってリフォールドされた蛋白質は、それから、限外透析によって濃縮化され、ゲル透析によって分離される。ゲル透析は、例えば、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）、Ｓ−３００カラムであって、２０ｍＭ トリス（登録商標）、ＨＣｌ，０．４Ｍ尿素、ｐＨ８．０によって平衡化されている。前記Ｓ−３００カラムからのリフォールドされるピーク（第２のピーク）は、さらに、ＦＰＬＣＲＥＳＯＵＲＣＥ−Ｑ（登録商標）カラムによって精製され、それは、２０ｍＭのトリス（登録商標）−ＨＣｌ、０．４Ｍｍ尿素、ｐＨ８．０と平衡状態にある。前記酵素は、ＮａＣｌの線型の勾配を持ったカラムから溶出される。前記Ｓ−３００からのリフォールドされたピークは、さらなる精製の前に活性化される。活性化のためには、その画分が等量の体積の０．２Ｍナトリウムアセテート、７０％のグリセロール、ｐＨ４．０と混合される。その混合物は、１８時間の間、２２℃でインキュベートされ、それから、２０ｍＭ ビス−トリス（登録商標）、０．４ Ｍ 尿素、ｐＨ６．０の２０倍の体積に対して２度 透析され。透析された物質は、それからさらに、２０ビス−トリス（登録商標）、０．４Ｍ尿素ｐＨ６．０と平衡状態にあるＦＰＬＣ ＲＥＳＯＵＲＣＥ−Ｑ（登録商標）カラム上で精製される。酵素は、ＮａＣｌの線型の勾配により溶出される。
【００９４】
以上説明した各実施の形態は、本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明では、特定の蛋白質を用いた場合のみを具体的に説明したが、該蛋白質の場合に限られるものではなく種々の蛋白質についても適用できる。また、光学的性質として濁度をのみ説明したが、その他、散乱光の強度、透過率、反射率、スペクトル等を測定することもできる。また、恒温手段として、４℃に設定した場合について説明したが、他の温度に設定することはもちろん可能である。例えば、１６℃に設定することにより、リフォールド処理を早めることができる．例えば、上記２４時間とあるのを２時間にすることができる。なお、各構成要素、部品、装置等、例えば、光学測定部、搬送部、容器、マルチノズルヘッドのノズル、分注機のノズル等についても、形状等は、図面に描かれたものに限定されるものではない。
【００９５】
【発明の効果】
第１の発明または第９の発明によれば、蛋白質のリフォールド処理を、人手によらずに、かといって、最初に設定した固定的処理手順に完全にまかせるのではなく、周期的に蛋白質溶液の光学的性質およびそのｐＨ値を測定し、その測定結果に基づいてリフォールド処理を進めるようにしている。したがって、各種蛋白質に応じた最適なリフォールド処理を行うことができる。
【００９６】
本発明によると、大量または多種類の蛋白質について、簡単な制御により、操作者の負担を増やすことなく、効率的に、迅速かつ安価にリフォールド処理を行うことができる。
【００９７】
また、本発明によると、測定した光学的性質およびｐＨ値に基づいて、算出した正確かつ精密な量の試薬の供給を行うことによって、信頼性の高いリフォールド処理を進めていくことができる。
【００９８】
第２の発明または第１０の発明によると、試薬供給部は、前記搬送経路において、光学測定部およびｐＨ測定部の下流側に設けている。したがって、試薬供給部は、前記光学測定部およびｐＨ測定部の測定結果に基づいて、正確かつ精密に該当する試薬の供給を行うことができる。
【００９９】
第３の発明または第１１の発明によると、これによって、前記容器に供給された試薬が蛋白質溶液中に混合して、均一で効率的に反応を引き起こすことができる。
【０１００】
第４の発明または第１２の発明によると、リフォールド処理の周期的な経過を知ることができるので、リフォールド処理の解析や改善に役に立たせることができる。
【０１０１】
第５の発明または第１３の発明によると、少なくとも３個の試薬吐出口を設けることによって簡単な構造で、ｐＨの確実な調節を可能とする。
【０１０２】
第６の発明または第１４の発明によると、容器の回転による液体の攪拌を行うことによって、簡単な構成および制御で、攪拌を行うことができる。
【０１０３】
第７の発明または第１５の発明によると、容器をボトル状に形成することによって、収容した液体の開口部からの流出を防止するとともに、内部に攪拌用突出部を設けることによって、収容された液体の攪拌をより効率的確実に行うことができる。
【０１０４】
第８の発明または第１６の発明によると、前記攪拌用突出部は、前記容器の内底部より一定高さ以上の位置に設けられている。したがって、該突出部の存在しない容器の位置において、光学測定を行うことによって、高い精度の測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置を示す斜視図
【図２】本発明の実施の形態に係るボトルを示す図
【図３】本発明の実施の形態に係る搬送装置の一部斜視図
【図４】本発明の実施の形態に係るｐＨ測定部を示す概念図
【図５】本発明の実施の形態に係る攪拌部を示す図
【図６】本発明の実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置の一部拡大斜視図
【図７】本発明の実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置の平面図
【符号の説明】
１０…蛋白質リフォールド装置
１１…フレーム
１２…基板
１３…蛋白質溶液
１４…ボトル
１５…搬送経路
１６…コンベイヤー（搬送部）
１７…蛇行領域
１８…断熱用蓋板
１９…濁度測定位置
２０…ｐＨ測定位置
２１…試薬供給攪拌位置
２２…吸引移送位置
２３…側壁
２４…貫通孔
２５…受光部（光学測定部、濁度測定部）
２６…ｐＨ測定用電極（ｐＨ測定部）
２７…電極用Ｚ軸駆動装置
２８…電極用Ｘ軸駆動装置
２９…ノズル（試薬供給部）
３０…マルチノズルヘッド（試薬供給部）
３１…攪拌部
３２…マイクロプレート
３３…自動分注機（吸引移送部）
３４…ノズル
３５…チップラック
３６…分注用Ｚ軸駆動装置
３７…分注用Ｘ軸駆動装置
３８…マイクロプレート等用Ｙ軸駆動装置
３９…自動ドア
４０…開口部
４１…首部（容器）
４２…胴部（容器）
４３…螺子山（容器）
４４…凸部（攪拌用突出部）
４５…底部
４６…目盛り
４７…チェーン（搬送部）
４８…搬送用ロッド（搬送部）
４９…ｐＨ測定部
５０…電極洗浄部
５１、５４、６０、６８…モータ
５２、５５…ボールねじ
５３…ナット部
５６…洗浄用容器
５７…スプレイ
５８…チューブ
５９…排出部
６１…カップリング
６２…シャフト
６３…ローラ
６４…アイドラ−ローラ
６５…アクチュエータ
６６…ソレノイド
６７…接触領域
６９…案内用スクリュー
７０…スプリング付ソレノイド
７１…キャリッジ
【発明の属する技術分野】
本発明は、自動蛋白質リフォールド装置および自動蛋白質リフォールド装置の使用方法に関する。本発明は、組換え蛋白質の製造の分野、特に、Ｅ． ｃｏｌｉ（大腸菌）原核生物発現系の封入体に発現された組換え蛋白質のリフォールド（本来の働きを失っている不活性型凝集蛋白質の間違った構造を解きほぐし、正しい立体構造に巻き戻すこと）の分野で用いられる。
【０００２】
「プロテオミクス」と呼ばれる、天然型の生物活性および構造をもった組換え蛋白質の発現は、いくつかの有機体及びヒトに対するゲノム解析の完成とともに重要性が増大している。プロテオミクスの１つの側面は、商業的な応用とともに、構造および機能研究のための大量の蛋白質を発現することである。組換え蛋白質を安価で効率的に発現する方法は、大腸菌内に蛋白質を発現することである。
蛋白質は菌体内に発現されるか、またはペリプラズム空間に隠れる。前者の場合には、前記蛋白質は、特にその蛋白質がジスルフィド結合を持つ場合にはしばしば封入体に沈積する。
【０００３】
