WO2004101601A1

WO2004101601A1 - 蛋白質リフォールド装置および蛋白質リフォールド装置の使用方法

Info

Publication number: WO2004101601A1
Application number: PCT/JP2004/006681
Authority: WO
Inventors: Hideji Tajima; Xinli Lin; Peter Burrowes; Chris Kusumoto
Original assignee: Universal Bio Research Co., Ltd.; Proteomtech, Inc.
Priority date: 2003-05-13
Filing date: 2004-05-12
Publication date: 2004-11-25
Also published as: JP2004345958A; EP1623988A4; EP1623988A1; US20050037486A1

Abstract

蛋白質リフォールド装置及び蛋白質リフォールド装置の使用方法に関し、蛋白質のリフォールド処理を人手によらずに、種々の蛋白質について、効率的かつ正確に行うことができる蛋白質リフォールド装置及び蛋白質リフォールド装置の使用方法を提供するために、本発明は、リフォールド対象の蛋白質を含有する蛋白質溶液を収容可能な1または2以上の容器を載置して、所定の閉じた搬送経路に沿って該容器を搬送する搬送部と、前記搬送経路に設けられ、前記容器内の蛋白質溶液の光学的性質を測定する光学測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のpHを測定するpH測定部と、該搬送経路に設けられ、該容器内の蛋白質溶液のpHを調節するための試薬を含む複数種類の試薬を各々供給可能とする試薬供給部とを有するように構成する。

Description

明細書蛋白質リフォールド装置およ Ό¾白質リフォールド装置の技術分野

本発明は、自動蛋白質リフォールド纖および自動蛋白質リフォール s<Dm細こ 0本発明は、織奐ぇ蛋白質の^ の分野、特に、 E. coli e¾昜菌）雜生翻の封入体に発現され/ «え蛋白質のリフォールド（本来の働きを失ってレヽる稱猶纖蛋白質の間違った «i ¾ ^きほぐし、本 ¾ )正しい立 i«tに戾すこと）の分野で用いられる。

「プロテオミタス」と¾¾ ^る、天鍵の生謹 |¾¾よ u^ をもつ:^繊ぇ蛋白質 « 現は、いくつ力握本及ぴヒトに财るゲノム角晰の誠とともに颜' 14 ^増大している。プロテオミクスの 1つ具1厨は、商!^な応用とともに、 « およ t«»¾のためのの蛋白質を発現することである。 urn 蛋白質を ^面で交!^)に発現する方法は、昜菌内に蛋白質を発現することである。蛋白質は菌体内に努現されるか、またはペリプラズムに隠れる。のには、 ΙΐίΙΒ蛋白質は、特にその蛋白質がジスルフィド^^をにはしばしば封入体に «fる。

しかしながら、昜菌内に、嚇頃の蛋白質を発現する^の 1つの問題は、発現された蛋白質の大部分が、

また虫 ©¾鄉を飾することにより! ¾されるが、昜菌ぉ咅養することは、卩辭園および昆虫の培養 ί 嫩してより早く力より面である。さらに、ある蛋白質は、その天 «に発現される ¾ ^に、そのホストに対して毒であるため、このような^性の封入体として現は、の糸嫩ぇ蛋白質を得る！^^の去である。藤なことは、 ^/、レベルの大部^蛋白質に対して誠できることである。糸 B¾fc咅養のリットル当り 400から

600mgの封入体は、日に^され、この方法をィ¾¾して 9700mg/Lまでがされてレ、る (Jeong L; Lee SY 著 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65:3027-32)。封入体は、簡単な!^/議早および界面活十 (β»法によって、 90%以上易に精製される。

封入体は、その細胞が ^下で棚 iJi~ると、雄度のカイコ細胞 «1 &のように見える。には、その細胞は、膽細包の»勺 βにより ^^し、 4700_gで、 30分間の間 <¾¾L^隹を行う。封入体は低レ心力で沈降し、雜也の綳包内蛋白質から ^t ること力 sできる。さらに、 tii e^o間に用レ、たパッファ液によって、觸己ペレット状のものを»し、または、 40から 50%のグリセロール内に β濁したペレツ ¾i'i ^f ることによってさらなる精製がされる。

難生物の菌体外の纖の蛋白質は、ジスルフィド ¾^¾r ^有する。多重ジスルフィド結合を有する蛋白質は、された: ゝらの折りたたみ（フォーゾイング folding) の間に、非天羅ジスルフィ

さらに、もし、正しくないジスルフィド総が、外部のチ^ "ルの肖戯たは蛋白質のチ^ ~ルからの:^によつ Tigくしな、のであれ ί漸りたたみが妨げられる。封入体としての原核生物における糸嫩ぇ蛋白質 «現の明らカ ^ I溢は、蛋白質はその天羅内で ί 辱られず、カ^ »に勺に活十生ィヒしてレヽないということである。背景技術

¾*、 tiff己蛋白質を分解しカ^ gf^i匕蛋白質を改¾"するようにそれらをリフォールドするの方法があつペレット状の糸嫩ぇ蛋白質の灘军は、通常 7M (モル難) の麵匕グァニジンまたは 8Mの藤のような変酷 IJを必要とする。もし、蛋白質が、変隨 U中に残ったままにしておくならば、蛋白質 (^織の量る（Kelly and Winker著「：¾菌中で ί¾¾された ^^蛋白質の折りたたみ」 Genetic Engineering 12, 1-19 at p. 6 (1990)、以下 ¾ U」という)。 »またはラムによる tfit己可渐ヒし^ f入 #¾らの変鹏 IJの除去は、 ΙίίΐΕ蛋白質を、天灘蛋白質がリフォールドされるのに必要な^ 下で灘させる。誤って折りたたまれた蛋白戴厳は、生物においては、非常に低レ勺な活 [■生をもつ。

封入体として、昜菌内の種々の蛋白質の発称よりたたみにっレ、ての錄の體があるけれども、蛋白質の折りたたみにおける黝军の 1つは、 t ^のリフォールド法は棚々の蛋白質ごとに開発しなければならいということである（嫌 s« i)。他の識军は、 m の蛋白質の大部分は、封入体からリフォールドすることができないということである

(Rudolph R. , LilieR著， 1996， FASEBJ 10 :49-56,以下「¾2」という、 Lilie H， Schwarz E, Rudolph R著 1998. Cuir. Opin. Biotechnol 9 ;497—501、以下「：¾3」とヽう）。公開された继は、大部分が:^昜菌から < )¾f入体をリフォールドする「サクセス J#l§であるので、この工程を棚した齢に、難された R l隨白質についての害がどの鍵である力

~¾的な思想を得ることは不可肯である。

ΙϋΙΒ«2、嫌 £«3内にされたリフォールド蛋白質より k< リフォールドする方法がある。種々のシャペロン、活およびカオトロピック剤が、リフォーノ、イングを ¾¾ΤΤるために翻されている。加えて、 ρ Η, イオンィ艘、、ノッファ糸賊、およ Ό¾¾ΰ Ι^^が、全てリフォールドにを与え得る。プロテオミクスまた〖« ゲノミタスにおける研究で要求されるような、大量の蛋白質をリフォールドするためにこれらの^ ί牛を全て^ rることは、負担が極端に大きいであろう。

繊ぇ系、特に、贜のような系 ί¾Λ体 ¾ 1"る系において、発現した大部分の蛋白質をリフォールドするための単一の簡単な頃が必要である。このような^)噴として、本歸の発明者によって、蛋白質、特に、糸雕ぇ蛋白質、さらに言えば、糸瞒のホスト内 ί レ、てる糸雕え蛋白質をリフォールドするための W去が «されてレ、る（国^

