JPS60500893A - タンパク質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の生産方法 技術分野 本発明は、組換えＤＮＡバイオテクノロジーを使用したタンノずり質生産の技術 分野に関する。より詳しく言うと、本発明は、タンパク質のコードとなる遺伝子 を含むベクターで形質転換された宿主生物により不溶性の形態で生産されたタン パク質の復元方法に関する。

背景技術 現在、異種の遺伝物質を発現することができる宿主生物を培養することにより大 量生産することができる、商業的に価値のあるタンパク質の例が多数ある。タン パク質が宿主生物心こより産生された場合、通常所望のクンバク質を得るために 宿主生物を成る方法で処理することが必要である。幾つかのケースでは、例え＋ ｒ大腸菌中でのインターフェロンの産生のように、溶菌又番ｉ透過処理を行うだ けでも充分満足のゆく収量を提供することができる。しかし、幾つかのタンパク 質は、溶菌又は透過処理だけでは抽出されｉｑない不溶性のタンパク質集合体の 形態で宿主生物内心こ産りＶされる。大腸菌中に産生されるヒトのインシュリン の融合タンノマク質は、不溶性タンパク質の集合体の形態を成して（、ｓるとし ）うことか報告されている（Ｄ、Ｃ，ウィリアムス他（１９Ｂ２）　−’Ｊ′イ エンス２１５　６８７〜６８９参照）。

タンパク質は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の門真として存在してい る。タンパク質の正常で生物学的Ｑこ活性な升毛態（以後、自然的形態と呼ぶ） では、この鎖は熱力学曲に好ましも）三次元構造に折り畳まれており、この配座 は、水素結合、疎７に相庁作用、電荷相互作用のような比較的弱い原子間力によ ってず呆１寺されている。イオウ原子間の共有結合は、インシュ１ノンの、にう な２　１８ＲＢｏ６０−５ｔ）０８９３　（２）多数のサブユニットより成るタ ンパク質の異なるポリペブチ１鎖間における分子間のジスルフィド架橋のように 、ポリペブチ１′鎖中で分子内のジスルフィド架橋を形成することができる。幾 つかの例で産生される不溶性のタンパク質は、それらの自然のものが・有する機 能的活性を示さず、このため一般的には商業的生産物としては殆ど利用価値のな いものである。機能的活性の欠如は、多くの要因に帰セられるであろうが、形質 転換された宿主生物により生産されたタンパク質は、それらの自然的形態のもの とは異なる配座で形成されているということが言えよう。また、ごれらのタンパ ク質は、分子内のジスルフィド結合に加えて、自然のタンパク質の機能的活性に Ｌ１必要でない不要の分子間ジスルフィド結合も持っているのかも知れない。こ のようなりンバク質の変更された三次元構造は、不溶性に結びつ（だりではなく 、タンパク質の生物学的活性を減少させたり、亡くし７たりさせている。所定の 宿主生物により発現された所定のタンパク質が可溶性となるか、又は不溶性とな るかを予言することはできない。

本出願人の同時係属中の英国特許出願６Ｂ２１００７３晩において、本出願人は クンバク質分解酵素であるキモシンの生産方法について述べた。この方法には、 関連するタンパク質の二ｒ　−１；となる遺伝子を含むベクターで形質転換され た宿主生物により産生されたキモシン前駆体タンパク質の切断が含まれている。

本発明者達は、研究中にキモシン前駆体タンパク質はそれらの自然的形態で産生 されるのではな（、不溶性の集合体として産生きれるということを見出した。切 断された後活性な自然のキモシンとなる自然的形態のキモシン前駆体を生産する ため、タンパク質の精製と切断に関する標準的技術を使用するＯＸｌに、宿主生 物により生産されたクンバク質を可溶化させてそれらの自然的形態に転換させた 。