しかしながら、大腸菌内に、哺乳類の蛋白質を発現する場合の１の問題点は、発現された蛋白質の大部分が、不溶性の封入体を形成することである。この問題点は、種々の哺乳類または昆虫の発現系を使用することにより、回避されるが、大腸菌を培養することは、哺乳類および昆虫の培養に比較してより早くかつより安価である。さらに、ある蛋白質は、その天然型に発現される場合に、そのホストに対して毒であるため、このような不溶性の封入体としての発現は、大量の組換え蛋白質を得る唯一の方法である。重要なことは、高いレベルの発現が、大部分の蛋白質に対して達成できることである。細菌培養のリットル当り４００から６００ｍｇの封入体は、日常的に達成され、この方法を使用して９７００ｍｇ／Ｌまでが報告されている（非特許文献１）。封入体は、簡単な凍結／融解および界面活性剤洗浄法によって、容易に９０％以上に精製される。
【０００４】
封入体は、その細胞が光学顕微鏡下で観測すると、高密度のカイコ細胞質微粒のように見える。典型的には、その細胞は、前記細胞の機械的破裂により分解し、４７００ｇで、３０分間の間の遠心分離を行う。封入体は、低い遠心力で沈降し、多数の他の細胞内蛋白質から分離することができる。さらに、前記細胞破裂の間に用いたバッファ液によって、前記ペレット状のものを洗浄し、または、４０から５０％のグリセロール内に再懸濁したペレットを遠心分離することによってさらなる精製がされる。
【０００５】
真核生物の菌体外の多数の蛋白質は、ジスルフィド結合を含有する。多重ジスルフィド結合を有する蛋白質は、変形された構造からの折りたたみ（フォールディングｆｏｌｄｉｎｇ）の間に、非天然型ジスルフィド結合を形成するかも知れない。
さらに、もし、正しくないジスルフィド結合が、外部のチオールの削減または蛋白質のチオールからの攻撃によって硬く結合しなのであれば、折りたたみは、それから妨げられる。封入体としての原核生物における組換え蛋白質の発現の明らかな不利益は、蛋白質はその天然型内では得られず、かつ典型的には機能的に活性化していないということである。
【０００６】
【従来の技術】
従来、前記蛋白質を分解しかつ活性化蛋白質を改質するようにそれらをリフォールドする多数の方法があった。ペレット状の組換え蛋白質の溶解は、通常７Ｍ（モル濃度）の塩酸化グアニジンまたは８Ｍの尿素のような変性剤を必要とする。
蛋白質の凝集の量は、もし、蛋白質が、変性剤中に残ったままにしておくならば、増加する（非特許文献２）。透析または脱塩カラムによる前記可溶化した封入体からの変性剤の除去は、前記蛋白質を、天然型蛋白質がリフォールドされるのに必要な条件の下で沈澱させる。誤って折りたたまれた蛋白質溶液は、生物的検査においては、非常に低い特異的な活性をもつ。
【０００７】
封入体として、大腸菌内の種々の蛋白質の発現および折りたたみについての多数の報告があるけれども、蛋白質の折りたたみにおける誤解の１つは、唯一のリフォールド法は各個々の蛋白質ごとに開発しなければならいということである（非特許文献２）。他の誤解は、哺乳類の蛋白質の大部分は、封入体からリフォールドすることができないということである（非特許文献３、非特許文献４）。公開された仕事は、大部分、大腸菌からの封入体をリフォールドする「サクセス」物語であるので、この工程を使用した場合に、精製された哺乳類蛋白質についての割合がどの程度であるかの一般的な思想を得ることは不可能である。
【０００８】
文献（非特許文献３、非特許文献４） 内に報告されたリフォールド蛋白質より多数のリフォールドする方法がある。種々のシャペロン、活性化剤およびカオトロピック剤が、リフォールディングを補助するために使用されている。加えて、ｐＨ，イオン化強度、温度、バッファ組成、および還元／酸化試薬が、全てリフォールドに影響を与えることができる。プロテオミクスまたは構造ゲノミクスにおける研究で要求されるような、大量の蛋白質をリフォールドするためにこれらの条件を全て試験することは、負担が大きいであろう。
【０００９】
組換え系、特に、大腸菌のような系において封入体を形成する系において、発現した大部分の蛋白質をリフォールドするための単一の簡単な手順が必要である。このような手順として、本出願の発明者によって、蛋白質、特に、組換え蛋白質、さらに言えば、細菌のホスト内において存在する組換え蛋白質をリフォールドするための方法が提供されている（特許文献１）。
【００１０】
該方法は、折りたたみの対象となる封入体に発現した蛋白質を解きほぐす工程と、生物学的活性型の正しい立体構造に巻き戻す工程という２つの主要な工程からなっている。第１の工程は、変性剤の存在下で、蛋白質溶液のｐＨを、９以上に、好ましくは１０にまで上昇させることである。該蛋白質溶液は、約２４時間までの期間の間、その高められたｐＨにされるか、または、直ちにゆっくりと下降するｐＨ、２４時間当り約０．２ｐＨの減少分で、前記溶液が約８．０のｐＨに達するまで、または、両方の工程が用いられる。好ましくは、精製された封入体は、８Ｍの尿素、０．１Ｍのトリス（２−ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１， ３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌはｐＨ８前後で非常に強い緩衝作用があり、緩衝液として頻用される）、１ｍＭ グリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１０ｍＭ βメルカプトエタノール、１０ｍＭ のジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ の 還元化グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＨの、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）でｐＨ１０の場合に、分解される。
前記蛋白質溶液の２８０ｎｍの波長の光に対する吸収度（ＯＤ２８０）は、５．０である。
この溶液は、２０ｍＭトリスを主成分とする体積の２０倍にまで、急速に希釈化される。その結果としての溶液は、１ＭのＨＣｌをもったｐＨ９．０に調節される。２４時間の間４℃に維持される。該ｐＨはｐＨ８．８に調節され、該溶液は、もう２４時間の間４℃に維持される。この工程は、前記ｐＨが、８．０に調節されるまで繰り返される。ｐＨ８．０で、２４時間経過した後、リフォールドされた蛋白質は、限外濾過によって濃縮化され、精製のためにゲル濾過カラムが適用される。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｊｅｏｎｇ ＫＬ； Ｌｅｅ ＳＹ 著 １９９９． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：３０２７−３２
【非特許文献２】
Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｗｉｎｋｅｒ著 「大腸菌中で生産された真核的蛋白質の折りたたみ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １２， １−１９ ａｔ ｐ．６ （１９９０）
【非特許文献３】
Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ．， Ｌｉｌｉｅ Ｈ．著， １９９６， ＦＡＳＥＢＪ １０：４９−５６
【非特許文献４】
Ｌｉｌｉｅ Ｈ．， Ｓｃｈｗａｒｚ Ｅ， Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ．著 １９９８． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９；４９７−５０１
【特許文献１】
国際公開ＷＯ０１／５５１７４ Ａ２
【非特許文献５】
Ｌｉｎ等著１９９４ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｕｍｏｌｏｇｙ ２１４， １９５−２２４
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、以上説明したように、発現された蛋白質をリフォールドするには、一旦発現された蛋白質を解きほぐし、解きほぐした蛋白質を再度巻き上げる必要がある。そのためには、該蛋白質の溶液について、長時間にわたり、微妙なｐＨの調節を繰り返す必要があった。
【００１３】
そのため、人手によって、この作業を行おうとすると、操作者が、長時間に渡って作業状況を監視して、緩衝液を含む各種試薬を、溶液のｐＨを測定しながら、その測定したｐＨに応じて定まる種類と量を適切な時間に添加してｐＨの調節を行う必要があり、操作者に大きな負担を強いていた。