0 1 / 5 5 1 7 4 Α 2 ) ο

% f 折りたたみの纖となる封入体に発現した蛋白質 ¾ ^きほぐす工程と、生物学白lSt鍾の正 /ヽ立{«1に戻す工程という 2つの «なェ鶴らなって!/、る。第 1の工程は、変随 IJの下で、蛋白徵繊の p Hを、 9 に、好ましくは 10にまで上昇させることである。該蛋白辯夜は、約 24日までの期間の間、その高められた p Hに循されるの力 S良く、または、 24 当り約 0.2pHの^^で、謝藤夜が約 8. 0の _P Hに針るまで、その p Hは直ちにゆっくりと下降するのが良く、または、両方の Illg^用いられる。好ましくは、精製された封入体は、 8Mの尿素、 0. 1Mのトリス（2 - amino-2- hydroxymethyl- 1, 3- propanediolは pH8 fif ^で非常に強レ乍用があり、画夜として麵される)、 ln グリシン、 ln の EDTA (エチレンジァミン四 S )、 lOraM /3メルカプトエタノール、 10n のジチオトレイトール（DTT)、 ln の ¾化ダルタチオン（G SH)、 0. ImHの、酸化グルタチオン（G S S G)で pHIOの:^に、军される。 ΙϋΐΕ蛋白質裔夜の 280nmの波長の光に财る吸 (OD₂₈₀) は、 5. 0である。この灘は、 20nM トリスを¾ ^とする髓の 20倍にまで、匕される。その結果としての赚は、 1Mの HC 1をもった _PH9. 0 に調節される。 24 H# ^の間 4°0^fされる。該 pHは pH8. 8に画され、該灘は、もう 24 B ^の間 4°Cに醫される。この工程は、 IfflEpHが、 8.0に謹されるまで繰り返される。 _PH8.0で、 24 B ^綱した後、リフォールドされた蛋白質は、腿纏によって膽化され、精製のためにゲル βカラム力 ¾ 用される。

しかしながら、 nしたように、発現された蛋白質をリフォールドするには、一旦発現された蛋白質初に解きほぐし、それから解きほぐした蛋白質を再航しレ^ に戻す必要がある。そのためには、 |¾®白質の裔夜について、長 ^にわたり、 ί微少な _P Hの調節を繰り返す必要があつた。

そのため、人手によって、この體をうとすると、操 S、鋼に渡って' 況を^して、 ,纖蔽 ¾ ^t » ^を、裔夜の _P Hを測定しながら、その測定した _P Hに応じてる觀と量 ¾¾0な Bf^に勸口して _P Hの調節を行う必要があり、擬傅に大きな負担を強いていた。

特に、または多觀の蛋白質についてリフォールド擁を行うには、同一; ¾ のり返しが必要となり、または、多觀の蛋白質についてリフォールド麵を行う場合の^^相特に^ ^等の觀、氲害恰の相違のために操 ί倚 (^担は勤るために、効率的力つな処理を行うことができないという Β題点を有して、た。これらの僕を、人手で行うために、その «に高レ麵性を与えること力 sできな、おそれがあるとともに、

よりその用が高くなるおそれがあるという題点を有してい

そこで、本発明は、の ^决するためになされたものであり、その第 1の目的は、蛋白質、特に、繊ぇ蛋白質、さらに言えば、糸衊のホスト内において封入体にる urnえ蛋白質のリフォールド^ aを、人手によらずに、自動的に行うことができるリフォ一ノレド装置およびリフォールド装置の翻方法をすることである。

その第 2の目的は、または多耱買の蛋白質を、簡^ 御により、 ¾ ^勺に、か ^面にリフォーノレド«を行うこと力 sできる蛋白質リフォールド isgおよ Ό¾白質リフォールド装置の使用： *¾を«することである。

その第 3の目的は、 iBft^つ精密に纖等るようにして蛋白質のリフォールド処理¾1めることができるィ謙性の^、蛋白質リフォールドおよ白質リフォールド装置の使用方法を«することである。発明の開示

Jの ^決するために、第 1の発明は、リフォールド通の蛋白質有する蛋白贊裔夜を収^ Τ能な 1または 2¾ の容器を ¾gして、縦の閉じ^^ iS珞に沿つ ^を » る i¾と、 tifl«¾wに設けられ、 t&i^器内の蛋白難夜の^^勺

'酸を測定する^ IJ 1と、言 «^1¾に設けられ、 ^^の蛋白戴親夜の _P Hを測定する p H澳 J¾¾と、に設けられ、 ^器内の蛋白夜の _P Hを |¾するための纖^ の藤を各々働合可能とする織合部とを有するとともに、僻合部は、廳己則の測雄果、謝己 _P H澳脑の測雄颗よび予め定めた _P Hパターンに、て蛋白鎌の p Hの謹を行うことによって蛋白質のリフォールドを行う蛋白質リフォールド装置である。

ここで、「½ ^鬧とは、勺々の隱をいい、例えば、各種の光（赤外線、遠赤外線、可«^) の Λ!ί光にる^ «、しく乱光の質、または^勺な ι·生質等をいう。例えば、 Λ#光にる^ ι¾の性質として、 ^m がある。

潜夜中の猿の光を吸収する度合いを表す値であって、藤の光の吸収率の«の纖である。すなわち、 log(I₀/I) をいう。ここで、 I。および Iは、難だけをした光および同じ厚さのした光の強さを表す。が大きくなれば、 « した蛋白質が解きほぐされて、赚中に懸獨する量が増大して!/、ることを意味する。従って、本発明では、蛋白質 (^きほぐされの键の測诘果を取り Alvr、 pHの講を行うことにより、リフォールド処理を進めていくことになる。

「_P Hを講するための » ^の翻としては、 _P Hを一定に保っため済リ、酸 ' [^またはアルカリ 'ίΦί,を少なくとも有し、これらに属する難を、職にまたは組み合わせて適当な量混合することによって、 ρ Ηを調節する。

ρ Ηのパターンは、リフォールドの纖となる蛋白質に応じて定められる。そのパターンの^ 頃向としては、リフォールドの第 1 としての瞧した蛋白質 ¾ ^きほ ^こめに、蛋白質藤を、 1 ¾_hのカオト口ピックよ O¾g¾織の雜の下で p Hで、 9. 0 に爵し、第 2赚として、解きほぐした蛋白質を正しい 3¾^¾¾tに戻こめに、該灘の _P Hをに、

≠ . Oにまできさせて、該蛋白質が、鄭勺に、

竊白質の少なくとも ~¾ の胜を講する。

赚に依存する。該艇は、該リフォールド難に設けられ、編される總内を戸破に保つよう〖^嗷またはる恒温手段によつされる。例えば、 ¾¾¾を 4°Cに言すると、所 » ^は、 24時間となり、該を i6°cにると、難は 2？となる。本発明によれば、恒温手段の^^を変えることによって、 «に必要な日# ^を、従って pHパターン々に定めることができる。すなわち、日 # ^ 誠させること力できる。また、この pHの^^ 例えば、毎に 0.2pHず^^させる。また、 ΜΙΒρΗの 9.0,gLhの膽は、例えば、 ¾ 定時間以上行われる。

嫌己 pHの^^は、酸を加えることによって行う。謙オト口ピック^ 3よ »職薬は、 0.5及び 1.0M尿素、 0. ΙιιΜから ΙΟΟπ の βメルカプトエタノール、 0. ΙηΜから lOmM の酸化グルタチオンのレヽずれカゝから選択されたものである。

