CN110183547A - 一种可得然多糖高效后提取方法 - Google Patents

一种可得然多糖高效后提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110183547A
CN110183547A CN201910491119.6A CN201910491119A CN110183547A CN 110183547 A CN110183547 A CN 110183547A CN 201910491119 A CN201910491119 A CN 201910491119A CN 110183547 A CN110183547 A CN 110183547A
Authority
CN
China
Prior art keywords
colloid
polysaccharide
right polysaccharide
obtain right
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910491119.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张晓健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Taixing East Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Taixing East Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Taixing East Biological Technology Co Ltd filed Critical Taixing East Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201910491119.6A priority Critical patent/CN110183547A/zh
Publication of CN110183547A publication Critical patent/CN110183547A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种可得然多糖高效后提取方法。首先向产可得然多糖土壤杆菌的发酵液中加入重组微生物蛋白酶DSNJ‑rPE，20‑45℃条件下反应1‑2h；过滤收集菌体，用碱液溶解可得然多糖；然后离心或板框过滤去除菌体；上清液用酸溶液中和，析出可得然多糖可逆凝胶；胶体用去离子水洗涤2‑4次，离心或板框过滤收集胶体，斩拌机将胶体切成颗粒状；用液氮或干冰对颗粒状胶体进行速冻处理；采用沸腾干燥法，脱水干燥颗粒状胶体；最后将干燥后的胶体颗粒进一步粉碎，即得到可得然多糖精制品。本发明方法可以降低生产成本、提高多糖回收率和生产效率。同时，使用本方法提取的可得然多糖的凝胶强度，高于传统方法提取的可得然多糖凝胶强度。

Description

一种可得然多糖高效后提取方法
技术领域
本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种可得然多糖高效后提取方法。
背景技术
Curdlan(中文名称：可得然多糖，又称为可得然胶)是一种以葡萄糖、蔗糖等糖类为原料由土壤杆菌(Agrobacterium sp.)等微生物发酵生产的高分子聚合物。它是一种由葡萄糖结构单元以β-1，3-糖苷键连接而成的直链多聚葡萄糖，该类聚葡萄糖具有水不溶的性质。Curdlan具有在加热条件下可快速形成凝胶的性质，经85℃以上温度条件，处理10分钟以上即可形成热不逆的凝胶，因此又被称为热凝胶。美国FDA早在1996年就批准Curdlan作为食品原辅料用于食品工业中。Curdlan是继黄原胶、结冷胶后第3个被FDA批准的微生物大分子胶。我国卫生部2006年第8号公告批准Curdlan作为一种新型的食品添加剂。GB2760-2014版规定Curdlan可以作为稳定剂、凝固剂和增稠剂，用于豆腐、面制品、肉制品、鱼糜等食品中。
Curdlan精制品，即经过分离提纯后的多糖，应用于食品加工才会发挥出具有较好的效果。因此，从发酵液中分离提纯Curdlan产品开发的重要一环，也占据总生产成本的重要部分。目前，工业化生产中可得然多糖的后提取工艺是对发酵产物碱溶液处理后，用酸液沉淀出胶体，再经乙醇脱水、干燥，最后粉碎得到Curdlan精制品。在用碱溶液溶解可得然多糖，以及酸溶液沉淀胶体环节，由于溶解或沉淀胶体不彻底，造成可得然多糖回收效率低，胶体损失的问题；脱水干燥环节使用乙醇，存在有机溶剂使用量大、成本高，且存在安全隐患的技术缺陷；若不使用酒精脱水工艺，则脱水效率低，干燥时间长。此外，制备的可得然多糖精品的凝胶强度低于发酵液粗品凝胶强度。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述问题，提供一种从微生物发酵液中高效分离提纯可得然多糖的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种从微生物发酵液中高效分离提纯可得然多糖的方法，包括以下步骤：
(1)产可得然多糖微生物发酵结束后，向发酵液中加入重组微生物蛋白酶DSNJ-rPE，20-45℃条件下反应1-2h；