【００１４】
特に、大量または多種類の蛋白質についてリフォールド処理を行う場合には、同一処理の機械的繰り返しが必要となり、または、多種類の蛋白質についてリフォールド処理を行う場合の条件の相違、特に試薬等の種類、量、割合の相違のために操作者の負担は急激に増加するために、効率的かつ迅速な処理を行うことができないという問題点を有していた。
【００１５】
これらの作業を、人手で行うために、その処理に高い信頼性を与えることができないおそれがあるとともに、操作者が長時間処理にかかわるために、人件費等によりその製造費用が高くなるおそれがあるという問題点を有していた。
【００１６】
そこで、本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、その第１の目的は、蛋白質、特に、組換え蛋白質、さらに言えば、細菌のホスト内において封入体に存在する組換え蛋白質のリフォールド処理を、人手によらずに、自動的に行うことができるリフォールド装置およびリフォールド装置の使用方法を提供することである。
【００１７】
その第２の目的は、大量または多種類の蛋白質を、簡単な制御により、効率的に、迅速かつ安価にリフォールド処理を行うことができる蛋白質リフォールド装置および蛋白質リフォールド装置の使用方法を提供することである。
【００１８】
その第３の目的は、正確かつ精密に試薬等を供給するようにして蛋白質のリフォールド処理を進めることができる信頼性の高い蛋白質リフォールド装置および蛋白質リフォールド装置の使用方法を提供することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
以上の技術的課題を解決するために、第１の発明は、リフォールド対象の蛋白質を含有する蛋白質溶液を収容可能な１または２以上の容器を載置して、所定の閉じた搬送経路に沿って該容器を搬送する搬送部と、前記搬送経路に設けられ、前記容器内の蛋白質溶液の光学的性質を測定する光学測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを調節するための試薬を含む複数種類の試薬を各々供給可能とする試薬供給部とを有するとともに、前記試薬供給部は、前記光学測定部の測定結果、前記ｐＨ測定部の測定結果および予め定めたｐＨパターンに基づいて蛋白質溶液のｐＨの調節を行うことによって蛋白質のリフォールドを行う蛋白質リフォールド装置である。
【００２０】
ここで、「光学的性質」とは、光学的な種々の性質をいい、例えば、各種の光（赤外線、遠赤外線、可視光等）の入射光に対する透過光、反射光若しくは散乱光の性質、または分光的な性質等をいう。例えば、入射光に対する透過光の性質として、光学的密度（濁度）がある。該光学的密度は、溶液中の溶質の光を吸収する度合いを表す値であって、溶質の光の吸収率の逆数の対数である。すなわち、ｌｏｇ（Ｉ０／Ｉ）をいう。ここで、Ｉ０およびＩは、溶媒だけを通過した光および同じ厚さの溶液層を通過した光の強さを表す。濁度が大きくなれば、凝集した蛋白質が解きほぐされて、溶液中に懸濁する量が増大していることを意味する。
【００２１】
従って、本発明では、蛋白質の解きほぐされの程度の測定結果を取り入れて、ｐＨの調節を行うことにより、リフォールド処理を進めていくことになる。
【００２２】
「ｐＨを調節するための複数種類の試薬」としては、ｐＨを一定に保つための緩衝剤、酸性化試薬またはアルカリ性化試薬を少なくとも有し、これらに属する試薬を、単独にまたは組み合わせて適当な量混合することによって、ｐＨを調節する。
【００２３】
ｐＨのパターンは、リフォールドの対象となる蛋白質に応じて定められる。そのパターンの一般的な傾向としては、リフォールドの第１段階としての凝集した蛋白質を解きほぐすために、蛋白質溶液を、１以上のカオトロピック試薬および還元試薬の存在の下でｐＨで、９．０以上に維持し、第２段階として、解きほぐした蛋白質を３次元構造に巻き上げるために、該溶液のｐＨを次第に、所定時間以上の時間で、ｐＨ８．０にまで減少させて、該蛋白質が、質的に、生物学的活性化および該蛋白質に特有の構造を表すように、該蛋白質の少なくとも一部の再生を誘導する。「所定時間」は、該処理が行われる温度に依存する。該温度は、該リフォールド装置に設けられ、前記搬送される容器内を所定温度に保つように加熱または冷却する恒温手段によって設定される。例えば、該所定温度を４℃に設定すると、所定時間は、２４時間となり、該温度を１６℃に設定すると、所定時間は２時間となる。本発明によれば、恒温手段の温度を変えることによって、処理に必要な時間を、従ってｐＨパターンを種々に定めることができる。すなわち、処理時間を増減させることができる。また、このｐＨの減少は、例えば、該所定時間毎に０．２ｐＨずつ減少させる。また、前記ｐＨの９．０以上の維持は、例えば、該所定時間以上行われる。
【００２４】
前記ｐＨの減少は、酸を加えることによって行う。前記カオトロピック試薬および変性試薬は、０．５及び１．０Ｍ 尿素、０．１ｍＭから１００ｍＭのβメルカプトエタノール、０．１ｍＭから１０ｍＭの酸化グルタチオンのいずれかから選択されたものである。
【００２５】
「蛋白質」には、組換え蛋白質、さらには、細菌の封入体から抽出された蛋白質をも含む。該細菌には、大腸菌を含む。該封入体は、ｐＨが９と１０との間で溶解される。
【００２６】
「閉じた搬送経路に沿って搬送する」ので、１の容器について、光学的性質およびｐＨを測定しながら、ｐＨの調節を繰り返して、リフォールド処理を行うことができる。ｐＨ測定部は、例えば、容器に挿抜可能に設けた電極と、該電極を洗浄する洗浄部と、前記容器と前記洗浄部との間を移動可能とする移動部とを有するように構成する。
【００２７】
第２の発明は、前記試薬供給部は、前記光学測定部および前記ｐＨ測定部の下流側に設けられた蛋白質リフォールド装置である。
【００２８】
好ましくは、これらの光学測定部、ｐＨ測定部および試薬供給部は、搬送経路に沿って、この順序またはｐＨ測定部、光学測定部、試薬供給部の順序で、隣接するように設ける。
【００２９】
第３の発明は、前記試薬供給部、または、それよりも下流側の搬送経路に、前記容器の収容物を攪拌させる攪拌部を設けた蛋白質リフォールド装置である。
【００３０】
第４の発明は、前記搬送経路には、前記容器に収容されている蛋白質液体の一部の所定量を吸引して、該当する容器に移送するための吸引移送部を設けた蛋白質リフォールド装置である。
【００３１】
第５の発明は、前記試薬供給部は、少なくとも３個の試薬吐出口を有し、各試薬吐出口からは少なくとも酸性試薬、アルカリ性試薬、およびバッファ用試薬のいずれかを独立に吐出可能に設けた蛋白質リフォールド装置である。
【００３２】
第６の発明は、前記攪拌部は、前記搬送経路において、前記容器を軸まわりに回転することによって、該容器内に収容されている液体の攪拌を行う蛋白質リフォールド装置である。
【００３３】
第７の発明は、前記容器は、ボトル状に形成され、該容器の内部に、容器の内壁から軸線方向に向かって突出する攪拌用突出部を設けた蛋白質リフォールド装置である。
【００３４】
第８の発明は、前記攪拌用突出部は、前記容器の内底部より一定高さ以上に設けられた蛋白質リフォールド装置である。
【００３５】
第９の発明は、リフォールド対象の蛋白質を含有する蛋白質溶液を収容可能な１または２以上の容器を載置する所定の閉じた搬送経路に沿って該容器を搬送する搬送工程と、前記搬送経路において、前記容器内の蛋白質溶液の光学的性質を測定する光学測定工程と、該搬送経路において、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定工程と、該搬送経路において、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを調節する試薬を含む複数種類の試薬を供給する試薬供給工程とを有するとともに、前記試薬供給工程は、前記光学測定工程の測定結果、前記ｐＨ測定工程の測定結果および予め定めたｐＨパターンに基づいて、前記蛋白質溶液のｐＨの調節を行う蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００３６】