本出願人の同時係属している国際公開された国際特許用１９ｊｉＷＯ８３／　０ ４４１Ｂにおいて、キモシン前駆体タンパク質の可溶化のために使用した方法が 記載されている。通常上述した方法では、タンパク質を変性させた後変性剤を取 り除き、これによりタンパク質を復元させている。１例で使用した変性剤は、尿 素、グアニジンハイドロクロライドのよ゛うな化合物である。不溶性の前駆体を 尿素又はグアニジンハイドロクロライドで処理すると、この前駆体は可溶化す本 。変性剤を例えば透析により取り除くと、タンパク質がキモシン前駆体の場合、 タンパク質は活性のキモシンに変わり得る、熱力学的に安定な配座に戻る。

可溶化したタンパク質は、遠心分離又は濾過により不溶性の細胞片から分離する ことができる。然るべく形質転換された宿主生物からのタンパク質の生産は潜在 的に大きな商業的価値を有するものである。関係する操作は、研究室的規模から 工業的規模に拡大することができるタイプのものである。しかしながら、生産さ れたタンパク質が不溶性の集合体として生成された場合には、操作における潜在 的な複雑さが実施可能なレベルを超える程生産費を増大させる可能性がある。上 述した可溶化の技術は、このようなタンパク質の可溶化には有効であるが、比較 的高価であり、かなりの生産費となることを意味する。

本発明者達は、一般的な態様では比較的高価な試薬を必要としない、広く応用可 能な可溶化方法を見出した。

発明の開示 本発明に基づき、可溶性で自然のタンパク質の生産方法を提供する。この生産方 法では、不溶性の形態のタンパク質を、タンパク質のコードとなる遺伝子を含む ベクターで形質転換された宿主生物により生産する。そして、不溶性の形態のタ ンパク質を、タンパク質の配座な保持するのに関与する一つ又は二つ以上のグル ープのタンパク質の解離を促進するように選定したｐＨのアルカリ性水溶液中で 司逆的に変性し、次にこのタンパク質を、クンバク質を変性させるのに有効なｐ Ｈ以下に溶液のｐＨを＋げることにより復元して可溶性で自然の形態のタンパク 質を生産する。

不溶性のタンパク質を変性させるためにアルカリ性水溶液を使用することにより 、操作の試薬コストが減少する。このアルカリ性水溶液のｐＨは、操作を適用す るタンパク質に応して選択する。

特に、このｐＨは、分子内の結合又は力により若しくはタンパク質集合体の場合 には多分非機能的な分子間の結合又は力により、タンパク質を自然でない配座に 保持させている複数のグループが、ｐｌ＋が下がったとき、クンバク質が自然の 配座に再び折り畳まれるように解離するｐＨに選ぶ。タンパク質を自然でない配 座に保持さセているグループは、イオン化可能なグループであり得るが、この場 合にはｐＨは、関連するイオン化可能なグループのｐＫａに合うように選ぶこと が好ましい。

我々の研究室の研究により、分子間のジスルフィド結合が、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）により産生されたプロキモシンの集合体中に存在することが明らかになった くシャーメイカー他（，１９８４）　ＰＮＡＳに提出）。自然のプロキモシンは モノマーであり、３つの分子内ジスルフィド結合を有している（フォルトマン化 （１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ。

八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ、　Ｓ、＾、　７４　２３２１−２３２４頁）。従 って、１分子当り６個のチオール基がタンパク質集合体中の分子間及び分子内結 合を形成するのに寄与していることになる。このため、変性及び復元させてうま くプロキモシンを可溶化させるためには、ジスルフィド結合を壊して適当に再形 成させる必要がある。これは、ｐＨ１０，７（±０．５）のアルカリ性水溶液を 使用することにより実現可能である。システィンの遊離のチオール基は、ｐ）＜ ａ値力月０．４６である。