(2)微生物发酵液经过滤，弃去上清液，收集菌体；
(3)在搅拌的条件下，将收集到的沉淀物，按照1-2％(质量百分含量)的比例溶解于碱溶液；
(4)过滤去除菌体；
(5)上清液用酸溶液调节pH至中性，静置0.1-1h后获得凝胶沉淀；
(6)所得凝胶沉淀用去离子水洗涤2-4次，板框压榨脱水，得到可得然多糖化学可逆凝胶；
(7)对胶体进行切条处理；
(8)对切条后的胶体进行速冻处理，对速冻的胶体进行高速斩拌破碎处理，得到可得然胶粒；
(9)对可得然胶粒进行热风干燥，其中设备为闪蒸干燥、沸腾干燥的一种；
(10)对干燥后的可得然胶，进行粉碎处理，即到可得然多糖精制品。
其中，所述步骤(1)中的微生物发酵液优选产可得然多糖的土壤杆菌发酵液。所述的重组微生物蛋白酶DSNJ-rPE，，是一种高效降低可得然多糖发酵液粘度的蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该蛋白酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述步骤(1)中的重组微生物蛋白酶DSNJ-rPE添加量为10-1000U/L发酵液，是通过以下方法制备获得的：
a.分析NCBI数据库中数种土壤微生物来源的蛋白酶序列基础上，设计简并引物，提取土壤样品中微生物的总基因组DNA，并以其为模板，利用简并PCR进行扩增，拼接所有扩增产物获得全长1521bp的完整读码框序列，如SEQ ID NO.1所示。该基因编码507个氨基酸，编码产物分子量为49.139kD，如SEQ ID NO.2所示。
b.将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有DSNJ-rPE基因的表达质粒pET-23a-DSNJ-rPE；
c.将含有DSNJ-rPE表达质粒pET-23a-DSNJ-rPE转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导，5小时后离心收集菌体；
d.将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10000×g离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书进行纯化。
步骤(2)中所述的过滤为板框过滤，板框过滤型号为箱式板框150—Uk，优选滤布750目。
步骤(3)中发酵液中所加碱溶液优选氢氧化钠或氢氧化钾溶液，浓度为0.2-0.5M。
步骤(4)中所述的过滤为板框过滤，板框过滤型号为隔膜板框150-Uk，过滤目数优选700目。
步骤(5)中所述的酸溶液优选盐酸、硫酸、乙酸、磷酸、柠檬酸中的任意一种，浓度优选为1-3M。
步骤(6)中凝胶沉淀用去离子水洗涤次数为2-4次，板框过滤采用隔膜高压板框，滤布目数优选2000目。
步骤(7)中所述的胶体进行分割，采用横刀切粒机或者圆刀片切条机进行与粉碎，分割为40mm×10mm的条状。
步骤(8)中所述的胶体速冻处理方法，优选为向所得化学可逆胶体添加液氮或二氧化碳干冰，液氮或干冰的添加量优选为胶体重量的0.5-2倍，高速斩拌机高速斩碎过程中持续均匀添加，其中斩拌机转速3600r/min,斩碎5min，斩拌后颗粒直径约为2-3mm左右。
步骤(9)中干燥进风温度60℃-90℃，出风温度为50℃-65℃，处理量300-400kg/h。
步骤(10)中，粉碎条件：采用RT型号粉碎机，粉碎过筛网后目数为80目。
采用权利要求中的1-9中任意一项所述方法生产得到的可得然多糖产品。
有益效果：
本发明的创造性在于：(1)本发明公开了一种微生物蛋白酶基因，可得然多糖发酵液经重组细菌蛋白酶DSNJ-rPE处理后，粘度明显下降，可得然多糖回收效率提高10％以上；(2)本发明公开一种可得然胶体非乙醇脱水干燥方法，即在可得然胶体脱色干燥环节，采用切割成颗粒、胶体速冻、闪蒸或沸腾干燥的方式，避免了乙醇的使用降低了生产成本，同时干燥效率显著提高。
附图说明
图1重组蛋白酶DSNJ-rPE基因表达载体构建过程
图2可得然多糖分离提纯工艺示意图
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不是对本发明的限定，任何依据本发明内容所作的等效技术手段的替换，均不脱离本发明的保护范围。本发明所涉及的可得然多糖分离提取工艺，不仅限于从土壤杆菌发酵液分离提纯可得然多糖，从其他产可得然多糖的微生物发酵液进行分离提纯工艺，也在本发明的保护范围之内。
实施例1：蛋白酶DSNJ-rPE基因的克隆与测序分析
从NCBI网站中搜索几种蛋白酶序列，进行生物信息学分析，用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)程序选择其中的两处高度保守的氨基酸序列设计了简并引物。
利用MP bio公司的土壤基因组DNA提取试剂盒( Spin Kit for Soil)提取50份不同来源的土壤样品总基因组。
在50μl体系中，分别加入上游引物:5′-gcaccggattccgacgacag-3′,和下游引物:5′-tcgccgcaggccgactctag-3′,终浓度各为0.8μM，dNTPs终浓度为0.2mM,土壤基因组总DNA10ng，2U Pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃5min；35×(94℃30s，55℃60s，72℃60s)；72℃10min。将PCR产物送上海生工生物工程公司测序。