第１０の発明は、前記ｐＨ測定工程は、前記光学測定工程の後に実行され、前記試薬供給工程は、前記ｐＨ測定工程の後に実行される蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００３７】
第１１の発明は、前記試薬供給工程において、または、該工程の後で、搬送経路において、前記容器の収容物を攪拌させる攪拌工程を設けた蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００３８】
第１２の発明は、前記搬送経路において前記容器に収容されている液体の一部の所定量を吸引して、該当する容器に移送する吸引移送工程を有する蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００３９】
第１３の発明は、前記試薬供給工程は、少なくとも３本の試薬吐出口から、少なくとも酸性試薬、アルカリ性試薬、およびバッファ用試薬のいずれかを吐出可能とする蛋白質リフォールド装置である。
【００４０】
第１４の発明は、前記攪拌工程は、前記搬送経路において、前記容器を軸まわりに回転することによって、該容器内に収容されている液体の攪拌を行う蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００４１】
第１５の発明は、前記攪拌工程は、ボトル状に形成された容器の内部に、容器の内壁から軸線方向に向かって突出する攪拌用突出部を設けた容器を回転させることによって行う蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００４２】
第１６の発明は、前記攪拌工程は、前記攪拌用突出部が前記容器の内底部より一定高さ以上に設けられた容器を回転する蛋白質リフォールド装置の使用方法である。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置１０を、図面に基づいて説明する。本実施の形態の説明は、特に指定のない限り、本発明を制限するものと解釈してはならない。
【００４４】
図１は、実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置１０の斜視図を示すものである。
該蛋白質リフォールド装置１０は、フレーム１１を有し、該フレーム１１の上側には、目的蛋白質のリフォールド作業を行う各種装置を有する作業基板１２が設けられ、該作業基板１２の下側の該フレーム１１の内側には図示しない各種機構部、恒温手段に相当する空調部（ペルチェ素子およびファンからなる）および後述する搬送部であるコンベイヤーの駆動回路等を有している。
【００４５】
前記作業基板１２には、処理の対象となる蛋白質を含有する蛋白質溶液１３が収容された１または複数（この例では、最大で９６本）の前記容器に相当するボトル１４を載置して、所定の搬送経路１５に沿って搬送するコンベイヤー（搬送部）１６が設けられている。該ボトル１４は、収容されている蛋白質溶液の濁度等の光学的性質を測定するために透明の素材、例えば、ガラス、または、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル等の樹脂で形成するのが好ましい。該コンベイヤー１６は、前記ボトル１４を、前記搬送経路１５に沿って一斉に図中矢印の方向に搬送する。
【００４６】
該搬送経路１５は閉路を形成し、その閉路の一部は、該搬送経路１５が蛇行するように配置された蛇行領域１７を有し、該搬送経路１５の全体は上側に断熱用蓋板１８が載置されている。該搬送経路１５のうちの大部分を占める該蛇行領域１７を前記恒温手段によって所定温度に設定することによって、前記ボトル１４が該蛇行領域１７を搬送される間に前記ボトル１４に対するインキュベーションが行われることになる。前記蛇行領域１７を除く前記搬送経路１５の非蛇行領域においては、上流側から、前記ボトル１４内に収容された蛋白質溶液１３の濁度を光学的性質として測定する濁度測定位置１９、該ボトル１４内に収容され蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定位置２０、該ボトル１４内の蛋白質溶液のｐＨを調節するために複数種類の所定試薬を分注可能とするとともに、該ボトル１４内に収容されている蛋白質溶液を攪拌する試薬供給攪拌位置２１と、該ボトル１４に収容されている蛋白質溶液の所定量を吸引して移送し、対応する容器内に吐出する吸引移送位置２２とが配置されている。これらの位置２０、２１、２２においては、前記断熱用蓋板１８には、上側から前記位置における前記ボトル１４内の蛋白質溶液１３に到達可能となるような孔が設けられている。
【００４７】
前記濁度測定位置１９には、前記搬送経路１５の両側壁２３に穿設された２つの貫通孔２４が設けられ、該貫通孔２４を通るように、該搬送経路１５を挟むように設けた図示しない照射部と、受光部２５が設けられている。前記照射部からの光のうち前記貫通孔２４を通り、前記受光部２５に達する光は、前記ボトル１４の下側を通る。濁度は、該受光部２５が受光した光の強度と前記照射部の光の強度の比に基づいて算出される。
【００４８】
前記ｐＨ測定位置２０においては、後述するように、ｐＨ測定用電極２６が設けられている。該ｐＨ測定用電極２６は、電極用Ｚ軸駆動装置２７および電極用Ｘ軸駆動装置２８によって、図中示すＺ軸およびＸ軸方向に移動可能である。
【００４９】
前記試薬供給攪拌位置２１には、前記ボトル１４内に収容された蛋白質溶液１３のｐＨを調節するために必要な種々の試薬（この例では１２種類）を供給するために１２本のノズル２９が設けられたマルチノズルヘッド３０を有し、各ノズル２９はチューブを介して前記フレーム１１の内部に設けられた図示しない前記各試薬を収容するタンクと連通している。
【００５０】
さらに、該試薬供給攪拌位置２１に位置した前記ボトル１４内に収容された蛋白質溶液１３を該ボトル１４を回転させることによって、該ボトル１４と、該ボトル１４内に収容されている蛋白質溶液１３との間に生ずる角速度の相違と前記凸部の存在により、該蛋白質溶液１３を攪拌するための攪拌部３１が設けられている。
【００５１】
前記吸引移送位置２２には、該位置２２に存在する前記ボトル１４内に収容されている液体を所定量吸引して移送し、所定のマイクロプレート３２の所定ウェルに吐出するための自動分注機３３が設けられている。該自動分注機３３は、該自動分注機３３のノズル３４にピペットチップ（図示せず）を着脱自在に装着して使用するものである。該ピペットチップは、各ボトル１４に対応した位置のチップラック３５に収容され、各ボトル１４に応じて、該当するピペットチップと交換して、吸引移送処理を行うようにしている。これによって、前記ボトル１４相互間のクロスコンタミネーションを防止することができる。
【００５２】
該自動分注機３３は、分注用Ｚ軸駆動装置３６によってＺ軸方向に駆動され、分注用Ｘ軸駆動装置３７によってＸ軸方向に駆動される。なお、Ｙ軸方向については、前記マイクロプレート３２およびチップラック３５をマイクロプレート等用Ｙ軸駆動装置３８によってＹ軸方向に移動させることによって、前記分注機３３は、前記マイクロプレート３２等に対して相対的に移動可能としている。
【００５３】
図１において、符号３９は、前記自動分注機３３のノズル３４または該ノズル３４に装着されたピペットチップが、前記チップラック３５に収容された各ピペットチップに到達し、またはマイクロプレート３２の各ウェルに到達可能となるように設けた前記断熱用蓋板１８に設けた開口部４０の開閉を行う自動ドアである。
【００５４】
図２は、前記ボトル１４を詳細に示すものである。
同図に示すように、該ボトル１４は、首部４１と、胴部４２とからなり、該首部４１には、図示しない蓋部と螺合するように螺子山４３が設けられている。胴部４２の外側面の一部は陥没し、該ボトル１４の半径方向に沿って内方に突出する縦長の凸部４４が、底部４５より所定高さ位置から所定長さ設けられている。
該凸部４４が前記攪拌用突出部に相当する。なお、前記凸部４４を前記底部４５から所定高さだけ高い位置に設けているのは、前記濁度を測定する際に、該凸部４４によって、光の進行を妨げないようにして、正確な濁度の測定を行うためである。
