CN117659107A - 一种绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绿色环保的5'‑胞苷酸提取工艺，涉及生物工程技术领域，包括：使胞苷酸酶解液中的蛋白变性，得灭活物料；将灭活物料过滤后浓缩，浓缩至胞苷酸含量100～200g/L；向浓缩液中加入钙盐，并搅拌30～45min，得沉淀溶液；分离沉淀溶液中的磷酸钙沉淀，得脱盐清液；调节脱盐清液pH至4～5，然后过滤，将残留的钙盐去除，得过滤清液；缓慢调节pH至2～3，搅拌结晶5.5～6.5h，得到结晶液；将结晶液使用离心机分离，得5'‑胞苷酸粗品；5'‑胞苷酸粗品淘洗后，真空干燥即得成品。本发明为生物法，没有使用有毒物质以及有机溶剂，通过简单的沉淀分离即可分离出磷酸盐，取代大量的离子交换和色谱脱盐的使用，产品纯度达到99％，是一种绿色环保的提取工艺。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种绿色环保的5’-胞苷酸提取工艺。
背景技术
5’-胞苷酸在常温常压为细灰宝色结晶粉末，可用作食品添加剂，也可用作核苷酸类药物的原料、反应合成的中间体，如用于合成三磷酸胞苷(CTP)、阿拉胞苷(Ara-C)、胞二磷胆碱(CDP-choline)等，用途十分广泛。
目前胞苷酸的生产方法有化学合成法、生物法两种。化学法合成法常以三氯氧磷为磷酸供体，在有机溶剂中反应，如专利CN104163842A，以胞苷、磷酸三乙酯、吡啶为原料，在-15～5℃下缓慢加入一定量的三氯氧磷，再进行水解、碱中和、脱色、结晶、过滤得到成品，整个制备过程路线长，反应条件要求苛刻，同时三氯氧磷属于剧毒品，中和后产生大量的氯化钠，对环境危害较大，不属于绿色生产。
常用的生物法如下三种：(1)利用核糖核酸(RNA)的降解来生产5’-胞苷酸，但该方法一次获得4种产物，除了5’-胞苷酸外，其他三种均为反应的副产物，需要经过进一步的分离纯化才能获得纯的5’-胞苷酸；而且该降解RNA生产5’-胞苷酸工艺中的分离操作复杂，目标产物收率较低。(2)直接发酵法，如专利CN113999271A提供一种从微生物发酵液中提取5’-胞苷酸的方法，先发酵产出胞苷酸再进行提取，但产酸量较低仅为30g/L，提取5’-胞苷酸时需要使用大量乙醇。(3)酶解法，如专利CN111269870A披露了一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用，仅是小试，酶解浓度是30～35mmol胞苷，也就是7.3～9.7g/L，含量低，也未涉及到后续的提取工艺。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种绿色环保的5’-胞苷酸提取工艺，没有使用有毒物质以及有机溶剂，通过简单的沉淀分离即可分离出大部分的磷酸盐，提取收率达到85％以上，产品纯度达到99％。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种绿色环保的5’-胞苷酸提取工艺，包括：
S1：调节胞苷酸酶解液的pH至3～5，加热至70～90℃，维持30～35min，使蛋白变性，得灭活物料；
S2：将灭活物料用5～50kd的陶瓷膜过滤，去除菌体碎片和变性蛋白，并对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗，得陶瓷膜清液；
S3：将陶瓷膜清液用反渗透膜或1000分子量以下的纳滤膜进行浓缩，浓缩至胞苷酸含量100～200g/L，得浓缩液；浓缩出水用于步骤S1中物料的溶解；
S4：向浓缩液中加入钙盐，并搅拌30～45min，生成磷酸钙沉淀，得沉淀溶液；
S5：分离沉淀溶液中的磷酸钙沉淀，得脱盐清液；
S6：调节脱盐清液pH至4～5，然后过滤，将残留的钙盐沉淀去除，得过滤清液；
S7：进一步缓慢调节pH至2～3，搅拌结晶5.5～6.5h，将5’-胞苷酸沉淀，得到结晶液；
S8：将结晶液使用离心机分离，得5’-胞苷酸粗品；
S9：5’-胞苷酸粗品淘洗后，真空干燥即得成品。
进一步地，制备步骤S1中胞苷酸酶解液的方法为：取胞苷300～400mmol、多聚磷酸钠60～80mmol、ATP 10mmol、镁盐60～90mmol、磷酸二氢钠10mmol、磷酸氢二钠10mmol，混合后加入900mL水溶解，配置成1L的体系，混合均匀后加入尿苷胞苷激酶、聚磷酸激酶酶解反应2～6h。
进一步地，所述步骤S2中，对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗时，用水量为胞苷酸酶解液体积的50～70％。
进一步地，所述步骤S4中的钙盐为氢氧化钙或氯化钙，添加量为320～440mmol/L。
进一步地，所述步骤S5中采用板框过滤或抽滤的方法分离沉淀溶液中的磷酸钙沉淀；步骤S6中的过滤采用板框过滤或抽滤。