「蛋白質」には、糸纖ぇ蛋白質、さらには、糸瞒の封入ゝら抽出された蛋白質をも^?。識田菌には、大腸菌を含む。 mx P Hが 9と 10との間で涵單される。

「閉じ :«»§に沿って腿する」ので、 1の織について、よび pHを測定しながら、 pHの調節を繰り返して、リブオールド雄を行うこと力 Sできる。 p H測餘! 5 は、例えば、織に撤可能に設けた亟と、該爵亟を-歸すると、觸^^と ItifB との間を移動可能とする移動部とを有するように構»る。

第 1の発明によれば、蛋白質のリフォールド鍵を、人手によらずに、力、といって、最初に誠した固^ β 頃に敏にま力せるのではなく、周期的に蛋白質鎌の^^ 4質およの _Ρ Η値を測定し、その測果にヽてリフォールド麵めるようにしてレ、る。したがって、各種蛋白質に応じた; ¾なリブオールド処理を行うことができる。本発明によると、または多漏の蛋白質について、簡単【胸により、 <7> s. を増ことなく、効率的に、迅速かっ^ (面にリフォー/レド処理を行うことができる。また、本発明によると、測定した «*3よび pH値に S ^ヽて、算出し IB 精密な量の簾の觸合を行うことによって、ィ蘭性のヽリフォールド麵¾1めていくことができる。

第 2(7 ¾明は、 ΙίίΙΞ^微合部は、 #ίΐ¾¾^1β|5およ Ό¾ί¾5ρΗ測 15の下蔵 ljに設けられた蛋白質リフォールド装置である。

好ましくは、これらの ¾^IJ¾¾、 p H測 |5およ Of^働合部は、に沿って、この順序または _Ρ Η測 ¾¾、光 ^¾ι^¾、合眘 15の1脾で、 1«するように設ける。第 2«明によると、灘袷部は、 lff¾imにおいて、則 1¾¾ょぴ p H測定部の下則に設けている。したがって、蘭働合部は、 |ίίΐΒ¾^則 19¾よび _P H測の測結果に基づレ、て、正確かつ精密に該当する醒の供給を行うことができる。

第 3の発明は、膽纖働合部、または、それよりも下爾則に、膽収容物を攪拌させる操拌部を設けた蛋白質リフォールド装置である。

第 3 < ^明によると、 tits^に働合された^が蛋白夜中に齢して、 ^—x 的に ®Sを弓 Iき起こすことができる。

第 4«明は、

TOされている蛋白戴夜体の mの戸旋量を吸引して、該当する^^ 射るための吸引移を設けた蛋白質リフォールド難でめる。

第 4 «明によると、リフォールド鍵の周期的な纏を知ることカできるので、リフォールド処理の角 fti^B女善に役に立たせることができる。

第 5 «明は、

らは少なくとも酸 i^m、アルカリ'！^ ¾、およびバッファ用藤のいか粒に卩 ±ffi 可能に設けた蛋白質リフォールド装置である。

第 5 ( ^明によると、少なくとも 3個の^ ^Diffi口を設けることによって簡^ ¾鍵で、 p Hの確実な調節を可能とする。

第 6の発明は、 Sft|»t¾3は、謙において、器を軸まわりにすることによって、容されている液体の辦を行う蛋白質リフォールド装置である。第 6 < ^明によると、による液体を行うことによって、簡^ ¾構 J ^よび制御で、攪拌を行うことができる。

第 7( ¾明は、 Ι ϊ^Ιはボトル状に形成され、内部に、内壁から!^ 向に向かって突出する攪拌用突出部を設けた蛋白質リフォールド装置である。

第 7の発明によると、をボトル状に形^ rることによって、収容した液体の開口部からの流出を防止するとともに、内部に辦用突出部を設けることによって、収容された液体の摸拌をより効率的確実に行うことができる。

第 8 ¾明は、 tfi^用突出部は、謝^ »内歸はり一鶴さに設けられた蛋白質リフォールド装置である。

第 8の発明によると、辦用突出部は、内隨 βより一鶴さ肚の位置に設けられている。したがって、出部の雜しなレヽ^ 鎖こおレ、て、 ¾ ^則定を行うことによって、高レ、精度の測定を行うことができる。

第 9の発明リフォールドの蛋白質を含有する蛋白質裔夜を収^ Γ能な 1または 2 m:の容器をる戶の閉じに沿つ τ¾ι§を ist^る «1工程と、 m において、膽繊内の蛋白戴薪夜の^^隱を測定する^ |i」¾ 程と、 |«¾ «において、 ^^内の蛋白戴夜の ρΗを測^ "る _ΡΗ測 ¾ 程と、において、言耱器内の蛋白赏裔夜の _ΡΗを鶴するの纖を働る難働合工程とを有するとともに、 m mm iMi ttt己; ^則 ¾ 程の測 ^果、 IGI己 P H測

¾ 程の測颗よび予め定めた ρ Ηパターンに、て、嫌己蛋白質裔夜の Ηの調節を行う蛋白質リフォールド装置の使用; ^去である。

第 9の発明によれば、第 1の発明と同様に、蛋白質のリフォールドを、人手によらずに、かといつて、最初に設定した固 ¾6^0»)噴ににま力せるのではなく、周期的に蛋白衡夜のよ ΪΗ:の ρ Η値を測定し、その測诘果に、てリフォールド処理¾1めるようにしてレ、る。したがって、各觀白質に応じなリフォールド鍵を行うこと力 Sできる。

本発明によると、または多觀の蛋白質について、簡により、榭倚の負担を增^JH "ことなく、効率的に、迅速かつ安価にリフォーノレド処理を行うことができる。また、本発明によると、測定した^ ^生質および pH値に^ 5ヽて、算出し c3» 精密な量の^^^合を行うことによって、ィ麵性の i¾、リフォールド処理 ¾itめていくことができる。

第 1 0«明は、 ttilBp H測 ¾ 程は、則 ¾ 程の後に紫 fされ、識^ ^働合工程は、 ItifSp H測定工程の後に紫される蛋白質リフォールド装置 ^方法である。第 1 0の発明によると、第 2の発明と同様に、織働合部は、嫌いて、光および pH測錢 (5の下菌 ijに設けている。したがって、難御·部は、

および _P H測の測 ¾¾果に¾^1/ヽて、密に該当する織 ( ^合を行うことができる。

第 1 1の発明は、纖 5^ 合工程 ί¾βいて、または、 ITU程の後で、 ^^において、

Ιϋΐ^ΐι©収働を徽丰させる爵工程を設けた蛋白質リフォールド¾¾©^方法である。第 1 1の発明によると、第 3の発明と同様に、これによつて、 ΙΐίΙΒ^に僻合された^ ¾ が蛋白職中に混合して、均一で効率的に ©ί:、を引き起こすことができる。

第 1 2の発明は、廳いて |ΐίΙΕ^§¾π|χ容されている液体のの )¾量を吸引して、該当するする吸引移送工程を有する蛋白質リフォールド纖方法である。

第 1 2の発明によると、第 4 明と同様に、リフォールド«の周期的¾»を知ることができるので、リフォールド処理の角? 改善に役に立たせることができる。

第 1 3( ^明は、嫌纖働合工程は、少なくとも 3本の口 JiHロカ、少なくとも酸 i^m, アルカリ' i^^、およびバッファ用のいかを ttm可能とする蛋白質リフォールド装置である。

第 1 3の発明によると、第 5«明と同様に、少なくとも 3個の^ mth s口を設けることによって簡単な^ tで、 p Hの «な調節を可能とする。

第 1 4(¾¾明は、謝工程は、において、 t¾is^器を軸まわりに mi云することによって、霄^^内〖容されてレ、る液体を行う蛋白質リフォールド¾¾(^) (吏用去である。