さらに、該ボトル１４は、該ボトル１４の容積を表示する目盛り４６を設けている。
【００５５】
図３は、前記コンベイヤー１６の主要部を詳細に示すものである。該コンベイヤー１６は、前記搬送経路１５の下側中央に沿って配置されたチェーン４７と、前記ボトル１４がその間に載置して搬送可能となる間隔、例えば、該ボトル１４の外径よりやや大きい程度の間隔で、前記ボトル１４の高さより低い搬送用ロッド４８が垂直方向に突出して設けられている。
【００５６】
図４は、前記ｐＨ測定位置２０に設けられた前記ボトル１４に収容された蛋白質溶液１３のｐＨの測定行うｐＨ測定装置４９である。該ｐＨ測定装置４９は、前述したように、前記ボトル１４内に挿入可能に設けられた前記ｐＨ測定用電極２６と、該電極２６をＺ軸方向に移動させる前記電極用Ｚ軸駆動装置２７と、該電極２６をＸ軸方向に移動させる前記電極用Ｘ軸駆動装置２８と、該電極２６を洗浄して再生させる電極洗浄部５０とを有している。前記電極用Ｚ軸駆動装置２８は、モータ５１と、該モータ５１によって、回転駆動され、前記電極用Ｘ軸駆動装置２８によって、Ｘ軸方向に沿って移動可能に保持されるＺ軸方向に沿って設けられたボールねじ５２と、該ボールねじ５２と螺合し、前記ボールねじ５２の回転によって、上下方向に移動可能であるとともに、前記電極２６が取り付けられたナット部５３とを有する。
【００５７】
また、前記電極用Ｘ軸駆動装置２８は、モータ５４と、該モータ５４によって回転駆動されるＸ軸方向に沿って設けられたボールねじ５５とを有する。前記電極洗浄部５０は、軸方向に沿って前記電極２６が挿入可能な洗浄用容器５６と、該洗浄用容器５６内において、挿入された前記電極２６に向かって洗浄液を噴射することができるスプレイ５７と、該スプレイ５７に前記洗浄液を供給するためのチューブ５８と、前記容器５６内にたまった液体を排出する排出部５９とを有する。
【００５８】
本実施の形態に係るｐＨ測定部によれば、電極を洗浄しながら用いるので、人手を介することなくかつクロスコンタミネーションなしに、正確に、そのｐＨを測定することができる。
【００５９】
図５（ａ）は、前記ｐＨ攪拌位置２１に設けられた攪拌部３１の側面図であり、同図（ｂ）は、その平面図を示す。
該攪拌部３１は、モータ６０と、カップリング６１を介して該モータ６０によって回転駆動されるシャフト６２と、該シャフト６２の回転によって回転するローラ６３と、該ローラ６３によって、その側面と接触して回転駆動される前記ボトル１４と、前記ローラ６３により該ボトル１４を回転させる際に、該ボトル１４のがたつきやゆれを防止するために該ボトル１４を押さえるためのアイドラーローラ６４と、該アイドラーローラ６４を前記ボトル１４に押し付けるために該ボトル１４の半径方向に移動させるアクチュエータ６５と、該アクチュエータ６５を駆動するソレノイド６６とを有する。なお、符号６７は、該ボトル１４上の接触領域である。
【００６０】
図６は、本実施の形態に係る前記蛋白質リフォールド装置１０の一部を取り出して示す斜視図である。
前記マイクロプレート等用Ｙ軸駆動装置３８は、モータ６８と、案内用スクリュー６９とを有する。図中、符号７０は、自動ドア開閉用のスプリング付ソレノイドであり、符号７１は、前記マイクロプレート等用Ｙ軸駆動装置３８により駆動される、前記マイクロプレート３２およびチップラック３５を搬送するキャリッジである。
【００６１】
図７は、本実施の形態に係る前記蛋白質リフォールド装置１０の概略平面図である。
なお、図示されていないが、前記光学測定部の測定結果、ｐＨ測定部の測定結果、およびｐＨパターンに基づく前記試薬供給部による、供給すべき試薬の種類および量を算出するため、または、恒温手段および搬送部の温度や速度の設定、進行および停止の指示については、ＣＰＵやメモリを有する演算処理装置，表示装置、キーボード、スイッチ、マウス、通信手段等の入力装置、プリンタ、メモリ等の出力装置からなる情報処理装置を有している。
【００６２】
続いて、本実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置１０を使用する場合について説明する。
【００６３】
一旦、蛋白質の最大量が発現されると、細菌のホストから分離され精製される。該蛋白質は、一般的に、細胞を溶解することによって、例えば、界面活性剤中に懸濁させ、リゾチームを加え、それから凍結することによって（例えば、ＴＮ／１％ トリトン（登録商標）Ｘ−１００の２０ｍｌ中に細胞を懸濁させ、１０ｍｇのリゾチームを加え、それから−２０℃で凍結することによって）、融解しかつＤＮＡエースを加えて細菌のＤＮＡの全てを解体するために加え、それから、緩衝剤で処理された溶液中で生成した沈殿物を洗浄することによって、一般的に抽出される。沈殿物は、それから、リフォールド処理のために、後述するような適当な溶液中で溶解され、前記ボトル１４に収容され、前記蛋白質リフォールド装置１０の搬送経路１５上に載置される。
【００６４】
ここで、該蛋白質リフォールド装置１０の試薬供給部が従うべきｐＨパターンおよび、試薬供給部から供給されるべき試薬について説明する。
大部分の従来の方法では、通常ｐＨ７．４から８．０のような生理的なｐＨにおいて、還元したカオトロピック塩（８Ｍの尿素のような）を用いて、通常、蛋白質をリフォールドする。これは、通常、大量の沈殿または凝集を生み出し、リフォールドを不可能または低い生産性に留める。しかし、最初のリフォールドのｐＨが高い（少なくとも、ｐＨが９．０、但し、ｐＨが１０のようなより高い物が望ましい）場合には、リフォールドが可能である。この方法は、ペプシノゲンが、ｐＨ８．０〜９．０において、可逆的に変性しまた復元するという事実によって最初に示唆された。
【００６５】
高いｐＨ（９．０のような）においては、蛋白質はいくつかの第２の構造を得て、リフォールド溶液の活性度が、生物学的ｐＨに低下したときに、より効率的にリフォールドすることができることが仮定されている。後ほど、生理学的なｐＨで蛋白質がリフォールドされる蛋白質でさえ、高いｐＨでより効率的に生産される。加えて、高いｐＨのリフォールド処理は、最初の大量の沈殿を防止するすばらしい方法である。本装置１０においても、前記パターンとして、この高いｐＨを維持するようにリフォールド処理を行う。
【００６６】
前記試薬供給部から供給されるべき試薬としては、０．５から１．０Ｍの尿素、塩酸化グアニジン、およびＬ−アルギニンのようなカオトロピック塩の非変性濃度がある。これらは、リフォールド処理を助け、リフォールドされた蛋白質を活性化するために役に立つからである（非特許文献３）。そのカオトロピック試薬の濃度の範囲は、０〜４Ｍであるが、好ましくは、０．４Ｍである。リフォールド／精製工程における尿素の濃度は、蛋白質上で変性効果をもたない。
また、前記試薬供給部から供給されるべき試薬として、還元／酸化試薬がある。
【００６７】
ジスルフィド結合を有する哺乳類の蛋白質封入体は還元試薬の存在中で溶解される必要がある。代表的な還元試薬は、β―メルッカプトエタノールを、０．１ｍＭから１００ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ、ＤＤＴを０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ、還元グルタチオン（ＧＳＨ）を、０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭ、および酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を、０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭ含有する。βメルカプトエタノールは、好ましい還元試薬である。加えて、ジチオトレイトールおよび／または還元／酸化グルタチオン（ＧＳＨ、ＧＳＳＧ）は、誤って折りたたまれた中間ジスルフィド結合の「オシド−シャッフリング」を容易化するために含ませることができる。
【００６８】