ここで使用する“不溶性”という用語は、実質的に中性の状態（例えば、５．５ から８．５の範囲のｐＨ）では、実質的に不溶性の形態か、宿主生物細胞の熔解 で出来た不溶性物質との不溶化した結合状態の形態にあることを意味する。不溶 性産物は、宿主生物の細胞中に不溶性で比較的高い分子量を持つ集合体の形態で 産生されるか、又は単に不溶性の細胞膜物質と結びついているだけである。この 操作には、溶解したクンバク質の不溶性の細胞片からの分離が含まれている。

本操作では適当なアルカリであれば何でも使用することができ、例えばＮａＯＨ 又はＫＯＪ＋のようなアルカリ金属の水酸化物の水溶液、緩衝液、トリエチルア ミンのような有機塩基の水溶液を使用することができる。

アルカリ性水溶液のｐＨは、９から１１．５とするのが好ましく、より好ましく は１０から１１までの間である。

不溶性のタンパク質をアルカリ性水溶液で処理しても、常にタンパク質が完全に 可溶化されるというわけではない。不溶性の物質は富に存在するのであるから、 多くの物質移動効果は重要になる。大きな抽出容量で行った場合であっても、ア ルカリで１回抽出するより複数回抽出した方がより効果的であることがわかった 。

このことはまた、可溶化したタンパク質がアルカリと接触している時間を最小に するという利点も有している。従って、変性したタンパク質に１回又は２回以上 抽出操作を施すことが好ましい。

公開された英国特許出願ＧＢ２１００７３７＾と国際公開された国際特許比１ｔ ＪＩＷ０　８３１０４４１Ｂに記載されている、グアニジンハイドロクロライド 又は尿素のような強い変性剤中で可溶化させる方法及び本発明の一般的態様に基 づきアルカリを使用して可溶化させる方法では、それぞれ宿主生物からの抽出物 に存在する不溶性タンパク質のかなりの割合を可溶化する。しかしながら、自然 のタンパク質の復元という点からは、どちらの方法も完全な量的対応性を持って いるというわけではない。この理由ははっきりわかっているわけではないが、多 分この２ｆ［の可溶化現象について異なるものである。グアニジンハイドロクロ ライドは存在する全ての物質を可溶化するが、一部分だけがグアニジンハイドロ クロライトラ取り除いた後、自然のタンパク質に変えられるようである。アルカ リ処理は、完全な復元を生じさせて自然的形態のタンパク質を形成させることは できず、また全ての不溶性の形態のタンパク質を可溶化させるわけではない。本 発明者達は、これらの２つの方法を組合せることにより大幅に増大した収量の自 然のタンパク質が得られることを見出した。

本発明の好適な態様に基づき、先ず、不溶性の形態のタンパク質を水溶液中で変 性させ、次に、得られた溶液をタンパク質の配座を保持するのに関与するーっ又 は二つ以上のグループのタンパク質の解離を促進するように選定したｐＨのアル カリ性水溶液中で希釈し、そしてタンパク質を変性させるのに有効なｐＨ以下に 溶液のｐｎを下げることによりタンパク質を復元させて、可溶性で自然の形態の タンパク質を生産する。

希釈は、例えばアルカリ性の変性溶液の中和による復元が生じる前に、変性した 分子間に物理的な分離を引き起こしている。希釈して変性した分子に物理的な分 離を生じさせることは、自然的形態への復元に役立っているようである。メチオ ニン−プロキモシンの場合、直ぐ上に述べた可溶化操作は、例えば、やはり上述 した多数回のアルカリ抽出のｌＯから２０％と比較して、３０％以上の復元に達 するものである。

アルカリ性水溶液のｐＨは９から１１．５が好ましく、より好ましくは１０から １１の間である。

希釈率は、１０倍から５０倍が好ましい（即ち、全容量を１０から５０容量に希 釈することである。）。

上述の組合せた可溶化操作において、不溶性のクンバク質は、少な（とも７Ｍの 濃度の尿素より成る水溶液中又は少なくとも６Ｍの濃度のグアニジンハイドロク ロライドより成る溶液中で変性させるのが好ましい。