第 1 4«明によると、第 6 «明と同様に、による液体 («|≥を行うことによって、簡単な構成および制御で、攪拌を行うことができる。

第 1 5 «明は、肅¾ ^工程は、ボトル状に形成され »内部に、内壁から暢妨向に向力て突出する辦用突出部を設けを云させることによって行う蛋白質リフォールド装置のである。

第 1 5 «明によると、第 7の発明と同様に、織をボトル状に形^ Tることによって、収容した液体の開口部からの流出を防止するとともに、内部に if 用突出部を設けることによって、収容された液体の攪拌をより効率的艘に行うことができる。

第 1 6の発明は、 ΐ κί»工程は、突出部が ϋίίΐ^»内蹈はり一;^さ以上に設けられた容器を回転する蛋白質リフォールド装置の使用;^去である。

第 1 6の発明によると、第 8 明とに、 ftfi^用突出部は、藤内蹈はり一 ¾¾さ¾ ©(立置に設けられている。したがって、難出部の雜しない立置におレ、て、光定を行うことによって、高レ、精度の測定を行うことができる。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の雞© ^態に係る蛋白質リフォールド ¾gを^ r纖図であり、第 2 図は、本発明のの形態に係るボトルを ¾¾i "図であり、第 3図は、本発明の難の形態に係る l^i^gの ~¾纖図であり、第 4図は、本発明の霊の形態に係る _PH測を «図であり、第 5図は、本発明の雄の形態に係る »部を^ "T図であり、第 6図は、本発明の雄態に係る蛋白質リフォールド難の"^ 図であり、第 7図は、本発明のの形態に係る蛋白質リフォールド装置の平面図である。発明を^;するための最良の开$態

本発明の »の幵離、に係る蛋白質リフォールド gl 0を、図面にヽ明する。本織態の説明は、特に指定のない限り、本発明帳するものと角椒してはならない。第 1図は、実施の形態に係る蛋白質リフォールド装置 1 0のを示すものである。該蛋白質リフォールド纖 1 0は、フム 1 1を有し、該フ "ム 1 1の上側には、目的蛋白質のリブオールド ί僕を行う各^ を有するイ^^反 1 2力けられ、

1 2の下側の該フム 1 1の内側には図示しなレ ¾«|3、恒温手段に相当する

(ぺノェ素子おょぴファンからなる）およ ^るであるコン^ fヤーの聽回路等を有している。

る蛋白贊裔夜 1 3力 S収容された 1また (この例では、駄で 96本）の嫌^^に相当するボトル 1 4を g ^して、所定«¾»1 5に沿って »Τるコン^ fヤー（1¾ぬ 1 6力 S設けられている。該ボトル 1 4は、収容されている蛋白衝繊の濁鶴の質を測針るために透明の謝、例えば、ガラス、または、ポリエチレン、ポリプロピレン、アタリノの樹脂で形 J¾ るの力好ましい。該コン^ fヤー 1 6 fま、 ttilBポトノレ 1 4を、編に f口、つて"^に図中矢印の方向に搬送する。

5は閉路

5カ ^ "るように配置され TtSM^l 7を有し、 trn mi 5の^ f本 ί让側に DM蓋板 1 8力種されている。 f«iWi 5のうちの大部分を占める 7を嫌己恒温手段によって戶旅に¾¾ ~ることによって、讖己ポトル 1 4力 7を腿される間に謝己ボトル 1 4にるインキュベーション力つれることになる。嫌 HS域 1 7を除く鍾 i Wl 5の ¾^8¾においては、上流側から、 fill己ボトル 1 4内に糖された蛋白離液 1 3の濁度を)¹^'隨として測針る濁度測定位置 1 9、該ボトル 1 4内 iOR容され蛋白贊碰の Ηを測^ Τる p H測定位置 2 0、該ボトル 1 4内の蛋白賢裔夜の p Hを言藤するためにの戸 ί¾ ^を分注可能とするとともに、該ボトル 1 4内に収容されている蛋白賢謙を»する難働合画立置 2 1と、該ボトル 1 4〖容されてぃる蛋白«» の縦量を吸引し送し、対応する織内に β±Κする吸引腿立置 2 2とが I己置されている。これらの f立置 2 0、 2 1、 2 2においては、 ΙίίΙ¾1^蓋板 1 8には、上ィ則;^ら tiffB位置における嫌己ボトル 1 4内の蛋白贊裔夜 1 3に到達可能となるような孔カ穀けられている。

度測定立置 1 9には、 |ίίΐ¾¾¾& 1 5の両個歷 2 3に^ ISされた 2つの貫通子し 2

4力 s設けられ、 i 2 4 るように、管 «¾w 1 5をょうに設けた図示しなレ、照射部と、受¾¾ 2 5カ穀けられて、る。 ¾»射部からの光のうち嫌己貫通孔 2 4 ¾1り、 ΙίίΙ己 ¾¾¾2 5に ¾"Tる光は、 ftifSポトノレ 1 4の下佣』¾1る。獨度は、 ¾¾ 2 5力 S受光した光の弓娘と肅己照射部の光の弓娘の比に基づ、て算出される。

鎌己 pH測定位置 2 0 ( いては、 »fるように、 pH測魏爵亟 2 6が設けられている。該 p H?則定用爵亟 2 6は、霞細 Z軸垂^ ¾2 7および車も垂 2 8によつて、図中示す Z軸おょぴ X軸方向〖動可能である。

嫌纖画立置 2 1には、 ΙΐίΙΕボトル 1 4内に収容された蛋白 ®嫌 1 3の ρ Ηを鶴するために必要な種々の纖（この例では 1 2觀を働^ Τるために 1 2本のノズル 2 9カ穀けられたマノノズノ! ^ッド 3 0を有し、各ノズル 2 9はチューブを介して ΙΐίΙΒフレーム 1 1の内部に設けられた図示しない tiit½ ^を収容するタンクと連通している。さらに、 ^¾#^合»(置 2 1にィ置した ΙίίΙΒポトノレ 1 4内〖OR容された蛋白夜 1 3を該ポトル 1 4を！ ¾させることによって、該ボトル 1 4と、該ポトル 1 4内容されている蛋白麵夜 1 3との間に^ fる角獻の相違と ΜΐΕ の雜により、該蛋白質嫌 1 3を攪拌するための攪拌部 3 1力 S設けられている。

脑及弓 I鍵催 2 2には、謝立置 2 2に ¾ る ΙίίΐΕポトル 1 4内容されてレ、る液

維のマイク口プ^ト 3 2の藏ゥエルに OittSするための自動分赚 3 3力殳けられてレ、る。該白敵赚 3 3は、該白！^灘 3 3のノズル 3 4にピぺットチップ (図を着脱自在に歸して鶴するものである。該ピぺットチップは、各ボトル 1 4に対応した位置のチップラック 3 5に収容され、各ボトル 1 4に応じて、該当するピペットチップとして、 P及引 #^0®を行うようにしている。これによつて、廳己ボトル 1 4相互間のクロスコンタミネーションを防止することができる。

該自敵灘 3 3は、分龍 Z

分 SfflX軸 !S¾¾g3 7によって X»向に麵される。なお、 Ylfc ^向については、膽己マイクロプ I ^"ト 3 2およびチップラック 3 5をマイクロプ！^ト等用 Y軸垂 3 8によって Y軸方向させることによって、分灘3 3は、廳己マイクロプト 3 2等に対して相対的に移動可能としている。