さらに、前記パターンとして、蛋白質のリフォールド処理を行うのに十分に長い時間、蛋白質溶液のｐＨを高い状態にしておくことが重要である。これは、好ましくは、ｐＨをゆっくりと、２４時間で０．２ｐＨの減少分で、下げることによって達成する。この方法では、前記蛋白質溶液は、高いｐＨ、好ましくは、少なくとも９．０以上に、または１０若しくは好ましくは１１未満にまで調節される。前記蛋白質は、好ましくは、少なくとも２４時間の間各ｐＨで維持される。同等な効果は、温度を調節することにより、より短い時間、例えば、２， ３， ６， ９， １２， １８または２０時間で達成されることができる。ｐＨは、前記ボトル１４に前記マルチノズルにより、酸等を加えることによって行われる。
【００６９】
次に、より具体的に組換え蛋白質のリフォールド処理の２つの実施例について説明する。
【００７０】
（１）第１の実施例
前段階として、組換え蛋白質の発現を行う。
発現プラスミドが、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）鎖のような適当なホストに導入され、ＺＢ／アンピシリンプレート上に置く。このことは、好ましい組換え有機体を選択する。各構造物から単一のコロニーが、１００ｍｌのＺＢ／アンピシリン媒体に植えつけられ、３７℃で１６時間成長する。
【００７１】
ＬＢ／アンピシリンの１リットル中に１晩の培養物の２０ｍｌを植え付け、３７℃で、波長６００の光の濁度が０．４〜０．６に達するまで攪拌し、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ加え、３時間攪拌する。
【００７２】
遠心分離し、細胞をＴＮ／１％トリトン（登録商標）Ｘ−１００の２０ｍｌに細胞を再懸濁する。１０ｍｇのリソチームを加え、−２０℃で一晩凍結する。
【００７３】
凍結された細胞を融解し、２０μｌの１ＭのＭｇＳＯ４，１００μｇ ＤＮＡエースを加え、細菌のＤＮＡが完全に溶解するまで攪拌する。
【００７４】
２５０ｍｌのＴＮ／１％のトリトンを加え、２から４時間の間攪拌し、遠心分離およびトリトンの洗浄をさらにもう一度繰り返す。８Ｍの尿素溶液の１０ｍｌに前記ペレットを溶解し、βメルカプトエタノールを１００ｍＭまで加え、その溶液が遠心分離されてリフォールドの準備ができる。
【００７５】
該溶液を前記ボトル１４内に収容して、前記蛋白質リフォールド装置１０の前記搬送経路１５上に載置する。
【００７６】
該ボトル１４が前記搬送経路１５上で図中左回りに間歇的に搬送され、前記濁度測定位置１９において、該ボトル１４の下側に波長２８０の光を前記照射部７２より照射し、前記受光部２５で受光することによって、濁度を算出し、８Ｍの尿素溶液に対して目標の５．０となるか否かを測定する。
【００７７】
該濁度が５．０になるまでは、再び該ボトル１４に対してｐＨ調節が繰り返される。該ボトル１４が、前記ｐＨ測定位置２０に到達すると、前記電極２６が、前記電極用Ｘ軸駆動装置２８によって移動し、前記ｐＨ測定位置２０の真上にまで到達する。次に、前記電極用Ｚ軸駆動装置２７によって、該電極２６を前記ボトル１４内の蛋白質容液１３内に挿入して、該溶液内の水素イオン濃度を測定する。測定後は、該電極２６を上昇させ、前記Ｘ軸方向に移動させて、該電極２６を洗浄用容器５６内に挿入し、前記スプレイ５７を用いて洗浄液を噴射し、電極２６を洗浄し、その廃液を排出部５９を介して排出する。該ｐＨは最終的に、１０．０になるまで、該ボトル１４に対してｐＨ調節のための試薬の供給が繰り返されることになる。
【００７８】
該ボトル１４が、試薬供給攪拌位置２１にまで達すると、該位置２１に設けたマルチノズルヘッド３０の各ノズル２９を介して、ｐＨ調節用試薬が該ボトル１４内に供給されることになる。該マルチノズルヘッド３０からは、例えば、次の還元試薬、１０ｍＭ βメルカプトエタノール、１０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭの還元化グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）のうち、前記濁度測定結果及び前記ｐＨ測定結果に基づいて、選択された試薬の所定量が各々供給されることになる。なお、該試薬供給攪拌位置２１において、前記試薬の供給が行われる際に、該ボトル１４は、前記攪拌部３１によって、該位置２１で、前記ボトル１４の軸まわりに回転が加えられることになる。すなわち、前記ローラ６３を前記モータ６０からの回転力をカップリング６１およびシャフト６２を介して伝達して回転させ、該ボトル１４の外側面を回転させるその際、前記アクチュエータ６５によって、アイドラーローラ６４を該ボトル１４に押さえつけて、該ボトル１４のがたつきを防止する。
【００７９】
該ボトル１４が回転すると、該ボトル１４内に設けた凸部４４が前記ボトル１４内の溶液を効果的に攪拌する。
【００８０】
最終的な溶液のｐＨは１０．０となるように、前記マルチノズルからの試薬によって調節される。
【００８１】
次に、前記ボトル１４が前記吸引移送位置２２に達すると、前記自動分注機３３のノズル３４が、前記Ｘ軸駆動装置３７によって、前記自動ドア３９が開いた前記開口部４０の該当するＸ座標の位置にまで移動する。同時に、前記キャリッジ７１のＹ軸方向の移動によって、チップラック３５の該ボトル１４に対応する未使用のピペットチップが保持されている位置の真上に前記開口部４０を介して前記ノズル３４が位置するようにする。次に分注用Ｚ軸駆動装置３６によって、該ノズル３４を下降して、該ノズル３４に前記ピペットチップを装着させる。次に該ピペットチップを装着したノズル３４を上昇させた後、前記吸引移送位置２２にまで前記Ｘ軸駆動装置３７によって移動させ、該ピペットチップを下降させて前記ボトル１４内に挿入し、所定量、例えば２５μｌずつの微小量の蛋白質溶液を吸引し、再び、前記開口部４０の該当するＸ座標位置にまで移動する。同時に、前記キャリッジ７１のＹ軸方向の移動によって、前記マイクロプレート３２の該ボトル１４に対応するウェルの位置の真上に、前記開口部４０を介して前記ノズル３４が位置するようにし、次に該ピペットチップを下降して、収容している前記溶液を対応するウェル内に吐出する。
【００８２】
該溶液を吐出した後、該ピペットチップを装着したノズル３４は、該ピペットチップを前記チップラック３５の使用済みのピペットチップを収容する領域の対応する位置に該ピペットチップを収容するために、前記開口部４０の該当するＸ座標に位置し、前記キャリッジ７１のＹ軸方向の移動により、該当するチップラック３５の収容位置の真上にまで、前記開口部４０を介して位置させ、該ピペットチップを、前記ノズル３４からこそぎ落とすようにして自動的に脱着する。
【００８３】
このようにして、前記ボトル１４が、該吸引移送位置２２を通過するたびに、所定量ずつ溶液を前記マイクロプレート３２の各ウェルに収容し、該蛋白質リフォールド装置１０による処理の流れを監視するために利用される。
【００８４】
該ボトル１４が前記吸引移送位置２２を通過した後は、該搬送経路１５の搬送経路１５の大部分の長さをもつ蛇行領域１７を、長い時間滞在しながら搬送されることになる。この蛇行領域１７を通過する間にインキュベーションが行われることになる。前記ボトル１４がこの搬送経路１５を一周する時間は、例えば、２時間であったり、２４時間であったり、リフォールドの対象となる蛋白質に応じて定められる。
【００８５】
このようにして、前記目標の濁度および目標のｐＨ値に前記蛋白質溶液が達成すると、再び、該ボトル１４を前記搬送経路１５に従って搬送させ、前記試薬供給攪拌位置２１において、前記ノズル２９の１つから２０ｍＭのトリス（登録商標）を供給し、該トリスを主成分とする体積の２０倍にまで急速に希釈化される。さらに、ｐＨが９．０となるように１ＭのＨＣｌを前記ノズル２９の１つから供給することによって、１周の間に前記ｐＨが最終的に８．８となるように調設され、さらに、次の周で、ｐＨが８．６になるようにｐＨが調節され、最終的には、ｐＨが８．０になるまで調節される。
【００８６】