分析测序结果，得到一个全长为1521bp完整读码框序列的基因，核苷酸序列如SEQID NO.1所示，编码一个由507个氨基酸组成的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：蛋白酶DSNJ-rPE基因原核表达载体的构建(附图1)
根据获得的测序获得的MTG基因序列，在5′与3′端分别加上SacI识别序列(GAGCTC)和XhoI识别序列(CTCGAG)后，委托上海生工生物工程公司合成该基因。合成的基因与载体pET-23a，分别用适量的相同限制性内切酶BamHI消化后，用T4 DNA连接酶连接。重组载体转化大肠杆菌DH5α。从转化平板上随机挑取单菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工生物工程公司测序。
实施例3：蛋白酶DSNJ-rPE基因在大肠杆菌中的表达
将含有DSNJ-rPE基因的重组表达质粒pET-23a-DSNJ-rPE转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50mlLB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导。1.5小时后离心收集菌体。破碎菌体，离心收集上清液，获得重组DSNJ-rPE蛋白酶粗酶液。
重组蛋白酶DSNJ-rPE活性测定方法：将带有荧光标记的酪蛋白溶于0.2mL的磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)，充分混匀后，吸取50μL的底物加入4.95mL磷酸缓冲液(pH 7.0)。取该溶液0.1mL于黑色96孔板中，再加入经适当稀释的酶液0.1mL，混匀，于40℃避光反应1h。利用多功能酶标仪在激发波长/发射波长＝500/530nm下测定荧光强度。酶活定义：1mL酶液在1h内水解带有荧光标记的酪蛋白后荧光值的增加量，为1个酶活力单位(U)。
采用上述方法测得pET-23a-DSNJ-rPE转化BL21(DE3)pLysS后的工程菌，重组蛋白酶DSNJ-rPE的产量为120U/ml发酵液。
实施例4：重组蛋白酶DSNJ-rPE的分离纯化
采用NTA(镍柱，GE公司产品)亲和层析法对实例3中获得的重组DSNJ-rPE粗酶液进行分离纯化。
样品中加5mM咪唑(终浓度)，增强吸附柱。
上样前，用20mM咪唑平衡层析柱。样品过三次柱材料，达到重组DSNJ-rPE与亲和柱材料充分结合的目的。
上样结束后，用100mM咪唑洗脱(分别用10个柱床体积)，收集洗脱液测酶活。上述纯化制备的重组DSNJ-rPE酶活为380U/mg蛋白。
实施例5本专利提供的方法提取可得然多糖
(1)发酵培养基：葡萄糖5％、(NH)2HPO4 0.1％、KH2PO4 0.3％、MgSO4.7H2O 0.2％、CaCO3(1000目)0.2％、玉米浆0.2％，以上均为质量百分含量，调节溶液PH至7。
(2)发酵菌种为土壤杆菌ATCC31749，采用50L发酵罐，发酵培养基装液量30L、发酵培养温度30℃、搅拌转速180r/min培养周期96h，发酵生产可得然多糖。
(3)土壤杆菌ATCC31749发酵结束后，向发酵液中加入DSNJ-rPE，添加量为100U/L发酵液，静止反应2h。
(4)发酵液经板框过滤，弃去上清液，收集菌体。板框过滤型号隔膜板框150-Uk，过滤目数为750目。
(5)将收集的菌体按照1.5％(质量百分含量)的比例，在搅拌条件下，加入到0.3M的氢氧化钠碱溶液。
(6)得到的碱溶液经板框过滤去除不溶性菌体，板框过滤型号隔膜板框150-Uk，过滤目数为700目。
(7)得到的上清液，搅拌条件下加入浓度为2M的盐酸溶液调节pH至6，加入盐酸溶液浓度为3M，静置0.5h。
(8)凝胶沉淀用去离子水洗涤次数为4次，板框过滤采用隔膜高压板框，滤布目数为2000目。
(9)对压榨得到的胶体进行分割，采用横刀切粒机或者圆刀片切条机进行与粉碎，分割为40mm×10mm的条状。
(10)所得条状胶体进行速冻处理。添加二氧化碳干冰，添加量为胶体重量的1.5倍，高速斩拌机高速斩碎过程中持续均匀添加，其中斩拌机转速3600r/min,斩碎5min，斩拌后颗粒直径约为3mm左右。
(11)对可得然胶粒进行热风干燥，其中设备为闪蒸干燥机型，干燥进风温度60℃，出风温度为50℃，处理量350kg/h。
(12)待胶粒完全干燥后，采用RT型号粉碎机，进行粉碎处理，粉碎过筛网后目数为80目，即得到可得然多糖精制品。
实施例6使用本专利重组蛋白酶DSNJ-rPE，采用传统乙醇干燥方法提取可得然多糖
(1)发酵培养基：葡萄糖5％、(NH)2HPO4 0.1％、KH2PO4 0.3％、MgSO4.7H2O 0.2％、CaCO3(1000目)0.2％、玉米浆0.2％，以上均为质量百分含量，调节溶液PH至7。
(2)发酵菌种为土壤杆菌ATCC31749，采用50L发酵罐，发酵培养基装液量30L、发酵培养温度30℃、搅拌转速180r/min培养周期96h，发酵生产可得然多糖。