第 1図にお、て、 f特 3 9は、廳己自 ¾ ^灘 3 3のノズル 3 4また f滅ノズル 3 4に装着されたピぺットチップが、謝己チップラック 3 5に収容された各ピぺットチップに到達し、また〖ィクロブ!^"ト 3 2の各ゥエルに到達可能となるように設けた ίϋΐΞ»用蓋板 1 8 に設けた開口部 4 0の開閉を行う自動ドアである。

第 2図は、編己ボトノレ 1 4を詳細に示すものである。

同図ように、該ポトル 1 4は、 ¾ 1と、月醅 (34 2と力なり、言输| 4 1には、図示しない譜 15と螺合するよう【子山 4 3力 S設けられている。月離 2の外 ft画の"^は贿殳し、該ポトル 1 4の向に沿って内方に突出する讓の ΰ¾4 4が、輕 154 5より戸さ^ Ϊ置から FJi¾長さ設けられている。該 ώ¾4 4が肅 ¾¾ψ用突出部に相当する。なお、謝己 β¾4 4を謙から戶 jf¾¾さだけ j¾ 置に設けているのは、觸度を測^ る際に、該 4によって、光を妨げなレヽょうにして、 iatな濁度の測定を行うためである。

さらに、該ポトル 1 4は、該ボトル 1 4の容積を表示する目盛り 4 6を設けている。第 3図は、 ftilSコン^ fヤー 1 6の^ ¾を詳細:^ものである。該コン^ fヤー 1 6 は、鎌 5の下側中央に沿って配置きれたチェーン 4 7と、黼己ボトル 1 4がその間〖i!¾gして腿可能となる間隔、例えば、該ボトル 1 4^)^より^ λきい鍵の間隔で、 t¾Bポトノレ 1 4の高さより低レロッド 4 8が垂向に突出しけられてレ、る。

第 4図は、 ΙΐίΙΒρ Η測定位置 2 0に設けられた謝己ポトル 1 4 容された蛋白質磁 1 3の _P Hの彻』亍う _P f¾IJ¾¾g4 9である。該 p P¾IJ¾¾g4 9ま、前述したように、前記ボトル 1 4内に挿入可能に設けられた編 β_Ρ Η測定用謹 2 6と、該 6を Ζ車肪向させる嫌己爵誦 Ζ軸麵¾©2 7と、該謹 2 6

用 X軸 Il¾¾g2 8と、該 ¾ί亟 2 6を»して ¾させる ¾M^B5 0とを有している。

ΙϋΐΒ 翻 Z軸 |¾ι¾Β2 8は、モータ 5 1と、該モータ 5 1によって、 HI¾||¾Jされ、前記餅翻 X軸垂 2 8によって、 Xli^向に沿つ »]可能に職される Z車肪向に沿つ Ti¾ナられたボールねじ 5 2と、該;^ルねじ 5 2と螺合し、謝己ボールねじ 5 2の蹄云によって、上下方向 t^i]可能であるとともに、廳己霞返 2 6力 S取り付けられたナツト部 5 3とを有する。

また、 ttflE饊廳 X軸麵纖 2 8は、モータ 5 4と、該モ

れる X»向に沿つて設けられたボールねじ 5 5とを有する。

向に沿って10!5翳亟2 6カ禅入可能な»用容器5 6と、該赚用織 5 Θ内において、揷入された Iff己爵亟 2 6に向力で蘭夜を ¾t ること力 ^sできるスプレイ 5 7と、該スプレィ 5 7に ttf¾¾fi夜を^ Tるためのチューブ 5 8と、 ΙϋΙ^^5 6内にたまった液体を ^ 出する排出部 5 9とを有する。

態に係る ρ Η測によれば、亟を激争しながら用いるので、人手を "ることなく力クロスコンタミネーションなしに、 ΊΕ¾に、その ρ Ηを測^ Τることができる。第 5図（a)は、鍵己 p H画立置 2 1に設けられ fc»部 3 1 <7 ί貝栖図であり、同図（b) は、その平面図を示す。

OT^|53 1は、モータ 6 0と、カツプリング 6 1を介しモータ 6 0によって IU^IE 動されるシャフト 6 2と、該シャフト 6 2の 0|云によって! ¾するローラ 6 3と、該ローラ 6 3によって、そ (^貝画と機してされる ftilBボトル 1 4と、ローラ6 3にょり該ボトル 1 4を US云させる際に、該ポトル 1 4のがたつきやゆれを防止するために該ボトノレ 1 4を押さえるためのアイドラーローラ 6 4と、ィドラーローラ 6 4を藤己ボトル 1 4に押し付けるために該ボトル 1 4の^^向^^させるァクチユエータ 6 5と、クチユエータ 6 5を! )¾ΓΤるソレノィド 6 6とを有する。なお、 6 7は、該ボトル 1 4上の擲蠊域である。

第 6図は、の形態に係る tfiB蛋白質リフォールド難 1 0の ^を取り出して;^ 1見図である。

ΙίίΙΒマイク口プ^~ト等用 Υ軸隱装置 3 8は、モータ 6 8と、案内用スクリュー 6 9とを有する。図中、 f措 7 0は、自動ドア開閉用のスプリング付ソレノイドであり、 ^ r i は、謝己マイクロブト等用 Y軸睡¾¾3 8により聽される、鍵己マイクロプト 3 2およびチップラック 3 5を搬送するキヤリッジである。

第 7図は、本雄の形態に係る ΙίίΙΒ蛋白質リフォールド^ g 1 0の概面図である。なお、 1»されていないが、謝己^則 15の測果、 pHSeWJj¾¾ および p Hパターンに ¾ ^く廳繊微合部による、べき薄の觀ぉよび量を算出するため、

磨¾¾よ t 亭止の m¾¾につレヽては、 C PUやメモリを有する藤 ^2^g，表^ @、キー^ "ド、スィッチ、マウス、通信手の入力装置、プリンタ、メモリ等の出力装置からなる情置を有している。嶽、て、 *mの形態に係る蛋白質リフォールド ¾gi 0をィ魏する：^につい明する。

一旦、蛋白質のカ現されると、糸職のホストから遍さ; «される。魏白質は、に、細胞を满することによって、例えば、界面活 IJ中に懸獨させ、リゾ^ ムを加え、それから «fることによって（例えば、 TN/1% トリトン（«¾鹳 X— 1 0 0の 20ml中に糸瑚包を襲させ、 lOmgのリゾ^^ムを加え、それから - 20°Cで^ Tることによって)、猶军し力つ DNAエースを加えて糸衊の DNAの全て M "るために加え、それから、 ,纖溯で鍵された灘中で »したを赚することによつて、に抽出される。 ¾¾¾は、それから、リフォールド麵のために、るよう当な謙中で溶解され、廳己ボトル 1 4 容され、 ΐ ΐΞ蛋白質リフォール m 1 0

5 上に ¾eされる。

ここで、白質リフォールド雜 1 0の織働合部力 ¾έうべき Ρ Ηパターンおよび、試薬供給部から供給されるべきにつレヽて説明する。

大部分の^ ¾W去では、通常 ρΗ7· 4から 8. 0のような^ 0勺な _P Hにおいて、 51¾したカオトロピック塩（8Mの尿素のような）を用いて、通常、蛋白質をリフォールドする。これは、通常、の a¾または?纖を生み出し、リフォールドを^ τ能または低い^ m性に留める。しかし、最初のリブオールドの p Hが i¾、（少なくとも、 ρ Ηが 9. 0、但し、 ρ Ηが 10のようなより高レ,が望ましい）齢には、リフォールドが可能である。この細ま、ぺプシノゲンが、 ρΗ8· 0〜9· 0において、可翻勺に変性しまた転するというによって最初に示唆された。