なお、該装置によってリフォールドされた蛋白質は、それから、限外透析によって濃縮化され、ゲル透析によって分離される。ゲル透析は、例えば、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）、Ｓ−３００カラムであって、２０ｍＭ トリス（登録商標）、ＨＣｌ，０．４Ｍ尿素、ｐＨ８．０によって平衡化されている。前記Ｓ−３００留分は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを駆動することによって検査される。うまくリフォールドされなかった蛋白質は、大変高い分子量になり、折りたたまれた蛋白質は、通常の分子量になる。
【００８７】
Ｓ−３００カラムからリフォールドされたピークは、さらに。ＦＰＬＣ Ｒｅｓｏｕｃｅ−Ｑ（登録商標）またはＲｅｓｏｕｃｅ−Ｓ（登録商標）カラムによって精製することができる。これらは、２０ｍＭトリス（登録商標）−ＨＣｌ（Ｒｅｓｏｕｃｅ−Ｓ（登録商標）のためのＨＥＰＥＳバッファ）、０．４ Ｍ 尿素、ｐＨ８．０によって、平衡化されている。
【００８８】
（２） 第２の実施例
メマプシン２（ｍｅｍａｐｓｉｎ ２）の発現およびリフォールド処理
プロ−メマプシン２は、ＰＣＲで増幅され、ｐＥＴ１１ａベクターの ＢａｍＨＩサイトにクローン化される。その生成されたベクターは、Ａｌａ−８ｐ からＡｌａ−３２６の塩基配列をもつプロ−メマプシン２を発現する。２つの発現ベクター、ｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ一（以後「Ｔ１」という）およびｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ２（以後「Ｔ２」という）が構成される。両方のベクターにおいて、発現された組換え蛋白質の前記Ｎ末端１５残基は、前記発現ベクターから導かれる。プロ−メマプシン２残基は、残基Ａｌａ−１６から始まる。２つの組換えプロ−メマプシン２ は種々のＣ末端長をもっている。Ｔｈｒ−４５４でＴ１末端をクローン化し、Ａｌａ−４１９で、Ｔ２末端をクローン化する。前記Ｔ１構造は、前記Ｔ２構造からのＣ末端の伸びを有するが、予測された膜間領域のいずれをも表現していない。
【００８９】
Ｔ１およびＴ２の発現ベクターは、別々に大腸菌株、ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入される。導入された細菌の培養のための処理、組換え蛋白質の合成のための導入および、組換え蛋白質を含有する封入体の回収および洗浄については、例えば非特許文献５を参照のこと。基本的には、封入体は、０．１Ｍ トリス（登録商標）ＨＣｌ，ｐＨ７．４中での１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００および０．１５Ｍ ＮａＣｌで洗浄され、不溶性の蛋白質は、８Ｍ 尿素、０．０５Ｍ シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭ 還元化グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ ｍＭ の酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）および１ｍＭグリシン、および１ｍＭ のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のＰｈ１０．５を含む溶液中に溶解されて、約５ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度になる。この溶液は、主として２０ｍＭのトリスの体積の２０倍に急速に攪拌して滴下するように加えられる。希釈化された溶液のｐＨは、１ＭのＨＣｌによって、９．０に再調節され、４℃で、２４時間の間再び保たれる。このプロセスは、ｐＨが８．０になるまで繰り返される。
【００９０】
封入体が、８Ｍの尿素、０．１Ｍトリス（登録商標）、１ｍＭのグリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのβメルカプトエタノール、ｐＨ１０．０に溶解される。
【００９１】
該溶液を前記ボトル１４内に収容し、前記蛋白質リフォールド装置１０の前記搬送経路１５上に載置し、前述したように、該搬送経路１５上を、図１中に示すように左回りに搬送する。該ボトル１４内の封入体の波長２８０の光に対する濁度は、前記試薬供給攪拌位置２１において、前記マルチノズルヘッド３０のノズル２９から、β―メルカプトエタノールなしの８Ｍ尿素により、５．０に調節されるように、前記蛋白質リフォールド装置１０を用いて前述したようにして、該試薬の供給が濁度を測定しながら繰り返される。最終的な溶液は、前記試薬供給攪拌位置２１のマルチノズルヘッド３０の各ノズル２９から次の還元試薬を供給する。
すなわち、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ｍＭｐＨの還元化グルタチオン、および０．１ｍＭの酸化グルタチオンであり、最終的な溶液のｐＨは、１０．０である。
【００９２】
このようにして得られた前記ボトル１４内の蛋白質溶液は、急速に、２０Ｍｍ トリス（登録商標）の主要成分の２０倍の体積にまで希釈化し、そのｐＨは、９．０になるように前記蛋白質リフォールド装置１０によって、調節され、その生成された溶液は１６時間の間、４℃に維持される。該溶液は、６時間で室温で平衡状態にし、該ｐＨは、８．５に調節され、該溶液は、再び１８時間の間に４℃に戻す。該溶液は、再び、６時間で平衡状態にし、そのｐＨは８．０に調節され、その溶液は、再び４から７日で、４℃に戻す。このリフォールド処理については、実施例１で説明したように該装置１０を用いて行われる。
【００９３】
該装置１０によってリフォールドされた蛋白質は、それから、限外透析によって濃縮化され、ゲル透析によって分離される。ゲル透析は、例えば、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）、Ｓ−３００カラムであって、２０ｍＭ トリス（登録商標）、ＨＣｌ，０．４Ｍ尿素、ｐＨ８．０によって平衡化されている。前記Ｓ−３００カラムからのリフォールドされるピーク（第２のピーク）は、さらに、ＦＰＬＣＲＥＳＯＵＲＣＥ−Ｑ（登録商標）カラムによって精製され、それは、２０ｍＭのトリス（登録商標）−ＨＣｌ、０．４Ｍｍ尿素、ｐＨ８．０と平衡状態にある。前記酵素は、ＮａＣｌの線型の勾配を持ったカラムから溶出される。前記Ｓ−３００からのリフォールドされたピークは、さらなる精製の前に活性化される。活性化のためには、その画分が等量の体積の０．２Ｍナトリウムアセテート、７０％のグリセロール、ｐＨ４．０と混合される。その混合物は、１８時間の間、２２℃でインキュベートされ、それから、２０ｍＭ ビス−トリス（登録商標）、０．４ Ｍ 尿素、ｐＨ６．０の２０倍の体積に対して２度 透析され。透析された物質は、それからさらに、２０ビス−トリス（登録商標）、０．４Ｍ尿素ｐＨ６．０と平衡状態にあるＦＰＬＣ ＲＥＳＯＵＲＣＥ−Ｑ（登録商標）カラム上で精製される。酵素は、ＮａＣｌの線型の勾配により溶出される。
【００９４】
以上説明した各実施の形態は、本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明では、特定の蛋白質を用いた場合のみを具体的に説明したが、該蛋白質の場合に限られるものではなく種々の蛋白質についても適用できる。また、光学的性質として濁度をのみ説明したが、その他、散乱光の強度、透過率、反射率、スペクトル等を測定することもできる。また、恒温手段として、４℃に設定した場合について説明したが、他の温度に設定することはもちろん可能である。例えば、１６℃に設定することにより、リフォールド処理を早めることができる．例えば、上記２４時間とあるのを２時間にすることができる。なお、各構成要素、部品、装置等、例えば、光学測定部、搬送部、容器、マルチノズルヘッドのノズル、分注機のノズル等についても、形状等は、図面に描かれたものに限定されるものではない。
【００９５】
【発明の効果】
第１の発明または第９の発明によれば、蛋白質のリフォールド処理を、人手によらずに、かといって、最初に設定した固定的処理手順に完全にまかせるのではなく、周期的に蛋白質溶液の光学的性質およびそのｐＨ値を測定し、その測定結果に基づいてリフォールド処理を進めるようにしている。したがって、各種蛋白質に応じた最適なリフォールド処理を行うことができる。