(3)土壤杆菌ATCC31749发酵结束后，向发酵液中加入DSNJ-rPE，添加量为100U/L发酵液，静止反应2h。
(4)发酵液经板框过滤，弃去上清液，收集菌体。板框过滤型号隔膜板框150-Uk，过滤目数为750目。
(5)将收集的菌体按照1.5％(质量百分含量)的比例，在搅拌条件下，加入到0.3M的氢氧化钠碱溶液。
(6)得到的碱溶液经板框过滤去除不溶性菌体，板框过滤型号隔膜板框150-Uk，过滤目数为700目。
(7)得到的上清液，搅拌条件下加入浓度为2M的盐酸溶液调节pH至6，加入盐酸溶液浓度为3M，静置0.5h。
(8)凝胶沉淀用去离子水洗涤次数为4次，卧螺离心去除部分水。
(9)所得中性胶体，用3倍质量的95％乙醇浸泡10分钟，卧螺离心去除乙醇。
(10)离心沉淀物放入烘箱中，在55℃条件下烘干，待完全干燥后放入研钵中研碎，过
100目筛子，即得到可得然多糖精制品。
实施例7不使用本专利重组蛋白酶DSNJ-rPE，采用本专利非乙醇干燥方法提取可得然多糖
(1)发酵培养基：葡萄糖5％、(NH)2HPO4 0.1％、KH2PO4 0.3％、MgSO4.7H2O0.2％、CaCO3(1000目)0.2％、玉米浆0.2％，以上均为质量百分含量，调节溶液PH至7。
(2)发酵菌种为土壤杆菌ATCC31749，采用50L发酵罐，发酵培养基装液量30L、发酵培养温度30℃、搅拌转速180r/min培养周期96h，发酵生产可得然多糖。
(3)土壤杆菌ATCC31749发酵结束后，发酵液经板框过滤，弃去上清液，收集菌体。板框过滤型号隔膜板框150-Uk，过滤目数为750目。
(4)将收集的菌体按照1.5％(质量百分含量)的比例，在搅拌条件下，加入到0.3M的氢氧化钠碱溶液。
(5)得到的碱溶液经板框过滤去除不溶性菌体，板框过滤型号隔膜板框150-Uk，过滤目数为700目。
(6)得到的上清液，搅拌条件下加入浓度为2M的盐酸溶液调节pH至6，加入盐酸溶液浓度为3M，静置0.5h。
(7)凝胶沉淀用去离子水洗涤次数为2-4次，板框过滤采用隔膜高压板框，滤布目数为2000目。
(8)对压榨得到的胶体进行分割，采用横刀切粒机或者圆刀片切条机进行与粉碎，分割为40mm×10mm的条状。
(9)所得条状胶体进行速冻处理。添加二氧化碳干冰，添加量为胶体重量的1.5倍，高速斩拌机高速斩碎过程中持续均匀添加，其中斩拌机转速3600r/min,斩碎5min，斩拌后颗粒直径约为3mm左右。
(10)对可得然胶粒进行热风干燥，其中设备为闪蒸干燥机型，干燥进风温度60℃，出风温度为50℃，处理量350kg/h。
(11)待胶粒完全干燥后，采用RT型号粉碎机，进行粉碎处理，粉碎过筛网后目数为80目，即得到可得然多糖精制品。
实施例8不使用重组蛋白酶DSNJ-rPE，采用传统乙醇干燥方法提取可得然多糖
(1)发酵培养基：葡萄糖5％、(NH)2HPO4 0.1％、KH2PO4 0.3％、MgSO4.7H2O0.2％、CaCO3(1000目)0.2％、玉米浆0.2％，以上均为质量百分含量，调节溶液PH至7。
(2)发酵菌种为土壤杆菌ATCC31749，采用50L发酵罐，发酵培养基装液量30L、发酵培养温度30℃、搅拌转速180r/min培养周期96h，发酵生产可得然多糖。
(3)土壤杆菌ATCC31749发酵结束后，发酵液经板框过滤，弃去上清液，收集菌体。板框过滤型号隔膜板框150-Uk，过滤目数为750目。
(4)将收集的菌体按照1.5％(质量百分含量)的比例，在搅拌条件下，加入到0.3M的氢氧化钠碱溶液。
(5)得到的碱溶液经板框过滤去除不溶性菌体，板框过滤型号隔膜板框150-Uk，过滤目数为700目。
(6)得到的上清液，搅拌条件下加入浓度为2M的盐酸溶液调节pH至6，加入盐酸溶液浓度为3M，静置0.5h。
(11)凝胶沉淀用去离子水洗涤次数为4次，卧螺离心去除部分水。
(7)所得中性胶体，用3倍质量的95％乙醇浸泡10分钟，卧螺离心去除乙醇
(8)离心沉淀物放入烘箱中，在55℃条件下烘干，待完全干燥后放入研钵中研碎，过100目筛子，即得到可得然多糖精制品。
实施例9不同提取方法制备的可得然多糖对比
可得然多糖纯度测定方法：具体参照国家标准GB 28304—2012执行。
可得然多糖提取率测定方法：称取实施案例5得到的发酵液称取W1,按照实施步骤干燥后的可得然胶成品称重W2,计算可得然胶提取率＝W2/W1*100％
可得然多糖凝胶强度测定方法：将精制品用纯水配制成2％(质量百分含量)悬浊液，均质机均质后，90℃水浴条件加热处理10分钟，4℃冷却5分钟，得到不可逆凝胶，并采用质构仪测定凝胶强度。
干燥效率测定方法：取斩拌机处理后的物料测出含水率S1，重量W3进行干燥操作，干燥时间为H1，干燥完成后取80目粉末，干燥重量W4，测含水率S2(要求≤10％)，计算干燥效率＝(W3.S1-W4.S2)/W3/H1,即每千克湿物料，每小时蒸发水分千克重量为干燥效率
采用上述测定方法，以处理150kg发酵液为例为例，对使用不同提取方法获得的可得然多糖精制品的纯度、凝胶强度、提取量，以及提取过程中乙醇的使用量和干燥效率进行比较。结果如表1所示。
表1不同可得然多糖提取方法对比
序列表
<110> 泰兴市东圣生物科技有限公司
<120> 一种可得然多糖高效后提取方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgagcaccg agaacgaggg cgccgccgtt ccttccgcgg gtggttcgca gtcgggatct 60