进一步地，所述步骤S1和步骤S6均使用硫酸调节pH值；步骤S7中用盐酸调节pH值。
进一步地，所述步骤S9中淘洗的具体工序为：将5’-胞苷酸粗品用温度为10～30℃的纯水淘洗，淘洗时间为1～2h，纯水的使用量为5’-胞苷酸粗品的2～3倍，分离得到5’-胞苷酸湿成品，用双锥或者耙式真空干燥后得到成品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明使用酶解的物料提取5’-胞苷酸，酶解后胞苷酸含量达到100g/L，整个过程为生物法，没有使用有毒物质以及有机溶剂，通过简单的沉淀分离即可分离出大部分的磷酸盐，然后通硫酸沉淀分离剩余的钙盐，取代大量的离子交换和色谱脱盐的使用，极大的减少了污水的排放，提取收率达到85％以上，产品纯度达到99％，是一种绿色环保的提取工艺。
(2)本发明使用硫酸沉淀剩余的钙盐，在pH为4～5时，胞苷酸不沉淀，可有效分离剩余的钙盐。
(3)本发明在纯化5’-胞苷酸时，利用溶解度的差异，使用淘洗进一步的提纯，使得最后得到的5’-胞苷酸纯度达99％以上。
附图说明
图1为本发明提供的制备5’-胞苷酸的提取工艺流程图
具体实施方式
下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
如图1所示，本实施例提供一种绿色环保的5’-胞苷酸提取工艺，包括如下步骤：
S1：制备胞苷酸酶解液
取胞苷300～400mmol、多聚磷酸钠60～80mmol、ATP 10mM、镁盐60～90mM、磷酸二氢钠10mmol、磷酸氢二钠10mmol，混合后加入900mL水溶解，配置成1L的体系，混合均匀后加入尿苷胞苷激酶(UCK)、聚磷酸激酶(PPK)酶解反应2～6h，得到胞苷酸含量为120～128g/L的胞苷酸酶解液，该胞苷酸酶解液的主要杂质为大量的无机盐与少量的蛋白。
S2：用硫酸将胞苷酸酶解液的pH值调节至3～5，并加热到70～90℃，维持30～35min，使蛋白失活变性，由可溶性蛋白转变为不溶性蛋白，得灭活物料；
S3：将处理好的灭活物料用5～50kd的陶瓷膜过滤，去除菌体碎片和变性蛋白，得陶瓷膜清液；陶瓷膜过滤过程中需用水对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗，用于清洗的水的用量为胞苷酸酶解液体积的50～70％，最后得到的陶瓷膜清液体积约为胞苷酸酶解液体积的1.5倍；
S4：将步骤S3中陶瓷膜清液用反渗透膜或1000分子量以下的纳滤膜进行浓缩，浓缩含量至胞苷酸含量为100～200g/L，得浓缩液；浓缩出水用于步骤S1中物料的溶解；
S5：向浓缩液中加入320～440mmol/L的钙盐(氢氧化钙或氯化钙)，并搅拌30～45min，使其中大量的磷酸根沉淀，生成磷酸钙，磷酸钙在农业中有着重要的应用，可作为磷肥，向植物提供所需的磷元素，促进植物的生长和发育；磷酸钙还可用于动物饲料中，补充动物体内所需的磷元素，提高动物的生长速率；
S6：将步骤S5得到的沉淀溶液板框过滤或抽滤，分离磷酸钙沉淀，得脱盐清液；
S7：将脱盐清液用硫酸调节pH至4～5，然后用板框过滤或抽滤，将残留的钙盐沉淀去除，得过滤清液；
S8：进一步用盐酸缓慢调节pH至2～3，搅拌结晶5.5～6.5h，将5’胞苷酸沉淀，得到结晶液；
S9：将结晶液使用离心机分离，得到含盐量很低的5’胞苷酸粗品；
S10：将5’-胞苷酸粗品用温度为10～30℃的纯水淘洗，淘洗时间为1～2h，纯水的使用量为5’-胞苷酸粗品的2～3倍，分离得到5’-胞苷酸湿成品，用双锥或者耙式真空干燥后得到成品，经检测，成品5’-胞苷酸的纯度达99％以上。
上述过程S6中回收的大量磷酸钙和步骤S7中回收的少量硫酸钙可作为生产肥料的原料，将步骤S9中提取5’-胞苷酸粗品后产生的母液进行浓缩后也可做为生产肥料的原料，步骤S10对5’-胞苷酸粗品进行淘洗得到的精母液回用至陶瓷膜工序。上述整套工艺与化学法制备5’-胞苷酸相比，没有用到剧毒的三氯氧磷跟大量有机溶剂；与生物法相比，不用进行离子交换和色谱脱盐，减少了大量的取排水，提取5’-胞苷酸的过程中也没有使用乙醇，本实施例提供的工艺方法成本低，无大量污水排放，收率在85％以上，成品纯度大于99％，适用于工业化生产。
实施例1
取胞苷酸酶解液1L，酶解液中胞苷酸含量120g/L，使用硫酸将pH由中性调至3，然后加热至70℃并维持30min。再通过5kd陶瓷膜过滤，并对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗，得到1.5升陶瓷膜清液，此时胞苷酸含量为52g/L，使用反渗透膜，压力50bar，进行浓缩至含量100g/L，出0.72L水回用。向浓缩液中加入氢氧化钙，搅拌30min，至沉淀不再产生，然后使用抽滤瓶抽滤，得脱盐清液。向脱盐清液中添加硫酸调pH至4.0，然后继续抽滤，过滤清液再用盐酸缓慢调pH至2.0，搅拌结晶6h，离心分离得到胞苷酸粗晶体76g，水分10％。然后使用20℃，152ml纯水淘洗，搅拌1h，离心分离得到湿成品，烘干后得到成品64g，收率80％，液相纯度99.5％。