【００９６】
本発明によると、大量または多種類の蛋白質について、簡単な制御により、操作者の負担を増やすことなく、効率的に、迅速かつ安価にリフォールド処理を行うことができる。
【００９７】
また、本発明によると、測定した光学的性質およびｐＨ値に基づいて、算出した正確かつ精密な量の試薬の供給を行うことによって、信頼性の高いリフォールド処理を進めていくことができる。
【００９８】
第２の発明または第１０の発明によると、試薬供給部は、前記搬送経路において、光学測定部およびｐＨ測定部の下流側に設けている。したがって、試薬供給部は、前記光学測定部およびｐＨ測定部の測定結果に基づいて、正確かつ精密に該当する試薬の供給を行うことができる。
【００９９】
第３の発明または第１１の発明によると、これによって、前記容器に供給された試薬が蛋白質溶液中に混合して、均一で効率的に反応を引き起こすことができる。
【０１００】
第４の発明または第１２の発明によると、リフォールド処理の周期的な経過を知ることができるので、リフォールド処理の解析や改善に役に立たせることができる。
【０１０１】
第５の発明または第１３の発明によると、少なくとも３個の試薬吐出口を設けることによって簡単な構造で、ｐＨの確実な調節を可能とする。
【０１０２】
第６の発明または第１４の発明によると、容器の回転による液体の攪拌を行うことによって、簡単な構成および制御で、攪拌を行うことができる。
【０１０３】
第７の発明または第１５の発明によると、容器をボトル状に形成することによって、収容した液体の開口部からの流出を防止するとともに、内部に攪拌用突出部を設けることによって、収容された液体の攪拌をより効率的確実に行うことができる。
【０１０４】
第８の発明または第１６の発明によると、前記攪拌用突出部は、前記容器の内底部より一定高さ以上の位置に設けられている。したがって、該突出部の存在しない容器の位置において、光学測定を行うことによって、高い精度の測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置を示す斜視図
【図２】本発明の実施の形態に係るボトルを示す図
【図３】本発明の実施の形態に係る搬送装置の一部斜視図
【図４】本発明の実施の形態に係るｐＨ測定部を示す概念図
【図５】本発明の実施の形態に係る攪拌部を示す図
【図６】本発明の実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置の一部拡大斜視図
【図７】本発明の実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置の平面図
【符号の説明】
１０…蛋白質リフォールド装置
１１…フレーム
１２…基板
１３…蛋白質溶液
１４…ボトル
１５…搬送経路
１６…コンベイヤー（搬送部）
１７…蛇行領域
１８…断熱用蓋板
１９…濁度測定位置
２０…ｐＨ測定位置
２１…試薬供給攪拌位置
２２…吸引移送位置
２３…側壁
２４…貫通孔
２５…受光部（光学測定部、濁度測定部）
２６…ｐＨ測定用電極（ｐＨ測定部）
２７…電極用Ｚ軸駆動装置
２８…電極用Ｘ軸駆動装置
２９…ノズル（試薬供給部）
３０…マルチノズルヘッド（試薬供給部）
３１…攪拌部
３２…マイクロプレート
３３…自動分注機（吸引移送部）
３４…ノズル
３５…チップラック
３６…分注用Ｚ軸駆動装置
３７…分注用Ｘ軸駆動装置
３８…マイクロプレート等用Ｙ軸駆動装置
３９…自動ドア
４０…開口部
４１…首部（容器）
４２…胴部（容器）
４３…螺子山（容器）
４４…凸部（攪拌用突出部）
４５…底部
４６…目盛り
４７…チェーン（搬送部）
４８…搬送用ロッド（搬送部）
４９…ｐＨ測定部
５０…電極洗浄部
５１、５４、６０、６８…モータ
５２、５５…ボールねじ
５３…ナット部
５６…洗浄用容器
５７…スプレイ
５８…チューブ
５９…排出部
６１…カップリング
６２…シャフト
６３…ローラ
６４…アイドラ−ローラ
６５…アクチュエータ
６６…ソレノイド
６７…接触領域
６９…案内用スクリュー
７０…スプリング付ソレノイド
７１…キャリッジ
Claims (16)
- リフォールド対象の蛋白質を含有する蛋白質溶液を収容可能な１または２以上の容器を載置して、所定の閉じた搬送経路に沿って該容器を搬送する搬送部と、前記搬送経路に設けられ、前記容器内の蛋白質溶液の光学的性質を測定する光学測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを調節するための試薬を含む複数種類の試薬を各々供給可能とする試薬供給部とを有するとともに、
前記試薬供給部は、前記光学的測定部の測定結果、前記ｐＨ測定部の測定結果および予め定めたｐＨパターンに基づいて前記蛋白質溶液のｐＨの調節を行うことによって蛋白質のリフォールドを行う蛋白質リフォールド装置。 - 前記試薬供給部は、前記光学測定部および前記ｐＨ測定部の下流側に設けられた請求項１に記載の蛋白質リフォールド装置。
- 前記試薬供給部、または、それよりも下流側の搬送経路に、前記容器の収容物を攪拌させる攪拌部を設けた請求項１に記載の蛋白質リフォールド装置。
- 前記搬送経路には、前記容器に収容されている蛋白質液体の一部の所定量を吸引して、該当する容器に移送するための吸引移送部を設けた蛋白質リフォールド装置。
- 前記試薬供給部は、少なくとも３個の試薬吐出口を有し、各試薬吐出口からは少なくとも酸性試薬、アルカリ性試薬、およびバッファ用試薬のいずれかを吐出可能に設けた請求項１に記載の蛋白質リフォールド装置。
- 前記攪拌部は、前記搬送経路において、前記容器を軸まわりに回転することによって、該容器内に収容されている液体の攪拌を行う請求項１に記載の蛋白質リフォールド装置。
- 前記容器は、ボトル状に形成され、該容器の内部に、容器の内壁から軸線方向に向かって突出する攪拌用突出部を設けた請求項６に記載の蛋白質リフォールド装置。
- 前記攪拌用突出部は、前記容器の内底部より一定高さ以上に設けられた請求項７に記載の蛋白質リフォールド装置。
- リフォールド対象の蛋白質を含有する蛋白質溶液を収容可能な１または２以上の容器を載置する所定の閉じた搬送経路に沿って該容器を搬送する搬送工程と、前記搬送経路において、前記容器内の蛋白質溶液の光学的性質を測定する光学測定工程と、該搬送経路において、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを測定するｐＨ測定工程と、該搬送経路において、該容器内の蛋白質溶液のｐＨを調節する試薬を含む複数種類の試薬を供給する試薬供給工程とを有するとともに、
前記試薬供給工程は、前記光学測定工程の測定結果、前記ｐＨ測定工程の測定結果および予め定めたｐＨパターンに基づいて、前記蛋白質溶液のｐＨの調節を行う蛋白質リフォールド装置の使用方法。 - 前記試薬供給工程は、前記光学測定工程及び前記ｐＨ測定工程の後に実行される請求項９に記載の蛋白質リフォールド装置の使用方法。
- 前記試薬供給工程において、または、該工程の後で、搬送経路において、前記容器の収容物を攪拌させる攪拌工程を設けた請求項９に記載の蛋白質リフォールド装置の使用方法。
- 前記搬送経路において前記容器に収容されている液体の一部の所定量を吸引して、該当する容器に移送する吸引移送工程を有する請求項９に記載の蛋白質リフォールド装置の使用方法。
- 前記試薬供給工程は、少なくとも３本の試薬吐出口から、少なくとも酸性試薬、アルカリ性試薬、およびバッファ用試薬のいずれかを吐出可能とする請求項９に記載の蛋白質リフォールド装置。
- 前記攪拌工程は、前記搬送経路において、前記容器を軸まわりに回転することによって、該容器内に収容されている液体の攪拌を行う請求項９に記載の蛋白質リフォールド装置の使用方法。
- 前記攪拌工程は、ボトル状に形成された容器の内部に、容器の内壁から軸線方向に向かって突出する攪拌用突出部を設けた容器を回転させることによって行う請求項９に記載の蛋白質リフォールド装置の使用方法。
- 前記攪拌工程は、前記攪拌用突出部が前記容器の内底部より一定高さ以上に設けられた容器を回転する請求項９に記載の蛋白質リフォールド装置の使用方法。
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