ccggctccgg aggaggcgaa cgctccggag gcggcgaggg ccccggaacc ggcgaaggct 120
ccggaggcgg cgaagggggc gacaccgcct gcggcaccgg cggccggccc cgccgcgacg 180
gagggcgggg acggacgcac cgagcggttc ccggccgtcc cgccgcacgc tccccccgcc 240
cccggaacgc ctccgccgcc cgcggaccag ggcgcctggt tcaacgcggc gggcgccccg 300
gccgcgtacg gcgcgacgcc gcaggacggc accgggcacg gcggcccgct cgtcccgccg 360
gccgccccct ggggcgcgcc cgaaccgccg cggcgccggc gcgggggcgg tctcgcggcg 420
gcggtcctgg tggcggccct ggtcgccggc gcggccggcg gcggcatcgg ctactgggcg 480
gcgaaccgga gcgacacctc gtccacgacc gtctcggccc ccggcgaccc gaagaccgcc 540
agccggacgc ccggttccgt cgcggacatc gccgcaaagg cgttgccgaa cgtcgtgacg 600
atcgaggcgc agagcagcgg cggcgagggc ggcaccggca ccggcttcgt ctacgacacc 660
gagggccaca tcctcaccaa caaccacgtc gtggcctcgg cggccgacgg cggccggctc 720
tccgtgacgt tctccaacgg caagcagtac gacgcggagg tcatcggccg cgcccagggc 780
tacgacgtcg cggtcatcaa gctgaagaac ccctccgggg cgaagctcag cccgttgccg 840
ctgggcgact cggacaagac ggccgtgggc gacgcgacgg tcgcgatcgg cgcgccgttc 900
ggcctctccg gcaccgtcac cacgggcatc gtcagcgcca agaaccgtcc cgtggcgtcc 960
agcgacggcg gcggcagcgg caacgcctcc tacatgagcg ccctgcagac cgacgcctcg 1020
atcaacccgg gcaactcggg cggcccgctg ctcaacgcgc agggcgcggt catcggcatc 1080
aactcggcca tccagtccgc gaacaacggc ggcggcttcc ccggcgccca gggccagtcc 1140
ggcagcatcg ggctgggctt cgccatcccc atcaaccagg ccaagaacgt cgccgagcag 1200
ctgatcaaga ccggtaagcc ggtctacccc gtcatcgggg ccacggtgaa catgaaggac 1260
ggcggcaccg gcgcccgcgt cgccgacaac ggcaccgacg ggtccgcggc ggtgaccccc 1320
ggcggcccgg cggacaaggc cggcctcaag ccgggcgacg tgatcgtcaa gctcggcgac 1380
accaagatcg acagcggccc caccctgatc agtgagatct ggacccacaa gcccggcacc 1440
aaggtcccga tcacctacgt gcgcaacggc aagcagacga cgacggacat cgtcctgggc 1500
gaacgcaccg gcgacaagta g 1521
<210> 2
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Ser Thr Glu Asn Glu Gly Ala Ala Val Pro Ser Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gln Ser Gly Ser Pro Ala Pro Glu Glu Ala Asn Ala Pro Glu Ala Ala
20 25 30
Arg Ala Pro Glu Pro Ala Lys Ala Pro Glu Ala Ala Lys Gly Ala Thr
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly Pro Ala Ala Thr Glu Gly Gly Asp
50 55 60
Gly Arg Thr Glu Arg Phe Pro Ala Val Pro Pro His Ala Pro Pro Ala
65 70 75 80
Pro Gly Thr Pro Pro Pro Pro Ala Asp Gln Gly Ala Trp Phe Asn Ala
85 90 95