不溶性のタンパク質は、宿主生物により産生された組換え型の動物タンパク質と することができる。このようなタンパク質の例は、免疫グロブリンのし鎖とＨ鎖 のポリペプチド、口蹄疫抗原、チモシンとインシュリンのタンパク質である。

この宿主生物は、自然に生じた生物又は不溶性のタンパク質を産生ずることがで きる突然変異した生物とすることができる。宿主生物は、宿主生物に対して異種 であり、不溶性の形態で産生されるタンパク質の産生の、コードとなる異種のＤ ＮＡ配列による組換えＤＮＡ技術を使用して形質転換した生物又は生物の子孫が 好ましい。宿主生物は、酵母又は動物又は植物の細胞のような真核生物とするこ とができる。酵母は、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ 　）とするのが好ましい。代わりとして、宿主生物は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） 、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ＞　、Ｂ　、ステアロサーモフイリス（Ｂ。

ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）又はシュードモナス（Ｐ、ｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ）のような細菌とすることができる。特定の宿主生物系の例としては 、大腸菌ＨＢＩＯＩ　（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ）　、大腸菌Ｘ１７７６　（ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ１７７６）、大腸菌Ｘ２８８２　（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ２８Ｂ２ ）　、大腸菌ＰＳ４１０　（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＰＳ４１０）、大腸菌ＰＶ３０Ｂ　 （Ｅ、ｃｏｌｉ　ＰＶ３０８）　、大腸菌ＭＲＣＩ　（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＰＣＩ 　）がある。

宿主生物は、ｃｏｌＥｌ、　ｐｃＲｌ、　ｐＢＲ３２２，ＲＰ４．ファージλＤ ＮＡ又はこれらの誘導体のようなプラスミドを含んだ適当なヘクター分子で形質 転換することができる。

本発明に係る操作で処理する前に、宿主細胞に生産物の回収を容易にするため、 適当な溶解処理又は透過処理を施しておくことができる。例えば、宿主生物をリ ソシームのような酵素で処理したり、細胞を破壊するための機械的細胞破壊装置 で処理しておくことができる。

次に、本発明の操作では、不溶性の生産物を可溶化し、そして得られた溶液を不 溶性の細胞膜断片のような固形細胞物質から分離する。濾過又は遠心分離を含む 適当な方法を用いて、固形細胞物質から可溶化したタンパク質を含む溶液を分離 することができる。

本発明を、下記の実施例に基づき詳細に説明する。

実施例１ ベクターｐｃＴ７０で形質転換した大腸菌細胞により産生された不溶性のメチオ ニン−プロキモシンの可溶化を、アルカリ変性を用いて行うという実験を実施し た。形質転換した大腸菌細胞系の調製法は、公開された英国特許用ｆｆＪｆ４　 ＧＢ２１００７３７＾に詳細に説明されている。

誘導状態で成長した凍結された大腸菌／ｐｃＴ７０細胞を、２３μｇ／ｍｅのフ ェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）と　１３０，１／　ｇ　／　 ｍｅのリソチームを含む３倍重量の０．０５Ｍ　）リス−Ｈｅｌ　ｐＨ８，１ｍ Ｍ　ＥＤＴ＾。