、 ρ Η (9. 0のような）においては、蛋白質はいくつ力第 2の鍵を得て、リフォールド、裔夜の活隨が、生物勺 ρ Ηに低下したときに、より擁勺にリフォールドすること力 Sできること力 S膝されている。後ほど、魏勺な ρ Ηで蛋白質がリフォールドされる蛋白^?さえ、 i¾ 、 p Hでより ¾ ^に鐘される。加えて、、 p Hのリフォールド鍵は、最初の^ Λのを防止するすばらしい去である。本 ¾g 1 0【いても、膽 Β ターンとして、この高レヽ p Hを維 if ^るようにリフォーノレド処理を行う。

嫌^ ¾働合部から働合されるべき織としては、 0. 5から 1. 0Mの尿素、 »(匕グァニジン、および L一アルギニンのようなカオトロピック塩の変がある。これらは、リブオールド鍵を助け、リフォールドされた蛋白質を活 t¾t るために役に立つからである (前

|B«2)。そのカオトロピック謎の？艇の範囲は、 0〜4Mである力好ましくは、 0. 4M である。リフォールド/ 程における尿素の?艘は、蛋白質上で変『顿果をもたない。また、 f&IS纖供給部から供給されるべき纖として、還元 Z酸ィがある。

ジスルフィドを有する卩辭頃の蛋白 »入体〖¾1¾ の被中で翻军される必要がある。ィ勺な ¾¾纖は、 /3メルカプトエタノールを、 0. lから ΙΟΟηΜの麵、好ましくは 10π 、 DD Τを 0. ImMから ΙΟπ の議、好ましくは 10 、 ί!¾ダルタチオン (G S Η) を、 0. Im から lOn の翻、好ましくは 1π 、およ 1«匕グルタチオン (GS S G)を、 0. ImM 力も ΙΟηΜの翻、好ましくは In 含有する。 βメルカプトエタノールは、好ましレ、讓である。カロえて、ジチォトレイトールおよび/また ί¾1¾ ^ί匕グルタチオン (G SH、 G S S G) は、誤って折りたたまれた中間ジスルフイド"^の「オシドーシャッフリング」を容易化するために含ませることができる。さらに、 ifE/、°ターンとして、蛋白質のリフォールドを行うのにに長い^ PB 蛋白爵夜の p Hを i¾、状態にしておくこと力である。これは、好ましくは、 pHをゆつくりと、 24B#^で 0. 2pHの^ で、下げることによって^ Tる。この方法では、廳己蛋白賢謙は、 i¾ ヽ p H、好ましくは、少なくとも 9.0 iiに、または 10若しく〖お子ましくは 11未満にまで調節される。 SiflE蛋白質は、好ましくは、少なくとも 24 8 ^の間各 p Hで維持される。同等な効果は、 '？艘を講することにより、より敏、 S#f 、例えば、 2, 3, 6, 9， 12, 18または 20 B ^で截されることができる。 p Hは、 ΙίίΙΒポトル 1 4に肅己マノノズルにより、酸等を加えることによって行われる。

次に、より具働勺嫩ぇ蛋白質のリフォールド麵の 2つの雄例にっレヽ |¾明する。

( 1 ) 第 1の麵列

前段階として、糸纖ぇ蛋白質の発現を行う。

発現プラスミドが、織の B L 2 1 (DE 3)鎖のよう ¾1当なホストに導入され、 Z B/アンピシリンプ^ "ト上に置このことは、好まし!/健え纏本雄尺する。各離物から単一のコロニーが、 100mlの Z B/アンピシリ^体〖うえつけられ、 37°Cで 16 0#^ 成長する。

L B/アンピシリンの 1リツトル中に 1晩の培養物の 20ralを植え付け、 37°Cで、波長 600 の光の濁度が 0. 4~0. 6に針るまで攪拌し、 I P T Gを 0. 5m 加え、 3時間攪 1~る。遠' L 隹し、糸邮包を TN/1%トリトン X— 1 0 0の 20mlに細胞を »^する。 lOragのリソチームをカ卩え、一 20°Cで一晩する。

離され f 細包を鬲蠏し、 20 Ai lの 1Mの Mg S 0₄, lOO/ g DNAエースを加え、糸疃の DNA力 S に溶解するまで攪拌する。

250mlの TN/1%のトリトンを加え、 2から 4Btf_Bの間 »し、遠 ffeよびトリトンの赚をさらにもう一度橾り返す。 8Mの歸裔夜の 10mlに ΙίίΙΕペレツトを翻率し、 βメルカプトエタノールを ιοθηΜま口え、その溜夜カされてリフォールドの聊ができる。該裔夜を譎己ボトル 1 4内に収容して、 ΙΙΪΙΒ蛋白質リフォールド ^gi o m ^

1 5上に継する。

嫌蜀度測定位置 1 9にお！/ヽて、該ポトル 1 4の下側に波長 280nmの光を翻射部 7 2より照射し、 ItflS^ «2 5で S ^することによって、濁度を算出し、 8Mの尿素灘に対して目標の 5.0となる力かを測定する。

該濁度が 5.0になるまでは、トル 1 4に対して ρ Η»が繰り返される。該ボトノレ 1 4力 ftilBpH彻 J定 f立置 2 0に ¾1針ると、 flit己爵亟 2 6カ、 |ίί|Β¾1¾Χ軸

2 8によって麵し、 ιίίΙΕρ Η測定位置 2 0の真上にまで針る。次に、 ffffB慰翻 Ζ軸 ,β装置 2 7によって、纖亟2 6を膽己ボトル 1 4内の蛋白夜 1 3内に挿入して、該溜夜内の水素イオンを測針る。測錢は、該饊亟 2 6を上昇させ、 mx^ 動させて、臂亥潘亟 2 6を微争用織 5 6内に挿入し、スプレイ 5 7を用レヽて游液を嘖射し、電極 2 6を»し、その廃液を排出部 5 9を介して排出する。該 pHは！^勺に、 10.0 になるまで、該ポトノレ 1 4に対して ρΗ»のための繰り返されることになる。該ボトノレ 14が、 ^^合画立置 2 1にまで ¾Τると、調置 2 1に設けたマノノズノ]^ッド 3 0の各ノズル 2 9を介して、 p HH節用難が孩ボトル 1 4内に微合されることになる。該マノ！^ノズノ1^ッド 3 0力らは、例えば、次の 31¾織、 ΙΟπ /3メルカプトエタノール、 lOmM DTT (ジチオトレイトール)、 Ιπ の ¾化ダルタチオン（GSH)、 0. In の謝匕グルタチオン (GS SG) のうち、 tfil¾度測雄: ひ爾己 pH測鎌果に¾^1/、て、邀尺された藻の所定量カ络々働合されることになる。なお、働合画立置 2 1 において、鍾^^ れる際に、該ボトル 1 4は、鍾^^部 3 1によって、該位置 2 1で、鍵己ボトル 1 4の軸まわりに随云が加えられることになる。すなわち、嫌己口ーラ 6 3を ttiSSモータ 6 0力、らの动をカツプリング 6 1およびシャフト 6 2を介して伝達してさせ、該ボトル 1 4 <7^μ貝麵をさせるその際、 ΙίίΙΒァクチユエータ 6 5によつて、アイドラーローラ 6 4を該ボトル 1 4に押さえつけて、該ポトル 1 4のがたつきを防止する。