Ala Gly Ala Pro Ala Ala Tyr Gly Ala Thr Pro Gln Asp Gly Thr Gly
100 105 110
His Gly Gly Pro Leu Val Pro Pro Ala Ala Pro Trp Gly Ala Pro Glu
115 120 125
Pro Pro Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Leu Ala Ala Ala Val Leu Val
130 135 140
Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ile Gly Tyr Trp Ala
145 150 155 160
Ala Asn Arg Ser Asp Thr Ser Ser Thr Thr Val Ser Ala Pro Gly Asp
165 170 175
Pro Lys Thr Ala Ser Arg Thr Pro Gly Ser Val Ala Asp Ile Ala Ala
180 185 190
Lys Ala Leu Pro Asn Val Val Thr Ile Glu Ala Gln Ser Ser Gly Gly
195 200 205
Glu Gly Gly Thr Gly Thr Gly Phe Val Tyr Asp Thr Glu Gly His Ile
210 215 220
Leu Thr Asn Asn His Val Val Ala Ser Ala Ala Asp Gly Gly Arg Leu
225 230 235 240
Ser Val Thr Phe Ser Asn Gly Lys Gln Tyr Asp Ala Glu Val Ile Gly
245 250 255
Arg Ala Gln Gly Tyr Asp Val Ala Val Ile Lys Leu Lys Asn Pro Ser
260 265 270
Gly Ala Lys Leu Ser Pro Leu Pro Leu Gly Asp Ser Asp Lys Thr Ala
275 280 285
Val Gly Asp Ala Thr Val Ala Ile Gly Ala Pro Phe Gly Leu Ser Gly
290 295 300
Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Ala Lys Asn Arg Pro Val Ala Ser
305 310 315 320
Ser Asp Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ala Ser Tyr Met Ser Ala Leu Gln
325 330 335
Thr Asp Ala Ser Ile Asn Pro Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Leu Asn
340 345 350
Ala Gln Gly Ala Val Ile Gly Ile Asn Ser Ala Ile Gln Ser Ala Asn
355 360 365
Asn Gly Gly Gly Phe Pro Gly Ala Gln Gly Gln Ser Gly Ser Ile Gly
370 375 380
Leu Gly Phe Ala Ile Pro Ile Asn Gln Ala Lys Asn Val Ala Glu Gln
385 390 395 400
Leu Ile Lys Thr Gly Lys Pro Val Tyr Pro Val Ile Gly Ala Thr Val
405 410 415
Asn Met Lys Asp Gly Gly Thr Gly Ala Arg Val Ala Asp Asn Gly Thr
420 425 430
Asp Gly Ser Ala Ala Val Thr Pro Gly Gly Pro Ala Asp Lys Ala Gly
435 440 445
Leu Lys Pro Gly Asp Val Ile Val Lys Leu Gly Asp Thr Lys Ile Asp
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Leu Ile Ser Glu Ile Trp Thr His Lys Pro Gly Thr
465 470 475 480
Lys Val Pro Ile Thr Tyr Val Arg Asn Gly Lys Gln Thr Thr Thr Asp
485 490 495
Ile Val Leu Gly Glu Arg Thr Gly Asp Lys
500 505

Claims (10)

1.一种可得然多糖后提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)向产可得然多糖的发酵液中，加入重组微生物蛋白酶DSNJ-rPE，20-45℃条件下反应1-2h；所述的重组微生物蛋白酶DSNJ-rPE，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)微生物发酵液经过滤，弃去上清液，收集菌体；