实施例2
取酶解液100L，胞苷酸含量125g/L，使用硫酸将pH由中性调至5，然后加热至90℃维持30min。再通过50kd陶瓷膜过滤，并对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗，得到150升陶瓷膜清液，此时胞苷酸含量58.8g/L。使用反渗透膜，压力80bar，浓缩至胞苷酸含量为200g/L，出105.9L水回用。向浓缩液中加入氢氧化钙，搅拌30min，至沉淀不再产生，然后板框过滤，得脱盐清液。向脱盐清液添加硫酸调pH至5.0，然后继续过滤，过滤清液再用盐酸缓慢调pH至2.5，搅拌结晶6h，离心分离得到胞苷酸粗晶体8300g，水分10％。然后使用249L纯水淘洗，搅拌1h，离心分离得到湿成品，烘干后得到成品6900g，收率86.25％，液相纯度99.1％。
实施例3
取酶解液5m3，胞苷酸含量128g/L，使用硫酸将pH由中性调至4，然后加热至80℃维持30min。再通过50kd陶瓷膜过滤，得到7.5方陶瓷膜清液，胞苷酸含量65.3g/L。使用150kd纳滤膜，压力50bar，进行浓缩至胞苷酸含量150g/L，出4.235方水回用。向浓缩液中加入氢氧化钙与氯化钙，搅拌30min，至沉淀不再产生，然后板框过滤。过滤清液使用硫酸调pH至4.5，然后继续过滤，过滤清液再用盐酸缓慢调pH至3.0，搅拌结晶6h，离心分离得到胞苷酸粗晶体553.6kg，水分15％。然后使用3倍粗晶体重量1.66m3纯水淘洗，搅拌2h，离心分离得到湿成品，烘干后得到成品430kg，收率86％，液相纯度99.3％。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，包括：
S1：调节胞苷酸酶解液的pH至3～5，加热至70～90℃，维持30～35min，使蛋白变性，得灭活物料；
S2：将灭活物料用5～50kd的陶瓷膜过滤，去除菌体碎片和变性蛋白，并对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗，得陶瓷膜清液；
S3：将陶瓷膜清液用反渗透膜或1000分子量以下的纳滤膜进行浓缩，浓缩至胞苷酸含量100～200g/L，得浓缩液；浓缩出水用于步骤S1中物料的溶解；
S4：向浓缩液中加入钙盐，并搅拌30～45min，生成磷酸钙沉淀，得沉淀溶液；
S5：分离沉淀溶液中的磷酸钙沉淀，得脱盐清液；
S6：调节脱盐清液pH至4～5，然后过滤，将残留的钙盐沉淀去除，得过滤清液；
S7：进一步缓慢调节pH至2～3，搅拌结晶5.5～6.5h，将5'-胞苷酸沉淀，得到结晶液；
S8：将结晶液使用离心机分离，得5'胞苷酸粗品；
S9：5'-胞苷酸粗品淘洗后，真空干燥即得成品。
2.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，制备步骤S1中胞苷酸酶解液的方法为：取胞苷300～400mmol、多聚磷酸钠60～80mmol、ATP 10mmol、镁盐60～90mmol、磷酸二氢钠10mmol、磷酸氢二钠10mmol，混合后加入900mL水溶解，配置成1L的体系，混合均匀后加入尿苷胞苷激酶、聚磷酸激酶酶解反应2～6h。
3.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤S2中，对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗时，用水量为胞苷酸酶解液体积的50～70％。
4.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤S4中的钙盐为氢氧化钙或氯化钙，添加量为320～440mmol/L。
5.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤S5中采用板框过滤或抽滤的方法分离沉淀溶液中的磷酸钙沉淀；步骤S6中的过滤采用板框过滤或抽滤。
6.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤S1和步骤S6均使用硫酸调节pH值；步骤S7中用盐酸调节pH值。
7.根据权利要求1～6任一项所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤S9中淘洗的具体工序为：将5'-胞苷酸粗品用温度为10～30℃的纯水淘洗，淘洗时间为1～2h，纯水的使用量为5'-胞苷酸粗品的2～3倍，分离得到5'-胞苷酸湿成品，用双锥或者耙式真空干燥后得到成品。
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