０、ＩＭ　ＮａＣ１溶液中で懸濁させた後、この懸濁液を４°Ｃで２０分間培養 した。デオキシコール酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるまで添加し、そ して出発物質である大腸菌１ｇにっき１０ＩＩｇの（ウシの膵臓からの）ＤＮＡ アーゼ１を添加した。この溶液を１５℃で３０分間培養し、この時間で溶液の粘 度は著しく減少した。上述したようにして得られた抽出物は、４℃、１００００ 　ｘ　ｇで４５分間遠心分離した。この段階で、多分細胞片への集合又は結合の 結果として、実質的に全てのメチオニン−プロキモシン産物は、不溶性の形態で ペレット分画に存在していた。ペレットは、４℃で３９ 容量の０．ＯＩＭ　ｌ−リス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０，１Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　 ＥＤＴＡ溶液中で洗った。上述したように更に遠心分離した後、上清を棄て、ペ レットを０．０５Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．ＩＭ　ＮａＣＪ 、　ｐＨ１０，７の３容量のアルカリ抽出緩衝液中で再び懸濁した後、この懸濁 液を水酸化ナトリウムでｐＨ１０，７に調整した。この懸濁液を４℃で少なくと も１時間（から１６時間まで）放置し、上清のｐＨを濃塩酸の添加で８．０に調 整した後、上述したように遠心分離した。最初ペレット中に存在していたメチオ ニン−プロキモシンのかなりの割合に当るメチオニン−プロキモシンが、不溶性 の形態で上清中に存在していることが見出され、これは、公開された英国特許出 願ＧＢ２１００７３７Ａに詳細に説明されている通り、酸性化及び中性化の活性 化処理により触媒作用で活性なキモシンに変えることができる。

更に付は加えると、最初のアルカリ抽出の後に残留する断片を再び抽出すると等 量のプロキモシンが遊離する。アルカリ抽出は全部で４〜５回繰り返すことがで き、それぞれの抽出で略同し濃度のプロキモシンが遊離する。

実施例２ ベクターｐＭＰ３で形質転換した大腸菌細胞により産生された不溶性の免疫グロ グリンし鎖のポリペプチドの可溶化を、アルカリ変性を用いて行うという実験を 実施した。形質転換した大腸菌細胞系の調製法は、同時係属している同日の国際 特許用ｌ１３Ｊ１１１ｋＩＰＣＴ／ＧＢ８４／　に説明されている。４−ヒドロ キシ−３−ニトロフェニル　アセチル（ＮＰ）が結合しているモノクローナル抗 体Ｓ４３のλＩＬ鎖のコードとなる遺伝子を含むプラスミドｐＭＰ３で形質転換 した大腸菌細胞を誘導条件の下で成長させた。細胞を回収し、この細胞を１３０ μｇ／ｍｊ！のりソチームを含む０．０５Ｍ　）リスｐｌ＋８．０．０．２３３ Ｍ　ＮａＣｌ、５％（Ｖ／Ｖ）グリセリン溶液中で再懸濁させた後、４℃又は室 温で２０分間培養した。次に、デオキシコール酸ナトリウムを最終濃度が０．０ ５％になるまで添加した後、大腸菌の湿重量１ｇ当り１０Ｍｇの（ウシの膵臓か らの）ＤＮＡアーゼ１を添加した。次に、この溶液を１５℃で３０分間培養し、 この時間で溶液の粘度は著しく減少した。次に、得られた混合物を遠心分離した （遠心分離は、１００００　ｘ　ｇで、小吉（ｉＨｍｌ）の場合、１５分間、こ れ以上の容量の場合、１時間で行う）。免疫沈降反応による研究結果は、λＬ鎖 のタンパク質は、可溶性分画よりは不溶性分画の方に存在していることを示して いた。

組換えＩ５鎖を精製するため、上述したように得られた大腸菌のペレット分画を ５０ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４、０，ＩＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡより成るｐ） ｌ１１．５の緩衝液中で再懸濁させた。この懸濁液を少なくとも１時間（から１ ６時間まで）放置し、上述したように遠心分離した後、上清のｐＨを濃塩酸の添 加により８．０に調整した。最初ペレット中に存在していたかなりの割合のλＬ 鎖タンパク質が上清中に見出され、これは可溶性の形態であった。

実施例３ ベクターｐｃＴ７０で形質転換した大腸菌細胞により産生されたメチオニン−プ ロキモシンの可溶化を、グアニジンハイドロクロライドを用いて変性させ、その 後アルカリ性溶液中で希釈するという方法を使用して行うという実験を実施した 。形質転換した細胞系の調製法は、公開された英国特許出願ＧＢ２１００７３７ Ａに詳細に説明されている。