(3)在搅拌的条件下，将收集到的沉淀物，按照1-2wt％的比例溶解于终浓度为0.2-0.5M碱溶液；
(4)过滤去除菌体；
(5)上清液用酸溶液调节pH至中性，静置0.1-1h后获得凝胶沉淀；
(6)所得凝胶沉淀用去离子水洗涤2-4次，板框压榨脱水，即得到可得然多糖化学可逆凝胶；
(7)对胶体进行切条处理；
(8)对切条后的胶体进行速冻处理，对速冻的胶体进行高速斩拌破碎处理，得到可得然胶粒；
(9)对可得然胶粒进行热风干燥；
(10)对干燥后的可得然胶，进行粉碎处理，即到可得然多糖精制品。
2.根据权利要求1所述的可得然多糖后提取方法，其特征在于，向产可得然多糖的土壤杆菌发酵液中，加入重组微生物蛋白酶DSNJ-rPE，酶的添加为10-1000U/L发酵液，反应条件为20-45℃温度下反应1-2h。
3.根据权利要求1所述的可得然多糖后提取方法，其特征在于步骤(2)中所述的过滤为板框过滤，板框过滤型号为箱式板框150—Uk，优选滤布750目。
4.根据权利要求1所述的可得然多糖后提取方法，其特征在于步骤(4)中所述的过滤为板框过滤，板框过滤型号为隔膜板框150-Uk，过滤目数优选700目。
5.根据权利要求1所述的可得然多糖后提取方法，其特征在于步骤(6)中板框压榨脱水采用隔膜高压板框，滤布目数优选2000目。
6.根据权利要求1所述的可得然多糖后提取方法，其特征在于步骤(7)采用横刀切粒机或者圆刀片切条机进行与粉碎，分割为40mm×10mm的条状。
7.根据权利要求1所述的可得然多糖后提取方法，其特征在于步骤(8)所述的胶体速冻处理方法为向所得化学可逆胶体添加液氮或二氧化碳干冰，液氮或干冰的添加量优选为胶体重量的0.5-2倍，高速斩拌机高速斩碎过程中持续均匀添加，其中斩拌机转速3600r/min,斩碎5min，斩拌后颗粒直径约为2-3mm。
8.根据权利要求1所述的可得然多糖后提取方法，其特征在于步骤(9)中热风干燥采用闪蒸干燥、沸腾干燥的一种，闪蒸干燥或沸腾干燥的条件是进风温度60℃-90℃，出风温度为50℃-65℃，处理量300-400kg/h。
9.根据权利要求1所述的可得然多糖后提取方法，其特征在于步骤(10)采用RT型号粉碎机，粉碎过筛网后目数为80目。
10.采用权利要求中的1-9中任意一项所述方法生产得到的可得然多糖产品。
CN201910491119.6A 2019-06-06 2019-06-06 一种可得然多糖高效后提取方法 Pending CN110183547A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910491119.6A CN110183547A (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种可得然多糖高效后提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910491119.6A CN110183547A (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种可得然多糖高效后提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110183547A true CN110183547A (zh) 2019-08-30

Family

ID=67720654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910491119.6A Pending CN110183547A (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种可得然多糖高效后提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110183547A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114920857A (zh) * 2022-05-18 2022-08-19 徐州工程学院 一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1583801A (zh) * 2004-06-11 2005-02-23 江南大学 一种微生物多糖－热凝胶的提取工艺
WO2007046575A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 Postech Academy-Industry Foundation The application using non-covalent bond between a cucurbituril derivative and a ligand
CN101284880A (zh) * 2008-05-12 2008-10-15 山东省食品发酵工业研究设计院 可得然胶的溶剂法提取生产方法
CN102408490A (zh) * 2011-08-02 2012-04-11 河北鑫合生物化工有限公司 可得然胶的后提取方法
CN104087531A (zh) * 2014-07-03 2014-10-08 江苏一鸣生物科技有限公司 一株粪产碱杆菌突变株及用它制备可得然胶的方法