該ボトル 1 4力跡云すると、該ボトル 1 4内に設けた ιί¾¾4 4力 ¾fiiSボトル 1 4内の頮夜を効果的に攪拌する。

な激夜の p Hは 10.0となるように、嫌己マゾノズからの織によつ Til節される。次に、 ΙίίΐΒボトノレ 1 4力 SftifEP及引立置 2 2に^ Tると、 ttflS自動^ M3 3のノズル 3 4力 m X 3 7によって、 tiff己自動ドア 3 9カ開ぃた|¾|5開ロ咅|34 0の該当する X座標の位置にま"^ ttfる。同時に、籠己キャリッジ 7

チップラック 3 5の該ボトノレ 1 4に対応する顿のピぺットチップ力 ¾¾fされている位置の真上に t&t己開口部 4 0を介して攏己ノズル 3 4カ涖針るようにする。次に分 ¾fflZ纏動赌 3 6によって、該ノズル 3 4を下降して、該ノズル 3 4に嫌己ピペットチップを歸させる。次に該ピペットチップを装着したノズル 3 4を上昇させた後、

2にまで己 X軸垂^ @ 3 7によつさせ、該ピぺットチップを下降させ TtfflSボトル 1 4内に挿入し、 ^量、例えば 25〃 1ずつ小量の蛋白 ® 夜を吸弓 Iし、再び、 luiE 開口部 4 0の該当する X座樹立置にまで^ ΤΤる。同時に、 St!己キャリッジ 7 1の向の麵によって、 ΙίίΙΒマイク口プレート 3 2の該ボトル 1 4に対応するゥエルの位置の真上に、嫌己開口部 4 0を介して ti Sノズル 3 4力立るようにし、次に該ピペットチップを下降して、収容している tUiM夜を対応するゥエル内に吐出する。

該赚を tbttSした後、該ピぺットチップを装着したノズル 3 4は、該ピぺットチップを前言己チップラック 3 5«ffl済みのピぺットチップを収容する織の対応する位置に該ピぺットチップを収容するために、謝己開口部 4 0の該当する X座標に位置し、 ttliSキャリッジ 7 1の Y車肪向の灘により、該当するチップラック 3 5の収執 έ置の真上にまで、編己開口部 4 0を介して位置させ、該ピぺットチップを、歸己ノズル 3 4力らこそぎとすようにして自動的に騰する。

このようにして、 flif己ボトノレ 1 4力言厳引立置 2 2 ¾S するたびに、 ¾*fつ溜夜を tiJlBマイクロプト 3 2の各ゥエルに収容し、該蛋白質リフォールド雜 1 0による処理の ¾¾τを^ ¾するため^^用される。

該ポト /レ 1 4力 SffifB及弓 | ^立置 2 2 した後は、 f«¾^ 1 5 1 5の大部分さをもっ蝤»1 7を、長い B ^赃しながら薩されることになる。この蛇 ^f7W^l 7 ¾®iする間にインキュベーションカわれることになる。 t9iaボトル 1 4がこ

5を一周する β ^は、例えば、 28 であったり、 24 であったり、リフォールドの纖となる蛋白質に応じて定められる。

このようにして、嫌 S目標の濁度おょぴ目標の ρΗ値に廳己蛋白質溜夜が ¾ ^ると、再ぴ、該ボトル 1 4を Sfj|¾¾ »l 5に従って腿させ、嫌纖微合画 έ置 2 1において、 t&fBノズル 2 9の 1つから 2 のトリス綱合し、該トリスを¾¾^とする鍾の 20倍にまで^ ^匕される。さらに、 p Hが 9.0となるように 1 Mの H C 1を ftiBノズル 29の 1つからることによって、 1周の間に ftJlEp Hが最に 8.8となるように厳され、さらに、次の周で、 11が8.6になるょぅに 11が舊され、 ¾^には、 p Hが 8.0になるまで調節される。

なお、によってリフォールドされた蛋白質は、それから、 P跳漸によって薩匕され、ゲ A»fによってされる。ゲノ l¾fは、例えば、 S EPHACRYL (^m )、 S— 300カラムであって、 20n トリス藤！)、 HC 1， 0. M尿素、 H8.0によって街化されている。 ¾¾53— 300留分は、 1¾SDS— PAGEを 1¾ΓΤることによつて驢される。うまくリフォールドされな力つた蛋白質は、、好量になり、折りたたまれた蛋白質は、通常の: ¾ ^量になる。 S-30。カラムからリフォールドされたピークは、さら FPLC Re s ou c e— Q または Re s ou c e— S

カラムによってすることができる。これらは、 20πΜトリス（^¾) 一 HC1 (Re souc e- S のための HE PESパ、ッファ）、 0.4M尿素、 pH8.0によって、化されている。

(2) 第 2の例

メマプシン 2 (memapsin 2) の発現おょぴリフォールド処理

プロ一メマプシン 2は、 PCRで増幅され、 pETl laベクターの BamHIサイトにクローン匕される。その «されたベタターは、 A 1 a— 8 pから A 1 a— 326の^ ¾己列をもつプロ一メマプシン 2を発現する。 2つの発現ベクター、 pETl 1一メマプシン 2 -T1 (以後「T1J という) および pETl 1—メマプシン 2— T2 (以後「T2」という）カ嚇される。両方のベクターにおいて、発現され嫩ぇ蛋白質の嫌己 N«l 5残基は、 tfffiB発現ベクターから^^れる。プロ一メマプシン 2纖は、歹錢 Al a— 16力始まる。 2つの繊ぇプロ一メマプシン 2 【纖々の。*¾¾をもってぃる。丁111：ー454 で Tl*¾をクローン化レ Al a—419で、 T 2*¾gをクローンィはる。 ftflETl観は、 Ι|5Τ2鍵からの伸びを有するが、予測され難»のい f¾をも表現していない。

T 1および T 2の発現べクターは、另 1J々に:^昜菌株、 BL21 (DE3) 入される。導入されネ瞒の: t鶴のための舰、糸藤え蛋白質成のための導よび、繊ぇ蛋白質^"有する封入体の回! 1¾3よにつヽては、例えば、 ¾4 (Lin ^ 1994 Methods in Enzumology 214, 195-224) を参照のこと。 ¾Φ¾には、封入体は、 0. 1Mトリス（^WfD HC 1， pH7. 4中での 1 % (v/v)トリトン X— 1 0 0および 0. 15 N a C 1でされ、 ^？容性の蛋白質は、 8M尿素、 0. 05Mシクロへキシ /レアミノプロパンスルホ^、 10n j3 -メルカプトエタノール、麵 DTT (ジチオトレイトール)、 ln ¾；化グルタチオン (G SH)、 0. 1 π の謝匕グルタチオン (GS S G) および Ιπ グリシン、および lnM のェチレンジアミン四酉搬 (EDTA) の pH10. 5 ½tf謹中に猶军されて、約 5mg/mlの蛋白質になる。この謹は、主として 2(Μίのトリスの f機の 20倍に^ ¾に»してするように加えられる。職化された灘の ρ Ηは、 1Mの HC 1によって、 9. 0に爾觸され、 4°C、 24時間の間再 Ό«ί呆たれる。このプロセスは、 p Hが 8. 0になるまで饑り返される。封入体が、 8Μの尿素、 0. 1Mトリス（^WD、 Ιπ のグリシン、 ΙπΜの EDTA、 ΙΟΟηΜ の βメルカプトェタノール、 ρΗΙΟ. 0に溶解される。

該灘を I5ポトル 1 4内に収容し、 ίΐίΙΞ蛋白質リフォールド耀 1 0の嫌 1 5上¾gし、前述したように、 W «1 5上を、第 1図中 ί^-Τよう〖回りに腿する。該ボトル 1 4内の封入体の波長 280の光にる濁度は、