不溶性のメチオニン−プロキモシンを含む大腸菌／　ｐｃＴ７０細胞片を調製し た後、上記実施例１で説明した通り洗い、次に室温で下記の操作を実施した。細 胞片は、３〜５容量の緩衝液中で熔解し、最終濃度を６Ｍ　グアニジン　ＨＣ１ ／　０．０５Ｍ　）リスｐＨ８＋　１ｍＭＥＤＴＡ、　０．ＩＭ　ＮａＣｌとし た後、３０分間から２時間放置した。混合液は、グアニジン　ＭＣＩを含まない １０〜５０容量の上記緩衝液（ｐ）１１０．７）１ で希釈した。希釈は、１０〜３０分間かけて攪拌されている希釈液に試料をゆっ くり添加することにより行った。希釈された混合液は、ＬＭ　ＮａＯＨを添加す ることによりｐＨ１０，７に再調整した後、１０分間から２時間放置した。次に 、ＩＮ　ＨＣＩの添加によりｐＨを８に調整した後、混合液を更に３０分間放置 し、そして沈殿したタンパク質を除去するための遠心分離を行った。このように して出来た上清には、酸性化及び中性化で触媒作用的に活性なキモシンに変わり 得る可溶性のメチオニン−プロキモシンが含まれており、この上清を公開された 英国特許出願ＧＢ２１００７３７Ａに記載されている通り精製した。非常に類似 した実験では、上述した６Ｍ　グアニジンＨＣＩ緩衝液の代わりに８Ｍの尿素緩 衝液を使用した。結果は、上述した通りであった。

実施例４ ベクターｐｃＴ７０で形質転換した大腸菌細胞により産生されたメチオニン−プ ロキモシンの可溶化を、実施例３に記載した方法と類似の方法を用いて行うとい う実験を実施した。形質転換した細胞系の調製法は、公開された英国特許出願Ｇ Ｂ、２１００７３７八に詳細に説明されている。

不溶性のメチオニン−プロキモシンを含む大腸菌／ｐｃＴ７０細胞片を調製した 後、上記実施例１に説明した通り洗い、次に下記の操作を室温で行った。これら の洗浄したペレットを、９Ｍの（脱イオン化した）尿素が添加された５０ｍＭ　 トリスＩＩｃＩ　ｐＨ８，０，１ｍＭＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　０． １ｍＭ　ＰＭＳＦを含む緩衝液中で懸濁した。１０ｇ量の出発物質当り、９０ｍ 　１２の緩衝液を使用した。１時間後、この溶液を１ｍＭ　ＥＤＴＡと５０ｍＭ 　ＮａＣｌ及び５０１１Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４ｐＨ１０，７を含む緩衝液中にゆっく り添加し、この溶液を少なくとも３０分間放置した。最適の希釈範囲を設定する ため、種々の希釈溶液を作った。

この結果、最適の希釈範囲は、１０〜５０倍のアルカリの希釈／８液であること がわかった。この間、ｐＨを１０．７に保ち、それからｐＨに調整した。この生 産物を活性化させて活性のキモシンを生しさせた後、キモシン活性のレベルを検 定した（エムターゲ、Ｊ、Ｓ、、アンガル、Ｓ、、ドウル、　Ｍ、Ｔ、、ハリス 、　Ｔ、Ｊ、Ｒ，、ジェンキンス、Ｂ。

リリイ、Ｇ、ｌ　ロウ、Ｐ、八、　（１，９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０、３６７１〜３６７５　）。結果を表１に示す。