CN108752499A (zh) * 2018-05-08 2018-11-06 南京农业大学 一种从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1583801A (zh) * 2004-06-11 2005-02-23 江南大学 一种微生物多糖－热凝胶的提取工艺
WO2007046575A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 Postech Academy-Industry Foundation The application using non-covalent bond between a cucurbituril derivative and a ligand
CN101284880A (zh) * 2008-05-12 2008-10-15 山东省食品发酵工业研究设计院 可得然胶的溶剂法提取生产方法
CN102408490A (zh) * 2011-08-02 2012-04-11 河北鑫合生物化工有限公司 可得然胶的后提取方法
CN104087531A (zh) * 2014-07-03 2014-10-08 江苏一鸣生物科技有限公司 一株粪产碱杆菌突变株及用它制备可得然胶的方法
CN108752499A (zh) * 2018-05-08 2018-11-06 南京农业大学 一种从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
登录号M3BLK9，ENTRY VERSION29: "Putative serine protease", 《UNIPROTKB》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114920857A (zh) * 2022-05-18 2022-08-19 徐州工程学院 一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109666658B (zh) 用于制备nmn的烟酰胺磷酸核糖转移酶、编码基因、重组载体及应用
CN105431534B (zh) 内切－1，3－β－葡聚糖酶、多核苷酸、重组载体、转化体、内切－1，3－β－葡聚糖酶的制造方法、酶制剂及低分子化裸藻淀粉的制造方法
CN103261409B (zh) 甘露聚糖酶、其编码基因及其生产
CN110923221B (zh) 一种来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶高温突变体
CN110923222B (zh) 一种新型的来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶酸性突变体
CN1528786A (zh) 碱法提取大米蛋白的方法
CN110183547A (zh) 一种可得然多糖高效后提取方法
Liu et al. Recombinant expression of a chitosanase and its application in chitosan oligosaccharide production
WO2006057398A1 (ja) キチンを含む有機物の処理法
CN112195168B (zh) 嗜热几丁质酶Chi304突变体及其制备方法和应用
CN111394374A (zh) 一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691及其应用
CN109161556B (zh) 一种海带中的m1pdh基因、其蛋白质及用途
CN113481186B (zh) 一种GH18几丁质酶ChiA及其应用
CN109652396A (zh) 一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用
CN107236772A (zh) 一种制备褐藻寡糖的方法
JP7400468B2 (ja) トリコデルマ属糸状菌変異株およびタンパク質の製造方法
CN117384894B (zh) 脱乙酰酶及其编码基因、重组质粒、重组菌与应用
CN113528481B (zh) 用温度响应型无规共聚醚eo20po80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法
RU2250026C2 (ru) Способ получения белкового продукта из отрубей
CN104087604A (zh) 一种菊糖果糖转移酶基因表达序列
CN114539389B (zh) 重组胶原蛋白及其应用
CN113151224B (zh) 一种外切葡聚糖酶基因cel1及其在制备海带水解液中的应用
CN112979819B (zh) 一种利用人工酶制备海带水解液的方法
EP2995687A1 (en) Thermostable beta-glucosidase
CN105132347B (zh) 一株高效转化l-天冬氨酸生产l-天冬酰胺的工程菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190830