1 にお、て、 ttilBマノノズノ！ ^ッド 3 0のノズル 2 9から、 ]3—メルカプトエタノールなしの 8M尿素により、 5. 0に赚されるように、嫌己蛋白質リフォールド雜 1 0を用、て前述したようにして、満度を測定しながら繰り返される。

mm

る。すなわち、 10πΜの DTT (ジチオトレイトール)、 lnMpHの il¾化ダルタチオン、および O. lmMの酸化ダルタチオンであり、最終的な?嶽の p Hは、 10. 0である。

このようにして得られた ΙίίΙΒボトル 1 4内の蛋白質謹は、纖に、 2(Mトリス

のの 20 體にまで麓化し、その _P Hは、 9. 0になるように ΙΐίΙΒ蛋白質リフォールド難 1 0によって、議され、その铺された赚は 16 Β ^の間、 4°Cに循される。該裔夜は、 6 B ^で室温で確状態にし、該 p Hは、 8. 5に鶴され、該赚は、再ぴ 18 B#l¾の間に 4°Cに戻す。該裔夜は、再び、 6 で状態にし、その p Hは 8. 0に調節され、その潜夜は、再び 4力 7日で、 4°Cに戻す。このリフォールド鍵については、実施例 1で説明したように難置 1 0を用レ、て行われる。

0によってリブオールドされた蛋白質は、それから、によって濃鏰化され、ゲ A»fによって適される。ゲは、例えば、 SEPHACRYL (^¾)、 S— 300カラムであって、 20nMトリス（^ D、 HC1, 0. M尿素、 ρΗ8·0によって平衡化されてレ、る。 fffBS-300カラムからのリフォールドされるピーク潔 2のピーク）は、さらに、 FPLCRE SOURCE— Q (¾W†Dカラムによって,され、それは、 20n のトリス標 -HC 1、 0.顿尿素、 _PH8.0と ¾状態にある。 ffgB^は、 N a C 1の翻の勾配を持ったカラムから溶出される。 lfJiHS-300からのリフォールドされたピークは、さらなる！^)前に活附匕される。活附匕のためには、その画分が等量の体積の 0.2Mナトリゥムァセテート、 70%のグリセロール、 H4.0と混される。その混' ま、 18日き間の間、 22°Cでインキュベートされ、それから、 2( 1ビス一トリス（^藤！)、 0.4M 尿素、 _PH6.0の 20 體に対して 2度 «さ^憲された観は、それからさらに、 20ビスートリス（¾i¾tD、 0.4M尿素 pH6.0と羽街状態にある FPLC RESOURC E-Q (m )カラム上で雷される。酵は、 NaClの繊の勾配により溶出される。

h説明した各雄の形態は、本発明をより良く趣军させるために具涵に説明したものであって、另 I膨態 ¾ ^服するものではない。したがって、発明の主旨をしない章観で変更可能である。例えば、の説明では、特定の蛋白質を用いた齢のみを具 #¾勺に説明したが、白質の齢に限られるものではなく種々の蛋白質についても删できる。また、

そ^ (也、 , ,スぺクトゾを測^ ることもできる。また、恒温手段として、 4°cに！^した齢につい n¾明したが、他の?破に離することはもちろん可能である。例えば、 16°Cにることにより、リフォールド; ¾®を早めることができる.例えば、上記 24時間とあるのを 2 B ^にすること力 sできる。なお、铺成歸、部品、 ,例えば、 ¾^則餘 15、織、マゾノス、/ ッドのノズンレ、分灘のノズ /めについても、形は、図面に翻、れたものに限定されるものではない。

Claims

請求の範囲

1. リフォールド¾ の蛋白質有する蛋白賢謙を収容可能な 1または 2 i:の容器を ¾gして、 ¾»¾の閉じに沿つを腿する«¾と、 ltit«^S^ に設けられ、鍵己織内の蛋白雷辯夜の) fe¥ ^生質を測針る)¹^則と、に設けられ、 ^^内の蛋白貧凝夜の _P Hを測定する _P H測と、養に設けられ、

する觀共給部とを有するとともに、

ttfl^^倒合部は、嫌己測の測果、 ΙϋϊΒρΗ測趨の測雄颗よび予め定めた ρ Ηパターンに ¾^5、て SfflS蛋白質藤の p Hの禱を行うことによって蛋白質のリフオールドを行う蛋白質リフォールド装 go

4. 嫌 ^には、謝器されている蛋白戴夜体のの量を吸引して、該当する容器に移送するための吸引移 ¾f 1を設けた蛋白質リフォールド装 ¾

5. ΙϋΙΕ^姆合部は、少なくとも 3個の織 atttj口を有し、 ^^tbffi口からは少なくとも酸^ ^、ァゾレカリ†^^、およぴパッファ用纖のい f bかを lihtB可能に設けた請求項 1に記載の蛋白質リフォール mUo

6. 部は、 &において、 ΙΞ^を軸まわりに云することによつて、 ^^内に収容されている液体を行う請求項 1に識の蛋白質リフォールド装

7. t&f^器はボトル状に形成され、内部に、内壁から車膝妨向に向力つて突出する攪拌用突出部を設けた請求項 6に記載の蛋白質リフォール mW

8. 讎用突 ίϋ¾は、 ΐίίΙΕ^»内歸 βより一鶴さに設けられた請求項 7 にの蛋白質リフォールド装

9. リフォールド象の蛋白質を含有する蛋白戴夜を収^ T能な 1または 2 の

^^を «W"る fi ^の閉じに沿つする « ^工程と、 ffj|«i» いて、嫌内の蛋白麵夜の ¾¾ι·生質を測る ¾^« 程と、言において、器内の蛋白貧灘の _PHを測^ る _P H測程と、言いて、該

^^内の蛋白夜の p Hを |¾するの^^をる^ 合:!:程とを有するとともに、

鎌^^働合工程は、嫌己) ^則紅程の測雄果、編己 p H測 ¾ 程の測驟よび予め定めた p Hパターンに ¾ ^、て、謝己蛋白麵夜の p Hの講を行う蛋白質リフォールド装置の使用规。

1 0.

H 程の後に節される請求項 9に記載の蛋白質リフォールド装置の使用^去。

1 1 . 編 51 ^働合工程において、または、程の後で、いて、 fiilB ^»収«)を »させる »工程を設けた請求項 9にの蛋白質リフォール K¾g« 用规

1 2. 嫌 ¾¾i»i ¾3いて ΙίίΙ^ίこ収容されている液体の 15の職量を吸引して、該当する繊する吸引難工程を有する請求項 9に雄の蛋白質リフォールド装置の使用方法。

1 3. 嫌^ ¾働合工程は、少なくとも 3本の織 thffi口から、少なくとも酸!^ 、アルカリ' |^m、およぴパッファ用のいかを卩可能とする請求項 9に曹識の蛋白質リフォールド装置。

1 4. rn ^ にお、て、 ΐϋΐ^^を軸まわりに云することによって、 ^^内容されている液体の »を行う請求項 9に ΐ織の蛋白質リフォールド装置の使用方法。

1 5. 鎌工程は、ボトル状に形成され部に、容»内ら權駄向に向力て突出する »用突出部を設けた^ ^を云させることによって行う請求項 9に ΙΒ¾の蛋白質リフォールド装置の使用^?去。

1 6. 嫌趣工程は、廳 3»用突出部が内ょり一鶴さ m:に設けられた容器を回転する請求項 9に記載の蛋白質リフォールド装置の方法。