表　１ 牛乳の凝固活性の回復についての希釈の効果希　釈　倍　率　牛乳の凝固活性 尿素　アルカリ　全　（ｍｇ） １　１０　１０　０．０４ １　２５　２５　０．１０ １　５０　５０　０、０５ ５　１０　５０　０．１０ ５　２５　１２５　０．０９ ５　５０　２５０　１．２３ １０　１０　１００　１．９７ １０　２５　２５０　１．５６ １０　５０　５００　０．０９ 実施例５ 大腸菌中に一緒に産生された不溶性の免疫グログリンＨ鎖とＬ鎖の可溶化を、尿 素で変性した後アルカリ中に希釈するという方法を用いて行うという実験を実施 した。形質転換した細胞系の調製法は、同時係属中で同日出願の国際特許用１Ｊ ｌｌＩｈＰｃＴ　／ＧＢ　８４に記載されている。

免疫グロブリンの両Ｈ鎖とＬ鎖の遺伝子を発現する大腸菌細胞から機能的抗体を 産生させるため、細胞を溶解し、不溶性物質を洗った後、超音波処理を施した（ ３分間に３回）。次に、この物１３ 質を９Ｍ　尿素、５０ｍＭ　グリシン−Ｎａ”　ｐＨ１０，８，１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、　２０ｍＭ２−メルカプトエタノール溶液中で溶解した。この抽出物を、２ ０容量の１００ｍＭ　ＩＣ！、　５０ｍＭ　グリシン−Ｎａ”　ｐＨｌｏ、８． 　５％　グリセリン、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５ｍＭ還元形グルタチオン 、０．１ｍＭ酸化酸化用グルタチオン溶液して３回、４０時間かけて透析を行っ た。透析物を３００００Ｘｇで１５分間遠心分離して澄ませた後、直ぐにＤＥＡ Ｅセファセルに詰め、１０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐ Ｈ８，０溶液中にＫＣＩが０から０．５Ｍまで直線的な濃度勾配となるように含 まれた溶液を用いて展開を行った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　不溶性の形態のタンパク質をタンパク質のコー°ドとなる遺伝子を含むベ クターで形質転換した宿主生物により産生させる操作と、この不溶性のタンパク 質をタンパク質の配座を保持するのに関与している１つ又は２つ以上のグループ のタンパク質の解離を促進させるように選ばれたｐｔｔのアルカリ性水溶液中で 可逆的に変性させる操作と、続いてこのタンパク質をタンパク質を変性させるの に有効なｐ）１以下に溶液のｐｏを下げることにより復元させて可溶性の形態の タンパク質を生成させる操作とを有する、可溶性で自然のタンパク質の生産方法 。 ２、アルカリ性水溶液のｐ）Ｉは９から１１．５である請求の範囲第１項記載の 生産方法。 ３、不溶性の形態のタンパク質は、アルカリ性水溶液に不溶性である、宿主生物 に由来する断片と結合して存在しており、変性させたタンパク質の抽出を１回以 上行う操作を有する請求の範囲第１項又は第２項記載の生産方法。 ４、先ず、不ｆ４性の形態のタンパク質を水溶液中で変性させる操作と、続いて 生成した溶液をタンパク質の配座を保持するのに関与している、１つ又は２つ以 上のグループのタンパク質の解離を促進させるように選ばれたｐｉのアルカリ性 水溶液中で希釈する操作と、タンパク質を変性させるのに有効なｐＨ以下に溶液 のｐＨを下げることによりタンパク質を復元させて可溶性で自然の形態のタンパ ク質を生成させる操作とを有する請求の範囲第１項又は第２項記載の生産方法。 ５、　アルカリ性水溶液のｐＨは、９から１１．５である請求の範囲第４項記載 の生産方法。 ６、希釈率は、１０倍から５０倍である請求の範囲第４項又は第５項記載の生産 方法。 ７、不溶性のタンパク質は、少なくとも７Ｍの濃度の尿素を含む水溶液中で変性 させるようにした請求の範囲第４項から第６項のうちのいずれか１項に記載の生 産方法。 ８、不溶性のタンパク質は、少なくとも６Ｍの濃度のグ′アニジンハイドロクロ ライドを含む水溶液中で変性させるようにした請求の範囲第４項から第６項のう ちのいずれが１項に記載の生産方法。 １